Padronização de testes para avaliação do estado de mania e potencial anti-maníaco de um agonista do receptor NOP

(1)

LISIANE DE SANTANA SOUZA

PADRONIZAÇÃO DE TESTES PARA AVALIAÇÃO DO ESTADO DE MANIA E POTENCIAL ANTI-MANÍACO DE UM AGONISTA DO RECEPTOR NOP

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.

(2)

LISIANE DE SANTANA SOUZA

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para obtenção do título de Mestre em Psicobiologia.

Orientador: Prof.ª Dr.ª Elaine C. Gavioli

(3)

(4)

Lisiane de Santana Souza

Data da Defesa: ____/____/____

Banca Examinadora:

___________________________________ Prof.ª Dr.ª Alianda Maira Cornélio da Silva

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

___________________________________ Prof.ª Dr.ª Elaine Cristina Gavioli

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN

___________________________________ Prof. Dr. Pablo Pandolfo

(5)

O que prevemos raramente ocorre; o que menos esperamos geralmente acontece.

(Benjamin Disraeli)

Porém,

Eu sou brasileira e não desisto nunca!

(6)

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, minha fonte de força desde sempre, especialmente quando tudo deu errado e eu não consegui passar na primeira seleção do mestrado, assim como no período em que, pra variar, os experimentos demoraram a funcionar.

À minha orientadora, Elaine Gavioli, por todo o conhecimento repassado, além de ajuda, conselhos, carinho e paciência, assim como por nunca ter se negado a ouvir minhas lamúrias e indecisões sobre o que fazer da vida. Serei eternamente grata, principalmente pelo suporte dado no período em que não pude estar presente no laboratório. “Xô uruca” pra nós!

À minha família, por todo o amor dado, pelos muitos sacrifícios que fizeram por mim, e por sempre terem me dado liberdade pra ir de encontro ao que me fizesse mais feliz, embora, muitas vezes, não entendam os caminhos que eu prefiro trilhar (mamãe que o diga!).

Aos colegas de laboratório, pela ajuda, risadas, apoio, piadas, semanas de limpeza do biotério e falhas de experimentos compartilhadas durante os últimos 5 anos. Cada um de vocês tem algo que agrega vida ao laboratório. Aos que tomaram outro rumo: Manara e as reclamações de que seus experimentos supostamente não funcionam; Luana e suas doidices que nos fazem falta; e Maíra, que virou minha companheira de viagens ao Rio e águas de coco em Copacabana: “É nóis na Tijuca!”. Aos que permanecem: Laila, a “matutina extrema” que me fazia acordar mais cedo que o usual; Iris e seu jeito fashion e alegre; Julia, detentora de cadeira cativa no Thomas;

Victor e as suas fontes quentíssimas; Décio e Adriana, os melhores organizadores de

festas do laboratório; Nataly, que me assumiu como dupla da semana da limpeza; e

Epifanio, também conhecido como “Antonio Pãozinho”, que sabota minha dieta todos

os dias. Você subiu de nível, mas será sempre meu aluno de IC, e todo mundo na feira sabe: Gláucia, D. Ana, Ana Rita... Aos demais, que não citei, mas que com certeza tem um lugarzinho reservado aqui dentro: muito obrigada!

Aos amigos que o mestrado me deu: Ariela, Lu Rocha e Jaqueiuto, vulgo “galerinha do mal”, amo vocês! O mestrado também não teria sido o mesmo sem a presença das ladies: Ceci, Lu Varella, Mari e May. Eu tenho fé que um dia a gente consegue reunir todas pro nosso chá! Aos demais colegas do PPG Psicobiologia, mais próximos ou um pouco mais distantes, obrigada por terem feito esses últimos 2 anos serem mais felizes.

Às minhas “amigas lindas”, as cajazeiras: Aldi, Anassely, Ju, Candy, também

agradeço a vocês o suporte e amizade que vocês me dão desde a graduação. Somos cada uma diferente das outras, mas juntas, nos completamos!

(7)

Aos professores Pablo e Alianda, por aceitarem fazer parte da banca de avaliação deste trabalho.

À CAPES e ao CNPq, pelo apoio financeiro imprescindível para a viabilização deste projeto.

(8)

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ... 17

1.1 Transtorno bipolar ... 17

1.2 Tratamento do Transtorno Bipolar ... 19

1.3 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP ... 21

1.4 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP e transtornos afetivos ... 24

1.5 Modelos Animais de Mania ... 26

METODOLOGIA ... 31

2.1 Animais ... 31

2.2 Drogas e tratamentos ... 31

2.3 Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular em camundongos ... 32

2.4 Testes comportamentais ... 34

2.4.1 Campo aberto ... 34

2.4.2 Hole board... 34

2.5 Desenho experimental ... 35

2.5.1.Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania induzido pela administração de ouabaína em camundongos ... 35

2.5.2 Etapa II – Padronização do hole board como um modelo para se avaliar a mania ... 36

(9)

2.6 Análise estatística ... 38

RESULTADOS ... 39

3.1 Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania promovido pela administração de ouabaína em camundongos ... 39

3.2 Etapa II – Padronização do hole board como um teste para se avaliar a mania ... 40

3.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania induzido por metilfenidato no hole board ... 49

DISCUSSÃO ... 56

CONCLUSÕES ... 64

(10)

RESUMO

O transtorno bipolar é caracterizado pela disfunção do humor, alternando entre episódios de mania/hipomania e depressão, e sua fisiopatologia exata ainda continua indeterminada. A farmacoterapia do transtorno bipolar baseia-se na prevenção dos episódios de mania e depressão através do uso de estabilizadores do humor. A nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) é um heptadecapeptídeo endógeno e agonista do receptor NOP, um receptor acoplado à proteína G do tipo inibitória. A N/OFQ e seu receptor desempenham uma série de papéis funcionais no organismo, e, entre eles, está a modulação de processos emocionais. Sabe-se que há alteração na concentração plasmática de N/OFQ em pacientes na fase depressiva e maníaca do transtorno bipolar e, por isso, presume-se que esse sistema teria algum papel na etiologia deste transtorno. Com relação à mania, os modelos animais utilizados na pesquisa tendem a focar em apenas um aspecto do quadro maníaco, como a hiperatividade ou agressividade. Nos anos 60, foi proposto o teste do hole board, aparato provido de furos onde prioritariamente se mede nos animais um comportamento conhecido como “imersão de cabeça” (head-dipping). Altos níveis de head-dippings podem ser indicativos de

