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Stress térmico no intertidal rochoso: influência na distribuição geográfica da Patella vulgata

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Agradecimentos

Para a realização desta dissertação foram vários os intervenientes que colaboraram direta ou indiretamente, aos quais merecem o meu reconhecimento e gratidão.

Ao meu orientador, Doutor Fernando Pádua Lima, pela forma como me orientou ao longo desta jornada, desde o processamento das amostras até à elaboração escrita da dissertação. A sua ajuda, apoio e constante motivação foram inúmeras vezes cruciais para ultrapassar todos os obstáculos inerentes à intensidade desta caminhada.

Ao Rui Seabra e à Catarina Queiroga, pela amizade, incentivo e preocupação com o meu bem-estar nos momentos de fadiga. Também um especial agradecimento pela sua disponibilidade e ajuda nas correções de última hora.

À Lara Sousa, pela paciência, preocupação e carinho demonstrado durante a elaboração do manuscrito.

Ao Nuno Queiroz, pela presença e preocupação durante esta etapa.

Aos colegas do CIBIO (Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto) pela constante motivação e preocupação, em especial à Margarida e à Filipa.

A toda a minha família, pelo apoio incondicional, acreditando sempre no meu esforço e empenho. Em especial à minha mãe, pela presença e carinho que em muito contribuíram para a conclusão deste manuscrito.

Ao Flávio Miranda, por toda a paciência, afeto e companheirismo que demonstrou durante todo este processo.

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Resumo

O aquecimento global - aumento da temperatura média da atmosfera e dos oceanos - é um fenómeno com grande potencial disruptivo para os sistemas biológicos. As consequências do aquecimento global são já detetáveis, e vários estudos demonstraram que o aumento da temperatura é um dos principais fatores responsáveis por algumas das alterações de distribuição de espécies já registadas, incluindo de organismos intertidais. No entanto, a forma como a temperatura do meio ambiente modela o stress térmico à escala dos organismos, nomeadamente ao nível das suas respostas fisiológicas, é ainda largamente desconhecida. Um melhor conhecimento desse mecanismo é fundamental para prever as consequências de futuros cenários de aquecimento global com maior nível de certeza. O presente trabalho procura aprofundar o conhecimento da relação entre a temperatura e o stress térmico sub-letal, medido através da quantificação dos níveis de heat shock proteins (HSP70). As HSP70 são proteínas produzidas por virtualmente todos os organismos quando expostos a vários tipos de stress (incluindo stress térmico), para protecção das proteínas celulares contra a desnaturação. Utilizando a lapa comum (Patella vulgata) como modelo, determinaram-se os níveis de HSP70 em indivíduos colhidos em diferentes micro-habitats e ao longo de uma escala latitudinal abrangente. Esses níveis foram depois relacionados com as temperaturas às quais esses organismos tinham sido expostos anteriormente às colheitas. Para obter essas temperaturas utilizaram-se sensores biomiméticos, que foram previamente colocados nos locais onde se realizaram as colheitas e registaram as temperaturas à escala do organismo de estudo, com uma frequência sub-horária durante cerca de um ano. Os resultados deste trabalho confirmam que os indivíduos que habitam micro-habitats voltados a sul estão geralmente mais expostos à radiação solar e a temperaturas mais elevadas do que os restantes. Mais importante, os resultados deste trabalho demonstram que os indivíduos que habitam micro-habitats voltados a sul apresentam níveis superiores de HSP70, mesmo na parte norte da área de amostragem (i.e., Reino Unido e Irlanda). Constatou-se ainda que a amplitude da diferença entre os níveis de HSP70 medidos em indivíduos que habitam micro-habitats voltados a sul e voltados a norte não é constante ao longo de toda a área de amostragem. Consequentemente, ao longo da quase totalidade da área de distribuição da espécie, os micro-habitats voltados a norte aparentam funcionar como refúgios do stress térmico, embora o grau de 'proteção' conferido por cada refúgio seja maior nalguns pontos de amostragem do que outros.

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Estes resultados sugerem que a topografia local e a variabilidade de micro-habitats que dela resulta, pode modelar a forma como os padrões climatológicos e oceanográficos afetam a fisiologia individual. Como resultado, alterações desses padrões deverão influenciar os níveis de stress térmico dos organismos intertidais de forma não homogénea, o que potencialmente se poderá traduzir numa diferencial contribuição dos indivíduos para as populações locais, influenciando por sua vez a distribuição da espécie como um todo.

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Abstract

Global warming – the rise of the average temperature of the atmosphere and oceans – has the potential to negatively impact biological systems. The consequences of global warming have already been detected, and many studies show that the rising of temperatures is one of the major factors driving some of the distributional shifts already recorded, including those of intertidal organisms. Nevertheless, the mechanisms through which temperature is translated into individual thermal stress, namely at the physiological level, remain poorly understood. A better knowledge of such mechanisms is essential for improved forecasts of the impacts that further climatic changes will impose on the world’s biota. The present work aims at improving the knowledge on the relationship between temperature and sub-lethal thermal stress, quantified using heat shock proteins (HSP70). HSP70 are a group of proteins produced by virtually all organisms when exposed to various types of stress (including thermal stress), to protect cellular proteins against denaturation. Using the common china limpet (Patella vulgata) as a model, the levels of HSP70 of individuals collected from different microhabitats across a wide latitudinal range were quantified. Such levels were then related to the temperatures organisms had been exposed to prior to collection. The temperature profiles were obtained using biomimetic sensors, deployed beforehand in the same locations were sampling would later take place, and registering temperatures at a scale relevant to the study organism, at a sub-hourly frequency for approximately one year. Data obtained confirmed that individuals that inhabit south-facing microhabitats are generally more exposed to solar radiation and higher temperatures than those attached to north-facing microhabitats. More importantly, results from this work showed that individuals from south-facing microhabitats exhibit elevated levels of HSP70, even in the most northern locations of the study area (i.e., in the United Kingdom and Ireland). In addition, it was shown that the magnitude of the difference between the levels of HSP70 detected in individuals from south-facing and north-facing microhabitats is variable throughout the study area. Hence, for almost the entire P. vulgata’s distribution range, north-facing microhabitats seem to function as refuges from thermal stress, although the level of protection seems to be greater for some locations than others. These results suggest that local topography, expressed through the variability of available microhabitats, can modulate the way climatologic and oceanographic patterns affect individual physiology. As a result, changes in such global/regional patterns can be expected to control the thermal stress of intertidal

