Expressão da proteína Ras em células endoteliais é dependente de S indecam-4.

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RENAN PELLUZZI CAVALHEIRO

EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RAS EM CÉLULAS

ENDOTELIAIS É DEPENDENTE DE SINDECAM-4

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Biologia Molecular.

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CAVALHEIRO, Renan Pelluzzi

Expressão da proteína Ras em células endoteliais é depente de sindecam-4. São Paulo, 2009. 81p.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina.

1.Proteoglicanos 2.Sindecam-4 3.Oncogene EJ-ras

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Tese preparada no Departamento de Bioquímica durante o Curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular e apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestrado em Biologia Molecular.

Orientadora: Profª Drª Helena Bonciani Nader Co-Orientadora: Profª Drª Carla Cristina

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AGRADECIMENTOS

À minha co-orientadora Dra. Carla Cristina Lopes de Azevedo por ter me recebido de braços abertos, sou grato por ter me guiado nos meus primeiros passos na pesquisa dentro deste laboratório.

À Dra. Juliana Dreyfuss pelo total apoio no desenvolvimento deste trabalho, desde a realização dos experimentos, como na elaboração desta tese.

Ao Dr. Edgar Paredes-Gamero, pela paciência e ajuda nos experimentos de citometria de fluxo.

O respeito e a admiração a todos os professores, Dra. Yara M. Michelacci, Dra. Leny Toma, Dr. Edvaldo da Silva Trindade, Dra. Marimélia A. Porcionatto, Dra. Aparecida Pinhal, Dr. Ivarne L. S. Tersariol, Dra. Gisele Zenker, Dra. Luciana Vasquez, por contribuírem na formação dos meus conhecimentos dentro da ciência.

Às técnicas Elsa Y. Kobayashi, Isabel A. N. Santos e Aline Mendes pelos ensinamentos a mim dedicados, desde a minha iniciação científica até os dias de hoje.

Aos amigos, Thais, Duda, Tarsis, Marcelo, Camila, Rodrigo, Gabriel, Diego (Popó) e Ana Isabel, pela descontração no dia a dia do trabalho no sexto andar, levando sempre com seriedade o trabalho em grupo.

Aos amigos do quinto e quarto andar, Vivien, Carolzinha, Ivete, Carol de Olinda Clarice, Eloah, Itatiana, Therése, Valquíria, Juliana Dominato, Patrícia, Clélia, Ritccheli, Cris, Daniel, Giovani, Ricardinho, Dani, Cileni, Jair, Rafael, Gioconda, Thais Aguilar, Renata, Daiana, Zaiane, Ana, Lívia, e Marceli, é um prazer trabalhar e conviver com todos vocês neste laboratório.

Às meninas da limpeza, em especial à Rosana e a Fran, por manter todo o laboratório limpo e em ótimo estado de trabalho, admiro muito a garra de vocês.

Ao CNPQ pela bolsa de estudos e pelos recursos oferecidos para elaboração deste trabalho.

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ÍNDICE GERAL

I. Introdução ... 1

1. Sinalização celular ... 1

2. Matriz extracelular e integrina ... 3

3. Glicosaminoglicanos...5

4. Heparam sulfato...9

5. Proteoglicanos...11

6. Família dos sindecans...14

7. Sindecam-4...15

8. Biglicam...18

9. Células endoteliais...19

10. RNA de interferência...20

10.1. Contexto Histórico...20

10.2. Mecanismos de ação do silenciamento gênico...21

10.3. Estratégias de silenciamento gênico...22

II. Objetivos...25

III. Materiais e métodos ... 26

1. Materiais ... 26

1.1. Linhagem celular...26

1.2. Meios de cultura e outras soluções...26

1.3. Enzimas...26

1.4. Anticorpos...27

1.5. Radioisótopo...27

1.6. Reagentes e materiais de biologia molecular...27

1.7. Outros materiais...28

1.8. Equipamentos...29

2.Métodos...30

2.1. Manutenção da cultura de células...30

2.2. RNA de interferência...30

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2.2.2. Anelamento dos oligonucleotídeos e construção do vetor...31

2.2.3.Transformação e clonagem em Escherichia coli...31

2.2.4. Transfecção com lipossomas...32

2.2.5. Seleção dos clones...33

2.3. Marcação metabólica dos glicosaminoglicanos sulfatados com [35S]-sulfato e separação dos compartimentos celulares...34