neofilia, enquanto baixos níveis poderiam ser reflexo de um comportamento do tipo ansioso. Como o aumento do comportamento exploratório e direcionado a objetivos são sintomas característicos dos quadros maníacos, este teste poderia oferecer subsídios para a pesquisa deste transtorno. Deste modo, o presente trabalho foi dividido em 3 etapas e visa apresentar (1) a indução de um estado similar ao de mania promovido pela administração de ouabaína, um inibidor da enzima Na+/K+-ATPase, em camundongos no campo aberto; (2) a padronização do hole board como um teste para mensuração de comportamentos do tipo maníacos; e (3) a investigação do efeito da N/OFQ na prevenção destes comportamentos no hole board. Para o desenvolvimento deste estudo, foram usados camundongos Swiss machos que participaram de apenas uma das etapas descritas acima e receberam um ou mais dos seguintes tratamentos, de acordo com a etapa: (1) ouabaína, nas doses de 10-6, 10-5, 10-4, 10-3 ou 10-2 M, intracerebroventricular (icv); (2) valproato de sódio 300 mg/kg, intraperitoneal (ip); (3) valproato de sódio 400 mg/kg, ip; (4) diazepam 1 mg/kg, ip; (5) metilfenidato 10 mg/kg, ip; e (6) N/OFQ nas doses de 0,1 ou 1 nmol, icv. Os resultados sugerem que o hole board é um teste que pode ser usado para a avaliação de quadros maníacos, através da análise de vários comportamentos do animal. Entretanto, não foi possível padronizar o modelo da disfunção da enzima Na+/K+-ATPase induzido pela administração de ouabaína usando camundongos como sujeitos experimentais. Ainda, os dados sugerem que a N/OFQ, nas doses testadas, não é eficaz na prevenção de um quadro de mania. Tomados em conjunto, os resultados apontam para uma nova abordagem na pesquisa da mania, através do uso do hole board. Entretanto, mais estudos precisam ser feitos a fim de comprovar o envolvimento do sistema da nociceptina/orfanina FQ na ocorrência do transtorno bipolar.

(11)

ABSTRACT

Bipolar disorder is characterized by mood impairment, alternating between mania/hypomania and depression, and its exact pathophysiology is already unknown. The treatment of bipolar disorder is based on prevention of the manic and depressive episodes using mood stabilizers. Nociceptin/orfanin FQ (N/OFQ) is an endogenous heptadecapeptide which binds as an agonist to NOP receptor, which is a G-coupled inhibitory receptor. N/OFQ and its receptor modulate a lot of functions in the organism, including emotional processes. It is known that the plasmatic concentration of N/OFQ is altered in patients in both phases depressive and manic of bipolar disorder and it is assumed that this system has a role on the etiology of this disorder. Concerning mania, the animal models used in research tend to focus in an unique aspect of the manic behavior, as hyperactivity or agressivity. In the 60’s, the hole board test was proposed, and it consists of an apparatus with holes where a behavior known as head-dippings is measured. High levels of head-dippings are suggestive of neophilia, while low levels can be characteristic of an anxious-like behavior. As the increase of exploratory and goal-directed behavior are characteristics of manic behavior, this test could help in mania research. Thus, this work was organized in 3 steps and aims to: (1) investigate the induction of a manic-like state promoted by ouabain, a Na+/K+-ATPase inhibitor, in the mouse open field test; (2) set up the hole board as a test to measure manic-like behaviors; and (3) investigate the N/OFQ effects in prevention of this kind of behavior on hole board. Male Swiss mice were used in this study, and they take part of only one of the described steps. Depending on the step performed, mice received one or more of the following treatments: (1) ouabain 10-6, 10-5, 10-4, 10-3 or 10-2 M, intracerebroventricular (icv); (2) sodium valproate 300 mg/kg, intraperitoneal (ip); (3) sodium valproate 400 mg/kg, ip; (4) diazepam 1 mg/kg, ip; (5) methylphenidate 10 mg/kg, ip; and (6) N/OFQ 0,1 or 1 nmol, icv. The results suggest that hole board can be used to evaluate a manic state, through analysis of different animal behaviors. However, it was not possible to standard the model of Na+/K+-ATPase dysfunction through ouabain administration in mice. Moreover, the data suggest that N/OFQ, at the doses tested, has not affected the methylphenidate-induced mania-like behavior. Taken together, the results point to a new approach of manic research, through the hole board using. However, more studies are necessary in order to verify the role of N/OFQ system on bipolar disorder.

(12)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Esquema de tratamento adotado na etapa I... 36

Tabela 2. Esquema de tratamento adotado na etapa II... 36

Tabela 3. Esquema de tratamento adotado na etapa III... 37

Tabela 4. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg e

metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30

minutos de observação... 40

(13)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ

em rato, camundongo e humano (Adaptado de Mogil e Pasternak, 2001)... ₂₂

Figura 2. Foto de camundongo durante o teste do hole board... 35

Figura 3. Efeito do tratamento com ouabaína nas doses de 10-4, 10-5 e 10-6 M, por via intracerebroventricular, na distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30 minutos de observação... 39

Figura 4. Efeito do tratamento com metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1

ml/10g), por via intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do tabuleiro durante os 10 minutos de observação... 41

Figura 5. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1

ml/10g), por via intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do tabuleiro durante os 10 minutos de observação no hole board... 43

Figura 6. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com

valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na interação com os furos centrais (A) e periféricos (B) do tabuleiro efetuado por

camundongos durante 10 minutos de observação no hole board... ₄₄

valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância total percorrida (A) e no número de rearings efetuados (B) por

camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação... 45

(14)

Figura 9. Efeito do tratamento com diazepam na dose de 1 mg/kg (0,1 ml/10g),

por via intraperitoneal, nas interações com os furos do centro (A) e da periferia (B) do aparato durante os 10 minutos de observação no teste do hole

board... ₄₈ Figura 10. Efeito do tratamento com N/OFQ nas doses de 0.1 e 1 nmol, por via

intracerebroventricular, na quantidade de interações com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10 minutos de observação... 50

Figura 11. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg (0,1 ml/10g)

associado com N/OFQ nas doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na quantidade de interações dos camundongos com os furos no centro (A) e periferia (B) do tabuleiro no teste do hole board durante 10 minutos de observação... ₅₁

associado com N/OFQ nas doses de 0,1 e 1 nmol (2µl), por via intracerebroventricular, na distância total percorrida (A) e quantidade de

rearings (B) no teste do hole board durante 10 minutos de observação... 52

(15)

LISTA DE ABREVIATURAS

µl – microlitros

5-HT – serotonina

AMPc –adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico

AP – ântero-posterior

Ca2+ - íons cálcio

CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais

DV – dorso-ventral

GABA – ácido gama-aminobutírico

icv – intracerebroventricular

ip – intraperitoneal

K+ - íons potássio

M – molar

ML – médio-lateral

N/OFQ – nociceptina/orfanina FQ

nmol – nanomolar

NOP – receptor da nociceptina/orfanina FQ

ppn/OFQ - prepro-N/OFQ

(16)

SNC – sistema nervoso central

(17)

INTRODUÇÃO

1.1Transtorno bipolar

Os transtornos mentais, uma das classes de doenças mais prevalentes no mundo, são caracterizados pela presença de um padrão mental ou comportamental anormal que leva a estados de sofrimento e/ou incapacidade de realizar adequadamente algumas funções neurais, levando a prejuízos na vida social e no bem-estar. Uma pesquisa publicada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2001 revelou que aproximadamente 450 milhões de pessoas ao redor do mundo sofrem de algum tipo de transtorno mental, e que uma em cada quatro pessoas desenvolve alguma desordem do tipo durante a vida (World Health Organization 2001). Uma revisão de estudos feitos em 16 países da Europa e incluindo 150.000 sujeitos estimou que aproximadamente 27% da população adulta da União Europeia têm ou teve pelo menos um quadro de desordem mental nos 12 meses anteriores à pesquisa, e 1/3 apresenta mais de um transtorno. Os mais frequentes foram: transtornos de ansiedade, depressão e dependência de substâncias psicoativas (Wittchen & Jacobi 2005). Hoje em dia, presume-se que, em geral, os transtornos mentais seriam fruto da interação entre os sistemas neurotransmissores, componentes genéticos e o ambiente, como sugerido em vários estudos (Dani & Harris 2005; Strous & Shoenfeld 2006; Cannon & Keller 2006; Repetti et al. 2002).

