UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA
FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA DA FOSFATASE ÁCIDA DE
Enterobacter
sp. ISOLADA DE ORQUÍDEA
Gustavo Bonagamba Sandrini
BiólogoUNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA
FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA DA FOSFATASE ÁCIDA DE
Enterobacter
sp. ISOLADA DE ORQUÍDEA
Gustavo Bonagamba Sandrini
Orientador: Prof. Dr. João Martins Pizauro Júnior
Co-orientadora: Dra. Cecília Maria Costa do Amaral
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia Agropecuária
Sandrini, Gustavo Bonagamba
S219c Caracterização cinética da fosfatase ácida de Enterobacter sp. isolada de orquídea / Gustavo Bonagamba Sandrini. – – Jaboticabal, 2011
vii, 55 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2011
Orientador: João Matins Pizauro Júnior
Banca examinadora: Jesus Aparecido Ferro, Luis Henrique Souza Guimarães
Bibliografia
1. Enterobacter sp. 2. ATPase. 3. Pirofosfatase. 4. PNFFase. I. Título. II. Jaboticabal - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 577.15
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
“O sucesso é ir de fracasso em fracasso sem perder entusiasmo”.
Winston Churchill
“Nossa maior fraqueza está em desistir. O caminho mais certo para vencer é tentar mais uma vez”.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor João Martins Pizauro Júnior pela orientação, pelo tempo, sugestões, pelo exemplo de dedicação e competência profissional, além de sempre abrir as portas de seu laboratório para a realização do trabalho.
A Pós-Doutoranda Cecília Maria Costa do Amaral pela co-orientação, paciência, determinação e amizade.
A Professora Doutora Eliana Gertrudes Macedo Lemos, por ter cedido gentilmente seu laboratório para as análises microbiológicas.
A Professora Doutora Maria Inês Tiraboshi Ferro, pelos constantes conselhos.
Agradeço à Fátima Aparecida Ribeiro Harnich, pelos ensinamentos, pela colaboração na execução de vários experimentos, além do carinho e da amizade.
Ao técnico de laboratório João Carlos Campanharo pelas constantes sugestões.
Aos companheiros de Laboratório de Enzimologia Aplicada: Flávio, Gisele, Adriano, Vanessa, Rafael, Diogo, Mariana, Márcia, Thiago, Carolina e Cecília, pela amizade, companheirismo, e pela ajuda.
A Andressa Reiko Bueno, por estar sempre ao meu lado nos momentos fáceis e difíceis, pelo amor e companheirismo, incentivo, colaboração e admiração.
Aos funcionários do departamento pela paciência e esclarecimentos.
A Deus, por ter proporcionado esta oportunidade.
SUMÁRIO
Páginas
ÍNDICE DE TABELAS ... iii
ÍNDICE DE FIGURAS ... iv
LISTA DE ABREVIATURAS ... v
RESUMO ... vi
ABSTRACT ... vii
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 3
2.1 Importância do fósforo ... 3
2.2 Microrganismos ... 4
2.3 Fosfatases ... 7
2.4 Aplicações das fosfatases ... 10
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 13
3.1 Isolamento e identificação da bactéria Enterobacter sp ... 13
3.2 Meio de manutenção do microrganismo ... 14
3.3 Meio para produção de fosfatase ... 14
3.4 Obtenção da fosfatase ácida de membrana em Enterobacter sp. ... 14
3.5 Ensaio enzimático ... 15
3.6 Determinação das atividades da Pirofosfatase e ATPase ... 15
3.7 Efeito do pH sobre a atividade da fosfatase ácida ... 16
3.9 Efeito de compostos na atividade da PNFFásica da fosfatase ácida ... 17
3.10 Determinação da concentração da proteína ... 17
3.11 Determinação dos parâmetros cinéticos ... 18
3.12 Análises estatísticas ... 18
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 19
4.1 Identificação da bactéria ... 19
4.2 Efeito da concentração ótima de fósforo na expressão da fosfatase ácida ... 20
4.3 Efeito do pH sobre a atividade da fosfatase ... 21
4.4 Efeito da concentração do substrato sobre as atividades da fosfatase ácida ... 22
4.5 Efeito de compostos na atividade PNFFásica ... 25
4.6 Inativação térmica ... 29
5. CONCLUSÃO ... 32
ÍNDICE DE TABELAS
Página
Tabela 1. Atividade da fosfatase ácida em meio de cultura contendo
diferentes concentrações de fosfato... 20
Tabela 2. Médias e coeficientes de variação da atividade (U.mg-1) da
fosfatase ácida em diferentes tampões... 22
Tabela 3. Parâmetros cinéticos para a hidrólise p-nitrofenilfosfato (PNFF), ATP e pirofosfato da fosfatase ácida ligada a
membrana de Enterobacter sp., em pH 3,5... 24
Tabela 4. Efeito de diferentes substâncias sobre a atividade da
fosfatase ácida ligada a membrana de Enterobacter sp... 25
Tabela 5. Constantes de inativação térmica da fosfatase ácida de membrana de Enterobacter sp. e respectivos tempos de
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Foto da orquídea Cyrtopodium paludicolum ... 19
Figura 2. Árvore filogenética demonstrando o isolado SIC45 como
Enterobacter sp... 20
Figura 3. Efeito da concentração do PNFF sobre a atividade
fosfohidrolitica da fosfatase ácida... 23
Figura 4. Efeito da concentração do pirofosfato sobre a atividade
fosfohidrolitica da fosfatase ácida... 23
Figura 5. Efeito da concentração do ATP sobre a atividade
fosfohidrolitica da fosfatase ácida... 24
Figura 6. Representação de Lineweaver-Burk da atividade PNFFásica
da fosfatase inibida pelo cobre... 27
Figura 7. Representação de Lineweaver-Burk da atividade PNFFásica
da fosfatase ácida inibida pelo arsenato... 28
Figura 8. Representação de Lineweaver-Burk da atividade PNFFásica
da fosfatase ácida inibida pelo fosfato... 28
Figura 9. Representação de Lineweaver-Burk para a atividade da
PNFFase da fosfatase ácida inibida pelo vanadato... 29
Figura 10 Inativação térmica da fosfatase ácida ligada à membrana de
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP Adenosina-5’-trifosfato
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
K0,5 Interação sítio-sítio
Km Constante de Michaelis
n Coeficiente de Hill
Vm Velocidade máxima
P Fósforo
PHMB p-hidroximercuriobenzoato
PNFF p-nitrofenilfosfato
PNFFase p-nitrofenilfosfatase
PNFFásica p-nitrofenilfosfatase
rRNA Ácido Ribonucléico Ribossomal
CARACTERIZAÇÃO CINÉTICA DA FOSFATASE ÁCIDA DE Enterobacter sp.