2.4. Extração de glicosaminoglicanos sulfatados...34

2.5. Métodos analíticos...34

2.5.1. Eletroforese em gel de agarose...34

2.6. Quantificação dos glicosaminoglicanos marcados metabolicamente...35

2.7. Imunofluorescência...36

2.7.1. Marcações de componentes de superfície celular e de matriz extracelular...36

2.7.2. Marcações de componentes intracelulares...36

2.7.3. Incubação com anticorpo secundário...37

2.7.4. Coloração do núcleo...37

2.7.5. Montagem e visualização das lâminas...37

2.8. Citometria de fluxo...37

2.9. Extração de RNA total e RT-PCR...38

IV. Resultados...40

1. Análise da construção do vetor para a síntese do shRNA-Syn4...40

2. Transfecção e características gerais das células EC, shRNA-Syn4-EC e EJ-ras-EC...41

3. Localização e expressão do fator de von Willebrand por imunofluorescência...42

3.1. Por microscopia confocal...42

3.2. Por citometria de fluxo...43

4. Seleção dos clones positvos parashRNA-Syn4...44

4.1. Síntese de heparam sulfato em células endoteliais transfectadas com shRNA-Syn4e EJ-ras...44

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5. Localização e expressão do proteoglicano sindecam-4 por

imunofluorescência...50

6. Localização e expressão da proteína Ras por imunofluorescência...53

7. Localização da subunidade β1 da integrina por imunofluorescência...55

8. Localização da fibronectina por imunofluorescência...56

9. Localização do proteoglicano biglicam por imunofluorescência...57

10. Localização do VEGF por imunofluorescência...58

V. Discussão...59

VI. Conclusão...64

VII. Resumo...66

VIII. Abstract...67

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: VIA Ras, Raf, MAP quinase...3

Figura 2: UNIDADE ESTRUTURAL DOS GLICOSAMINOGLICANOS...7 Figura 3: DISTRIBUIÇÃO DOS GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS

NA ESCALA FILOGENÉTICA...8 Figura 4: ESTRUTURA DE HEPARAM SULFATO DE DIFERENTES

ORIGENS...10 Figura 5: TIPOS DE LIGAÇÕES DOS GLICOSAMINOGLICANOS

SULFATADOS AO ESQUELETO PROTÉICO...12 Figura 6: PROTEOGLICANOS DA FAMÍLIA DOS SINDECANS...15 Figura 7: PARTICIPAÇÃO DO SINDECAM-4 EM EVENTOS CELULARES.17 Figura 8: MECANISMO DO SILENCIAMENTO GÊNICO

PÓS-TRANSCRICIONAL PELA TÉCNICA DE iRNA E SUAS

ESTRATÉGIAS DE UTILIZAÇÃO...24 Figura 9: ANÁLISE DA CONSTRUÇÃO DO VETOR PELA DIGESTÃO COM

ENZIMA DE RESTRIÇÃO...40 Figura 10: MICROSCOPIA DE INTERFERÊNCIA DE FASE DAS CÉLULAS

EC (WT), EJ-ras-ECeshRNA-Syn4-EC EM CULTURA...41

Figura 11: MARCAÇÃO DO FATOR DE von WILLEBRAND POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL...42

Figura 12:EXPRESSÃO DO FATOR DE von WILLEBRAND POR ANÁLISE DE CITOMETRIA DE FLUXO...43

Figura 13:COMPORTAMENTO ELETROFORÉTICO DOS

GLICOSAMINOGLICANOS SINTETIZADOS PELAS DIFERENTES CÉLULAS...45

Figura 14:SÍNTESE DE GLICOSAMINOGLICANOS PRESENTES NA FRAÇÃO CÉLULAR E SECRETADO PARA O MEIO DE CULTURA (CPM

TOTAL)...46

Figura 15:SÍNTESE DE GLICOSAMINOGLICANOS PRESENTES NA FRAÇÃO

CÉLULAR E SECRETADO PARA O MEIO DE CULTURA (CPM/µg DE

PROTEÍNA)...47

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Figura 17: LOCALIZAÇÃO DO SINDECAM-4 POR MICROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA CONFOCAL...51 Figura 18: EXPRESSÃO DE SINDECAM-4 POR ANÁLISE DE CITOMETRIA

