Submetido em 01/10/2010. Aprovado, após revisão, em 23/11/2010. Declaramos a inexistência de conflito de interesse. Comitê de Ética nº 0196.0.243.000-09. Universidade Federal de Santa Maria – UFSM.
1. Graduanda do Curso de Farmácia da UFSM
2. Mestre em Bioquimica Toxicológica pela UFSM; Farmacêutica-Bioquímica
3. Doutora em Ciências Farmacêuticas pela Universidade de São Paulo; Professora Adjunta da UFSM
Correspondência para: Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde - Prédio 26, sala 1205. Universidade Federal de Santa Maria, Campus Universitário – Camobi. Santa Maria, RS. CEP: 971059-00. E-mail: andreiampazini@gmail.com
Relevância clínica e frequência de
padrões citoplasmático e pontilhado ino
denso observados em FAN-HEp-2
Andréia Martini Pazini1, Juliana Fleck2, Rosane Souza dos Santos2, Sandra Trevisan Beck3
RESUMO
Objetivos: O presente estudo procurou determinar a frequência e relacionar o título sorológico dos padrões de
imuno-luorescência para citoplasma celular e nuclear pontilhado ino denso com possível correlação clínica. Métodos: No período entre 2007 a 2009 foram avaliados os resultados de 2.788 testes sorológicos para pesquisa de autoanticorpos
pela técnica de imunoluorescência indireta (IFI), utilizando como substrato células HEp-2, realizados no LAC-HUSM/
UFSM. Resultados: Entre as amostras analisadas, 1.998 resultaram não reagentes para a pesquisa de autoanticorpos.
Entre as amostras reagentes (n = 790) foram encontradas 57 (7,2%) amostras apresentando padrão de reatividade descrita como pontilhado ino denso (SFD) (3,8%) ou luorescência citoplasmática (Cit) (3,4%). Nas amostras com padrão SFD (n = 29), nove apresentaram título < 1/160, onde apenas um paciente apresentava doença autoimune (DAI). Entre os pacientes com título > 1/160 apenas um não apresentava DAI. Entre as amostras com padrão Cit (n = 27), 20 apresentavam
título < 1/160, onde apenas oito não tinham DAI associada. Todos os outros 7 pacientes com título > 1/160 tinham relato de DAI. Conclusão: Os resultados encontrados ratiicam o valor de 1/160 como melhor ponto de corte para deinição de presença de DAI, para qualquer um dos padrões de luorescência avaliados. Contudo, deve-se prestar atenção a títulos
inferiores, principalmente para IFI Cit, uma vez que apenas 40% não apresentavam relato de DAI presente.
Palavras-chave: anticorpos, autoimunidade, técnica indireta de luorescência para anticorpo.
como esclerose sistêmica (ES) e síndrome de Sjögren. Essa técnica, ao longo das últimas décadas, foi modiicada de forma a conferir sensibilidade progressivamente maior 3.
Na atualidade, a IFI utilizando célula de Epitelioma de Laringe Humana – HEp-2 (epitelioma humano tipo 2 – clone CCl 23ATCC) praticamente substituiu a IFI utilizando imprint de células de roedores, devido a múltiplos fatores, entre o quais, a possibilidade de padronização universal, já que os vários laboratórios em todo o mundo passaram a utilizar o mesmo tipo de substrato. Atualmente, diversos fabricantes fornecem lâminas comerciais com células HEp-2 ixadas com excelente qualidade2,3 contribuindo para a aplicação técnica uniforme
INTRODUÇÃO
A pesquisa de anticorpos antinúcleo (ANA) pela técnica de imunoluorescência indireta (IFI), também conhecido como fator antinuclear (FAN), em soro de pacientes com suspeita de doença autoimune (DAI), trata-se de um excelente exame de rastreamento de autoanticorpos. No início da década de 1950, realizava-se a IFI tendo como substrato corte ou imprint de fígado de roedores para a triagem de FAN no soro de pacientes com suspeita de DAI.1 A pesquisa positiva passou a indicar a
Figura 1
Frequência dos padrões de fluorescência do FAN-HEp-2
na população estudada.18
Citoplasmático Pontilhado fino denso Outros padrões 3,4%
3,7%
92,92%
