UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
CINTIA RODRIGUES MARQUES
TESE DE DOUTORADO
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS
PRESENTES NO CROMOSSOMO X COM ASMA E
ATOPIA
Salvador, BA 2016
ii
CINTIA RODRIGUES MARQUES
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS
PRESENTES NO CROMOSSOMO X COM ASMA E
ATOPIA
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Imunologia
Orientador: Drª. Camila Alexandrina Figueiredo
Salvador 2016
iii
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por estar presente em todos os momentos da minha vida; por me conceder as oportunidades, me instruindo e me guiando pelos caminhos corretos.
Aos meus familiares pelo apoio concedido ao longo desta jornada. Pela credibilidade e confiança.
À Universidade Federal da Bahia por todas as oportunidades concedidas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia pela oportunidade de desenvolver este trabalho e me aperfeiçoar academicamente.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Imunologia que contribuíram para o meu aperfeiçoamento profissional ao longo deste período.
A minha orientadora, Drª Camila Alexandrina Figueiredo, primeiramente pela oportunidade em fazer parte da sua equipe, pelo direcionamento, incentivo e acima de tudo pela confiança em mim depositada. Admiro muito, como pesquisadora e como pessoa!
Ao projeto SCAALA, professores e pesquisadores envolvidos, sem os quais este trabalho não poderia ser desenvolvido, em especial ao Professor Dr. Maurício Lima Barreto.
Aos integrantes dos projetos ProaAR e EPIGEN-Brasil pelas valiosas contribuições na elaboração e aperfeiçoamento de parte importante deste trabalho.
À Dilceia, Juci e Aline por suas qualidades como simpatia, generosidade e competência e por sempre estarem disponíveis para ajudar.
iv A Gustavo pela forma solícita e cordial com que sempre se pôs à disposição para contribuir com o desenvolvimento desta pesquisa.
A Pablo por suas contribuições no primeiro capítulo deste trabalho.
Às colegas Emília, Alana e Tatiane pelas imensas contribuições no segundo capítulo deste trabalho, além do companheirismo.
Às estudantes de iniciação científica Wagma, Monica e Bianca que contribuíram imensamente para a execução deste trabalho.
Aos colegas de laboratório Raimon, Hugo, Norma, Anaque, Gerson e Hellen por proporcionarem um ambiente descontraído e agradável.
À Valdirene por sua amizade e por sempre estar disposta em colaborar, além das contribuições para o desenvolvimento deste trabalho.
Às grandes amizades que conquistei nesta etapa da minha vida, Ryan e Tamires, pelo companheirismo e por compartilhar momentos descontraídos e eternamente memoráveis. Serei eternamente grata!
A Thiago, primeiramente, pela valiosa contribuição neste trabalho e por seu companheirismo, simplicidade, paciência e dedicação. Agradeço por estar presente todos esses anos, tornando os meus dias muito especiais.
A todos os pacientes e seus familiares sem os quais este trabalho não seria possível.
À CAPES, pela concessão da bolsa de doutorado.
À FAPESB pelo suporte financeiro na aprovação do projeto, do qual este trabalho faz parte.
v
Se espalharmos coisas boas por
onde passar, a vida se carrega de
trazer outras melhores ainda.
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RESUMO
MARQUES, Cintia Rodrigues. AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS PRESENTES NO CROMOSSOMO X COM ASMA E ATOPIA. 76f. 2016. Tese (Doutorado) – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia.