(18)

todas as atividades diárias, além de sintomas como: alterações no apetite ou peso, sono e atividade psicomotora; diminuição da energia, sentimentos de desvalorização pessoal ou culpa, dificuldades em pensar, concentrar-se ou tomar decisões; pensamentos recorrentes de morte e planos ou tentativas suicidas (MacQueen et al. 2001; Townsend & Altshuler 2012, DSM-V, 2013). De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais em sua 5ª edição (DSM-V) (DSM-V, 2013), um episódio maníaco é caracterizado por humor eufórico ou irritável que ocorre concomitante com outros sintomas, como diminuição da necessidade de sono, loquacidade, sentimento de grandiosidade, distrabilidade, aumento de atividades direcionadas a um objetivo claro e envolvimento em comportamentos de risco (como promiscuidade, impulsividade, etc.).

Estima-se que a prevalência do transtorno bipolar durante a vida seja de aproximadamente 3,9%, com idade média de início aos 25 anos (Flaisher-Grinberg & Einat 2010). Em pessoas acima de 18 anos, a Organização Mundial da Saúde estimou a prevalência nos Estados Unidos para o transtorno bipolar de 0,8% para homens e 1% para mulheres (Ayuso-Mateos 2002; World Health Organization 2004).

(19)

1.2 Tratamento do Transtorno Bipolar

O paciente com diagnóstico de transtorno bipolar tem sua qualidade de vida afetada, em virtude dos impedimentos funcionais resultantes das alterações nos componentes afetivos, cognitivos, comportamentais e físicos. A capacidade de trabalho e socialização é reduzida ou até anulada. Por causa dessas alterações, existe um alto grau de morbidade para este transtorno, o que leva à necessidade de intervenção através da farmacoterapia (Barge-Schaapveld et al. 1999). A escolha do medicamento nos transtornos afetivos deve basear-se na apresentação mínima de efeitos adversos, para que ocorra boa adesão ao tratamento (Lam et al. 2009).

No caso do transtorno bipolar, a farmacoterapia baseia-se na prevenção dos episódios de mania e depressão através do uso de estabilizadores do humor, principalmente pela administração do cátion monovalente lítio ou de fármacos anticonvulsivantes, como ácido valpróico ou carbamazepina. Já com relação às crises, sejam elas maníacas ou depressivas, a politerapia é preconizada e são prescritos fármacos das seguintes classes: antipsicóticos atípicos, antidepressivos e benzodiazepínicos (Lafer et al., 2009; Matson et al. 2006; Sanches et al. 2010).

Vários sistemas de transdução de sinal e de receptores parecem estar envolvidos no mecanismo de ação do lítio. Sabe-se que a administração de lítio causa inibição das inositol monofosfatases, modulação de proteínas G e inibição de cascatas de transdução de sinal, como a da glicogênio sintetase quinase 3 (GSK3), mas nenhum dos mecanismos supracitados ainda foi totalmente creditado aos efeitos antimaníacos da droga (Stahl, 2008).

(20)

excreção, o que leva à necessidade de monitoramento periódico dos níveis séricos, mais frequentemente no início do tratamento ou quando as doses forem alteradas, ou ainda a qualquer momento, desde que haja indícios ou suspeita de intoxicação. Em decorrência dessa característica, a farmacoterapia com o lítio produz uma variedade de efeitos adversos, em especial relacionados ao sistema endócrino e renal (Lydiard & Gelenberg, 1982; Matson et al. 2006). Além disso, o lítio apresenta início de ação lento, efeito antimaníaco limitado e potencial teratogênico. Assim, a busca para substituir o uso do lítio tornou-se tema comum, e a utilização de outros medicamentos estabilizadores do humor tem sido colocada em prática pela comunidade científica. Dentre eles, estão a carbamazepina, cujo efeito antimaníaco é creditado ao bloqueio da atividade de canais de Na+ sensíveis à voltagem, e o ácido valpróico, que além do bloqueio de canais de Na+, também pode exercer ações através da facilitação da neurotransmissão GABAérgica e da inibição da atividade de segundos mensageiros (Stahl, 2008). Tanto a carbamazepina quanto o ácido valpróico são medicamentos originalmente usados para epilepsia, e que, em relação à mania, são menos eficazes que o lítio, além de compartilharem de seu perfil teratogênico. Outros aspectos destes medicamentos é que ambos levam à alteração do metabolismo de medicamentos em geral: a carbamazepina é um potente indutor de enzimas hepáticas, enquanto que o valproato atua como inibidor de algumas enzimas do citocromo P450, o que gera inúmeras interações medicamentosas (Rosa et al. 2009; Wilson et al. 1998).

(21)

natureza protéica, eles são menores que a maioria das proteínas, e sua estrutura terciária é menos complexa. Eles são providos de muito mais informações químicas e sítios de reconhecimento para os receptores que os neurotransmissores clássicos, o que leva a uma afinidade e seletividade ao receptor muito maior quando comparado a estes – os neuropeptídeos têm afinidade de ligação até 1000 vezes maior com o seu receptor que o visto para os neurotransmissores clássicos e seus respectivos receptores. Como conseqüência disso, apenas uma pequena quantidade de peptídeos é suficiente pra promover efeitos no organismo. Os neuropeptídeos se difundem através do organismo e ligam mais lentamente - porém mais fortemente - ao seu receptor que os neurotransmissores clássicos, e o complexo neuropeptídeo-receptor pode ser internalizado pelas células para causar dessenssibilização (Hökfelt et al. 2003).

1.3 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP

(22)

cauda. Reinscheid et al. (1995) isolaram este ligante endógeno de extrato de cérebro de porco e o denominaram de orfanina FQ, pois foi mostrado que este peptídeo interagia com um receptor órfão, por isso orfanina. Além disso, eles perceberam que na sequência aminoacídica deste peptídeo, os aminoácidos fenilalanina e glicina (abreviados pelas letras F e Q), estão localizados nas extremidades carboxi e amino terminal, respectivamente, daí o peptídeo se chamar orfanina FQ (figura 1).

A N/OFQ, assim como a maioria dos neuropeptídeos, é derivada da clivagem de um precursor maior, a prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), o qual já foi clonado a partir de ratos, camundongos e humanos (Meunier et al. 1995; Pan et al. 1996; Reinscheid et al. 2000) e cujo gene, nesta última espécie, foi localizado no cromossomo 8 (8p21) (Mollereau et al. 1996). A ppN/OFQ apresenta alta homologia entre as espécies animais supracitadas, com similaridade estrutural superior a 80%, e sua clivagem, além da N/OFQ, dá origem também a outros peptídeos bioativos, como por exemplo a nocistatina (Mogil & Pasternak 2001).