entre os laboratórios de análises clínicas.4 Outro fator
impor-tante nesta substituição é a excelente visibilidade de múltiplos padrões de luorescência5 e a oferta de uma diversidade de
autoantígenos inerente a esse substrato. Como consequência, o teste de FAN passou também a apresentar maior sensibilidade
e menor especiicidade.4
Ultimamente, porém, têm sido reportados laudos labora-toriais com grande número de informações, que nem sempre traduzem de forma objetiva ou auxiliam determinar a condição de saúde de um paciente. O aumento na sensibilidade, no en-tanto, resultou em diminuição substancial na especiicidade até mesmo para o diagnóstico de doença reumática autoimune, pois alguns indivíduos aparentemente hígidos (2% a 4%) passaram a apresentar resultados positivos pela técnica de FAN-IFI,2 o
que era extremamente raro com o teste das células LE. Um dos principais padrões de imunoluorescência presente em amostras de indivíduos sadios é o pontilhado ino denso (SFD). Sua alta frequência em indivíduos com patologias não autoimunes torna o seu reconhecimento importante para que se possa apreciar adequadamente os achados do teste de FAN-HEp-2.6 Está bem demonstrada que a presença de
autoan-ticorpos pode ser desencadeada transitoriamente por infecções, medicamentos e neoplasias. O padrão citoplasmático (Cit), que passou a ser relatado recentemente, na maioria dos casos, ainda não tem sua relevância clínica deinida.
O presente trabalho teve por objetivo determinar a frequên-cia e título de anticorpos do padrão de luorescênfrequên-cia nuclear ino denso e citoplasmático relacionando com a presença de DAI, determinando a relevância clínica dos resultados.
MATERIAIS E MÉTODOS
Casuística
Foram revisados os resultados de pesquisa de FAN por IFI rea-lizada no Laboratório de Análises Clínicas (LAC) do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM) e analisados os prontuá-rios dos pacientes que apresentaram positividade para os padrões SFD e Cit no período de janeiro de 2007 a março de 2010.
Imunofluorescência indireta (IFI)
A pesquisa de FAN por IFI em células HEp-2 (Hemagen Diagnóstica, Inc- Virgo® Products Division Columbia, Maryland 21045 USA) é realizada no LAC-HUSM de acordo com o seguinte protocolo: as células são incubadas com os soros dos pacientes diluídos em tampão salina fosfato pH 7,2 (PBS) por 30 minutos em câmara úmida à temperatura
ambiente. Em seguida, as lâminas são lavadas duas vezes por 10 minutos em PBS e incubadas por 30 minutos com anticorpo secundário antigamaglobulina humana conjugada com isotio-cianato de luoresceína (FITC) em câmara escura à temperatura ambiente. Após a incubação, as lâminas são lavadas em PBS e montadas com glicerina tamponada e lamínula. A leitura é feita em microscópio de luorescência, modelo Olympus BX 50 sob aumento de 500 vezes. A cada rotina de realização dos testes FAN são realizados controles internos negativos e positivos.
Os dados foram analisados utilizando-se estatística descri-tiva (média e frequencia [%]). O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFSM sob o número CAAE 0196.0.243.000-09.
RESULTADOS
Entre os resultados FAN-HEp-2 avaliados (n = 2.788) entre janeiro/2007 e março/2010 no LAC/HUSM, 1.998 (71,66%) resultaram negativos para a pesquisa de autoanticorpos e 790 (28,33%) tiveram resultados reagentes.
Dos 790 que tiveram positividade, 734 (92,92%) apresenta-ram os seguintes padrões de luorescência: nuclear homogêneo, nuclear pontilhado grosso, nuclear pontilhado ino, nuclear tipo membrana nuclear, nucleolar homogêneo, nucleolar pontilha-do, nucleolar pontilhado pontos isolados, nucleolar pontilhado centromérico, nucleolar aglomerado e 56 (7,1%) resultaram nuclear SFD ou Cit. Sendo que 29 amostras revelaram padrão nuclear SFD e 27 revelaram padrão Cit (Figura1).