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organisms in a heterogeneous way, influencing the contribution of individuals to local populations, and therefore driving the species’ distribution as a whole.

Keywords: Patella vulgata, intertidal, physiology, thermal stress, micro-habitat, biogeography.

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Introdução... 8 Material e Métodos... 13 1. Área de estudo... 13 2. Temperaturas... 14 3. HSP 70... 15 3.1. Recolha de amostras...15 3.2. Western Blotting... 15 3.2.1. Extração proteica...15 3.2.2. Eletroforese... 15 3.2.3. Transferência... 16 3.2.4. Imunodeteção... 16 4. Análise estatística... 17 Resultados... 18 Discussão... 22 Referências... 26

Introdução

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Embora a temperatura média dos oceanos tenha vindo a aumentar desde meados do século XX (Trenberth et al., 2007; Lima & Wethey, 2012), esse aumento tem vindo a acentuar-se nas duas últimas décadas (Hansen et al., 2010; Burrows et al., 2011). Este acréscimo tem sido mais intenso nas zonas costeiras (Belkin, 2009), e tem sido também acompanhado por uma diminuição na frequência dos eventos extremos de frios e um aumento da frequência dos eventos extremos de calor (Lima & Wethey, 2012).

Na zona intertidal, o efeito das marés resulta numa alternância regular entre condições marinhas e condições terrestres. Assim, os organismos que aí habitam (na quase totalidade organismos de ancestralidade marinha) têm que lidar frequentemente com um ambiente potencialmente stressante, tanto em relação à desidratação como à temperatura. Devido a este facto, vários autores têm sugerido que os impactos biológicos das alterações climáticas observar-se-ão em primeiro lugar, e com maior intensidade, nas comunidades intertidais (Helmuth et al., 2006; Harley et al., 2006; Sorte et al., 2010). Por essa mesma razão estas comunidades têm vindo a ser usadas como um modelo de estudo em relação aos efeitos das alterações climáticas nos sistemas biológicos (Helmuth et al., 2006).

Os efeitos do aquecimento global nos organismos intertidais podem-se agrupar em três grandes classes: perturbações na fenologia (e.g. Blanchette et al., 2007; Dong et al., 2008; Moore et al., 2011), alterações nas interações entre espécies (e.g. Sanford, 1999; Sanford et al., 2003; Pincebourde et al., 2008), e mudanças biogeográficas (Berke et al., 2010; Hilbish et al., 2012). Relativamente às mudanças biogeográficas motivadas pelo aquecimento global, estas ocorrem porque o aumento da temperatura promove o aumento das densidades populacionais nas zonas de distribuição mais próximas dos polos (cuja temperatura se torna comparativamente mais amena), e porque os episódios de mortalidade tendem a acumular-se nas zonas equatoriais da distribuição dos organismos (Hawkins et al., 2008), onde os indivíduos estavam já sujeitos a condições adversas, próximas do seu limite fisiológico (Sorte & Hofmann, 2004). A direccionalidade deste efeito torna-se mais evidente com a observação da gradual deslocação das isotérmicas em direção aos polos (Burrows et al., 2011), que por sua vez tem sido acompanhada pela deslocação da área de ocorrência de várias espécies intertidais na mesma direção (e.g. Southward et al., 1994; Herbert et al., 2003; Precht & Aronson, 2004; Mieszkowka et al., 2006, 2007; Lima et al., 2006, 2007; Wethey & Woodin, 2008; Wethey et al., 2011; Jones et al., 2012). Apesar de a maioria das espécies aparentar estar em sintonia com os grandes padrões climáticos, várias espécies apresentam alterações da área de ocorrência na direção oposta, em aparente contradição com o padrão acima descrito (Lima et al., 2007). No entanto, uma análise mais detalhada revela que nestes casos a

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lógica subjacente é semelhante, porém a influência das condições locais sobre os grandes padrões climáticos e oceanográficos (e.g., existência de episódios de upwelling) revelou-se suficiente para contrariar a homogeneidade inicial do sistema (e.g. Sagarin et al., 1999; Hilbish et al., 2010).