Figura 1. Estrutura da prepro-N/OFQ (ppN/OFQ), da nocistatina e da N/OFQ em rato, camundongo e

humano (Adaptado de Mogil & Pasternak, 2001).

(23)

reduz a entrada de Ca+2 e diminui a produção de AMPc (Connor et al. 1996; Vaughan & Christie 1996; Wu et al. 1997). Mesmo fazendo parte da família dos receptores opioides, devido inclusive à grande similaridade estrutural, o receptor NOP difere, do ponto de vista farmacológico, dos sistemas opioides clássicos. Nem os opioides, nem os seus antagonistas se ligam com alta afinidade ao receptor NOP (Mogil & Pasternak 2001). O receptor NOP possui alta expressão em diversas áreas do sistema nervoso central, em particular no prosencéfalo, sistema límbico e na medula espinhal, nos cornos dorsal e ventral. É densamente localizado nos núcleos serotoninérgicos, noradrenégicos e dopaminérgicos, como nos núcleos da rafe, locus coeruleus, núcleo do trato solitário, área tegmental ventral e substância nigra (Mollereau et al. 1994; Neal et al. 1999). Já o precursor da N/OFQ, a proteína pronociceptina, possui distribuição mais limitada em comparação ao receptor NOP. No cérebro de rato, transcritos do gene da pronociceptina foram encontrados em áreas envolvidas na transmissão ou modulação de estímulos nociceptivos, em núcleos pertencentes a outras vias sensoriais, incluindo aferências visuais e auditivas, no sistema límbico e núcleos hipotalâmicos (Boom et al. 1999). A N/OFQ e o seu receptor estão bem distribuídos em estruturas do sistema límbico envolvidas no processamento de estímulos emocionais, como: hipocampo, septo, núcleo do leito da estria terminal, banda diagonal de Broca, a habênula, o complexo amigdalóide e formação hipocampal (Mollereau & Mouledous 2000), o que dá suporte ao papel deste sistema na modulação de estados emocionais, como a ansiedade e depressão (Gavioli & Calo' 2006).

(24)

(Lambert 2008). A disponibilidade de ligantes seletivos do receptor NOP, sejam eles peptidérgicos (Calo’ et al. 2000; Calo' et al. 2002) ou não-peptidérgicos (Ozaki et al. 2000; Zaratin et al. 2004), permite a investigação do papel desempenhado pelo sistema endógeno N/OFQ-receptor NOP no controle de diferentes funções biológicas.

1.4 Sistema da Nociceptina/Orfanina FQ – Receptor NOP e transtornos afetivos

Estudos pré-clínicos mostram que antagonistas do receptor NOP, incluindo [Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2, J-113397, UFP-101 e SB-612111 possuem atividade do tipo antidepressiva em animais experimentais (Gavioli & Calo' 2006). De fato, estudos realizados em roedores tratados com antagonistas peptídicos do receptor NOP, como [Nphe1]N/OFQ(1-13)-NH2 e UFP-101, por via intracerebroventricular (icv) e submetidos a testes de desespero comportamental, como o teste de natação forçada e o teste de suspensão pela cauda, mostraram diminuição do tempo de imobilidade dos animais (Redrobe et al. 2002; Gavioli et al. 2003; Gavioli et al. 2004), mas a N/OFQ ou o agonista do receptor NOP Ro64-6198 (icv), não foram capazes de afetar o tempo de imobilidade nestes mesmos testes comportamentais (Gavioli et al. 2004; Goeldner et al. 2012). O antagonista UFP-101 também mostrou atividade do tipo antidepressiva em tratamento crônico por 21 dias (icv) no modelo de estresse crônico variável, restaurando o consumo de solução de sacarose, o equilíbrio na concentração de serotonina (5-HT) e nos níveis de cortisol sérico (Vitale et al. 2009). O trabalho de Vitale e colaboradores (2009) foi o único que conseguiu demonstrar que o bloqueio dos receptores NOP reverte parâmetros comportamentais, neuroquímicos e endócrinos relacionados à depressão experimental.

(25)

apresentavam comportamento do tipo antidepressivo, reforçando o papel exercido pelo sistema peptidérgico N/OFQ-receptor NOP na mediação da depressão experimental (Gavioli et al. 2003; Gavioli et al. 2004; Rizzi et al. 2011).

Já é sabido que a N/OFQ causa hipolocomoção em roedores de forma dose-dependente (Reinscheid et al. 1995). No entanto, em relação aos antagonistas NOP, não foi observada nenhuma alteração na locomoção espontânea. As doses administradas dos antagonistas que levavam à diminuição do tempo de imobilidade na natação forçada e teste de suspensão pela cauda não mostraram alteração de mobilidade no teste do campo aberto (Nishi et al. 1997; Redrobe et al. 2002; Gavioli et al. 2004), o que confere um comportamento genuíno do tipo antidepressivo induzido por antagonistas NOP.

(26)

modelos animais do transtorno bipolar, para investigar o potencial terapêutico dos ligantes do receptor NOP nesta psicopatologia.

1.5 Modelos Animais de Mania

Os modelos animais já provaram ser uma ferramenta vital para o estudo da neurobiologia e tratamento de vários transtornos neuropsiquiátricos. Contudo, o desenvolvimento de parâmetros a serem avaliados continua sendo um desafio. Como em todos os modelos animais de doenças psiquiátricas, é difícil inferir estados afetivos em roedores que mimetizem os sintomas clínicos e déficits cognitivos que caracterizam a psicopatologia em humanos. O modelo animal ideal para o estudo do transtorno bipolar seria aquele que incluiria comportamentos espontâneos e progressivos que oscilariam entre a manifestação de aumento e a redução de determinada conduta, mimetizando, assim, o comportamento humano nos episódios maníacos e depressivos. Este quadro observado nos animais deveria também normalizar por meio do tratamento crônico, porém não agudo, com estabilizadores do humor (Gavioli et al. 2009). Infelizmente, um modelo animal como o descrito acima, com alta validade aparente, preditiva e de construto, é muito difícil de reproduzir em laboratório.

(27)

aspectos da depressão, contribuem pouco para a natureza recorrente do transtorno bipolar (Redrobe & Bourin 1999; Prica et al. 2008).

Os modelos de mania atualmente disponíveis foram desenvolvidos baseando-se, principalmente, em três abordagens: farmacológica, comportamental e genética. Os modelos de mania com abordagem farmacológica baseiam-se no fato de que o aumento da concentração sináptica de dopamina, decorrente da administração de fármacos psicoestimulantes, causa aumento da atividade locomotora, que é revertida pela administração de fármacos estabilizadores do humor. Já a abordagem comportamental envolve a análise do comportamento espontâneo do animal ou, ainda, após manipulação experimental, a qual promove alteração no comportamento de base, como no caso dos animais privados de sono. Finalmente, os modelos com abordagem genética visam à criação de animais com traços específicos de determinada patologia ou que sofreram manipulação genética em genes tidos como responsáveis pela etiologia do transtorno (para revisão: Gavioli et al., 2009), como, por exemplo, o caso dos camundongos que não expressam os genes clock (Mukherjee et al. 2010). Atualmente, os modelos mais utilizados para estudar a mania são: modelo de hiperatividade induzida por psicoestimulantes, modelo da disfunção da enzima Na+/K+-ATPase, utilizando um inibidor específico dessa enzima, como a ouabaína; e modelo da privação do sono (Herman et al. 2007; Young et al. 2011).