ISOLADA DE ORQUÍDEA
RESUMO – Bactérias do gênero Enterobacter sp. são conhecidas por produzir ácidos orgânicos e solubilizar fosfato inorgânico presente no solo. O objetivo do trabalho foi caracterizar a enzima fosfatase ácida ligada à membrana de
Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídeas Cyrtopodium paludicolum. A enzima ligada à membrana foi purificada por centrifugação a 100.000 x g durante uma hora a 4ºC. A atividade da p-nitrofenilfosfatase (PNFFásica) foi determinada descontinuamente a 37°C. A bactéria foi inoculada em meio de cultura líquido e a enzima foi estritamente regulada pelo fósforo, atingindo expressão máxima a 5 mM, em pH ótimo aparente de 3,5. Em relação aos inibidores avaliados, verificou-se que o cobre apreverificou-sentou inibição não-competitiva. Já o arverificou-senato, vanadato e fosfato inibiram competitivamente a enzima, demonstrando que são análogos estruturais. A enzima exibiu comportamento “michaeliano” para a hidrólise do PNFF (atividade específica de 30,67 U/mg, Km = 0,55 mM e n = 1). Interações
sítio-sítio foram observadas para a hidrólise do ATP (atividade específica de 11,2 U/mg, Km = 0,62 mM e n = 1,8) e para a hidrólise do pirofosfato (atividade
específica de 15,64 U/mg, Km = 0,89 mM e n = 2,8). Os valores obtidos pela
inativação térmica demonstraram que a enzima manteve-se estável a 45°C e a atividade enzimática diminuiu com o aumento da temperatura. Os resultados sugerem que a produção da fosfatase ácida promove aumento na disponibilidade dos nutrientes para as plantas, solubilizando minerais insolúveis através da produção de enzimas, sendo um dos mecanismos que esses microrganismos utilizam para solubilização de fosfato mineral.
KINETIC CHARACTERIZATION OF ACID PHOSPHATASE OF Enterobacter sp.
ISOLATED FROM ORCHID
ABSTRACT – Bacteria of the genus Enterobacter sp. are known as organic acid producers and are able to solubilize inorganic phosphate which is present in soil. The aim of this work was to characterize the cell-wall associated acid phosphatase of Enterobacter sp. symbionts of plants and were isolated from roots of orchid
Cyrtopodium paludicolum. The enzyme was obtained by centrifugation at 100.000 x g, for one hour at 4ºC and the activity from p-nitrophenilphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C Culture medium was inoculate d with bacteria and supplemented with phosphorus. Under optimal conditions (5mM phosphorus, pH 3.5) the enzyme was expressed. The activity from p-nitrophenylphosphatase (PNPPase) was determined at 37°C. The enzyme presen ted Michaelis behavior for the hydrolysis of PNPP (specific activity of 30.67 U/mg, Km = 0.55 mM and n = 1).
Besides site-site interactions were observed for ATP hydrolysis (specific activity of 11.2 U/mg, Km = 0.62 mM and n = 1.8) and pyrophosphate hydrolysis (specific
activity of 15.64 U/mg, Km = 0.89 mM and n = 2.8). It was observed that enzyme
activity decreased with increasing temperature. Inhibition studies revealed that copper inhibited the enzyme in a non-competitive manner. In contrast arsenate, and vanadate which are structural analogues of phosphate presented a competitive inhibition. The results suggest that plants expressing acid phosphatase are able to solubilize mineral phosphate and are able to hydrolyse insoluble minerals thereby increasing the availibilty of nutrients which can be used by the plant.
1. INTRODUÇÃO
Atualmente, bactérias benéficas associadas às raízes ou bactérias de vida livre, têm sido denominadas como rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (PGPR – Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) (KLOEPPER et al., 1989) ou bactérias capazes de incrementar a melhora na produção vegetal (YIB – Yield-Increasing Bacteria) (PIAO et al., 1992).
A associação de raízes com microrganismos é um mecanismo utilizado pela planta para disponibilizar nutrientes presentes no solo, melhorando a absorção (JEFFRIES; BAREA, 2000). De acordo com Barea et al. (2005) essas associações podem ser exploradas em práticas sustentáveis de produção, tanto em ecossistemas agrícolas como em ecossistemas naturais, melhorando a absorção e, consequentemente, a produção vegetal. Esses microrganismos, responsáveis pela mineralização e solubilização do fósforo, também participam da transformação de compostos nitrogenados, oxidação e precipitação do ferro.
O fósforo (P) é um dos minerais mais importantes para nutrição vegetal, sendo o principal elemento limitante do crescimento das plantas (SÁNCHEZ; SALINAS, 1983). De acordo com Schachtman et al. (1998), esse elemento está envolvido em diferentes reações biológicas, sendo importante para o crescimento celular, além de participar de reações de desfosforilação que ocorre nas transmissões de sinais (STOCK et al., 1995) e em várias vias metabólicas (ALLAN et al., 1994). A deficiência desse nutriente altera o metabolismo, a respiração, a fotossíntese e o crescimento das plantas (GARCIA-SÁNCHES et al., 1996; GNIAZDOWSKA et al., 1998).
para o metabolismo (KIM et al., 1998), hidrolisando mono ou diesteres fosfóricos (FEDER, 1973).
As fosfatases são produzidas tanto por organismos procariotos como eucariotos e sua atividade ótima depende do pH de atuação, podendo ser classificadas como ácidas, neutras ou alcalinas. Podem ser extracelulares, encontradas nas paredes celulares ou intracelulares presentes no vacúolo e citoplasma das células (LEE, 1998).