Muito embora o conjunto de evidências relacionando mudanças da distribuição geográficas de espécies com alterações climáticas seja já bastante vasto, poucos estudos se debruçaram nos mecanismos fisiológicos que medeiam estes processos (no entanto, ver Sorte & Hofmann, 2004). O presente trabalho tenta aprofundar este assunto, analisando os padrões de stress térmico ao longo da parte Atlântica da distribuição geográfica da lapa comum, a Patella vulgata. Esta espécie é um bom modelo para a realização deste tipo de trabalhos porque apresenta uma distribuição setentrional (pode ser, portanto, qualificada como espécie de água fria) abarcando a maioria da costa Atlântica europeia (excepto na zona central da Baía da Biscaia), e cujo limite sul se situa no Algarve, sul de Portugal (Southward et al., 1994; R. Seabra, comunicação pessoal). Ao longo da sua distribuição, a P. vulgata está sujeita a uma variedade de condições climáticas e oceanográficas, possibilitando testar várias hipóteses relativas às condicionantes da sua distribuição geográfica. Para além disso, é uma espécie de fácil identificação no campo, permitindo facilmente a obtenção de densidades in situ e a demarcação dos seus limites de distribuição. Em acréscimo, esta é uma espécie chave nas comunidades intertidais (Thompson, 1980), destabilizando e reduzindo o domínio de várias espécies de macroalgas através da herbivoria, promovendo assim a biodiversidade (Coleman et al., 2006; Firth & Crowe, 2008). Assim os resultados obtidos neste trabalho podem ser importantes para melhor compreender o funcionamento dos ecossistemas intertidais.

Recentes avanços tecnológicos ao nível da microeletrónica têm permitido o desenvolvimento de sensores e registadores de dados ambientais de pequenas dimensões, que têm vindo a ser aplicados à ecologia de uma forma cada vez mais frequente. As robolapas são um exemplo claro desta transferência tecnológica. São aparelhos de pequenas dimensões, autónomos e com capacidade para registar a temperatura tal como experienciada por indivíduos do género Patella no seu habitat natural (Lima & Wethey, 2009; Lima et al., 2011). Num recente estudo, Seabra e colaboradores utilizaram robolapas para registar os perfis de temperatura corporal de Patella spp. numa grande variedade de micro-habitats ao longo da Península Ibérica, durante cerca de 18 meses (Seabra et al., 2011). Estes autores concluíram que embora existam diferenças latitudinais nas temperaturas a que os animais estão sujeitos, a maior fração da variabilidade está associada com diferenças no grau de exposição à radiação solar, i.e., indivíduos habitando micro-habitats orientados a sul (expostos ao sol) estão sujeitos

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a uma amplitude térmica vastamente superior à amplitude térmica experienciada por indivíduos encontrados nas faces das rochas com orientação oposta (orientadas a norte, à sombra). Embora este estudo tenha mostrado uma diferença dramática entre as condições térmicas nos micro-habitats sul e norte, ficou por esclarecer qual a importância fisiológica dessas diferenças térmicas.

Neste estudo utilizaram-se robolapas para obter perfis térmicos nos micro-habitats de 17 localidades na costa Atlântica europeia, e recorreu-se à biologia molecular (western blotting) para determinar o stress térmico através da quantificação da concentração tecidular de proteínas de stress térmico (HSP) em indivíduos de P. vulgata colhidos nesses mesmos micro-habitats. Assim procurou-se investigar de que forma a temperatura está relacionada com a produção de HSP, e esclarecer se as diferenças de temperatura se traduzem em diferenças ao nível de stress térmico.

As proteínas de stress térmico (HSP) são virtualmente produzidas por todos os organismos ao longo da totalidade do seu ciclo de vida (Frydman, 2001), sendo que a sua concentração é mais elevada após exposição a um ou mais fatores de stress. Estes fatores de stress podem ser temperaturas extremas, ou outras situações de stress (e.g., exposição a metais pesados, poluentes, antibióticos, agentes patogénicos ou elevados níveis hormonais; Kiang & Tsokos, 1998). Existem várias famílias de HSP, que se distinguem através do peso molecular. Neste trabalho será dado ênfase às HSP 70, pois os principais fatores de stress que induzem a sua síntese são a temperatura, agentes patogénicos e compostos químicos (Kiang & Tsokos, 1998; Simoncelli et al., 2010).

O processo de formação das HSP70 baseia-se no estabelecimento de ligações entre os monómeros existentes na célula denominados Fatores de Stress Térmico (heat shock factors -HSF) e os Elementos de Stress Térmico (heat shock elements - HSE), que são genes responsáveis pela resposta térmica (Fernandes et al., 1994; Kiang & Tsokos, 1998; Guertin & Lis, 2010). As proteínas resultantes deste processo (hsc70, proteínas de stress térmico constitutivas), são imediatamente funcionais e assumem um papel importante na manutenção da integridade celular. No entanto, após a exposição a fatores de stress, a produção de hsc70 aumenta consideravelmente, e parte deste conjunto de moléculas associa-se à co-chaperona HSP40 (pertencente ao domínio DnaJ) dando origem às proteínas de stress térmico induzido (hsp70, ver Frydman, 2001).

As proteínas pertencentes à família HSP70 (hsc70 e hsp70) atuam como chaperonas, isto é, ajudam na organização dos organelos celulares permitindo a sua importação e/ou exportação da célula (Feder & Hofmann, 1999), estabilizam o dobramento de cadeias

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polipeptídicas evitando a sua degradação (Frydman, 2001), alteram a atividade enzimática (Kiang & Tsokos, 1998), e restauram a estrutura nativa das proteínas desnaturadas (Sagarin & Somero, 2006). Estas funções são essenciais para a sobrevivência, reduzindo a desnaturação proteica e assim conferindo tolerância à hipotermia, à hipertermia e à radiação ultravioleta (Feder & Hofmann, 1999). Devido ao rápido processo de produção das hsp70 face a um evento de stress, é um excelente marcador biológico, possibilitado mesmo a deteção de baixos níveis de stress (Feder & Hofmann, 1999). Devido a este facto, numerosos autores têm vindo a usar a quantificação das hsp70 para medir a intensidade da exposição de vários organismos a temperaturas extremas (Hofmann & Somero, 1995; Dilorio et al., 1996; Place et al., 2004; Snyder & Rossi, 2004; Dong et al., 2011; Lyytinen et al., 2012).

