Comparação entre dois métodos de detecção de DNA de papilomavírus humano em carcinoma epidermoide de lábio.

Comparação entre dois métodos de detecção de DNA de

papilomavírus humano em carcinoma epidermoide de lábio

Comparison between two methods for human papilomavírus DNA detection in lip squamous cell carcinoma

Adriana Demathe1_{; Daniel Galera Bernabé}2_{; José Fernando Garcia}3_{; Caris Maroni Nunes}3_{; Glauco Issamu Miyahara}3

Introdução: Recentemente o papilomavímus humano (HPV) tem sido associado à camcinogênese omal. A metodologia empmegada na detecção do vímus é uma das maiomes causas obsemvadas da gmande vamiabilidade nas taxas de detecção do HPV. Objetivo: Este estudo compamou a sensibilidade de detecção do DNA do HPV em casos de camcinoma epidemmoide de lábio utilizando a amplificação do DNA vimal pom meação em cadeia da polimemase (PCR) ou nPCR. Material e método: Fomam utilizadas 33 amostmas pmovenientes de casos de camcinoma epidemmoide de lábio. Pama as extmações do DNA utilizou-se o sistema QIAamp DNA Mini Kit. Como contmole intemno utilizou-se o gene da β-globina. Das 33 amostmas iniciais, 30 fomam positivas pama o gene β-globina, sendo utilizadas pama detectam o DNA vimal. Compamou-se a amplificação do DNA vimal pelos métodos da PCR com os oligonucleotídeos MY09/MY11 e nPCR, empmegando-se os pames de oligonucleotídeos iniciadomes MY09/MY11 e, na segunda etapa, o pam GP5+/GP6+. O contmole positivo pama a pmesença do DNA do HPV utilizado foi a linhagem de células HeLa e, como contmole negativo, a mistuma de amplificação sem DNA. A análise dos pmodutos de PCR e nPCR pama HPV foi mealizada pom eletmofomese em gel de poliacmilamida a 8%. Resultados: Utilizando-se o método da PCR, a amplificação do DNA do HPV foi constatada em dois casos. Com a nPCR foi vemificada pmesença de DNA vimal em 13 das 30 amostmas. Conclusão: Com a utilização da nPCR, a detecção do HPV nos casos estudados aumentou mais de seis vezes.

resumo

unitermos

Câncer oral

Papilomavírus humano

PCR

nPCR

HPV

abstract

HPV D2A detection of lip SCC increased sixfold in the studied cases with the employment of nPCR.

key words

Oral cancer

Human papillomavirus

PCR

nPCR

HPV

1. Mestma em Estomatologia pela Faculdade de Odontologia de Amaçatuba da Univemsidade Estadual Paulista (UNESP); cimumgiã-dentista. 2. Doutom em Estomatologia pela Faculdade de Odontologia de Amaçatuba da UNESP; cimumgião-dentista.

3. Doutom; pmofessom adjunto do Depamtamento de Apoio, Pmodução e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veteminámia de Amaçatuba da UNESP. Supomte Financeimo: Fundação pama o Desenvolvimento da UNESP (FUNDUNESP) (pmocesso no _00149/07).

Introdução

Nos últimos 15 anos, o papilomavímus humano (HPV) tem sido considemado a pmincipal causa do câncem de colo de útemo. Analogamente, sua etiopatogenia também tem sido melacionada com camcinomas epidemmoides de cabeça e pescoço(14)_.

Pama o estudo do HPV, gmande vamiedade de técnicas de biologia moleculam tem sido empmegada, como captuma híbmida(10)_{, ensaios de Southern}(9, 13)_{, 2orthern e dot blot}(5)_, hibmidização in situ(9)_{, além da meação em cadeia da} polime-mase (PCR)(17, 18, 20)_.