Estudos demonstraram que raízes presentes em solos com deficiência de fósforo apresentam aumento significativo da atividade da fosfatase ácida, como resposta aos baixos níveis desse nutriente (GILBERT et al., 1999; MORA; TORO, 2007; AL-OMAIR, 2010). O aumento dessa atividade na rizosfera é observado em grande número de espécies de plantas (GARDNER et al., 1983; HOFFLAND et al., 1989; FUENTE et al., 1997).
Bactérias da família Enterobactericeae são conhecidas como produtoras de fosfatases, embora, diferentes cepas demonstrem alterações nos padrões de atividade enzimática (LEE et al., 1989; EDWARDS et al., 1993; POMPEI et al., 1993; THALLER et al., 1995), sendo a Escherichia coli a espécie mais estudada desta família. No entanto, informações sobre atividade e produção dessa enzima em Enterobacters ainda são contraditórias e escassas na literatura.
O objetivo do presente estudo foi caracterizar cineticamente a enzima fosfatase ácida da bactéria Enterobacter sp. isolada de raízes de orquídea
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Importância do fósforo
O fósforo (P) é um macronutriente presente em todos os organismos vivos e faz parte de diversas moléculas vitais, tais como o DNA, o RNA, os fosfolipídios, lectina, pepsina, caseína, além de integrar membranas celulares, estruturas ósseas, dentes e moléculas de ATP (LEHNINGER, 2002). Também atua na regulação da atividade de várias enzimas, mantém o balanço ácido-básico equilibrando o pH (RUNHO et al., 2001), possui função tamponante no líquido intracelular, participa das etapas de fosforilação da glicose e é ativador de coenzimas, como a vitamina B, com atuações em várias reações metabólicas (PIZZOLANTE, 2000).
De acordo com Pommerening (1987), o fósforo é um nutriente essencial requerido em alto nível tanto para o crescimento como para o desenvolvimento dos seres vivos. Esse mineral é o segundo mais abundante na composição dos tecidos animais, sendo que 80% do fósforo está presente em ossos e dentes, e o restante distribuído entre os fluídos e outros tecidos (UNDERWOOD; SUTTLE, 1999). Essa grande presença nos ossos atua como reserva de cálcio e de fósforo, atendendo as exigências nutricionais (MAYNARD; LOOSLY; HINTZ, 1984) e acelerando o processo de cicatrização de fraturas, devido à formação de colágeno e mineralização óssea.
Além dessas funções nos animais, o fósforo também participa do metabolismo das plantas. Depois do nitrogênio, o fósforo é o principal nutriente limitante para o crescimento vegetal, tanto em produções agrícolas como em sistemas naturais (HOLFORD, 1997).
é a natureza desses compostos e suas interações com a fração mineral. Os ácidos nucléicos e fosfolipídios com ligações diéster facilitam a decomposição da matéria orgânica, devido à estrutura química existente, sendo o fósforo facilmente mineralizável em sua forma inorgânica (H2PO4-) (SCHUMACHER, 2003). Já o
fosfato de inositol interage com os constituintes inorgânicos do solo, devido a sua alta carga residual, dificultando a mineralização (STEWART; TIESSEN, 1984; TATE, 1984) e tornando-se insolúvel e indisponível para a captação das plantas (LÓPEZ-BUCIO et al., 2002),
Essa mineralização ocorre devido à presença da massa microbiana presente no solo, que utiliza esses resíduos orgânicos como fonte de carbono, energia e nutrientes (SMECK, 1985; NEVES, 1992), os quais são insolúveis e indisponíveis para o vegetal (LÓPEZ-BUCIO et al., 2002).
Por isso, são necessários estudos que promovam uma melhora na absorção dos nutrientes reduzindo a utilização de compostos que prejudicam o meio ambiente, tais como os fertilizantes químicos, que desempenham um importante papel na agricultura, pois o uso excessivo vem acarretando redução na fertilidade do solo e aumentando a poluição por excesso de nutrientes (PRADHAN; SUKLA, 2005; CHEN et al., 2006).
2.2 Microrganismos
Na absorção do fósforo, a atividade fosfatásica tem sido encontrada em vários microrganismos. Entre os fungos, foram observados atividades de fosfatase em Aspergillus ficuum (SHIEH et al., 1969), Aspergillus nidulans (HARSANYI; DORN, 1972), Apergillus fumigatus (BERNARD et al., 2002), além de Aspergillus
niger e Penicillium sp. (SILVA-FILHO et al., 2002), que demonstraram elevada quantidade de fosfatases intracelular (YADAV; TARAFDAR, 2003).
De acordo com Nahas et al. (1994), os fungos possuem maior atividade da fosfatase ácida no solo, superando em quase 150% as bactérias produtoras de fosfatase alcalina. Já segundo Tarafdar et al. (2001), as fosfatases ácidas de origem microbiana, quando comparadas com as enzimas de origem vegetal, são mais eficientes na hidrólise dos compostos orgânicos como fitina, lecitina e glicerofosfato, presentes no solo.
Já entre as bactérias, essa enzima foi estudada em Lactobacillus curvatus (MAGBOUL; McSWEENEY, 1999), Mycobacterium tuberculosis (SALEH; BELISLE, 2000), Bradyrhizobium japonicum (KHALID et al., 2004), Pseudomonas
putida (BARAZANI; FRIEDMAN, 1999), Enterobacter cloacae e Enterobacter sakazakii (GOULLET; PICARD, 1986), além de gêneros do tipo Bacillus (GUTIERREZ-MAÑERO, 1996), Azospirillum, Xanthomonas e Rhizobium.
As bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae são bacilos gram-negativos que podem ser encontradas em diversos locais, tanto em solos como também na flora intestinal humana e animal. De acordo com Forsythe (2005), a presença dessas bactérias em alimentos processados pode indicar recontaminação, favorecendo o crescimento desses organismos. A Escherichia
FORSYTHE, 2003), além de ser associada a casos de meningite (BAR-OZ et al., 2001).
Bactérias do gênero Enterobacter são um dos grupos mais comuns de bactérias endofíticas isoladas de tecidos vegetais (HALLMANN et al.,1997), sendo encontradas em milho (FISHER et al., 1992), arroz (VERMA et al., 2001), na gramínea chilena Lolium perenne (SHOEBITZ et al., 2008) e também em associações com diversas orquídeas que, além do valor comercial e ornamental, vem sendo utilizadas em diversos estudos farmacológicos (ROBERTS; DIXON, 2008).