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O presente trabalho teve como objetivo analisar os níveis de stress térmico da Patella vulgata em diversos micro-habitats e ao longo de grande parte da sua presente distribuição geográfica. Para tal, definiram-se realizar três tarefas fundamentais:

1- Determinar os níveis de HSP70 presentes em indivíduos colhidos em micro-habitats contrastantes do ponto de vista térmico (rochas voltadas a sul vs. rochas voltadas a norte); 2- Analisar latitudinalmente a variação dos níveis de HSP70;

3- Relacionar os níveis de HSP70 obtidos com os perfis de temperatura observados em cada combinação localidade/micro-habitat;

Na discussão deste trabalho aborda-se também a importância dos resultados obtidos para a previsão do impacto que os efeitos das alterações climáticas poderão causar na atual distribuição da P. vulgata na costa Atlântica europeia.

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1.

Área de estudo

A área de estudo englobou 17 praias rochosas na costa Atlântica europeia, distribuídas por cinco países (Portugal, Espanha, França, Reino Unido e Irlanda, ver Figura 1). As praias amostradas foram Alteirinhos, São Lourenço, Mindelo e Moledo (Portugal), Touriñan, La Caridad e San Vicente de la Barquera (Espanha), Biarritz, Royan, Le Croisic e Landunvez (França), Wembury, Isle Anglesey e South Cairn (Reino Unido) e Minard Castle e Emlagh (Irlanda).

Figura 1: Localização das praias amostradas (círculos pretos), ao longo da costa Europeia ocidental.

As praias foram selecionadas não só em função da acessibilidade e da distância entre cada uma (de forma a que fosse logísticamente possível fazer o trabalho), mas principalmente em função de possuírem lajes rochosas na zona médio-superior do intertidal (habitat da P. vulgata, ver Branch, 1981), orientadas de acordo com os ângulos requeridos para o estudo

Baía de Biscaia

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(aproximadamente 180º para a faces rochosas viradas a sul e aproximadamente 0º para as faces orientadas a norte).

2. Temperaturas

As robolapas utilizadas no âmbito deste trabalho foram manufaturadas de acordo com Lima & Wethey (2009). As robolapas são constituídas por uma bateria de lítio que está ligada a um microchip reprogramável de leitura de temperaturas e armazenamento de dados (iButton DS1922L, Dallas semiconductor), inseridos dentro de uma concha de Patella spp e isolados da água do mar com uma resina (3M Scotchcast 2130 Flame Retardant Compound). As robolapas são instrumentos autónomos, pois colhem dados sem necessidade de supervisão, são inconspícuos, dificultando a sua destruição intencional por pescadores e curiosos, e apresentam características térmicas semelhantes aos indivíduos de Patella spp, pois possuem a mesma cor, forma e tamanho (Lima & Wethey, 2009; Lima et al., 2011). As robolapas possuem dois contactos elétricos externos feitos a partir de uma liga metálica à prova de corrosão pela água do mar (constantan, part EXPP- T-14, Omega Engineering) o que possibilita a recolha dos dados e a reprogramação dos sensores sem haver necessidade de os retirar da rocha (Lima & Wethey, 2009).

Os sensores foram colocados na rocha com uma resina de fixação rápida (Z-spar, Kop-Coat Inc., Pittsburgh, Pennsylvania, USA). Todos os sensores foram colocados no nível médio intertidal, situado na zona dominada pelos mexilhões (Mytilus spp.). Em cada praia, as robolapas foram colocadas em micro-habitats opostos, i.e. em faces orientadas a norte (com menor exposição à radiação solar) e em faces orientadas a sul (com maior exposição à radiação solar). Em cada micro-habitat colocaram-se três réplicas, perfazendo um total de 6 robolapas por praia.

A programação das robolapas foi feita no campo, recorrendo a um cabo telefónico para estabelecer a comunicação entre o sensor e um leitor portátil criado especificamente para a tarefa (NS-71, Newshift Lda., Leiria, Portugal). Este aparelho permite descarregar os dados de temperatura das robolapas para um cartão Secure Card (SD) (Lima et al., 2011). Os registos de temperatura foram posteriormente lidos e processados com o software R (versão 2.15.1, R Development Core Team, 2011). As robolapas foram programadas para recolher dados a cada 40 minutos e com uma resolução de 0.0625°C, de forma a obter uma periocidade entre descargas manuais de dados de quase 6 meses.

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3.1. Recolha de amostras

Durante as marés baixas em período de sizígia (marés que ocorrem nas luas nova e cheia, quando os efeito lunares e solares se reforçam produzindo marés de elevada amplitude) em junho e agosto de 2011, colheram-se em cada um dos locais em estudo oito indivíduos em micro-habitats expostos à radiação solar (doravante designados por indivíduos S) e oito indivíduos em micro-habitats orientados a norte ou fendas nas rochas (doravante designados por indivíduos N). A recolha de espécimes revelou-se impossível em duas praias: em Biarritz (sudoeste de França), devido à ausência de P. vulgata na zona central da Baía da Biscaia, e em Evaristo (Algarve, sudoeste de Portugal), praia situada para além do limite sul absoluto de distribuição desta espécie. Todos os indivíduos recolhidos foram imediatamente congelados em gelo carbónico e transportados até ao laboratório, onde foram armazenados a -80°C.