DE FLUXO...52 Figura 19: LOCALIZAÇÃO DA PROTEÍNA RAS ANALISADA POR

MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL...53 Figura 20: EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RAS POR CITOMETRIA DE

FLUXO...54 Figura 21: LOCALIZAÇÃO DA INTEGRINA β1 POR MICROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA CONFOCAL...55 Figura 22: LOCALIZAÇÃO DA FIBRONECTINA POR MICROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA CONFOCAL...56 Figura 23: LOCALIZAÇÃO DO BIGLICAM POR MICROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA CONFOCAL...57 Figura 24: LOCALIZAÇÃO DO VEGF POR MICROSCOPIA DE

FLUORESCÊNCIA CONFOCAL...58

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ÍNDICE DE TABELAS

Tabela I: CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS

GLICOSAMINOGLICANOS...6

Tabela II: CLASSIFICAÇÃO DE ALGUNS PROTEOGLICANOS SEGUNDO

SUA LOCALIZAÇÃO E HOMOLOGIA DAS PORÇÕES

PROTÉICAS...13

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B

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A

S

Ago: Proteína Argonauta

AS: ácido siálico

Asn: L-asparargina

CETAVLON: brometo de cetil trimetilamônio

CS: condroitim sulfato

Dicer: RNAase

DS: dermatam sulfato

dsRNA: double-stranded RNA

EC: células endoteliais de aorta de coelho

EJ-ras-EC: células endoteliais transfectadas com vetor plasmidial contendo o

oncogene EJ-ras

FGF:fibroblast growth factor

FGFR: receptor para fator de crescimento de fibroblasto

GAG: glicosaminoglicano

Gal: galactose

GalNAc: N-acetilgalactosamina

GlcUA: ácido D-glucurônico

GlcN: D-glucosamina

GlcNAc: glucosamina N-acetilada

GlcNS: glucosamina N-sulfatada

GPI: glicosilfosfatidilinositol

HEP: heparina

HGF:hepatocyte growth factor

HS: heparam sulfato

IduA: ácido L-idurônico

IGF:insuline-like growth fact

iRNA: RNA de interferência

MAPK: mitogen-activated protein kinase

MEC: matriz extracelular

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Man: manose

NGF:nerve growth factor

NST: N-sulfotransferase

PDA: tampão 1,3 diaminopropano acetato

PDGF:platelet-derived growth factor

PG: proteoglicano

PGHS: proteoglicano de heparam sulfato

PIP2: fosfatidilinositol 4,5 bifosfato

PKC-α: proteína kinase C-α

QS: queratam sulfato

RISC: RNA-induced silencing complex

Ser, (S): serina

SFB: soro fetal bovino

SH2: src homology 2 domain SH3: src homology 3 domain

shRNA: short hairpin RNA

shRNA-Syn4-EC: células endoteliais transfectadas com o vetor plasmidial para a

expressão do “short hairpin” RNA para o sindecam-4

siRNA: small interfering RNA

SRLPs:small leucine rich proteoglycans

Tris: tris(hidroximetil)-aminoetano

VEGF:vascular endothelial growth factor

vWF: fator de von Willebrand

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INTRODUÇÃO

1-SINALIZAÇÃO CELULAR

Todas as células recebem e respondem a sinais ao seu redor. A ligação de muitas moléculas sinalizadoras os seus receptores inicia uma série de reações intracelulares que regulam virtualmente todos os aspectos do comportamento celular, incluindo metabolismo, movimento, proliferação e diferenciação.

Os fatores de crescimento compreendem uma classe diversificada de moléculas sinalizadoras, como: fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fator de crescimento do hepatócito (HGF), insulina, fator de crescimento similar à insulina-1 (IGF-1), fator de crescimento da célula nervosa (NGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF), entre outros.