As fosfatases são encontradas na região próxima a raiz, denominada rizosfera, devido ao constante acúmulo de compostos orgânicos ali presente (GLICK 1995), associada a membrana dos microrganismos ou livre nos solos. A população bacteriana associada às raízes das plantas são chamadas de rizobactérias, que são classificadas de acordo com os efeitos sobre a planta em benéficas, deletérias ou neutras (DOBBELAERE et al., 2003). Quando benéficas, essas bactérias são livres no solo e tem sido denominadas rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (KLOEPPER et al., 1989), promovendo o aumento do “status” nutricional da planta por meio da solubilização de fósforo (PÉREZ et al., 2007) e da fixação biológica de nitrogênio (LI et al., 2008).
Em relação aos fungos, as bactérias são mais abundantes próxima a raiz devido a dois fatores: habilidade em utilizar compostos como fonte de carbono e nitrogênio e por apresentarem rápido crescimento. Em condições naturais essa associação de plantas com microrganismos do solo desempenha um papel chave na ciclagem de nutrientes e na proteção da planta contra microrganismos patogênicos (JEFFRIES; BAREA, 2000), além de implementar, direta ou indiretamente, a extensão ou a qualidade do crescimento vegetal (AHMAD et al., 2008).
do desenvolvimento de bioinoculantes comerciais e bioprocessos de fosfatos minerais.
Além disso, são biocontroladoras de pragas e doenças, pela produção de antibióticos e sideróforos (MEHNAZ; LAZAROVITS, 2006), produzem substâncias nocivas a nematóides (HALLMANN et al., 1999), produzem hormônios como auxina, poliamina e giberelina (TSAVKELOVA et al., 2006; SOLANO et al., 2008), contém ações específicas produzidas em condições de estresse (SOUZA et al., 2005), além de ação bacteriostática, inibindo o crescimento de outros microrganismos, com substâncias antagônicas (CARRIM, 2006). De acordo com Bacon e Hinton (2002), diferentes cepas da bactéria Bacillus mojavencis apresentam variadas formas de antagonismo com o fungo Fusarium moniliforme, um fitopatógeno de milho, através do contato direto ou por produção de toxinas que se difundem no meio, destruindo suas hifas.
Outra propriedade dessa associação é o auxílio na biorremediação. De acordo com Sheng et al. (2008), essas bactérias são capazes de atuar na degradação de substâncias carcinogênicas e de substâncias pesadas persistentes no ambiente, sendo uma importante estratégia para a recuperação de áreas contaminadas (RAJKUMAR; FREITAS, 2008). Atualmente, a utilização desses microrganismos pode ser uma alternativa ao uso de fertilizantes e pesticidas, contribuindo para a sustentabilidade dos sistemas agrícolas e redução de problemas associados ao uso excessivo de produtos químicos (CATTELAN; GRASSANO, 2007; AVIS et al., 2008; SOLANO et al., 2008).
2.3 Fosfatases
A classificação dessa enzima é baseada em critérios bioquímicos e biofísicos, sendo o pH ótimo de atuação a principal forma de categorização, exibindo atividade catalítica ótima em valores de pH ácidos, neutros e alcalinos (ROSSOLINI et al., 1998; OH et al., 2004). De acordo com Dvorak et al. (1988), o grupo das fosfatases ácidas atua em pHs ótimos de 2,5 a 6,0 e o grupo das fosfatases alcalinas atua em pHs ótimos na faixa de 8,0 a 10,5.
Outras classificações são baseadas de acordo com a especificidade do substrato (específicas ou não específicas) ou tamanho molecular. Fosfatases ácidas de diferentes origens podem ser classificadas em relação à massa molecular, como de baixa massa molecular, as menores que 50 kDa ou de alta massa molecular, maiores que 90 kDa (ARAUJO et al., 1976). As fosfatases de baixa massa molecular são sensíveis ao sulfidril, insensíveis ao tartarato e possuem especificidade variável. Já as fosfatases ácidas de alta massa molecular são sensíveis ao tartarato e insensíveis ao grupo sulfidril e a especificidade quanto ao substrato é restrita.
De acordo com Esposito e Azevedo (2004), as fosfatases podem ser induzidas ou constitutivas. As enzimas constitutivas são sintetizadas independentes da presença ou não do substrato. Já as induzidas são sintetizadas em proporções baixas, porém significativas até que o substrato induza grande aumento na atividade enzimática, variando assim a sua concentração, sendo sintetizadas em concentrações limitantes de fósforo.
As fosfatases podem ser encontradas em diversos tecidos animais, vegetais (FERREIRA et al., 1999) e em microrganismos (GONZÁLES et al., 1993), sendo sintetizadas fora da membrana (secretadas em formas solúveis), podem permanecer ligadas a membrana plasmática (BEACHAM, 1979; WANNER, 1996), ou ainda encontradas no citoplasma, estando envolvidas em várias reações metabólicas (STOCK et al., 1995).
biológica, importantes na deposição de fosfato de cálcio e conseqüentemente no crescimento longitudinal ósseo (PIZAURO et al., 2002).
Além disso, estudos vêm demonstrando grande progresso na compreensão do controle do crescimento e na regulação das células eucarióticas (TONKS; NEEL, 1996), através do balanço entre a fosforilação e desfosforilação das proteínas. De acordo com Jia (1997), essas pesquisas auxiliam no desenvolvimento e na avaliação de carcinógenos, hormônios, citocinas e substâncias tóxicas, regulação da divisão, desenvolvimento e morte celular, metabolismo, contração, transporte, locomoção celular e na expressão gênica (JOHNSON; BARFORD, 1993; GENOUX, et al., 2002).
Os solos brasileiros em geral, possuem altos teores de fósforo, entretanto, insuficientes para o suprimento das exigências das plantas, pois esse nutriente encontra-se na forma orgânica, sendo pouco solúvel e indisponível para absorção (NARLOCH et al., 2002). Assim, a relação planta-bactéria através da associação com microrganismos na rizosfera, capacita o vegetal a absorver fósforo pela mineralização do fosfato orgânico, promovendo incremento no crescimento vegetal. Entre os diversos mecanismos que possibilitam essa melhoria na taxa de solubilização, podemos citar o aumento na área superficial das raízes com associações micorrízicas, o deslocamento do equilíbrio de adsorção e a promoção do crescimento de raízes laterais e dos pelos radiculares (MENDES; REIS JÚNIOR, 2003).