3.2. Western Blotting 3.2.1.Extração proteica

Para o tratamento das amostras foi necessário separar as proteínas de cada amostra dos restantes constituintes do tecido extraído. Esta extração consistiu na imersão de cerca de 20 mg de músculo de P. vulgata, em 600 µl de tampão de homogeneização (0.4% TRIS-HCl, 2% Sulfato Dodecil de Sódio, 1% Ácido EtilenoDiamino Tetra-Acético, 72% Água destilada, 1% Protease inhibitor cocktail (Thermo Scentific #78444, VWR, PT), pH 6.8). As amostras foram incubadas 5 minutos a 100°C e trituradas 5 minutos a 30 Hz repetindo este processo duas vezes e usando um homogeneizador mecânico (Retsch MM400, DE). Por último, centrifugou-se o homogeneizado 15 minutos a 14000 rpm (5400 g) a 10°C, e guardou-centrifugou-se o sobrenadante a -80°C.

Para a determinação da concentração de proteína total contida em cada amostra utilizou-se o método de Bradford, utilizando o kit BCA Protein assay reagent (Pierce #23225 Kit reagent, Fischer). Para a calibração do ensaio colorimétrico recorreu-se a diluições com concentração conhecida de albumina de soro de bovino (Pierce #23210, Fisher, PT).

3.2.2.Eletroforese

A eletroforese permite a separação de todas as proteínas dos extratos de acordo com o seu peso molecular. As amostras previamente armazenadas a -80°C foram fervidas durante 5 minutos a 100°C numa placa de aquecimento, seguindo-se a adição de Laemmli Sample Buffer 1:1 (v/v) (Sigma, PT). Para a eletroforese foram utilizados géis de poliacrilamida (4% staking gel e 7.5% resolving gel). Num poço de cada gel adicionou-se Recombinant Human HSP70B'

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Protein (Stressgen, #SPP-762, Citomed) com uma concentração conhecida, de forma a permitir a posterior quantificação exata das bandas de HSP70 obtidas. Noutro poço de cada gel adicionou-se uma porção de uma amostra comum (i.e., resultante de uma única extração e usada em todos os géis), de forma a permitir determinar o desvio-padrão entre géis. Nos restantes poços foram adicionadas iguais quantidades de proteína (15 µl) das amostras a analisar, previamente quantificadas utilizando o método de Bradford (ver a cima). Posteriormente foi realizada a eletroforese (20 minutos a 100 volts seguido de 65 minutos a 120 volts) numa solução de running buffer (1.4% Glicina, 0.3% TRIS Base, 0.1% Sulfato Dodecil de Sódio até 1 litro de Água destilada, pH 8.3)

3.2.3.Transferência

Esta fase permite passar as proteínas do gel para uma membrana de modo a possibilitar o contacto entre as proteínas e os anticorpos utilizados na fase seguinte. Para tal, o gel e respetiva membrana de Flureto de Polinilideno, PVDF (0.45 µm, Fischer, PT), foram comprimidos de modo a possibilitar um contacto direto entre ambos, utilizando para o efeito um sistema de transferência proteica (#170-3930, BioRad, PT). De seguida, o gel e a membrana foram imersos numa solução de transfer buffer (0.03% Glicina, 0.06% TRIS Base, 79% Água destilada e 20%de Metanol), e submetidos a uma corrente elétrica de 100 volts, durante 35 minutos.

3.2.4.Imunodeteção

Por último utilizaram-se anticorpos específicos para detetar as HSP70, de modo a permitir a sua posterior quantificação em relação a uma banda standard. Após a transferência colocou-se a membrana numa máquina de vácuo e realizou-se o bloqueio desta com uma solução de NFDM (0.1% Leite magro em pó, 0.2%Tween), numa solução salina de tampão fosfato (0.2% Fosfato de sódio monobásico, 1.1% Fosfato de sódio dibasico, 8.5% Cloreto de sódio, em Água destilada). De seguida procedeu-se à incubação da membrana durante 10 minutos com anticorpo primário (#MA3-006, Thermo scientific, Fischer, PT) e anticorpo anti-tubulina (Monoclonal anti-α-tubulin, #T5168, Sigma, PT) diluídos numa proporção de 1:1000 e 1:8000 respetivamente, numa solução de NFDM. A utilização do anticorpo anti-tubulina permitiu a quantificação para cada amostra, da quantidade de proteína house-keeping tubulina. Este método permitiu assim a deteção e posterior correção de possíveis erros inerentes à utilização da técnica western blotting. Após os 10 minutos efetuaram-se 3 lavagens com 15 ml de PBST (PBS+0.2%Tween) cada uma. De seguida efetuou-se a incubação da membrana com

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anticorpo secundário (Amershan, #NA931-1ML, VWR) diluído na proporção de 1:1000 numa solução de NFDM durante 10 minutos, e novamente 3 lavagens com PBST. Por último, a membrana foi colocada 1 minuto em reagente de deteção ECL (Amersham ECL western blotting detection reagents, GE#RPN 2106, VWR) e exposta a uma película fotográfica (Amersham Hyperfilm ECL, GE#28-9068-37, VWR) durante 2-7minutos. A película fotográfica foi de seguida digitalizada, e as bandas de HSP70 e de tubulina foram quantificadas usando o programa ImageJ (versão 1.4, Abramoff et al., 2004).

4. Análise estatística

Neste estudo foram analisadas dezasseis amostras por praia, das quais metade eram indivíduos N e as restantes indivíduos S (i.e., oito réplicas por cada micro-habitat). Para investigar as diferenças entre os níveis de HSP70 existentes entre as praias e orientações em estudo, efetuou-se uma análise de variância simples (ANOVA), considerando diferenças significativas as que apresentaram uma probabilidade inferior a 0.05. A homogeneidade das amostras foi avaliada utilizando o teste de Cochran. Para executar a ANOVA e ao teste de homogeneidade recorreu-se à página web http://www.fc.up.pt/pessoas/amsantos/anova.php, e para determinar as correlações entre os perfis de temperatura e os níveis de HSP70 recorreu-se ao software estatístico R (versão 2.15.1, R Development Core Team, 2011).