Para que os sinais enviados pelas moléculas transmissoras sejam recebidos pela célula, é necessário um complexo sistema de proteínas. Esse sistema inclui receptores protéicos de superfície celular e intracelular, proteinoquinases, fosfatases, proteínas que ligam GTP e muitas outras proteínas, com as quais essas proteínas-sinais interagem (Bromberg, 2000; Takai et al., 2001)

Uma das vias de sinalização celular melhor estudada é a via Ras, Raf e

MAP quinase (MEK e ERK). As proteínas da superfamília Ras, incluindo as

famílias Ras e Rho, alternam entre as formas ativas (ligadas a GTP) e inativas

(ligadas a GDP) e funcionam como chave nas vias de transdução de sinal que regulam o crescimento, a diferenciação e a sobrevivência celular (Takai et al., 2001).

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2 outras proteínas, como por exemplo Grb2 (Growth factor receptor-bound

protein 2). A proteína adaptadora Grb2 liga-se á região fosforilada do receptor

pelo domínio SH2. Grb2 além do domínio SH2, possui um domínio SH3 que liga outros peptídeos, como SOS. SOS é um fator estimulador da dissociação do nucleotídeo guanina que se liga a Ras após ativação do receptor. A

conformação nativa de Ras é então comprometida, e GDP é dissociado de Ras

para que haja a ligação de GTP. Após ligar-se a GTP, Ras está num estado

ativo e apto para recrutar Raf da membrana celular, possibilitando a ativação

de Raf. Portanto, a ativação de Raf é mediada pelo Ras ativo, que por sua vez

ativa uma série de quinases (MAPK: mitogen-activated protein kinase, MAPKK:

MAPK kinase). Quando uma MAP quinase é ativada transmite um sinal por

meio da fosforilação de várias proteínas celulares, incluindo outras proteinoquinases e proteínas reguladoras de genes, promovendo a transcrição dos genes de resposta imediata (“early genes”) (Figura 1) (Lee and McCubrey, 2002; Monteiro et al., 2008).

O proto-oncogene Ras pode se tornar um oncogene ativo, capaz de

transformações malignas, por mutações pontuais que usualmente prejudicam a atividade de GTPase da proteína Ras (Kovary et al., 1989)

Mutações ativas em H-, K- e N-Ras são encontradas em

aproximadamente 30% de todos os tipos de câncer humano, já em cânceres com Ras tipo selvagem, pode ocorrer um aumento da expressão de fatores de

crescimento levando à ativação da via Ras, Raf e MAP quinase, sugerindo uma

importante contribuição da função de Ras para o desenvolvimento de cânceres

humanos (Sivaraman et al., 1997; Takai et al., 2001; von Lintig et al., 2000). Além disso, o oncogene Ras ativo induz a senescência em cultura de células

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FIGURA 1: VIA Ras, Raf, MAP QUINASE (Lopes, 2004)

MAPKK: MAP QUINASE QUINASE; MAPK: MAP QUINASE.

2.MATRIZ EXTRACELULAR E INTEGRINA

A matriz extracelular (MEC) compreende membrana basal e matriz conjuntiva, e é constituída por um conjunto de macromoléculas como colágenos, proteoglicanos (PGs), glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas (fibronectina, laminina, vitronectina, entactina, entre outras). Está envolvida na sobrevivência celular e na organização dos tecidos (Aoudjit & Vuori, 2001; Yurchenco & Schittny, 1990).

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4 (Bernfield et al., 1999; Kresse & Schonherr, 2001; Schonherr & Hausser, 2000; Trindade et al., 2008; Yamaguchi, 2000).

As integrinas foram originalmente caracterizadas como moléculas de adesão responsáveis pela ancoragem da célula a MEC (Haas & Plow, 1994; Hynes, 1987; Yamada et al., 2003). Essas moléculas estão envolvidas nos mecanismos de transdução de sinais, os quais acabam por alterar o fenótipo e o comportamento das células, tanto nos processos fisiológicos quanto nos patológicos (Hynes, 1987).

As integrinas constituem uma família de heterodímeros formados por uma cadeia α e outra denominada β com domínios extracelulares que se ligam a MEC e domínios citoplasmáticos que se associam à actina do citoesqueleto e interagem com outras proteínas como vinculina, talina e α-actina (Burridge & Chrzanowska-Wodnicka, 1996; Dedhar et al., 1999). As subunidades integrínicas α e β constituem uma proteína transmembrana do tipo I onde cada heterodímero possui um grande domínio extracelular (aproximadamente 800 aminoácidos), um domínio transmebrânico (aproximadamente 20 aminoácidos) e um curto domínio citoplasmático (de 13 a 70 aminoácidos). As subunidades α e β têm aproximadamente 1.000 e 750 resíduos de aminoácidos, respectivamente (Boudreau & Jones, 1999; Moser et al., 2009).