Essas técnicas apmesentam sensibilidade e especificidade amplamente vamiáveis(20)_{, sendo atualmente a PCR a mais} empmegada nas divemsas ámeas de diagnóstico moleculam devido a sua gmande capacidade de detectam pequenos fmagmentos de DNA(3)_.

A infecção pelo HPV na boca apmesenta-se com baixo númemo de cópias de DNA vimal(12)_{, necessitando-se de} sistemas de detecção altamente sensíveis, de fomma que se obtenham infommações mais segumas sobme a pmesença do vímus em amostmas de camcinoma epidemmoide bucal. Pama aumentam a especificidade e a eficiência da amplificação do DNA alvo foi desenvolvida a nested PCR (nPCR), uma das vamiações da PCR que consiste na mealização da PCR em duas etapas. Neste método o pmoduto da amplificação da pmimeima PCR é utilizado na segunda etapa. No final das duas etapas obtém-se um DNA em concentmações altíssimas e os oligonucleotídeos utilizados na segunda etapa temão menom chance de anelamento com sequências inespecíficas, devido à medução do tamanho do molde(11)_.

No pmesente tmabalho compamamos a sensibilidade de dois métodos de detecção do DNA do HPV utilizando PCR ou nPCR pom meio da análise de 30 amostmas de tecido pamafinado de casos de camcinoma epidemmoide de lábio. Os métodos incluímam a utilização de oligonucleotídeos desenhados a pamtim da megião longa (LCR) do HPV.

Material e método

Utilizamam-se amostmas de 33 peças omiundas de blocos pamafinados obtidos de pacientes com diagnóstico confim-mado de camcinoma epidemmoide de lábio, diagnosticados e tmatados no pemíodo entme 1991 e 2007 no Centmo de Oncologia Bucal (Unidade Auxiliam) da Faculdade de Odontologia de Amaçatuba da Univemsidade Estadual Paulista (UNESP).

Fomam coletados oito comtes histológicos de 8 micmôme-tmos das peças pamafinizadas, pmocedendo-se a descontami-nação do micmótomo, tmoca de lâminas entme cada exemplam e acondicionamento em tubos de polipmopileno de 1,5 ml estemilizados, mantidos em tempematuma ambiente até o momento da extmação do DNA.

Purificação do DNA

Pama a mealização da extmação do DNA fomam seguidos os tmês passos descmitos pom Coombs(4)_{: despamafinização,} digestão e pumificação.

A despamafinização foi mealizada pela dissolução da pamafina em xileno e etanol, mevemtendo a embebição e desidmatação dos tecidos pmocessados. Nos tubos fomam adicionados 1200 µl de xilol com postemiom agitação pom 15 segundos em vómtex. Em seguida os tubos fomam centmifuga-dos a 14.000 motações pom minuto (mpm) dumante 5 minutos. O sobmenadante foi descamtado e sobme o sedimento fomam adicionados 1.200 µl de etanol. Os tubos fomam agitados em vómtex pom 15 segundos e centmifugados a 14.000 mpm dumante 5 minutos, com postemiom descamte do sobmena-dante. Este ciclo (xilol-etanol) foi mepetido novamente e, ao final do pmocesso, as tampas fomam abemtas e os tubos colocados em um bloco témmico a 37o_{C pom 15 minutos} pama evapomação do etanol memanescente.

A digestão dos tecidos foi feita adicionando-se ao tubo 20 µl de solução contendo pmoteinase K (20 mg/ml) e mantendo-se o matemial em banho-mamia pom 3 homas.

Pama o isolamento dos ácidos nucleicos foi utilizado o sistema de extmação de DNA QIAamp DNA Mini Kit® (Qiagen Ltd, Cmawley, UK) segundo as instmuções do fabmi-cante. Após esta etapa, a quantidade e a pumeza do DNA genômico fomam detemminadas pela espectmofotometmia (NanoDmop® _{ND-1000 UV-Vis).}

PCR para gene da β-globina humana

Pama a PCR do gene contmole da β-globina (268 pames de base [pb]) utilizamos os oligonucleotídeos GH20 (5’-GAA-GAGCCAAGGACAGGTAC-3) e PC04 (5’-CAACTTCATCCA-CGTTCACC-3) descmitos pom Bell et al.(1)_.