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Foram obtidas e processadas amostras de todos os locais da área de amostragem, exceto dos dois locais propositadamente escolhidos em zonas fora da área de ocorrência da P. Vulgata (Biarritz, França e Evaristo, Portugal). Para cada micro-habitat (i.e., combinação entre praia e orientação) foram processadas amostras provenientes de oito indivíduos. Em todas as praias amostradas os níveis médios de HSP70 foram sempre superiores nos indivíduos S em comparação com os indivíduos N, como evidenciado na Figura 2.

Figura 2: Níveis médios de HSP70 presentes nos indivíduos de P. vulgata colhidos no verão de 2011 ao longo da área de estudo. As barras vermelhas representam a média dos valores obtidos utilizando indivíduos S e as barras azuis os valores obtidos utilizando indivíduos N. As barras de erro representam o desvio-padrão associado a cada valor médio.

Adicionalmente, verificou-se a existência de dois grupos no padrão latitudinal de produção de HSP70, correspondendo às duas zonas contíguas de distribuição de P. vulgata na costa Atlântica europeia (Figura 2). No grupo norte (de Emlagh, Irlanda a Royan, França) os níveis médios de HSP70 são relativamente semelhantes nos indivíduos S, com duas exceções:

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Minard Castle (Irlanda), que apresenta níveis médios de HSP70 mais baixos do que as restantes praias do grupo norte, e Royan (França), que apresenta a situação inversa. Relativamente aos indivíduos N, os níveis médios de HSP70 são semelhantes entre quase todas as praias, destacando-se apenas Royan por apresentar níveis superiores. No segundo grupo, o grupo sul (de San Vicente de la Barquera, Espanha a Alteirinhos, Portugal), existe um gradiente mais claro nos níveis médios de HSP70 dos indivíduos S. Os indivíduos N apresentam um gradiente semelhante, mas menos acentuado, com a exceção de Alteirinhos. Nesta praia, mesmo os indivíduos N (abrigados da radiação solar) apresentam valores médios de HSP70 elevados, inclusivamente superiores aos valores médios de HSP70 observados nos indivíduos S em quase todas as restantes praias da área de estudo.

Apesar destas diferenças é interessante notar que em ambos os grupos as praias mais a sul apresentam níveis médios de HSP70 superiores, independentemente da exposição do micro-habitat, bem como que os valores absolutos dos níveis médios de HSP70 dos dois grupos se revelaram equiparáveis, sendo San Vicente de la Barquera, no norte de Espanha, uma das praias com o nível médio de HSP70 mais baixo.

De forma a avaliar o nível de significância das diferenças identificadas realizou-se uma análise de variância simples (ANOVA) utilizando o fator aleatório ‘praia’ e o fator fixo ‘orientação’. A homogeneidade das variâncias dos dados foi avaliada recorrendo a um teste de Cochran (P=0.158 > 0.05), de forma a garantir o cumprimento deste pressuposto da ANOVA.

Tabela 1: Resultados da análise de variância simples (ANOVA) para testar o efeito do local de amostragem e da orientação da superfície da rocha nos níveis médios de HSP70 observados em P. vulgata

na área de estudo.

Fatores SS DF MS FR P Testado contra Praia 0.167 14 0.012 8.583 0.000 Erro Orientação 0.193 1 0.193 138.724 0.000 Erro Praia*Orientação 0.029 14 0.002 1.472 0.123 Erro Erro 0.292 210 0.001 Total 0.681 239

Os resultados da ANOVA revelaram a existência de diferenças significativas (P < 0.05) tanto para o fator ‘praia’ como para o fator ‘orientação’ (Tabela 1). Estes resultados indicam que os níveis de HSP70 detetados são significativamente diferentes de acordo com a praia em análise e com a orientação da rocha de onde os organismos foram recolhidos. A Tabela 1 mostra também a ausência de interação (P > 0.05) entre os fatores praia e orientação.

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Para melhor compreender a forma como o stress térmico é influenciado pela temperatura procedeu-se à análise do grau de correlação entre diversos aspetos dos perfis de temperatura registados no campo e os níveis médios de HSP70 detetados (Figura 3).

Figura 3: Correlação entre os níveis médios de HSP70 de indivíduos de P. vulgata e as temperaturas a que estes estiveram expostos antes da sua recolha, em função do tamanho da janela temporal amostrada.

Os quatro aspetos analisados foram o percentil 90 da temperatura durante o período de emersão, a média de todos os valores de temperatura registados, e a temperatura máxima absoluta durante a imersão e emersão. Os valores de cada um destes parâmetros foram calculados para janelas de tempo desde um dia (dia anterior ao da colheita) até um ano (últimos 365 dias antes da colheita, ver Figura 3) para cada micro-habitat, e foi estimada a correlação entre esses valores e o nível médio de HSP70. Através da análise da Figura 3 pode-se constatar a existência de uma forte correlação entre os níveis médios de HSP70 e o percentil 90 e a temperatura máxima absoluta durante a emersão. A temperatura máxima absoluta durante a imersão e a média de todas as temperaturas também se correlacionam com o nível de HSP70, embora em menor grau (Figura 3).