Chen et al. (2002) observaram aumento nos teores de fósforo e da fosfatase na rizosfera em plantas de pinheiros, provocada pelo aumento da massa microbiana. Conte (2001) também verificou, em Latossolo Vermelho distroférrico do Planalto Riograndense, que a adição de fósforo proporcionou aumento do fósforo microbiano.
ou quando os sistemas apresentam baixos teores de fósforo disponível (OBERSON et al., 1996; CONTE, 2001).
Dessa forma, o interesse no estudo da fosfatase bacteriana não está restrito apenas ao entendimento de suas funções na biologia celular, mas também nas amplas possibilidades de aplicações biotecnológicas e ambientais dessa enzima.
2.4 Aplicações das fosfatases
O interesse pelas enzimas iniciou-se em meados de 1830, com a preparação de um complexo enzimático extraído do malte de cevada na hidrólise do amido. Neste período, a pepsina isolada foi responsável pela digestão da albumina. Com o avanço dos estudos teóricos sobre catálise e cinética das reações, as aplicações industriais enzimáticas tornaram-se uma realidade, otimizando a produção em escala industrial e realizando intensas pesquisas na área de engenharia genética (SAID; PIETRO, 2004).
As enzimas industriais podem ser obtidas a partir de tecidos animais, mas principalmente são originadas de bactérias, fungos ou vegetais superiores. De acordo com Said e Pietro (2004), há um grande interesse no emprego de técnicas de engenharia genética, para fins industriais e utilização de microrganismos, devido à facilidade de controle das condições de cultivo e a biodiversidade em relação às enzimas extraídas de animais e vegetais. Além disso, os microrganismos produtores de enzimas podem ser utilizados como biofertilizantes, otimizando a produção, diminuindo a contaminação ambiental, além de apresentarem menor custo. Nesse sentido, há também uma crescente busca por novos produtores de enzimas devido à enorme diversidade de microrganismos existentes (LIMA, 2001; CARVALHO et al., 2005).
por fungos e bactérias, possuindo grande potencial para futuras aplicações biotecnológicas, sendo empregadas em indústrias de alimentos, detergentes, tratamento de resíduos e de couro (NAIDU; DEVI, 2005).
Atualmente, um dos principais interesses na biotecnologia de enzimas é a melhora na absorção de nutrientes através da adição de enzimas presentes em rações. A maior parte do fósforo presente nos vegetais está na forma de fitato, sendo apenas 30% disponível para os animais, devido à quantidade de fósforo ligado nas moléculas de ácido fítico. De acordo com Maga (1982), o ácido fítico é um constituinte antinutricional, que reduz a disponibilidade desses minerais à nutrição animal.
Com isso, enzimas que hidrolisam fitato em rações atuam aumentando a digestibilidade e a disponibilidade do fósforo pelos animais, melhorando o valor nutricional dos alimentos (SEGUEILHA et al., 1992), além de reduzirem a contaminação ambiental produzida pela lixiviação do fósforo das excretas, que podem ocasionar a eutrofização do ecossistema (ABELSON, 1999).
Além disso, outra aplicação é a utilização de microrganismos no tratamento de locais poluídos. A biorremediação pode ser considerada uma nova tecnologia no uso de agentes biológicos para o tratamento de áreas contaminadas (MARIANO, 2006). De acordo com Bamforth e Singleton (2005), a técnica da biorremediação consiste na conversão de poluentes em produtos menos prejudiciais ao meio ambiente. A maioria desses compostos pode ser metabolizada por esses microrganismos, podendo participar em alguma via metabólica, desde que as condições físico-químicas do meio estejam adequadas (INAZAKI, 2003).
na identificação e taxonomia bacteriana (THALLER et al., 1992; ROSSOLINI et al., 1998) e na regulação da expressão gênica (MAKINO et al., 1994; ROSSOLINI et al., 1998).
3 – MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Isolamento e identificação da bactéria Enterobacter sp.
A bactéria foi obtida de raízes da orquídea Cyrtopodium paludicolum, no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, UNESP - Câmpus de Jaboticabal. O isolado SIC45 foi selecionado e identificado por meio do sequenciamento parcial do gene 16S rRNA (GALDIANO JÚNIOR, 2008).
3.2 Meio de manutenção do microrganismo
O microrganismo foi isolado em placas de petri com meio de cultura sólido DYGS (pH 6,8), nas seguintes concentrações: glicose (2 g/L), peptona (1,5 g/L), extrato de levedura (2 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4 .7H2O (0,5 g/L), ácido
glutâmico (1,5 g/L) e Ágar (9g/L). A cultura foi mantida em estufa B.O.D a 30° C.
3.3 Meio para produção de fosfatase
Através de uma alça de inoculação, a bactéria foi transferida da placa de petri para o pré-inóculo com meio de cultura líquido (Czapezk), contendo 20g de glicose, 2g de NaNO3, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,5g de KCl, 0,5g de extrato de
levedura, 0,01g de FeSO4 e 0,1g de KH2PO4. Foi feito a leitura desse meio
contendo a bactéria de duas em duas horas até chegar a uma densidade ótica de 0,8 nm. Findo tal período, foi pego 1 mL desse meio de cultura e colocado em outro meio de cultura, com as mesmas concentrações citadas anteriormente, porém sem KH2PO4, mas com solução mãe de fosfato 0,05 mM, variando a
concentração de fósforo de 0 a 7 mM, em volume final de 1 litro (pH 6,8). Esse meio foi mantido em vidros erlenmeyers (250 mL) por 24 horas, em constante agitação de 140 rpm a 30°C.