(28)

na atividade da bomba de sódio (Looney & El-Mallakh 1997). Além disso, os cérebros de indivíduos portadores de transtorno bipolar podem expressar menores níveis da subunidade alfa-2 da bomba de sódio (Rose et al. 1998).

A ouabaína, um potente inibidor da bomba de sódio, é uma substância já consolidada como indutora de um estado similar ao de mania em ratos, tendo sido empregada em vários estudos (El-Mallakh et al. 2003; Herman et al. 2007; Riegel et al. 2009). Contudo, ainda não existe um protocolo para a indução de um estado de mania induzido por ouabaína em camundongos. Do ponto de vista da pesquisa, o uso de camundongos é mais viável para alguns laboratórios, pois apresentam menor custo de manutenção, sendo animais muito prolíferos e que não ocupam tanto espaço quanto os ratos, daí a importância de se padronizar um modelo experimental utilizando esse animal.

Os episódios de mania são também marcados por uma variedade de sintomas, incluindo grandiosidade e verborragia, que são extremamente difíceis de inferir a partir do comportamento de roedores. Por isso, o aumento da atividade motora continua sendo o parâmetro comportamental mais avaliado pelos modelos animais. Contudo, cabe ressaltar que a hiperlocomoção dos roedores não é exclusividade dos modelos de mania, sendo este mesmo comportamento também aferido em modelos animais para outros transtornos psiquiátricos, como esquizofrenia e transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) (Young et al. 2011). Portanto, a busca por modelos de mania que avaliam comportamentos específicos e que apresentem validade aparente, preditiva e de construto são imprescindíveis para o estudo da fisiopatologia do transtorno bipolar.

(29)

um modelo ideal de mania seja baseado na avaliação de comportamentos relacionados a estes sintomas. Já sintomas como hipersexualidade e religiosidade são menos frequentes nos pacientes em mania (40-50% dos casos) (Goodwin & Jamison 2007).

Um outro sintoma encontrado nos quadros de mania é o aumento do vigor e dos comportamentos direcionados a um objetivo específico (socialmente, no trabalho, na escola ou sexualmente) (DSM-V, 2013), e tem-se sugerido que a sua ocorrência estaria associada a uma hiperatividade do sistema dopaminérgico (Cousins et al. 2009).

Dada a variedade de sintomas apresentados pelos pacientes na fase de mania e a dificuldade de se obter um modelo que englobe todos os aspectos da doença, uma possível abordagem a ser utilizada na pesquisa seria o uso de vários modelos em uma bateria de testes, de modo a avaliar os diversos comportamentos indicativos de mania para que, assim, se consiga fazer uma completa caracterização deste quadro em animais. Deste modo, modelos que apresentam validade aparente de maneira parcial (como o modelo de hiperlocomoção induzida por psicoestimulantes ou o modelo do residente-intruso, por exemplo), quando combinados, podem levar a uma caracterização muito mais confiável do real estado do animal.

Nos anos 60, foi proposto o teste do hole board, aparato que consiste em uma arena com buracos no piso, nos quais o animal pode introduzir a cabeça, comportamento conhecido como “imersão de cabeça” (head-dipping) (File & Wardill

1975b; File & Wardill 1975a). A frequência e duração dos head-dippings são tidas como medidas de neofilia ou exploração direcionada que são independentes da atividade locomotora geral do animal (File & Wardill 1975b; Ljungberg & Ungerstedt 1976) e, de fato, existem estudos mostrando que a locomoção e a quantidade de

head-dippings podem variar independentemente entre si (Abel 1995; Durcan & Lister 1989).

(30)

enquanto baixos níveis podem ser resultado de falta de neofilia ou, ainda, reflexo de um comportamento do tipo ansioso por parte do animal (Crawley 1985; Takeda et al. 1998), motivo pelo qual este teste tem sido usado largamente na pesquisa de substâncias ansiolíticas.

Como o aumento do comportamento exploratório e direcionado a objetivos são sintomas característicos dos quadros maníacos, o uso do hole board poderia ser cotado como um novo modelo animal para a pesquisa de mania, fornecendo informações sobre esses tipos de comportamentos através da medida da interação do animal com os furos do aparato que, em conjunto com outros aspectos demonstrados durante o teste, formassem um quadro característico de mania que poderia ser prevenido pelo tratamento com estabilizadores do humor.

(31)

METODOLOGIA

2.1 Animais

Foram empregados camundongos Swiss machos (25-30 g) provenientes do biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os animais foram alojados em, no máximo, quinze por caixa (40 x 33 x 17 cm), com livre acesso a comida e água, e mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 horas (6:00-18:00 h), a uma temperatura ambiente de 23°C  1oC. Todos os procedimentos experimentais foram executados de acordo com as recomendações da Lei nº 11.794 de 08/10/2008 (Lei Arouca) e foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Protocolo nº 040/2012; 041/2014).

2.2 Drogas e tratamentos

Para este estudo, foi utilizado o agonista peptídico do receptor NOP, a N/OFQ, doado pelo Prof. R. Guerrini (Dept. of Biotechnology and Pharmaceutical Chemistry, University of Ferrara, Itália). O peptídeo foi diluído em solução salina e mantido a 20ºC em solução estoque. Imediatamente antes do teste, uma alíquota de solução estoque foi diluída em salina para se chegar à dose desejada, que foi administrada por via icv no volume de 2µl.

Na etapa que objetivou verificar o efeito de um ansiolítico clássico no hole

(32)

mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, diluído em solução salina. O grupo controle recebeu apenas solução salina pela mesma via de administração.

Para a indução de um estado similar ao de mania induzido por ouabaína em camundongos, foram avaliados os efeitos comportamentais das seguintes concentrações: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6 M de ouabaína (Sigma-Aldrich), diluída em solução salina e injetada por via intracerebroventricular (icv), no volume de 2 µl. Os animais controle foram tratados com solução salina pela mesma via de administração.

Para a padronização do modelo do hole board, foi feita a indução de um estado de mania nos animais através da administração de metilfenidato (Ritalina®, Novartis) na dose de 10 mg/kg, 15 minutos antes do teste. A escolha desta droga justifica-se pelo fato de que a hiperatividade induzida por anfetamínicos é considerada o padrão-ouro para indução de mania em roedores (Berggren et al. 1978; Gould et al. 2001), ainda que as alterações comportamentais induzidas em animais não sejam exatamente as mesmas apresentadas por humanos quando na fase de mania (Silverstone et al. 1998). Para a avaliação da prevenção dos sintomas de mania, foi utilizado o valproato de sódio (Valpakine®, Sanofi Aventis) na dose de 300 mg/kg, e o mesmo foi administrado 45 minutos antes do teste (30 minutos previamente à administração de metilfenidato) por via intraperitoneal. Solução salina foi usada como controle, assim como meio de diluição de ambas as drogas.