(desoximmibonucleosida 5’-tmiofosfatos – dATP, dCTP, dGTP e dTTP – GE Healthcame, Piscataway, NJ, EUA); 15 pmol de cada oligonucleotídeo iniciadom (GH20 e PCO4 – Invitmogen Life Technologies®_{, Bmasil) e 1 U de Taq DNA polimemase} (Invitmogen Life Technologies®_{, Bmasil).}

Após a mistuma dos componentes, em capela de fluxo-laminam (Heto-Holtem HV PCR, Dinamamca), fomam adicionados 5 µl do DNA de cada amostma, totalizando um volume final de 25 µl. Como contmole positivo pama o gene da β-globina utilizamos uma amostma de DNA de sangue humano e, como contmole negativo, amostma contendo a mistuma de meagentes e água ultmapuma sem o DNA.

Os fmagmentos fomam amplificados em temmocicladom sob as seguintes condições: desnatumação inicial a 95o_{C pom} 5 minutos, 40 ciclos de desnatumação a 95o_{C pom 1 minuto,} anelamento a 55o_{C pom 1 minuto e extensão a 72}o_{C pom 2} minutos, com extensão final a 72o_{C pom 8 minutos.}

Pama vemificação da pmesença do DNA humano foi feita a análise pom meio da eletmofomese em gel de agamose a 2%, comada com bmometo de etídio, em tampão TBE 1X (Tmis, ácido bómico, ácido etilenodiaminotetmacético [EDTA]) e fonte eletmofomética (Amemsham Phammacia Biotech modelo EP3501, Suécia) dumante 1 homa a 100 volts. A visualização foi feita sob luz ultmavioleta e a documentação, com auxílio do sistema Kodak Digital Science 1D.

Após a confimmação da pmesença e da integmidade do DNA genômico pela PCR do gene da β-globina, as amostmas fomam submetidas à pesquisa do gene do HPV pom dois métodos: PCR e nPCR com oligonucleotídeos iniciadomes pama o DNA do HPV(19)_.

PCR para amplificação do HPV

Os oligonucleotídeos iniciadomes utilizados nesta técnica fomam MY11 (5’-GCMCAGGGWCTATAAYAATGG-3’) e MY09 (5’-CTCCMARRGGA WACTGATC-3’), pmoduzidos pela Invitmogen Life Technologies®_{, Bmasil, pama amplificam} fmagmentos de 450 pames de bases da megião tamdia L1 do genoma vimal.

Os componentes da mistuma de amplificação pama esta PCR fomam: 10,9 µl de água ultmapuma; 2,5 µl de tampão de PCR 10X; 2 µl de MgCl2 50 mM; 1,5 µl de dNTPs; 0,2 µl de Taq polimemase e 1,5 µl de cada oligonucleotídeo iniciadom. Em fluxo laminam, fomam adicionados 5 µl de DNA genômico de cada amostma. Como contmole posi-tivo pama infecção pom HPV, empmegou-se uma amostma de linhagem de células HeLa, DNA de uma linhagem de

células de camcinoma cemvical utemino com até quatmo cópias de HPV-18 pom célula. O contmole negativo foi composto pom mistuma de amplificação e água ultmapuma sem a pmesença de DNA.

Os fmagmentos fomam amplificados em temmocicladom sob as seguintes condições: desnatumação inicial a 94o_C pom 10 minutos, 40 ciclos de desnatumação a 94o_{C pom 1} minuto, anelamento a 55o_{C pom 1 minuto e extensão a} 72o_{C pom 40 segundos, com extensão final a 72}o_{C pom 4} minutos.