Asma e atopia são condições determinadas por fatores genéticos e ambientais, que podem atuar tanto independentemente quanto em interação. Diversos estudos de associação ampla do genoma têm sido desenvolvidos para tentar compreender quais componentes genéticos influenciam na asma. No entanto, genes localizados no cromossomo X são frequentemente pouco representados. Um dos genes localizados nesse cromossomo, o FOXP3, codifica uma fator de transcrição que está diretamente relacionado à ativação e diferenciação de células T regulatórias. Tais células constituem um importante mecanismo relacionado ao controle de doenças alérgicas. Diversos polimorfismos já foram descritos nas regiões codificante e regulatória do FOXP3, o que sugere que os
mesmos possam ter um impacto funcional sobre a proteína correspondente. Desta forma, fatores genéticos que afetam o gene FOXP3 podem determinar diferenças na susceptibilidade a doenças alérgicas, tais como a asma. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o impacto de polimorfismos em genes localizados no cromossomo X, a exemplo FOXP3, no desenvolvimento da asma e atopia. Para analisar a associação de polimorfismos presentes no cromossomo X e asma, foi realizado um X-WAS (Estudo da Associação Ampla do Cromossomo X). Já para verificar a associação de polimorfismos no gene FOXP3 com asma e atopia foi realizado um estudo de gene-candidato. Como resultados mais importantes destaca-se a associação do polimorfismo rs12007907 no gene IL1RAPL com sintomas de asma (P = 3.33x10-6; OR=0.49, 95% IC= 0.37 - 0.67) e níveis de produção de IL-13 (p = 0.045) no X-WAS; a associação dos polimorfismos no gene FOXP3 rs2232368 (OR = 1,95; 95% IC= 1.04 – 3,66) com sintomas de asma, rs2232368 (OR = 2,31; 95% IC= 1,16 – 4,59), rs3761549 (OR = 1,44; 95% IC= 1,028 – 2,018) e rs2280883 (OR = 0,836; 95% IC= 0,704 – 0,992) com atopia, além da interação entre o rs2280883 no FOXP3 e infecção com EBV no desenvolvimento de atopia definida por SPT (OR = 0,64; 95% IC: 0,47 – 0,87) e IgE específico para aeroalérgenos (OR = 0,62; 95% IC: 0,46 – 0,83). Estes achados sugerem que polimorfismos em genes do cromossomo X, dentre eles
FOXP3 e IL1RAPL, possuem impacto no desenvolvimento de asma e alergia
em nossa população. No entanto, novos estudos devem ser conduzidos na tentativa de elucidar melhor o impacto funcional destes polimorfismos aqui descritos no desenvolvimento de asma e alergia, além da replicação em outras populações.
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ABSTRACT
MARQUES, Cintia Rodrigues. ASSOCIATION OF EVALUATION OF POLYMORPHISMS PRESENTS THE X CHROMOSOME WITH ASTHMA AND ATOPY. 76f. 2016. Tese (Doutorado) – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia.
Asthma and atopy are conditions determined by genetic and environmental factors, which can act independently and in interaction. Several Genome Wide Association Studies has been conducted to try to understand which genetic components influence asthma. However, genes located on the X chromosome are often underrepresented. One of the genes located in this chromosome, the
FOXP3, encodes a transcription factor that is directly related to the activation
and differentiation of regulatory T cells. Such cells are an important mechanism related to the control of allergic diseases. Several polymorphisms have been described in coding and regulatory regions of the FOXP3, which suggests that they may have a functional impact on the corresponding protein. Thus, genetic factors affecting the FOXP3 gene can determine differences in susceptibility to allergic diseases such as asthma. In this context, this study aimed to assess the impact of polymorphisms in genes located on the X chromosome, such the
FOXP3, in the asthma and atopy risk. To analyze the association between
polymorphisms on chromosome X and asthma, it was carried out an X-WAS (Study of Wide Association of Chromosome X). To verify the association of polymorphisms in the FOXP3 gene with asthma and atopy, a gene-candidate study was conducted. The meaningful results were the association of rs12007907 polymorphism in IL1RAPL gene with asthma symptoms (p = 3.33x10-6; OR = 0.49, 95% CI = 0.37 - 0.67) and IL-13 production levels (p = 0.045) in X-WAS; furthermore we observed association of rs2232368 in the