2.3 Cirurgia para a implantação da cânula intracerebroventricular em

camundongos

(33)

um aparelho estereotáxico. A pele da região craniana foi removida para facilitar a visualização do bregma, que serviu de ponto de partida para a orientação das coordenadas. Uma cânula-guia de 8 mm foi implantada unilateralmente no ventrículo lateral (VL) de acordo com as seguintes coordenadas: AP 0.6 mm; ML ±1.1 mm; DV -1.0 mm. A cânula foi fixada com acrílico e pontos foram aplicados a fim de fechar a incisão. Todo o procedimento foi executado sob condições de higiene e o local da incisão foi tratado com o agente antisséptico iodo-povidine. Logo após o procedimento cirúrgico, os animais receberam uma injeção do anti-inflamatório diclofenaco sódico (10 mg/kg, uma dose por via subcutânea) e do antibiótico oxitetraciclina (2 mg/kg, intramuscular), a fim de evitar infecções e atenuar a dor causada pelo procedimento.

(34)

2.4 Testes comportamentais

2.4.1 Campo aberto

Os camundongos foram submetidos ao teste do campo aberto 5 minutos após a administração da ouabaína, por via icv, e permaneceram no aparelho por 30 minutos, sendo este período dividido em blocos de 5 minutos cada. Este teste foi realizado em uma caixa de fórmica quadrada medindo 40 cm x 40 cm e cercada por paredes de 40 cm de altura. Os animais foram submetidos individualmente a 30 minutos de exploração do aparelho e, durante este período, foram avaliados pelo video tracking AnyMaze

(Stoelting Co., Wood Dale, IL, USA) quanto aos seguintes parâmetros

comportamentais: distância percorrida pelo animal (em metros) e tempo de imobilidade (em segundos).

2.4.2 Hole board

Os animais foram postos no centro de um tabuleiro medindo 40 cm x 40 cm e

cercado por paredes de 35 cm de altura. O tabuleiro conta com 16 furos de 3 cm de

diâmetro, sendo 4 centrais e 12 periféricos, e está suspenso a 5 cm do chão. Para a

execução deste teste, os animais foram avaliados por 10 minutos. Durante esse tempo,

foram medidos parâmetros como a distância total percorrida, distância percorrida no

centro e tempo no centro através do software AnyMaze (Stoelting Co., Wood Dale, IL,

USA). Após os experimentos, os vídeos foram avaliados por um observador quanto ao

número de interações com os furos no tabuleiro e cálculo da porcentagem da distância

(35)

percorrida no centro dividida pela distância total percorrida e o resultado foi

multiplicado por 100). Considera-se interação tanto quando o animal examina o furo,

quanto quando ele imerge a cabeça dentro deste pelo tempo mínimo de

aproximadamente 1 segundo. Foi registrado o número de interações com os furos

centrais e periféricos. Nas situações em que o animal interagiu com um furo, retirou a

cabeça e voltou a interagir com o mesmo em até 3 segundos, registrou-se apenas uma

interação. Além disso, foi medida a frequência de levantamento de patas dianteiras

(rearings), tanto no tabuleiro quanto nas paredes do aparato. Os animais que porventura

acessaram a parte de baixo do tabuleiro por algum buraco e passaram mais de 2 minutos

fora do alcance da câmera foram excluídos do teste (aproximadamente 7% dos animais

testados).

2.5 Desenho experimental

2.5.1.Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania induzido pela

administração de ouabaína em camundongos

A ouabaína foi administrada nas seguintes concentrações: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 e 10-6 M, por via intracerebroventricular (2 µl). A administração foi feita através da cânula previamente implantada no ventrículo lateral. Cinco minutos após a

Figura 2. Foto de camundongo

(36)

administração da ouabaína, a atividade locomotora do animal foi medida no teste do campo aberto por 30 minutos. A tabela abaixo ilustra os tratamentos da etapa I:

Tabela 1 – Esquema de tratamento adotado na etapa I

Grupo Número de

animais Tratamento icv Volume

A 6-12 Salina

2 μL B 6-12 Ouabaína 10-2M

C 6-12 Ouabaína 10-3M D 6-12 Ouabaína 10-4 M E 6-12 Ouabaína 10-5 M F 6-12 Ouabaína 10-6 M

2.5.2 Etapa II – Padronização do hole board como um modelo para se avaliar

a mania

Quinze minutos após a administração de salina ou metilfenidato na dose de 10 mg/kg, os animais foram submetidos ao hole board por 10 minutos. Após a caracterização do comportamento animal decorrente da administração de metilfenidato neste modelo, o mesmo foi validado através da utilização de valproato de sódio (300 ou 400 mg/kg, ip), um estabilizador do humor. Para isso, os animais foram pré-tratados com valproato de sódio e, após 30 minutos, foi administrado o metilfenidato, ambos por via intraperitoneal. Após 15 minutos, os animais foram submetidos ao hole board, onde ficaram por 10 minutos. A tabela abaixo ilustra os tratamentos da etapa 2:

Tabela 2 – Esquema de tratamento adotado na etapa II:

animais

Pré-tratamento ip

Dose (volume)

Tratamento ip

A 6-12 Controle (0,1 ml/10 g) Controle (0,1

(37)

B 6-12 Controle (0,1 ml/10 g) Metilfenidato

10 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

C 6-12 Valproato de

sódio

300 mg/kg

(0,1 ml/10 g) Controle

(0,1 ml/10 g)

D 6-12 Valproato de

sódio

300 mg/kg (0,1 ml/10 g)

Metilfenidato

10 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

E 6-12 Valproato de

sódio

400 mg/kg

(0,1 ml/10 g) Controle

(0,1 ml/10 g)

F 6-12 Valproato de

sódio

400 mg/kg (0,1 ml/10 g)

Metilfenidato

10 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

2.5.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do

receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania

induzido por metilfenidato no hole board

Visando avaliar o efeito do tratamento com o agonista do receptor NOP, a N/OFQ, no comportamento de camundongos no hole board, uma cânula foi implantada no ventrículo lateral dos animais. Após 3 a 5 dias, os mesmos foram pré-tratados com salina ou N/OFQ nas doses de 0,1 ou 1 nmol (2 μL) e, 5 minutos depois, tratados com

metilfenidato (10 mg/kg) ou salina. Após 15 minutos, os animais foram expostos ao teste do hole board durante 10 min. O desenho experimental se desenvolveu de acordo com a tabela abaixo:

Tabela 3 – Esquema de tratamento adotado na etapa III:

animais

Pré-tratamento icv

Tratamento ip

A 6-12 Controle (2 μL) Controle (0,1

(38)

B 6-12 Controle (2 μL) Metilfenidato

10 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

C 6-12 N/OFQ 0,1 ou 1 nmol_{(2 μL)} Controle (0,1

ml/10 g)

D 6-12 N/OFQ 0,1 ou 1 nmol _{(2 μL)} Metilfenidato

10 mg/kg

(0,1 ml/10 g)

2.6 Análise estatística

(39)

RESULTADOS

3.1 Etapa I – Indução de um estado similar ao de mania promovido pela administração de ouabaína em camundongos

A figura 3 ilustra o efeito do tratamento icv com ouabaína, em concentrações crescentes, no desempenho locomotor de camundongos submetidos ao teste do campo aberto durante 30 minutos de observação.