Existem pelo menos dezoito subunidades α e oito β já identificadas, que geram 24 distintos heterodímeros αβ. As integrinas exibem consideráveis sobreposições de seus ligantes específicos, como exemplo, o receptor αvβ3liga vitronectina porém, também apresenta grande afinidade para fibronectina, colágeno, trombospondina e fibrinogênio. Assim, componentes particulares da membrana podem se ligar a mais de um tipo de integrina (Boudreau & Jones, 1999; Dreyfuss et al., 2009). As integrinas são também consideradas proteoglicanos facultativos, podendo sofrer modificação pós-transducional, pelo processo de glicosilação com a adição de cadeias de glicosaminoglicanos (heparam sulfato e condroitim sulfato) a suas subunidades protéicas (Franco et al., 2009; Veiga et al., 1997).

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5 diferenciação (Giancotti & Ruoslahti, 1999; Guan, 1997). Assim, as integrinas não são apenas receptores para adesão celular, mas também interagem com receptores específicos de crescimento, regulando a sobrevivência, a diferenciação e a proliferação celular (Danen & Yamada, 2001).

3. GLICOSAMINOGLICANOS

Os glicosaminoglicanos (GAGs) são heteropolissacarídeos lineares formados por unidades dissacarídicas repetitivas, constituídas por uma hexosamina (D-glucosamina ou D-galactosamina) unida por ligação glicosídica

a um açúcar não nitrogenado, que pode ser um ácido urônico (D-glucurônico ou L-idurônico) ou um açúcar neutro (D-galactose). A maioria desses compostos

apresenta grupamentos sulfatos, que juntamente com as carboxilas dos ácidos urônicos, conferem uma alta densidade de cargas negativas a eles (Nader et al., 1984; Nader et al., 1989).

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Tabela I

CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS GLICOSAMINOGLICANOS

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FIGURA 2: UNIDADE ESTRUTURAL DOS GLICOSAMINOGLICANOS

A Figura ilustra as unidades estruturais dos glicosaminoglicanos. A D-glucosamina é a hexosamina da heparina, heparam sulfato, queratam sulfato e ácido hialurônico e a D-galactosamina está presente em condroitim 4 e 6-sulfatos e dermatam sulfato. O açúcar não nitrogenado é um ácido urônico (D-glucurônico ou L-idurônico), exceto no queratam sulfato que apresenta D-galactose. Os grupamentos sulfatos podem estar localizados em C-2 e C-6 na hexosamina e C-2 no ácido urônico. A hexosamina está unida ao ácido urônico por ligação α na heparina e no heparam sulfato e β nos demais compostos (Dietrich et al., 1983).

CONDROITIM 6 - SULFATO

DERMATAM SULFATO OH NAc O COOH OH O O O OH

CH2OH

OH O OH O COOH NAc OH O CH2OH

ÁCIDO

HIALURÔNICO

R1_{= AC, SO}3_H

HEPARAM SULFATO O OH OH O OH O O NAc OH O OH O OH O NAc

CH2O-R CH2OSO3H CH2O-R

CH2OSO3H

QUERATAM SULFATO R = H, SO3_H

R2= H, SO3H

COOH O OH OH O O O OH OH

NSO3H

O COOH OH O

OSO3H

O

OH O

OSO3H

O COOH OH

O O

CH2OSO3H

NSO3H

CH2OSO3H

NSO3H

HEPARINA

n

OH O COOH OH OH O O OH O OH O COOH OH O O

N -R1

CH2O-R2

N -R1

CH2O-R2

...

_...

OH O COOH OH O NAc O O OH O COOH OH O NAc

O HO3SO

CH2OH

HO3SO

...

O COOH OH OH NAc O OH O O OH O COOH OH O NAc OH O

CH2OSO3H

...

OH NAc OH NAc O COOH OH O O O CH2OH

HO3SO

O COOH

OH O O HO3SO

CH2OH

...