FOXP3 gene with asthma symptoms (OR = 1.95; 95% CI = 4.1 - 3.66) and a
association with atopy for the rs2232368 (OR = 2.313; 95% CI = 1.16 to 4.59), the rs3761549 (OR = 1.44; 95% CI = 1.03 to 2.02) and rs2280883 (OR = 0.836, 95% CI = 0.70 to 0.99). In addition, we reported an interaction between the rs2280883 located on FOXP3 and infection with EBV in the atopy development defined by SPT (OR = 0.64; 95% CI: 0.47 - 0.87) and specifc IgE to allergens (OR = 0.62; 95% CI: 0.46 - 0.83). These findings suggest that polymorphisms in genes of the X chromosome, including FOXP3 and IL1RAPL, have potential impact on the development of asthma and allergy in our population. However, further studies should be conducted to elucidate the functional impact of these polymorphisms described in this study in the asthma and atopy, as well as replication in other populations.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Prevalência de sintomas de asma no mundo em crianças entre 13-14 anos...14 Figura 2. Caracterização dos fenótipos de células T helper...16
Figura 3. Genes identificados para asma através de GWAS...19
Artigo 1:
Figure 1. Manhattan plot of X chromosome-wide association results………….32 Figure 2. Quantile-quantile plot for childhood asthma symptoms in the discovery population………..33 Figure 3. Regional plot for logistic regression results……….34 Figure 4. Geometric means for IL-13 production according to rs12007907 genotypes………..34
Artigo 2:
Figure 1. Mechanism of asthma development……….49 Figure 2. Schematic diagram of the FOXP3 gene (a), protein (b) and X Chromosome………....50
Artigo 3:
Figura 1. Interação gene-ambiente do SNP rs2280883 com infecções para EBV no desenvolvimento de atopia...64
ix
LISTAS DE TABELAS:
Artigo 1:
Table 1. The twenty most associated SNPs in the X chromosome-wide association with asthma symptoms………...33 Supplemental Table 1. In silico analysis of the properties of IL1RAPL1 polymorphisms in linkage disequilibrium (LD) with rs12007907 (r2>0.6) and association with symptoms of asthma in SCAALA cohort………...43 Supplemental Table 2. Association of IL1RAPL1 rs12007907 polymorphism with asthma in different cohorts………...43 Supplemental Table 3. One hundred most associated SNPs in the X chromosome-wide association with asthma symptoms………...………..43
Artigo 2:
Table 1. FOXP3 SNPs investigated for association with asthma and allergy…….………52 Table 2. FOXP3 epigenetic studies investigated for association with asthma and allergy………...53
Artigo 3:
Tabela 1. Análise de concordância para a genotipagem do SNP rs2280883 métodos dede RT-PCR e Ilumina...62 Tabela 2. Associação entre polimorfismos no gene FOXP3 e sintomas de asma...62 Table 3. Associação entre polimorfismos no gene FOXP3 e SPT e IgE para aeroalérgenos...63 Table 4. Associação entre polimorfismos no gene FOXP3 e asma em crianças atópicas e não atópicas...64
x
LISTAS DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
Chr: Cromossomo (Chromossome)
CI: Intervalo de Confiança (confidence intervals)
DACH2: Fator de transcrição da família Dascshund (Dachshund Family
Transcription Factor)
DNA: Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleicacid) EBV: Vírus Epstein-Barr (Epistein Barr Virus)
FOXP3: Forkhead box P3
GALA II: Genes-environments & Admixture in Latino Americans study
GM-CSF: fator estimulante de colônia de granulócitos e monócitos
(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
GWAS: Estudo de Associação Ampla do Genoma (Genome Wide Association
Studies)
HAV: Vírus Hepatite A (Hepatitis A virus) Ig: Imunoglobulina (Immunoglobulin) IL: Interleucina (interleukin)
IL1RAPL1: proteína tipo acessória de IL-1R (IL-1R acessory protein-like) iNKTs: células T NK invariante (Invariant natural killer T)
IPEX: Síndrome da imunodesregulação, poliendocrinopatia e enteropatia ligada ao cromossomo X (immunedysfunction, polyendocrinopathy, enteropathy,
X-linked)
LD: Desequilíbrio de ligação (linkage disequilibrium) MAF: alelo de menor frequência (minnor allele frequence) MIF: Frequência de dados perdidos (missing frequency) MZT: Gêmeos monozigóticos (monozygotic twins)
NFAT: Fator de transcrição nuclear de células T ativadas (Nuclear factor of
activated T-cells)
OR: Razão de chances (Odds ratio) OVA: Ovoalbumina (ovalbumin)