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De forma a investigar com maior detalhe a forte correlação detetada entre o percentil 90 da temperatura durante a emersão e os níveis de HSP70, analisaram-se os dados correspondentes ao ponto máximo dessa correlação (Figura 4). Esta análise revelou que a janela de tempo mais informativa para este parâmetro equivale a cerca de 1.5 meses. Analisando a Figura 4 podemos ainda verificar que os indivíduos N estão sujeitos a temperaturas mais amenas e que exibem níveis médios de HSP70 baixos, em oposição aos indivíduos S que estão sujeitos a temperaturas mais elevadas e que exibem níveis médios de HSP70 também superiores. Mais uma vez, o micro-habitat correspondente aos indivíduos N da praia de Alteirinhos destaca-se por apresentar níveis de HSP70 bastante altos, embora se torne agora evidente que esses níveis resultam de um regime de temperaturas que também é bastante distinto dos restantes micro-habitats não expostos.

Figura 4: Correlação entre o percentil 90 da temperatura do ar observado nos 1.5 meses anteriores à colheita e os níveis médios de HSP70 dos indivíduos de P. vulgata. Os pontos a vermelho representam indivíduos S e os pontos a azul representam indivíduos N.

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No presente trabalho foi realizada a caracterização dos níveis médios de HSP70 em micro-habitats expostos e protegidos da radiação solar, em 15 localidades diferentes abrangendo a maior parte da distribuição da P. vulgata na costa Atlântica europeia. Adicionalmente, foram também registadas as temperaturas a que os organismos estiveram expostos em cada um desses micro-habitats, bem como nos microhabitats de dois locais fora da área de ocorrência, durante cerca de um ano.

O período de atividade da P. vulgata está relacionado, entre outros fatores, com a inclinação do substrato em que o animal se encontra, porém nunca abrange o período de emersão diurna (Wiliams et al., 1999). Durante os períodos de inatividade, os indivíduos de P. vulgata permanecem na sua home scar (depressão formada na rocha pela abrasão provocada pela concha), constituindo provavelmente uma adaptação comportamental para evitar perdas de água e prevenir a desidratação (Branch, 1981). Estes padrões de movimento permitem, para os efeitos deste estudo, considerar estes organismos como sésseis (i.e., embora apresentem movimentos durante a noite e/ou períodos de imersão, em relação ao momento de maior exposição à radiação solar encontram-se restritos sempre ao mesmo micro-habitat). Este padrão de comportamento foi recentemente confirmado através da marcação e monitorização mensal dos movimentos de várias centenas de indivíduos de P. vulgata em várias praias na costa Portuguesa durante cerca de um ano (Lima et al., dados não publicados). Por essa razão é seguro assumir que os registos de temperatura obtidos utilizando as robolapas representam largamente as temperaturas a que as lapas posteriormente recolhidas estiveram expostas.

Os resultados obtidos em relação aos níveis de HSP70 evidenciaram duas fontes de variabilidade: dentro de cada local, e entre locais (Figura 2). Uma vez que a temperatura da água não varia significativamente entre os dois micro-habitats de cada praia (demonstrado pelas diferenças de temperatura inferiores ao limite de medição das robolapas de cada praia; dados não publicados), as diferenças nos níveis de HSP70 observadas dentro de cada local, ou seja, entre indivíduos S e indivíduos N de cada praia, podem apenas ser atribuídas às diferenças de temperatura durante os períodos de emersão. De facto, é sobretudo durante a exposição diurna ao ar que as robolapas em micro-habitats voltados a sul atingem temperaturas muito superiores àquelas atingidas por robolapas nos micro-habitats opostos. Tal significa que as diferenças nos níveis de stress detetados entre os micro-habitats de cada local resultam exclusivamente do fator orientação. Em contrapartida, as diferenças nos níveis de HSP70 entre locais podem resultar de diferenças nas temperaturas durante os períodos de emersão, mas também de diferenças nas temperaturas durante os períodos de imersão. Neste caso, verifica-se a existência de dois grupos no padrão latitudinal ilustrado na Figura 2. No

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grupo norte (de Emlagh, Irlanda a Royan, França) os níveis médios de HSP70 são relativamente semelhantes entre os indivíduos S, ocorrendo o mesmo entre os indivíduos N. Esta região é caracterizada por temperaturas comparativamente baixas, tanto do ar como da água, o que significa que os organismos nestas praias estão sujeitos a regimes térmicos menos agressivos, o que justifica os níveis de HSP70 geralmente moderados.

Relativamente ao grupo sul (de San Vicente de la Barquera, Espanha a Alteirinhos, Portugal), os níveis médios de HSP70 medidos nos indivíduos S aumentam de uma forma gradual em direção ao sul, atingindo o seu valor máximo na praia de Alteirinhos. Por outro lado, os indivíduos N apresentam também um aumento gradual dos níveis médios de HSP70, porém muito mais modesto. Este padrão contrastante de diferenças crescentes entre indivíduos N e indivíduos S em direção a sul é aparentemente explicável através das diferenças nas temperaturas corporais atingidas nos dois micro-habitats ao longo das praias deste grupo. Os dados dos sensores biomiméticos mostraram que a temperatura a que os organismos estiveram sujeitos aumenta desde o norte de Espanha até ao sul de Portugal de forma gradual nos micro-habitats virados a sul, enquanto nos micro-habitats voltados a norte se verifica uma maior homogeneidade nas temperaturas registadas (mesmo entre localidades que distam entre si várias centenas de Km).