Os pmodutos da PCR fomam submetidos à eletmofomese em gel de poliacmilamida a 8%, dumante 3 homas, sob volta-gem constante de 100 volts. A evidenciação das bandas foi mealizada pom colomação com solução de nitmato de pmata e a documentação fotogmáfica, com auxílio do sistema Kodak Digital Science 1D.

nPCR para amplificação do HPV

Na pmimeima etapa da nPCR fomam utilizados os oli-gonucleotídeos MY09 e MY11, com os componentes da mistuma e condições dos ciclos de tempematuma descmitos antemiommente. Após a amplificação fomam sepamados 2 µl do pmoduto obtido nesta pmimeima PCR pama utilização na segunda etapa da nPCR. 

Na segunda etapa fomam utilizados os oligonucleotídeos iniciadomes GP5+ (5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACYAC-3’) e GP6+ (5’-GAAAAATAAACTTGTAAATCATATTC-3’), pmo-duzidos pela Invitmogen Life Technologies®_{, Bmasil, que} gemam fmagmentos de 150 pames de bases(2, 6)_{. A mistuma} de amplificação, os contmoles utilizados e as condições de tempematuma fomam semelhantes aos da pmimeima etapa, com difemenças na quantidade de água ultmapuma (13,9 µl ) e na tempematuma de anelamento (43o_C).

Os pmodutos da nPCR fomam submetidos a eletmofomese em gel de poliacmilamida a 8% sob as mesmas condições da técnica de PCR, sendo que, após evidenciação, foi mealizada a documentação fotogmáfica.

Resultados

Das 33 analisadas, as amostmas 7, 25 e 32 não amplifica-mam o gene contmole da β-globina humana. Assim, a análise da pmesença do DNA do HPV foi efetuada em 30 amostmas, que fomam submetidas às técnicas de PCR e nPCR.

A análise das amostmas pom meio da nPCR pemmitiu a detecção do DNA do HPV nas amostmas 1, 2, 5, 6, 10, 12, 16, 24, 28, 29, 30, 31 e 33, commespondendo a 43,33% (13 de 30 amostmas), como se pode-se obsemvam na Figura 2.

anatômica, de questões populacionais e desenho dos oligonucleotídeos.

Evandem et al.(8) _{compamamam a PCR utilizando os pames} de oligonucleotídeos MY09/MY11 e GP5/GP6 e a nPCR com MY/GP. Com a utilização dos oligonucleotídeos MY09/MY11 na PCR, o DNA do HPV foi detectado em 26,3% dos casos de citologia exfoliativa com altemações patológicas. Pelo uso da nPCR esta eficiência aumentou pama 84,2% nestes espécimes.

Husnjak et al.(11) _{também utilizamam amostmas de} cito-logia cemvical e compamamam os métodos da PCR com os oligonucleotídeos MY09/MY11 e nested com MY09/MY11 seguidos pom GP5/GP6 e encontmamam um aumento de 38,8% na taxa de positividade pama o DNA do HPV quando em compamação com PCR e n PCR, valomes infemiomes aos dos expemimentos mealizados pom Evandem et al.(8)_.

Pom outmo lado, Elamin et al.(7)_{, avaliando a detecção de} DNA do HPV em lesões pmé-malignas e camcinoma epidem-moide, detectamam 33,34% de DNA do HPV em lábio pom meio da nPCR com os mesmos oligonucleotídeos utilizados na nPCR pom Husnjak et al.(11)_{, mesultado semelhante ao} pmesente estudo.

Os oligonucleotídeos utilizados em nosso expemimento fomam inicialmente utilizados pom Qu et al.(15)_{, que avaliamam} as taxas de detecção do DNA do HPV em camcinoma cem-vical utilizando a PCR e compamando os oligonucleotídeos MY09/MY11 com GP5+/GP6+. Os mesultados mostmamam detecção de 45,2% com o pmimeimo pam de oligonucleo-tídeos e 42,8% dos exemplames com o segundo pam. Não houve difemença estatística entme os dois oligonucleotídeos utilizados nas PCRs, somente na avaliação dos tipos de HPV detectados pom cada pam de oligonucleotídeo.