3.4 Obtenção da fosfatase ácida de membrana em Enterobacter sp.
As análises enzimáticas foram realizadas no Laboratório de Enzimologia Aplicada (LEA), do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV, UNESP - Câmpus de Jaboticabal.
tampão acetato de sódio 100 mM (pH 6,0), com o auxílio de homogeneizador tipo Potter. Posteriormente, a amostra foi submetida à ultrassonicação, em aparelho Branson sonifier 250, a 50 micropulsos por segundo, durante ciclos de 1 minuto para o rompimento das células onde. Esse material foi novamente submetida a centrifugação de 10.000 x g, por 10 minutos a 4°C e o precipitado ressuspendido em 5 mL de tampão acetato de sódio 100 mM (pH 6,0). Após isso, a amostra foi ultracentrifugada a 100.000 x g, 4°C, por 1 hora e o precipitado foi novamente ressuspendido em 5 mL de tampão acetato de sódio 100 mM (pH 6,0). Em seguida, foram divididas em alíquotas de 1,5 mL, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70 °C, para posteriores estudos de estabilidade térmica e caracterização cinética.
3.5 Ensaio enzimático
A atividade da fosfatase ácida foi determinada em meio de reação contendo 85 mM de tampão glicina (pH 3,5), 4 mM de MgCl2 e 4 mM do p-nitrofenilfosfato
(PNFF) utilizado como substrato, em volume final de 1 mL.
A reação foi iniciada pela adição da enzima ao meio e a incubação foi realizada em banho maria a 37°C, durante 10 minutos , sendo interrompida com 1 mL de NaOH 1 M. A quantidade de p-nitrofenolato liberado (ε = 17.600 M-1 cm-1, pH 13) no meio de reação foi determinada pela leitura em espectrofotômetro Hitachi U-2000 a 410 nm.
3.6 Determinação das atividades da Pirofosfatase e ATPase
A reação foi iniciada pela adição da enzima ao meio contendo tampão glicina 100 mM (pH 3,5), MgCl2 100 mM e diferentes concentrações de pirofosfato
e ATP (0,01 a 10 mM), em volume final de 0,4 mL. O tempo de reação foi 45 minutos, e interrompida com 100 µL de TCA 50%. Os tubos foram colocados imediatamente no gelo, para diminuir a hidrólise espontânea do substrato. O precipitado proteico foi eliminado por centrifugação a 10000 x g, a 4°C por 10 minutos e a dosagem do fosfato inorgânico foi efetuada de acordo com o procedimento descrito por Pizauro et al. (1995).
Após centrifugação, colocou-se em cada tubo 0,5 mL da solução A (10 mM de Molibdato de Amônio e 2 mM de Ácido sulfúrico, em volume final de 250 mL), agitando continuamente por 15 segundos. Depois, acrescentou-se 1 mL de acetona e os tubos foram agitados por mais 15 segundos. Finalmente, foi adicionado mais 0,5 mL de solução de Ácido cítrico 0,4 M, e agitados por mais 15 segundos. O fosfato orgânico liberado foi dosado espectrofotometricamente a 355 nm.
Todas as determinações foram realizadas em duplicatas. Testes sem a adição da enzima também foram incluídos para efeito de controle, sem que ocorresse a hidrólise enzimática do substrato. Uma unidade de enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima que libera 1,0 nanomol de produto por minuto, a 37 ºC.
3.7 Efeito do pH sobre a atividade da fosfatase ácida
3.8 Inativação térmica da fosfatase ácida
Alíquotas de 100 µL da enzima foram transferidas para tubos de ensaio e incubadas em banho-maria em diferentes temperaturas a 45°C; 50°C; 55°C e 60°C. Em intervalos previamente estabelecidos, os t ubos foram retirados e colocados imediatamente em gelo moído com a finalidade de interromper o processo de inativação e manter a enzima em sua configuração. Essas alíquotas foram colocadas no meio de reação e a atividade PNFFásica foi determinada conforme descrito anteriormente.
3.9 Efeito de compostos na atividade PNFFásica da fosfatase ácida
A reação foi iniciada com adição de 50 µL da enzima no meio de reação, com tampão glicina 100 mM (pH 3,5), contendo 4 mM PNFF e os seguintes compostos testados em diferentes concentrações: MgCl2 (0,5 – 2,5 mM), CuSO4
(0,5 – 2,5 mM), CoCl2 (5 – 25 µM), MnCl2 (5 – 25 µM), ZnCl2 (5 – 25 µM), teofilina
(1 – 10 mM), levamisol (1 – 10 mM), PHMB (0 – 1 mM), fosfato (1 – 10 mM), arsenato, (1 – 10 mM), metavanadato (1 – 10 mM), EDTA (1 – 10 mM), em um volume final de 1 mL.
3.10 Determinação da concentração da proteína
3.11 Determinação dos parâmetros cinéticos
Os parâmetros cinéticos Vmáx, Km, K0,5 e n foram ajustados utilizando-se o
programa Origin 8.0 (OriginLab Corp., Northampton, MA, USA) e foram obtidos através da equação de Lineweaver-Burke (1933).
3.12 Análises estatísticas
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 identificação da bactéria
A identificação e classificação da bactéria isolada de raízes de orquidea nativas (Figura 1), foi realizada por meio da análise de similaridade de nucleotídeos com o banco de dados GenBank.
Figura 1. Foto da orquídea Cyrtopodium paludicolum
Os resultados da sequência obtida em relação àquelas do banco de dados foram de 98-99% de similaridade, o que indica confiabilidade para os dados encontrados. Assim, a análise filogenética definiu o isolado SIC45 como
Figura 2. Árvore filogenética demonstrando o isolado SIC45 como Enterobacter sp.
4.2 Efeito da concentração ótima de fósforo na expressão da fosfatase acida
O efeito da concentração de fosfato na produção da fosfatase ácida ligada a membrana de Enterobacter sp. é mostrado na Tabela 1. A concentração de proteína total em 5 mM de fosfato foi maior (P<0,05) em relação às demais concentrações avaliadas. No que tange a fosfatase, verifica-se que com o aumento da concentração de fosfato ocorre o aumento da atividade da enzima (P<0,05), sendo máxima a 5 mM. Verifica-se ainda que após essa concentração, a atividade da enzima tende a diminuir com o aumento da concentração de fósforo.
Tabela 1. Atividade específica da fosfatase ácida ligada a membrana de Enterobacter sp. em meio de cultura contendo diferentes concentrações de fosfato.