Veriicou-se que em 74% dos pacientes que apresenta
Tabela 1
Doenças associadas aos padrões de luorescência encontrados em FAN-HEp-2
Padrão
Pontilhado fino denso Citoplasmático
Título Doença autoimune (n) Outra condição (n) Doença autoimune (n) Outra condição (n)
1/40 Pênfigo vulgarAR 11 Politraumatismo Estresse 11
LES AR Cirrose. Biliar Polimiosite 5 5 1 1 Cardiopatia Depressão Artralgia 1 1 1
1/80 Hepatite AI 1 Herpes,HIV,
Psoríase
1 1 1
Anemia hemolítica
Esclerodermia 21 Depressão 1
≥ 1/160 LES AR
Esclerodermia
14 4
2 Câncer 1
LES AR Hepatite AI 4 2 1
Total 23 6 23 4
LES: lúpus eritematoso sistêmico; AR: artrite reumatoide; AI: autoimune.
Figura 3
Frequência de doença autoimune (DAI) relacionada ao título de anticorpos encontrados no padrão de luorescência pontilhado ino denso (SFD) no FAN em células HEp-2.
40 80 160 320 640
8 7 6 5 4 3 2 1 0
Fator de distribuição
Pacientes (n)
Doença autoimune Outras patologias
Figura 2
Frequência dos títulos de anticorpos e padrões de luorescência de FAN na população estudada.
Padrão citoplasmático Padrão SFD 40
15
5 5
4 4
3
80 160 320 ≥ 640
16 14 12 10 8 6 4 2 0
Fator de distribuição
Pacientes (n)
2 2
8 8
Figura 4
Frequência de doença autoimune (DAI) relacionada ao título
de anticorpos apresentados pelo padrão de luorescência cito
-plasmático (Cit) no FAN em células HEp-2.
Doença autoimune Outras patologias Fator de distribuição
40 80 160 320 640
12 10 8 6 4 2 0 Pacientes (n)
padrão SFD que predominou em pacientes com títulos mais elevados. (Figura 2)
Ao ser relacionado o título de IFI encontrado com evidência de DAI, pode ser observado que a prevalência de DAI ocorreu nos dois padrões em estudo, porém com diferentes níveis de reatividade (Tabela 1).
Os resultados relatados como padrão de luorescência SFD, foram estratiicados em conformidade com o título encontrado no soro de 29 pacientes classiicados de acordo com a presença e ausência de evidência de autoimunidade (Figura 3).
DISCUSSÃO
A detecção de autoanticorpos no soro tem um papel prognóstico nas DAI, pois relete a presença, a natureza e a intensidade da resposta autoimune. Existem mais de 100 diferentes tipos de doenças reumatológicas, sendo frequente a necessidade de diagnóstico diferencial entre as tais doenças.7
Houve uma acentuada evolução na interpretação dos padrões de IFI para detecção de autoanticorpos em células HEp-2 no transcorrer dos últimos anos. Essa metodologia apresenta a capacidade de rastrear uma grande variedade de anticorpos, proporcionando a localização e provável identidade do autoantígeno, porém apresenta como limitação variações
na interpretação dos padrões de luorescência.8 Tempos atrás,
a maioria dos estudos estavam focados principalmente nos ANA, mas hoje acredita-se que anticorpos contra citoplasma, superfície celular, espaço intercelular e componentes da célula
também são importantes no contexto das DAI.9
Conforme, o 3º Consenso Nacional de Padronização de Laudos de FAN, estão descritas mais de 25 possibilidades de padrões de luorescência. Cada um pode reletir uma dada expressão antigênica reconhecida pelo seu autoanticorpo.10-12
Estudo pioneiro relacionado ao padrão SFD foi realizado por Ochs et al.13 e conforme já relatado por Laurino et al.14 há uma baixa prevalência deste padrão de luorescência com placa metafásica positiva comparado aos outros existentes. Leser et al.15 demonstraram que o padrão SFD apresentou alta
taxa de associação com ausência de autoimunidade em títulos baixos, médios e altos.
Entre os padrões encontrados no presente estudo, a fre-quência do padrão SFD (3,7%) e Cit (3,4%) foi inferior ao relatado em outro serviço, onde a frequência foi de 6,3% e 9%, respectivamente.14 Provavelmente isso acontece devido
à solicitação desse exame estar embasada no contexto clínico de cada paciente, tendo sido solicitado principalmente por reumatologistas do HUSM, o que levou a um número menor de detecção do padrão vinculado a inespeciicidade. Tampoia et al.16 observaram que os reumatologistas solicitavam o FAN
com uma maior frequência para pacientes que apresentavam dois ou mais critérios para classiicação de DAI, ao contrário dos médicos de outras especialidades, que solicitavam esse exame para pacientes que apresentavam somente quadros inlamatórios.