A robustez destes padrões é suportada pelos níveis de significância obtidos através da ANOVA (Tabela 1). Por sua vez, a ANOVA permitiu ainda constatar a ausência de interação entre o fator praia e o fator orientação, o que significa que o efeito da orientação nos níveis de HSP70 não varia significativamente nas praias amostradas, e vice-versa. Estes dados mostram que indivíduos expostos a diferentes temperaturas, como resultado de se encontrarem em diferentes praias/orientações, estão também sujeitos a diferentes níveis de stress térmico, corroborando essa mesma hipótese avançada por Seabra e colaboradores (Seabra et al., 2011).

Nas duas zonas geográficas é possível também observar um aumento considerável dos níveis de HSP70 nas localidades mais a sul, já perto dos limites de distribuição da espécie (Royan, na Baia de Biscaia, França, a última praia rochosa onde se pode encontrar P. vulgata antes do hiato na distribuição da Biscaia, e Alteirinhos, na Costa Vicentina, Portugal, já próximo do limite de distribuição absoluto da espécie no Algarve). Este aumento não se verifica somente nos animais expostos à radiação solar (indivíduos S) mas também nos indivíduos protegidos do sol, nos micro-habitats voltados a norte. No verão, estas duas zonas apresentam temperaturas oceânicas bastante elevadas, mesmo na zona de rebentação, excedendo os 20°C durante largos períodos. As temperaturas oceânicas elevadas levam a um aquecimento

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das massas de ar atmosféricas, em particular junto à costa, o que significa que mesmo os indivíduos que estão à sombra estão sujeitos a temperaturas muito altas, ultrapassando os 30°C. Em acréscimo, durante a maré alta, devido ao facto de a temperatura da água do mar ser bastante elevada, não há qualquer possibilidade de recuperar do choque térmico recebido durante a maré baixa. Isto é particularmente problemático uma vez que é nesta fase do ciclo da maré que a P. vulgata está mais ativa (Branch, 1981) e portanto, provavelmente mais vulnerável fisiologicamente. Estes são por ventura os resultados mais interessantes deste trabalho pois sugerem que por um lado há um padrão co-ocorrência de micro-habitats stressantes e não-stressantes do ponto de vista térmico ao longo da distribuição de uma espécie. Por outro lado, mostram que perto dos limites de distribuição não existem micro-habitats não stressantes (refúgios térmicos, portanto), o que muito provavelmente constitui a razão da existência do limite de distribuição naquela zona.

O facto de alguns indivíduos de P. vulgata permanecerem em habitats caracterizados por elevadas temperaturas durante as marés baixas diurnas, e por isso atingirem elevados níveis de stress, sugere que estes possuam estratégias adaptativas para sobreviver a essas condições adversas. Algumas das estratégias descritas são, por exemplo, a adequação da morfologia da concha (Harley et al., 2009) e o recurso a uma home scar (Wiliams et al., 1999). Estas estratégias permitem mitigar as perdas de água e contribuir para um bom funcionamento dos mecanismos intracelulares (Feder & Hofmann, 1999), e, em conjunto com a produção de HSP70, facilitam a sobrevivência destes organismos em ambientes doutra forma inacessíveis. Neste contexto, importa realçar que o recurso à produção de HSP70, bem como a outras estratégias de autoproteção, acarreta custos energéticos não negligenciáveis para os organismos (Heredia-Middleton et al., 2008). A futura realização de estudos sobre esta relação custo-benefício na produção de HSP70 é portanto fundamental para esclarecer de que forma a produção de HSP70 é representativa do stress térmico a que os organismos estão sujeitos.

O facto de os níveis de stress térmico se correlacionarem com os valores de temperatura observados até vários meses antes da colheita sugere que em adição a qualquer stress agudo que possa existir, o stress térmico em causa tem provavelmente também uma importante componente crónica, a longo prazo. Estes dados são portanto cruciais para uma melhor compreensão, modelação e previsão dos efeitos do aquecimento global sobre esta espécie e sugerem que muitas outras espécies sesseis poderão apresentar o mesmo tipo de padrões. Diversos autores mostraram que o efeito crónico da temperatura tem consequências negativas para os organismos estudados, condicionando a quantidades de energia que podem despender para o crescimento, reprodução e funções metabólicas (Helmuth & Hofmann, 2001,

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Pincebourde et al., 2008, Helmuth et al., 2010). O presente trabalho mostra que apesar da existência de diversos estudos sobre esse tema, ainda há muita informação por aprofundar.

Embora ainda estejam por apurar os níveis de HSP70 que correspondem a uma situação letal para a Patella vulgata, os níveis elevados de HSP70 em todos os micro-habitats das localidades na proximidade dos limites de distribuição sugerem que essas populações estejam já fortemente condicionadas do ponto de vista térmico. Esta hipótese é confirmada pelas baixas densidades populacionais observadas nestas localidades (F. Lima et al., dados não publicados). É portanto razoável esperar que com o aumento previsto da temperatura média do ar e da frequência de ondas de calor (Lima & Wethey, 2012), as populações de P. vulgata junto aos limites de distribuição se possam extinguir. Por outro lado, na restante área de distribuição, embora o aumento de temperatura e de condições meteorológicas extremas possam causar mortalidade nos micro-habitats expostos à radiação solar, o facto de existir uma grande abundância de refúgios térmicos em todas as localidades estudadas sugere que só muito dificilmente não haverá hipótese de repovoamento, e portanto uma rápida recuperação dos efetivos populacionais.

Em conclusão, pode-se afirmar que este trabalho vem contribuir para mostrar que o intertidal é um mosaico entre micro-habitats muito stressantes e micro-habitats pouco stressantes, e que a proporção entre ambos deverá ser extremamente importante para o equilíbrio populacional e consequentemente para a dinâmica da área de distribuição geográfica das espécies intertidais a larga escala.

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