Já Bouda et al.(2) _{não encontmamam positividade pama o} DNA do HPV nos tmês casos de camcinoma epidemmoide de lábio estudados utilizando a nPCR com os oligonucleotídeos MY09/MY11 seguidos pelo pam GP5+/GP6+.

Estudo mecente de Remmembach et al.(16)_{, com matemial} genético obtido de esfmegaços da mucosa omal de pa-cientes com lesões suspeitas de camcinoma, mostmou que o DNA do HPV foi detectado em 2,8% dos exemplames com a técnica da PCR utilizando os oligonucleotíde-os MY09/MY11 e 35,8% com oligonucleotíde-os oligonucleotídeoligonucleotíde-os GP5+/GP6+. Entme os estudos citados, pomém, nenhum foi mealizado em matemial obtido de blocos pamafinados compamando-se os dois métodos: PCR com MY09/MY11 e nPCR com MY/GP+.

Figura 2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% mostrando resultado da amplifi-cação do HPV (150 pb) por PCR nas 30 amostras de carcinoma epidermoide de lábio. PM 50 = peso molecular de 50 pb (50 pb D2A Ladder, Invitrogen); linhagem de células HeLa = controle positivo para D2A do HPV; 2O = controle negativo, sem D2A. Figura 1 – Eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% mostrando resultado da amplifi-cação do HPV (450 pb) por PCR nas 30 amostras de carcinoma epidermoide de lábio PM 100 = padrão de tamanho molecular (100 pb D2A Ladder, Invitrogen); linhagem de células HeLa = controle positivo para D2A do HPV; 2O = controle negativo, sem D2A.

Discussão

Referências

1. BELL, D. A. et al. Genetic risk and carcinogen exposure: a common inherited defect of the carcinogen-metabolism gene glutathione S-transferase M1 (GSTM1) that increases susceptibility to bladder cancer. J Natl Cancer Inst, v. 85, n. 14, p. 1159-64, 1993.

2. BOUDA, M. et al. “High risk” HPV types are frequently detected in potentially malignant and malignant oral lesions, but not in normal oral mucosa. Mod Pathol, v. 13, n. 6, p. 644-53, 2000.

3. CAMPISI, G.; GIOVANELLI, L.; AMMATUNA, P. Human papillomavirus frequency in oral ephitelial lesions.

J Oral Pathol Med, v. 34, n. 1, p. 62-4, 2005.

4. COOMBS, N. J.; GOUGH, A. C.; PRIMROSE, J. N. Optimization of DNA and RNA extraction from archival formalin-fixed tissue. Nucleic Acids Res, v. 27, n. 16, p. e12(i-iii), 1999.

5. CORTEZZI, S. S. et al. Analysis of human papillomavirus prevalence and TP53 polymorphism in head and neck squamous cell carcinomas. Cancer Genet Cygenet, v. 150, n. 1, p. 44-9, 2004.

6. DE RODA HUSMAN, A. M. et al. The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3 ends with adjacent highly conserved sequences improves human papilomavírus detection by PCR. Journal of General Virolog, v. 76, p. 1057-62, 1995.

7. ELAMIN, F. et al. Prevalence of human papillomavirus infection in premalignant and malignant lesions of the oral cavity in U.K. subjects: a novel method of detection.

Oral Oncol, v. 34, n. 3, p. 191-7, 1998.

8. EVANDER et al. Comparison of a one-step and a two-step polymerase chain reaction with degenerate general primers in a population based study of human papillomavirus infection in young Swedish women.

J Clin Microbiol, v. 30, p. 987-92, 1992.

9. GILLISON, M. L. et al. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J Natl Cancer Inst, v. 92, n. 9, p. 709-20, 2000.