DERMATAM SULFATO OH NAc O COOH OH O O O OH

CH2OH

OH O OH O COOH NAc OH O CH2OH

ÁCIDO

HIALURÔNICO

R1_{= AC, SO}3_H

HEPARAM SULFATO O OH OH O OH O O NAc OH O OH O OH O NAc

CH2O-R CH2OSO3H CH2O-R

CH2OSO3H

QUERATAM SULFATO R = H, SO3_H

R2= H, SO3H

COOH O OH OH O O O OH OH

NSO3H

O COOH OH O

OSO3H

O

OH O

OSO3H

O COOH OH

O O

CH2OSO3H

NSO3H

CH2OSO3H

NSO3H

HEPARINA

n

OH O COOH OH OH O O OH O OH O COOH OH O O

N -R1

CH2O-R2

N -R1

CH2O-R2

...

_...

OH O COOH OH O NAc O O OH O COOH OH O NAc

O HO3SO

CH2OH

HO3SO

...

O COOH OH OH NAc O OH O O OH O COOH OH O NAc OH O

CH2OSO3H

...

HO3SO

O COOH

OH O O HO3SO

CH2OH

...

HO3SO

O COOH

OH O O HO3SO

CH2OH

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8 Os GAGs sulfatados são encontrados com exclusividade no reino animal e apresentam-se amplamente distribuídos na escala filogenética, desde espongiários até mamíferos superiores. HS e CS são encontrados tanto em vertebrados quanto em invertebrados. Já o DS ocorre somente em cordados e hemicordados. Por outro lado, o QS é encontrado somente em cordados. Heparina, por sua vez, está presente principalmente em vertebrados com exceção de algumas espécies de ctenóforas, moluscos, anelídeos e crustáceos (Cassaro & Dietrich, 1977; Chavante et al., 2000; Dietrich et al., 1985; Dietrich et al., 1989; Dietrich et al., 1983; Dietrich et al., 1999; Dietrich et al., 1998; Ferreira et al., 1993; Gomes & Dietrich, 1982; Medeiros et al., 2000; Mourao et al., 1998; Nader et al., 1984; Nader et al., 1996; Pavao et al., 1995; Spillmann et al., 1995; Straus et al., 1982; Toledo & Dietrich, 1977), como mostra a Figura 3.

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9 Esses polissacarídeos, com exceção do ácido hialurônico e heparosan, são sintetizados e estão presentes nos tecidos na forma de proteoglicanos (PGs), nos quais as cadeias de GAGs estão covalentemente ligadas ao esqueleto protéico (Kjellen &Lindahl, 1991; Sampaio et al., 2006).

4. HEPARAM SULFATO

O heparam sulfato (HS) foi isolado em 1948 por Jorpes e Gardell como sendo uma heparina com baixa atividade anticoagulante (Jorpes & Gardell, 1948).

O heparam sulfato é constituído de unidades alternadas de ácido D

-glucurônico (GlcUA) e D-glucosamina (GlcN), unidas por ligações glicosídicas

do tipo β (1-4), e de ácido L-idurônico (IdoA) ligado à D-glucosamina por meio

de ligação glicosídica α (1-4). Por outro lado, a ligação interdissacarídica é do tipo α (1-4). A glucosamina pode estar N-acetilada (GlcNAc) ou N-sulfatada (GlcNS) e/ou, ainda, O-sulfatada na posição C-6 (GlcN6S). A D-glucosamina no heparam sulfato mostra-se com elevado grau de N-acetilação (40-60%), sendo que o restante encontra-se na forma N-sulfatada (60-40%). O que diferencia o heparam sulfato da heparina é o fato do mesmo conter maior teor de ácido glucurônico e glucosamina N-acetilada (Cifonelli & Dorfman, 1960; Cifonelli & King, 1973; Dietrich & Nader, 1974; Dietrich et al., 1971; Dietrich et al., 1983; Dietrich et al., 1998; Hook et al., 1974); (Hovingh & Linker, 1974; Hovingh et al., 1986; Taylor et al., 1973; Tersariol et al., 1994; Turnbull & Gallagher, 1990).LINKER

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10 Empregando-se enzimas específicas para degradação de HS, como a