Ouabaína icv

0-5

min

5-10

min

10-15

min

15-20

min

20-25

min

25-30

min

5 10 15 20 25

ouabaína 10-6 M ouabaína 10-5 M salina

ouabaína 10-4 M

Di

s

tâ

n

c

ia

(

m

)

Figura 3. Efeito do tratamento com ouabaína nas concentrações de 10-6, 10-5 e 10-4 M, por via intracerebroventricular, na distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30 minutos de observação. A dose de 10-2 M causou morte dos animais, enquanto a de 10-3 M causou um estado de pré-convulsão (dados não mostrados). As barras representam a média  erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais.

(40)

3.2 Etapa II – Padronização do hole board como um teste para se avaliar a mania

Como um estágio prévio a esta etapa, foi realizada uma análise da atividade locomotora espontânea dos animais, de modo a mensurar se os tratamentos, per se, produziam algum efeito nesta função. Para isso, os animais passaram pelo teste do campo aberto por 30 minutos, onde foram avaliados os parâmetros distância percorrida e tempo de imobilidade. Os resultados encontram-se na tabela abaixo:

Tabela 4. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg e metilfenidato na dose de

10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância percorrida por camundongos no teste do campo aberto durante 30 minutos de observação. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato 10 mg/kg. ANOVA de uma via seguida do teste de Newman-Keuls.

Grupos

(0,1 ml/10g – via i.p.)

Distância percorrida (m) Média±erro padrão

Tempo de imobilidade (s) Média±erro padrão

Controle 46,74±5,67 1045,17±64,49

Valproato 300 mg/kg 70,08±14,37* 1095,38±137,58

Valproato 400 mg/kg 43,66±5,73 1161,28±117,04*

Metilfenidato 10 mg/kg 175,04±19,69* 231,28±50,33* Valproato 300 mg/kg +

Metilfenidato 10 mg/kg 242,36±13,69

*#

129,98±46,10*# Valproato 400 mg/kg +

Metilfenidato 10 mg/kg 104,75±11,05

*#

810,12±109,41*#

Como demonstrado na tabela acima, apenas a dose de 400 mg/kg de valproato foi capaz de prevenir o efeito hiperlocomotor causado pela administração de metilfenidato 10 mg/kg. Contrariamente, o valproato na dose 300 mg/kg potencializou o efeito do metilfenidato na hiperlocomoção e redução do tempo de imobilidade dos animais.

(41)

A figura 4 mostra a quantidade de interações dos animais nos furos do centro (A) e na periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste. O grupo tratado com metilfenidato 10 mg/kg apresentou uma quantidade significativamente maior de interações com os furos centrais e periféricos que o controle. 0 10 20 30 40 controle

metilfenidato 10 mg/kg

* N º d e i n te ra ç õ e s n o c e n tr o 0 -1 0 m in 0 20 40 60 80 100 * N º d e i n te ra ç õ e s n a p e ri fe ri a 0 -1 0 m in 0 10 20 30 40 *** D is tâ n c ia t o ta l p e rc o rr id a ( m ) 0 -1 0 m in 0 10 20 30 * N º d e r e a ri n g s 0 -1 0 m in 0 5 10 15 20 Di s tâ n c ia p e rc o rr id a n o c e n tr o ( % ) 0 -1 0 m in 0 10 20 30 40 50 60 T e m p o g a s to n o c e n tr o ( s ) 0 -1 0 m in

A) B)

C) D)

(42)

Figura 4. Efeito do tratamento com metilfenidato na dose de 10 mg/kg (0,1 ml/10g), por via

intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do tabuleiro durante os 10 minutos de observação. As barras representam a média  erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. ***p≤0,001 vs. controle; *p≤0,05 vs. controle. Student teste T independente.

Observando os gráficos, podemos inferir que o grupo tratado com metilfenidato 10 mg/kg apresentou uma quantidade significativamente maior de interações com os furos centrais (A) e periféricos (B) que o controle. Com relação à distância total percorrida (C), o metilfenidato foi capaz de aumentar significativamente a locomoção dos animais, enquanto reduziu significativamente a quantidade de rearings (D), sinalizando que, ao contrário da atividade exploratória horizontal, o metilfenidato provoca uma diminuição da atividade exploratória vertical. Em (E), podemos ver a porcentagem da distância percorrida no centro em relação à distância total percorrida pelos animais dos grupos controle e metilfenidato e em (F), o tempo gasto no centro pelos animais. Nos dois parâmetros, a diferença entre os grupos não foi significativa, embora haja uma tendência ao aumento no tempo gasto no centro pelos animais tratados com metilfenidato (p=0,09).

(43)

0 10 20 30

salina

valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg

* N º d e i n te ra ç õ e s n o c e n tr o 0 -1 0 m in 0 20 40 60 80 100 * N º d e i n te ra ç õ e s n a p e ri fe ri a 0 -1 0 m in 0 10 20 30 40 * D Is tâ n c ia t o ta l p e rc o rr id a (m ) 0 -1 0 m in 0 10 20 30 40 50 * N º d e r e a ri n g s 0 -1 0 m in 0 5 10 15 Di s tâ n c ia p e rc o rr id a n o c e n tr o ( % ) 0 -1 0 m in 0 20 40 60 * T e m p o g a s to n o c e n tr o (s ) 0 -1 0 m in

Figura 5. Efeito do tratamento com valproato nas doses de 300 e 400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via

intraperitoneal, na quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) do tabuleiro durante os 10 minutos de observação no hole board. As barras representam a média  erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle. ANOVA de uma via seguida do teste de Newman-Keuls.

Podemos notar que a dose de 400 mg/kg reduziu significativamente as interações com os furos (A) centrais (F(2,37) = 5,29) e (B) periféricos (F(2,37) = 6,88) do

tabuleiro. Assim como demonstrado no teste do campo aberto, o valproato na dose de

A) B)

C) D)

(44)

300 mg/kg aumentou significativamente a locomoção total (C) dos animais no hole

board (F(2,37) = 16,48). Também houve um aumento significativo com relação ao

número de rearings efetuados (D) pelos animais (F(2,37) = 76,00). Não foram

encontradas diferenças entre os grupos com relação à porcentagem da distância percorrida no centro em relação à distância total (E), porém, com relação ao tempo gasto no centro (F), tal parâmetro foi significativamente reduzido pelo tratamento com valproato 400 mg/kg (F(2,37) = 3,80).

Feitas as caracterizações do perfil do metilfenidato e valproato no hole board, a próxima etapa foi testar o efeito da associação entre essas duas substâncias, a fim de saber se a administração prévia de valproato ao metilfenidato seria capaz de prevenir as alterações comportamentais causadas pelo mesmo nos animais.