Concentrações de fosfato (mM) Proteína Total* Fosfatase ácida (U.mg-1)
0,05 2,49B 6,16G
0,10 2,35B 9,58F
0,15 2,36B 6,89G
0,20 2,05B 11,60E
0,30 2,17B 11,95E
0,50 3,11B 15,39D
1,00 3,46B 18,10B
5,00 15,77A 29,26A
7,00 7,30B 17,15C
CV% 41,43 2,15
A análise desses resultados demonstra que a fosfatase ácida é sintetizada em condições limitantes de P, sendo que em baixas concentrações a atividade da enzima é baixa devido à limitação nutricional. Já em altas concentrações, a síntese diminui, sugerindo que nessas condições a produção da enzima e estritamente regulada pela concentração do fósforo no meio de cultivo(YASHPHE et al., 1990).
Esses resultados estão de acordo com trabalhos anteriores que também demonstraram regulação da expressão de fosfatase com o aumento de concentrações de fósforo, tanto em plantas capazes de estimular o crescimento vegetal, (COELHO, 2002; MORA; TORO, 2007; STARNES et al., 2008) como em micro-organismos (BERNARD et al., 2002; LUNG; LIM, 2006; YEUNG et al., 2009; VIRUEL, 2011). Já em fungos, foi demonstrado que as fosfatases ácidas estão sujeitas à repressão por altas concentrações de fosfato inorgânico (ALEKSIEVA; MICHEVA-VITEVA, 2000; BERNARD et al., 2002).
Esses resultados mostram que a síntese e secreção da fosfatase de micro-organismos estão relacionadas diretamente com mecanismos adaptativos como a condição limitante de fósforo.
4.3 Efeito do pH sobre a atividade da fosfatase
Tabela 2. Médias e coeficientes de variação da atividade (U.mg-1) da fosfatase ácida em diferentes tampões.
pH Ac. Fórmico Glicina Ac.Maléico Citrato Acetato
2,0 1,21E 0,88EF 0,04E 0,44E nd
2,5 6,54D 1,19E 0,31E 1,09D nd
3,0 14,90B 15,38B 1,57D 1,85C nd
3,5 20,43A 22,25A 14,31A 5,04A 20,51A
4,0 19,05A 15,45B 14,07A 2,91B 19,02A
4,5 nd 12,34C 12,69B 0,39E 13,92B
5,0 nd 9,39D 11,12C nd 11,79C
5,5 nd nd nd nd 10,14C
6,0 nd nd nd nd 7,20D
CV% 5,04 3,09 1,66 4,25 5,04
Médias seguidas por letras maiúsculas diferentes na coluna, diferem pelo teste de Tukey (P<0,05). nd – não definido
Estudos realizados por vários pesquisadores mostram que a atividade da fosfatase ácida é ótima entre pHs 5 e 6,5, tais como os estudados em fungos
Aspergillus fumigatus (BERNARD et al., 2002), em outras espécies de Enterobacter spp. (KANG et al., 2006) e em raízes de plantas de Vigna aconitifolia (AL-OMAIR, 2010). Resultados semelhantes com pHs mais baixos foram encontrados em Saccharomyces cerevisiae (TOH-E, 1973), Escherichia coli (DASSA, 1982; GOLOVAN, 1999) e em Thermus thermophilus (WANG et al., 2009), porém, artigos que avaliem pHs próximos a 3,5 são escassos na literatura.
4.4 Efeito da concentração do substrato sobre as atividades da fosfatase ácida
Figura 3. Efeito da co membrana d fosfatase ác
Figura 4. Efeito da c membrana pela fosfata
concentração de substrato sobre a atividade da a de Enterobacter sp.. A – Representação de Hill p ácida de membrana
a concentração de substrato sobre a atividade d na de Enterobacter sp. A – Representação de Hill p fatase ácida de membrana
da fosfatase ácida ligada à ll para hidrólise do PNFF pela
Figura 5. Efeito da c membrana fosfatase á
Verifica-se q inespecificidade de pH 3,5. O PNFF fo aproximadamente o velocidade do pirofo pelo substrato (Km
alta especificidade p
Tabela 3. Parâmetros ci para a fosfata
Substrato ATP PNFF Pirofosfato
a concentração de substrato sobre a atividade d na de Enterobacter sp. A – Representação de Hill e ácida de membrana
que a fosfatase ácida de Enterobacter de substrato, sendo capaz de hidrolisar dif foi o substrato que apresentou maior Vm
e o triplo da velocidade do ATP (11,2 U ofosfato (15,64 U.mg-1) e também apresen
= 0,55 mM), demonstrando que essa e e pelo PNFF (Tabela 3 ).
cinéticos para a hidrólise p-nitrofenilfosfato (PNFF tase ácida ligada a membrana de Enterobacter sp.
Parâmetros cinéticos
V (U.mg-1) n
11,2 1,8
30,67 1,1
15,64 2,8
da fosfatase ácida ligada à ill para hidrólise do ATP pela
ter sp. apresenta ampla diferentes substratos em
m (30,67 U.mg-1), sendo
U.mg-1) e o dobro da entando menor afinidade a enzima apresenta uma
FF), ATP e do pirofosfato ., em pH 3,5.
(mM) K0,5 = 0,62
Km =0,55
Embora tenha sido encontrado diferentes valores de afinidade e Vmáx em
diferentes espécies (LUNG et al., 2008; THAM et al., 2010), a hidrólise dos substratos foi similar aos obtidos para a enzima de raízes de plantas (AL-OMAIR, 2010) e de alguns micro-organismos, como em Geobacillus toebii (ZHANG et al., 2008) e em Thermus thermophilus (WANG et al., 2009).
Em relação ao coeficiente de Hill, os resultados indicaram que a enzima ligada à membrana apresenta características “Michaelianas” para a hidrólise do PNFF (n = 1,1). Já para os demais substratos, os resultados demonstraram interações sítio-sítio para a hidrólise do ATP (n = 1,8) e do pirofosfato (n = 2,8).
4.5 Efeito de compostos na atividade PNFFásica
Os efeitos dos compostos sobre a atividade da fosfatase ácida demonstraram que tais elementos são capazes de alterar diferencialmente a atividade da referida enzima (Tabela 4). Alem disso, os efeitos desses compostos sobre a atividade de fosfatase têm sido estudados com o objetivo de determinar os sítios específicos e sua interação com cada composto, assim como a sua cinética.
Tabela 4. Efeito de diferentes substâncias sobre a atividade da fosfatase ácida ligada a membrana de Enterobacter sp.