Flavobacterium heparinum (Dietrich et al., 1993; Dietrich et al., 1991; Nader et

al., 1988; Nader et al., 1999; Nader et al., 1990; Silva et al., 1976; Silva & Dietrich, 1975), foi possível demonstrar a formação de cinco tipos de unidades dissacarídicas principais (Figura 4) distribuídas em regiões variáveis formadas por blocos contendo GlcA(1-4)GlcNAc, GlcA(1-4)GlcNS, IdoA(1-4)GlcNAc6S, IdoA(1-4) GlcNS,6S e IdoA,2S(1-4)GlcNS,6S, e duas regiões constantes, uma contendo o tetrassacarídeo IdoA-GlcNAc-IdoA-GlcNS, e outra no terminal não redutor do polímero contendo GlcNS ou GlcNS,6S (Dietrich et al., 1998; Tersariol et al., 1994). As estruturas desses dissacarídeos foram determinadas por análises químicas e enzimáticas (Dietrich & Nader, 1974; Silva et al., 1976),

como também por ressonância magnética nuclear de 13C e 1H (Nader et al., 1990; Perlin et al., 1971).

FIGURA 4: ESTRUTURA DE HEPARAM SULFATO DE DIFERENTES ORIGENS.

A seqüência dissacarídica completa do heparam sulfato de pâncreas bovino e a seqüência parcial dos outros sete heparam sulfatos analisados por Dietrich e col. (1998), estão representados na Figura acima. GlcUA - ácido D-glucurônico; IdoUA - ácido L-idurônico; IdoUA,2S - ácido L-idurônico 2-sulfato; GlcNAc - glucosamina N-acetilada; GlcNAc,6S - glucosamina N-acetilada,6-sulfato; GlcNS - glucosamina N-sulfato; GlcNS,6S - glucosamina 2,6-dissulfato.

PÂNCREAS BOVINO

PULMÃO BOVINO

FÍGADO DE COELHO

FÍGADO CANINO

FÍGADO BOVINO

FÍGADO SUÍNO

CÉREBRO SUÍNO

CÉREBRO BOVINO

SEQÜÊNCIA NÃO ESTABELECIDA

0

UNIDADES TERMINAL NÃO REDUTOR

0 2 4 6 8 10 0 2

0 2 4 6

0 2 1 GlcUA-GlcNAc GlcUA-GlcNS IdoUA-GlcNS,6S 2 4 0 6

0 2 4 6 1 0

TERMINAL REDUTOR (ligação ao esqueleto

protéico) IdoUA -GlcN S IdoUA -GlcN Ac IdoUA -GlcN S IdoUA -GlcN Ac,6S IdoUA -GlcN Ac,6S IdoUA ,2S-G lcNS,6 S IdoUA ,2S-Gl cNS,6 S GlcN S,6S+ GlcN S PÂNCREAS BOVINO PULMÃO BOVINO

FÍGADO DE COELHO

FÍGADO CANINO

FÍGADO BOVINO

FÍGADO SUÍNO

CÉREBRO SUÍNO

CÉREBRO BOVINO

SEQÜÊNCIA NÃO ESTABELECIDA

0

UNIDADES TERMINAL NÃO REDUTOR

0 2 4 6 8 10 0 2

0 2 4 6

0 2 1 GlcUA-GlcNAc GlcUA-GlcNS IdoUA-GlcNS,6S 2 4 0 6

0 2 4 6 1 0

TERMINAL REDUTOR (ligação ao esqueleto

(27)

I

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o

11 5. PROTEOGLICANOS

Os PGs são compostos de alto peso molecular formados por um esqueleto protéico ao qual se ligam, covalentemente, cadeias de glicosaminoglicanos e oligossacarídeos N- e/ou O-ligados (Thonar & Sweet, 1977; Lohmander et al., 1980; Nilsson et al., 1982). As cadeias de glicosaminoglicanos estão unidas pelo terminal redutor a um tetrassacarídeo, ácido β-D-glucurônico-β-D-galactose-β-D-galactose-β-D-xilose, estando a xilose ligada por uma ligação O-glicosídica ao grupamento hidroxila de um resíduo de serina da proteína. Este tipo de ligação é específico para a maioria dos proteoglicanos de tecido conjuntivo, não tendo sido identificado para outros complexos carboidrato-proteína (Baker et al., 1975; Bray et al., 1967; Rosenberg & Lam, 1979).

(28)

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12

FIGURA 5: TIPOS DE LIGAÇÕES DOS GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS AO ESQUELETO PROTÉICO.

Condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS), heparam sulfato (HS) e heparina (Hep) ligam-se a um resíduo de L-ligam-serina da porção protéica por uma região de ligação comum composta pelo tetrassacarídeo(GlcUAβ1→3Galβ1→3Galβ1→4Xilβ1→3Ser).O queratam sulfato (QS) pode ser tanto O-ligado (cartilagem), quanto N-ligado (córnea). Xil, xilose; Gal, galactose; GlcUA, ácido glucurônico; GalNAc: N-acetil-D-galactosamina; GlcNAc: N-acetil-D-glucosamina; AS: ácido siálico; Man: D-manose; Ser: L-serina, Asn: L-asparagina; : hexosamina; : ácido urônico; : D-galactose; : possível sítio de sulfatação Figura modificada de (Hardingham & Fosang, 1992).

Os proteoglicanos são classificados de acordo com a sua localização, em intracelular, associado à superfície celular e extracelular (ou associado à matriz extracelular). Na Tabela II estão classificados alguns proteoglicanos de acordo com a sua localização e homologia das porções protéicas.

(CS, DS, HS ou Hep)

(QS - córnea) (QS - cartilagem) Ser - O - GalNAc GlcNAc Gal

-Gal - AS (ou GlcNac) Ser - O - Xil - Gal - Gal -

GlcUA-- N GlcUA-- GlcNAc GlcUA-- GlcNAc GlcUA-- Man Man GlcNAc Man GlcNAc -Asn

(CS, DS, HS ou Hep)

(QS - córnea) (QS - cartilagem) Ser - O - GalNAc GlcNAc Gal

-Gal - AS (ou GlcNac) Ser - O - Xil - Gal - Gal -

(29)

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13

Tabela II

CLASSIFICAÇÃO DE ALGUNS PROTEOGLICANOS SEGUNDO SUA LOCALIZAÇÃO E HOMOLOGIA DAS PORÇÕES PROTÉICAS

Localização Classificação Nome

Grânulos Secretórios

Família dos Serglicins

Serglicim

Proteoglicano Facultativo _{Cromogramina A}

S up er fíc ie C el ul ar

Ancorados por GPI Família dos Glipicans

Glipicam-1 Glipicam-2 (Cerebroglicam) Glipicam-3 (OCI-5) Glipicam-4 (K-Glipicam) Glipicam-5 Transmembrânicos

Família dos Sindecans

Sindecam-1 Sindecam-2 (Fibroglicam) Sindecam-3 (N-sindecam) Sindecam-4 (Riudocam ou Anfiglicam) Outro tipo de PG

NG2 Proteoglicanos Facultativos Trombomodulina Betaglicam CD44 Cadeia Invariante Receptor de Transferrina

Integrina α5β1

E xt ra ce lu la r Membrana Basal

Família "EGF-Laminina" Perlecam Agrim

Outro tipo de PG Bamacam Leprecam Matriz Extracelular Família "LEC-HABr" Agrecam Versicam Neurocam Brevicam

Família "Leucine Rich"

Decorim Biglicam Fibromodulina Lumicam Queratocam Osteoaderina Epificam Mimecam PRELP Oculoglicam Proteoglicano Facultativo _Colágeno

α2 (tipo IX)

Outros tipos de PGs Fosfacam _Testicam

Apicam

(30)

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14 6. FAMÍLIA DOS SINDECANS

O termo sindecam tem origem na palavra grega syndein que significa “o

que liga junto” em função da propriedade desses proteoglicanos de ligarem a componentes do citoesqueleto e da matriz extracelular (Saunders et al., 1989).

Sindecans constituem uma família de quatro membros de proteoglicanos transmembrânicos que apresentam em geral cadeias de heparam sulfato covalentemente ligadas, sendo que condroitim sulfato também pode ocorrer em algumas situações. Essa família de proteoglicanos caracteriza-se por apresentar um domínio transmembrânico e outro citoplasmático bem conservado, e uma região extracelular variável entre os diferentes sindecans. Até o presente momento, foram isolados 4 tipos de sindecans: sindecam-1; sindecam-2 (ou fibroglicam); sindecam-3 (ou N-sindecam) e sindecam-4 (ou anfiglicam ou riudocam).