A figura 6 mostra a quantidade de interações com os furos do centro (A) e da periferia (B) do tabuleiro durante os 10 minutos de observação. A associação do metilfenidato 10 mg/kg com o valproato, nas duas doses, foi capaz de prevenir o aumento na interação com os furos centrais provocados pelo metilfenidato (ANOVA de duas vias, pré-tratamento com valproato: F(2,64) = 5,01, p≤0,05; tratamento com

metilfenidato: F(1,64) = 5,72, p≤0,05). Ao contrário, com relação à quantidade de

interações com os furos periféricos, a associação do metilfenidato 10 mg/kg com o valproato, nas duas doses, apresentou resultado semelhante ao grupo metilfenidato 10 mg/kg + controle.

controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg

0 10 20 30 40

50 _controle

metilfenidato 10 mg/kg *

# _#

Pré-tratamentos

Nº

d

e

i

n

te

ra

ç

õ

e

s

n

o

c

e

n

tr

o

0

-1

0

m

in

(45)

controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg 0 20 40 60 80 100 controle

metilfenidato 10 mg/kg * Pré-tratamentos Nº d e i n te ra ç õ e s n a p e ri fe ri a 0 -1 0 m in

Figura 6. Efeito do tratamento com metilfenidato 10 mg/kg associado com valproato nas doses de 300 e

400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na interação com os furos centrais (A) e periféricos (B) do tabuleiro efetuado por camundongos durante 10 minutos de observação no hole board. As barras representam a média  erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *_p_≤_{0,05 vs.} controle + controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

A figura 7 mostra a distância total percorrida (A) e o número de rearings (B) efetuados pelos animais no hole board durante os 10 minutos de teste. Em (A), percebe-se que a associação metilfenidato 10 mg/kg + valproato, nas duas doses testadas, tem resultado significativamente maior do que a associação metilfenidato 10 mg/kg + controle.

Já quanto ao número de rearings, o grupo tratado com a dose de 10 mg/kg de metilfenidato não demonstrou uma redução significativa na quantidade destes, enquanto que o tratamento com valproato, nas duas doses, foi capaz de restabelecer a atividade exploratória vertical dos animais reduzida pelo tratamento com metilfenidato (ANOVA de duas vias, pré-tratamento com valproato: F(2,64) = 10,44, p≤0,05).

0 20 40 60 80 controle

(46)

0 20 40

60 controle

# #

Pré-tratamentos

Nº

d

e

r

e

a

ri

n

g

s

0

-1

0

m

in

400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância total percorrida (A) e no número de rearings efetuados (B) por camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras representam a média  erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. ***_p_≤_{0,001 vs.} controle + controle; ###p≤0,001 vs. metilfenidato + controle; #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

A figura 8 mostra a porcentagem da distância percorrida no centro em relação à distância total percorrida (A) e o tempo gasto no centro do tabuleiro (B) pelos animais no hole board durante os 10 minutos de teste. O metilfenidato aumentou significativamente a distância percorrida no centro do aparato. O pré-tratamento com valproato na dose de 300 mg/kg preveniu significativamente o aumento da porcentagem de tempo gasto no centro induzido pelo metilfenidato (ANOVA de duas vias, pré-tratamento com valproato: F(2,64) = 3,08, p≤0,05), e tal efeito também tende a ser

prevenido pelo pré-tratamento com a dose de 400 mg/kg (p=0,07).

Quanto ao tempo gasto no centro do tabuleiro, não houve diferença entre nenhum dos grupos testados, embora haja uma tendência, novamente, que o grupo controle + metilfenidato seja significativamente diferente do grupo controle + controle (p=0,06).

(47)

controle valproato 300 mg/kg valproato 400 mg/kg 0 5 10 15 20 25 controle

# * * Pré-tratamentos Di s tâ n c ia p e rc o rr id a n o c e n tro ( % ) 0 -1 0 m in

0 20 40 60 80 100 controle

Pré-tratamentos T e m p o g a s to n o c e n tr o ( s ) 0 -1 0 m in

400 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal, na distância percorrida (A) e no tempo gasto (B) no centro do tabuleiro por camundongos no teste do hole board durante 10 minutos de observação. As barras representam a média  erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *_p_≤_{0,05 vs.} controle + controle e #p≤0,05 vs. metilfenidato + controle. ANOVA de duas vias seguida do teste de LSD.

Devido a um efeito ansiolítico já descrito na literatura para o valproato, e levando em conta os resultados encontrados, onde a dose de 300 mg/kg foi capaz de aumentar a atividade exploratória tanto horizontal quanto vertical dos animais sem afetar o número de interações com os buracos do tabuleiro, foi incluído no estudo um grupo experimental tratado com diazepam 1 mg/kg (0,1 ml/10g), um fármaco ansiolítico clássico, a fim de avaliar o efeito deste tratamento no comportamento dos animais no

hole board e servir de comparação para os demais grupos aqui estudados.

A figura 9 mostra a quantidade de interações dos animais nos furos do centro (A) e periferia (B), a distância total percorrida (C), quantidade de rearings (D), distância

A)

(48)

percorrida no centro (E) e tempo no centro (F) durante os 10 minutos de teste pelos animais tratados com diazepam em comparação ao grupo controle.

0 5 10 15 20 25 salina

diazepam 1 mg/kg

N º d e i n te ra ç õ e s n o c e n tr o 0 -1 0 m in 0 20 40 60 80 100 * N º d e i n te ra ç õ e s n a p e ri fe ri a 0 -1 0 m in 0 5 10 15 20 25 * D is tâ n c ia t o ta l p e rc o rr id a ( m ) 0 -1 0 m in 0 5 10 15 N º d e r e a ri n g s 0 -1 0 m in 0 5 10 15 20 Di s tâ n c ia p e rc o rr id a n o c e n tr o ( % ) 0 -1 0 m in 0 10 20 30 40 50 60 ** T e m p o g a s to n o c e n tr o ( s ) 0 -1 0 m in

Figura 9. Efeito do tratamento com diazepam na dose de 1 mg/kg (0,1 ml/10g), por via intraperitoneal,

nas interações com os furos do centro (A) e da periferia (B) do aparato durante os 10 minutos de observação no teste do hole board. As barras representam a média  erro padrão da média. Cada grupo é constituído por 6-12 animais. *p≤0,05 vs. controle; **p≤0,01 vs. controle. Student teste T independente.

Como podemos ver no gráfico, o tratamento com diazepam foi incapaz de modificar a quantidade de interações com os furos centrais (A), ao passo que aumentou

A) B)

C) D)

(49)

significativamente a quantidade de interações com os furos da periferia (B). Em (C), podemos ver a atividade exploratória horizontal, mensurada pela distância total percorrida e em (D), a vertical, mensurada pela quantidade de rearings. Como já esperado, devido ao seu efeito ansiolítico, o diazepam foi capaz de aumentar significativamente a locomoção dos animais, enquanto que, com relação ao número de

rearings, não houve diferenças entre os grupos. Em (E), podemos ver a porcentagem da

distância percorrida no centro em relação à distância total percorrida, onde nota-se que não houve mudança de perfil do animal em decorrência da administração de diazepam e, em (F), o tempo gasto no centro do tabuleiro do hole board pelos animais, que foi significativamente aumentado no grupo que recebeu diazepam em relação ao controle.

3.3 Etapa III – Avaliação dos efeitos comportamentais de um agonista do receptor NOP em camundongos submetidos ao modelo animal de mania induzido por

metilfenidato no hole board

Para a avaliação dos efeitos do peptídeo nociceptina/orfanina FQ (N/OFQ) em animais submetidos ao hole board, foi seguido o mesmo protocolo da etapa II, apenas substituindo-se a administração ip de valproato pela administração icv do peptídeo nas doses testadas.

Primeiramente foi feita a caracterização do perfil apresentado pelos animais após a injeção da N/OFQ. As doses testadas foram as de 1 e 0,1 nmol, por via icv (2µl).