Todos os indivíduos apresentam certo grau de
autoimu-nidade isiológica, a qual pode variar dependendo das sobre
-cargas a que o sistema imunológico seja exposto. Elevações transitórias dos títulos de FAN podem ocorrer em indivíduos com processos infecciosos agudos e com certos medicamentos
como hidralazina, carbamazepina, hidantoína, procainamida, isoniazida, metildopa, dentre outros.12 Provavelmente por este
fator, alguns indivíduos com outras condições não autoimunes possam ter apresentado pesquisa de FAN reagente como de-monstrado na Tabela 1. Não foi possível considerar a baixa re-atividade exclusivamente como um fator normal, uma vez que a amostra analisada foi composta por soro de indivíduos que procuraram atendimento no HUSM, tendo seu exame realizado pelo laboratório central deste hospital, não podendo então ser excluída a presença de alguma enfermidade presente. Sabe-se que apesar da sensibilidade do teste de ANA ser bastante alta (quase 100%) principalmente para o LES, sua especiicidade pode ser baixa, principalmente quando a intensidade da reação é pequena (baixos títulos), fazendo com que seja detectado também em diferentes condições clínicas.17
O padrão nuclear SFD com placa metafásica positiva é descrito na literatura como tendo uma maior prevalência em pacientes sem evidências clínicas de DAI.18 Assim, Leser et
al.15 observaram que os padrões nuclear SFD, nuclear pon-tilhado reticulado e nuclear ponpon-tilhado ino associaram-se predominantemente a indivíduos sem qualquer evidência de DAI. Por outro lado, ao se conjugarem as informações de pa-drão de luorescência e título, observaram que, para os padrões pontilhado ino e pontilhado grosso reticulado, a associação com ausência de DAI foi real apenas em títulos baixos. O mesmo não foi absolutamente verdadeiro para o padrão SFD, que apresentou alta taxa de associação com ausência de DAI em títulos baixos, médios e altos.15
Watanabe et al.6, em estudo sobre a frequência e o padrão
do FAN por IFI em trabalhadoras hígidas de uma hidrelétrica, revelaram que o padrão SFD foi frequentemente encontrado naquelas com FAN positivo, aparecendo em títulos baixos,
médios e altos. Esses resultados também puderam ser verii
-cados no presente estudo, contudo, como pode ser observado na Figura 3, apesar de em títulos menores que 1/80 haver predomínio de outras condições não autoimunes, não é pos-sível excluir totalmente a probabilidade, uma vez que cinco pacientes com DAI apresentaram título 1/40 com esse padrão de luorescência. Apenas em títulos maiores ou iguais a 1/640 não foram observados pacientes sem evidência de DAI.
Um segundo ponto a ser considerado é o título do FAN-HEp-2, muito embora seu valor seja relativo. Em geral, os por-tadores de DAI tendem a apresentar títulos moderados (1/160 e 1/320) e elevados (≥ 1/640), enquanto os indivíduos sadios com FAN-HEp-2 positivo tendem a apresentar baixos títulos (1/80).2 Entretanto, é importante ter em mente que exceções de
ambos os lados não são infrequentes.15 Dessa maneira, se faz
importância, realizado por Tan et al.2 com indivíduos entre 20 e
60 anos. Entre os indivíduos hígidos, as seguintes percentagens de testes positivos foram encontradas: 1/40 em 31,7% dos indivíduos, 1/80 em13,3%, 1/160 em 5,0% e 1/320 em 3,3%.
A relevância clínica do padrão Cit não se encontra ainda totalmente estabelecida. Segundo os pesquisadores Massabki et al.19 e Eystathioy et al.20, o padrão citoplasmático quando em
títulos baixos ou moderados podem não ter relevância clínica
deinida. No entanto, o presente estudo veriicou que pacien
-tes com DAI como artrite reumatoide, LES, ES, poliomiosite apresentam esse padrão de luorescência em baixos títulos.
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