Reagente Concentração % (Atividade enzimática residual)
Controle - 100
MgCl2
5 µM 99.3
10 µM 95,52
15 µM 88,34
20 µM 84,07
25 µM 82,72
CuSO4
0,5 mM 94,89
1 mM 86,87
2 mM 78,40
2,5 mM 76,37
Reagente Concentração % (Atividade enzimática residual)
15 µM 103,48
20 µM 105,74
25 µM 108,92
MnCl2
5 µM 99,57
10 µM 97,56
15 µM 96,78
20 µM 90,02
25 µM 85,06
ZnCl2
5 µM 98,83
10 µM 105,21
15 µM 109,32
20 µM 105,51
25 µM 104,85
Teofilina
1 mM 98,10
2 mM 95,98
5 mM 92,42
8 mM 89,91
10 mM 85,33
Levamisol
1 mM 98,84
2,5 mM 97,76
5 mM 92,45
8 mM 91,33
10 mM 88,67
PHMB 1 mM 61
EDTA
1 mM 94,53
2,5 mM 89,87
5 mM 86,40
8 mM 84,99
10 mM 81,86
Vanadato
1 mM 28,46
2 mM 15,76
2,5 mM 17,30
3 mM 12,36
4 mM 10,09
5 mM 8,75
Arsenato
1 mM 93,47
2,5 mM 83,37
5 mM 74,31
8 mM 67,11
10 mM 66,22
Fosfato
1 mM 90,46
2,5 mM 83,33
5 mM 76,97
8 mM 69,52
Nesse sentido, os resultados obtidos mostram que o íon cobre, elemento essencial envolvido em várias atividades celulares, inibiu a atividade da enzima, apresentando uma inibição não-competitiva (Figura 6). Resultados semelhantes foram obtidos em Aspergillus ficcum (ULLAH, 1988), Pseudomonas syringae (CHO et al., 2003), Enterobacter spp. (KANG et al., 2006) e em Thermus
thermophilus (WANG et al., 2009).
Figura 6. Representação de Lineweaver-Burk para a atividade da PNFFásica da fosfatase ácida ligada a membrana inibida pelo cobre. As concentrações de cobre utilizadas foram: (■)
zero; (□) 2,5 mM; (●) 5,0 mM.
O arsenato e o fosfato, conhecidos como inibidores da atividade da fosfatase ácida, demonstraram inibição competitiva (Figuras 7 e 8), inibindo 32 e 34 % a atividade da enzima (a 10 mM), respectivamente. Uma vez que esses dois compostos são considerados análogos estruturais entre si, competem por um mesmo sítio ativo da enzima (DURMUS et al., 1999). Resultados similares demonstraram a mesma inibição da fosfatase por estes dois compostos em
Penicillium implicatum (NAKAGI et al., 2007) e em Ipomoea batatas (CHAN, 2011).
0 5 10
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
1
/v
Figura 7. Representação de Lineweaver-Burk para a atividade da PNFFásica da fosfatase ácida ligada a membrana inibida pelo arsenato. As concentrações utilizadas foram: (■) zero;
(□) 2,5 mM; (●) 5,0 mM; (○) 10,0 mM.
Figura 8. Representação de Lineweaver-Burk para a atividade da PNFFásica da fosfatase ácida ligada a membrana inibida pelo fosfato. As concentrações utilizadas foram: (■) zero;
(□) 2,5 mM; (●) 5,0 mM; (○) 10,0 mM. 0
5 10 15 20
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5
1
/v
1/[PNFF] mM-1
0 2,5 5
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
1
/v
Como observado em enzimas produzidas por diferentes micro-organismos, verificou-se que a fosfatase ácida também foi inibida pelo metavanadato (BERNARD et al., 2002; ULLAH et al., 2011), demonstrando inibição competitiva (Figura 9). Porém, não foi totalmente inibida pelo PHMB sugerindo que essa enzima não é uma tirosina fosfatase, pois tanto o vanadato como a PHMB são potentes inibidores da tirosina fosfatase (LAU, 1985).
Figura 9. Representação de Lineweaver-Burk para a atividade da PNFFásica da fosfatase ácida ligada a membrana inibida pelo vanadato. As concentrações utilizadas foram: (■) zero;
(○) 5 µM; (●) 10,0 µM; (□) 20,0 µM
4.6 Inativação térmica
Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que a curva de inativação térmica segue uma cinética de primeira ordem (Figura 10).
0 5 10 15
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5
1
/v
0 200 400 600 800 1000 20 40 60 80 100 % d a A tiv id ad e R es id ua l Tempo (seg)
Figura 10. Inativação térmica da fosfatase ácida ligada à membrana de Enterobacter sp. A atividade foi determinada pela adição de 50 µl de enzima em tampão glicina 100 mM, pH 3,5, contendo 4 mM PNFF, em um volume final de 1,0 ml. As temperaturas testadas foram: (■) 45ºC; (□) 50 ºC; (●) 55 ºC; (○) 60 ºC.
As constantes de inativação térmica e os tempos de meia vida são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Constantes de inativação térmica da fosfatase ácida de membrana de Enterobacter sp. e respectivos tempos de meia vida
Temperatura (°C) K x 10-4 (seg-1) T ½ (min) T ½ (seg)
45°C 0,222 520 31200
50°C 0,442 260 15600
55°C 9,24 12,5 750
60°C 252 0,45 27,5
Resultados similares foram encontrados em Aspergillus niger (TO-O et al., 1997; WANG et al., 2004), em Geobacillus toebii (ZHANG et al., 2008) e em outras espécies de Enterobacter sp. (SATO, 2011).
5. CONCLUSÃO
A fosfatase ácida de membrana é uma enzima induzida e sua expressão foi regulada pela concentração de fósforo presente no meio.
O pH ótimo de atuação da enzima foi 3,5, sendo capaz de hidrolisar diferentes substratos, como o PNFF, pirofosfato e ATP, apresentando comportamento “michaeliano” para a hidrólise do PNFF e interações sítio-sítio para a hidrólise do ATP e do pirofosfato.
A enzima foi inibida pelo cobre (inibição não-competitiva), fosfato (inibição competitiva), arsenato (inibição competitiva) e vanadato (inibição competitiva), sendo que os demais compostos testados apresentaram pouca influência na atividade da enzima.
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