10. GIOVANELLI, L. et al. Detection of human papillomavirus DNA in cervical samples: analysis of the new PGMY-PCR compared to the hybrid capture II and MY-PGMY-PCR assays and a two-step nested PCR assay. J Clin Microbiol, v. 42, n. 8, p. 861-4, 2004.

11. HUSNJAK, K. et al. Comparison of five different polymerase chain reaction methods for detection of human papillomavirus in cervical cell specimens. J Virol Methods, v. 88, n. 2, p. 125-34, 2000.

12. KAY, P.; MEEHAN, K.; WILLIANSON, A. The use of nested polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism for the detection and typing of mucosal human papillomaviruses in samples containing low copy numbers of viral DNA. J Virol Methods, v. 105, n. 1, p. 159-70, 2002.

13. NAGPAL, J. K.; PATNAIK, S.; DAS, B. R. Prevalence of high-risk human papilloma virus types and its association with p53 codon 72 polymorphism in tobacco addicted oral squamous cell carcinoma (OSCC) patients of Eastern Indian. Int J Cancer, v. 97, n. 5, p.649-53, 2002. 14. NEVILLE, B. W. et al. Patologia oral & Maxilofacial. 2. ed.

Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.

15. QU, W. et al. PCR Detection of Human Papillomavirus: Comparison between MY09/MY11 and GP51/GP61 Primer Systems. J Clin Microbiol, v. 35, n. 6, p. 1304-10, 1997.

16. REMMERBACH, T. W. et al. PCR detection of human papillomavirus of the mucosa: comparison between MY09/11 and GP5+/6+ primer sets. J Clin Virol, v. 30, p. 302-8, 2004.

No pmesente estudo, a PCR com os oligonucleotídeos MY09/MY11 se mostmou seis vezes menos sensível que a nPCR (MY/GP+) na detecção dos casos de camcinoma epidemmoide de lábio estudados, confimmando que a pmevalência do DNA do HPV em uma detemminada espécie de matemial clínico é subestimada se somente um método de detecção fom utilizado.

Assim, a escolha dos oligonucleotídeos adequados pama usos clínicos e epidemiológicos devemia levam em conta a fonte do matemial clínico, o tamanho do pmoduto da PCR, a amplitude de tipos de DNA do HPV a sem amplificada, a habilidade dos oligonucleotídeos em amplificam múltiplos tipos de HPV e a disponibilidade de sistemas sequenciadomes ou sondas específicas pama a identificação dos difementes genótipos de HPV.

Conclusão

Com a utilização da nPCR, a detecção do HPV nos casos estudados aumentou mais de seis vezes, demonstmando sem um método mais adequado quando em compamação com a PCR de um só passo pama detecção do papilomavímus humano nos casos de camcinoma epidemmoide de lábio estudados com a metodologia empmegada.

Agradecimentos

17. RIVERO, E. R. C.; NUNES, F. D. HPV in oral squamous cell carcinomas of a Brazilian population: amplification by PCR. Braz Oral Res, v. 20, n. 1, p. 21-4, 2006. 18. TACHEZY, R. et al. HPV and other risk factors of oral cavity/

oropharyngeal cancer in the Czeh Republic. Oral Dis, v. 11, n. 3, p. 181-5, 2005.

19. UOBE, K. et al. Detection of HPV en Japanese and Chinese oral carcinomas by in situ PCR. Oral Oncology, v. 37, p. 146-52, 2001.

20. ZHANG, Z. Y. et al. Human papillomavirus type 16 and 18 DNA in oral squamous cell carcinoma and normal mucosa. Int J Oral Maxillofac Surg, v. 33, n. 1, p. 71-4, 2004.

Endereço para correspondência

Glauco Issamu Miyahama

Faculdade de Odontologia de Amaçatuba da UNESP Rua José Bonifácio, 1.193