PFT: teste de função pulmonar (Pulmonary Function Testing)
ProAR: Programa Para o Controle da Asma e da Rinite Alérgica na Bahia (Asthma and Allergic Rhinitis Control Program in Bahia)
PWM: pokeweed
QQ-plot: gráfico quantil-quantil (quantile-quantile-plot)
RT-PCR:reação da transcriptase reversa (Reverse transcription polymerase
chain reaction)
SCAALA: Mudanças sociais asma e alergia na América Latina (Social Changes
Asthma and Allergy in Latin America)
SNP: polimorfismo de nucleotídeo único (single-nucleotide polymorphisms) SPT: Teste cutâneo (Skin Prick Test)
Th: Células T auxiliaries (T helper)
TLR: Receptor tipo toll (Toll-Like Receptor) Tregs: Células T regulatórias (T regulatory cells) UTR: região não traduzida (untranslated region)
X-WAS: Estudo de Associação Ampla do Cromossomo X (X Chromosome
xi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 12
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 14
2.1. Doenças alérgicas ... 14
2.2. Imunopatogênese das doenças alérgicas ... 155
2.3. Proteína e gene FOXP3 nas doenças alérgicas ... 188
2.4. Interações gene-ambiente na asma e atopia... 20
3. OBJETIVOS ... 221
3.1. Geral ... 221
3.2. Específicos ... 221
4. MANUSCRITO 1: X Chromosome Wide Association Study revels a member of the IL1R’s family associated with asthma ... 22
4.1. Abstract ... 24 4.2. Introduction ... 26 4.3. Methods ... 27 4.4. Results... 30 4.5. Discussion ... 35 4.6. References ... 39 4.7. Supplementary material ... 43
5. MANUSCRITO 2: Genetic and Epigenetic Studies of FOXP3 in Asthma and Allergy ... 46
5.1. Abstract ... Erro! Indicador não definido. 5.2. Backgroud ... Erro! Indicador não definido. 5.3. FOXP3, Asthma and Allergies ... Erro! Indicador não definido. 5.4. Structure and function of FOXP3 ... 48
5.5. The role of FOXP3 polymorphism in asthma and allergic diseases ... 50
5.6. Epigenetic regulation of FOXP3 in asthmaErro! Indicador não definido. 5.7. Conclusions ... Erro! Indicador não definido. 5.8. References ... 54
6. MANUSCRITO 3: Impacto dos polimorfismos no gene FOXP3 e fatores ambientais no desenvolvimento de asma e atopia ... 57
6.1. Resumo ... 57 6.2. Introdução... 58 6.3. Métodos ... 59 6.4. Resultados ... 61 6.5. Discussão ... 65 6.6. Conclusão... 68 6.7. Referências ... 69 7. CONCLUSÃO GERAL ... 71 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 72
12
INTRODUÇÃO
A asma é uma doença complexa, determinada por interações entre fatores genéticos do hospedeiro e fatores ambientais (1, 2). Estima-se que 334 milhões de pessoas em todo o mundo tenham asma, e a prevalência desta doença vem aumentando nas últimas décadas entre crianças que vivem em países industrializados e mais recentemente nos países em desenvolvimento, onde esse aumento pode estar ligado a mudanças ambientais associadas à urbanização e à aquisição de um estilo de vida "moderno" (3).
Para identificar a influência dos fatores genéticos na determinação da asma, estudos do tipo GWAS (Genome Wide Association) e gene candidato tem sido realizado e através destes, já foram identificadas múltiplas regiões no genoma humano contendo vários genes associados a diversas doenças alérgicas (4-6). Neste sentido, estudos envolvendo a expressão e função de células Treg (células T regulatórias) poderiam fornecer importantes dados sobre o impacto dessas células no desenvolvimento da asma. Um importante fator de transcrição relacionado ao desenvolvimento e função de células Treg é, o FOXP3, codificado pelo gene de mesmo nome e localizado no cromossomo X. Embora o FOXP3 seja considerado o marcador mais específico de identificação de células Treg (7, 8),
poucos estudos foram realizados analisando a associação deste gene com asma e atopia. Além disso, há um crescente reconhecimento da importância da interação gene-ambiente na determinação da asma (9-11). A existência deste tipo de interação pode resultar no aparecimento de associações genéticas apenas em ambientes específicos (12). Dessa forma, fatores ambientais tais como exposição a infecções podem determinar a ocorrência ou não de determinada condição de acordo com o background genético do indivíduo em questão. Há evidências que certos patógenos virais como Hepatitis A virus (HAV), Herpes simplex, Herpes zoster e Epstein-Barr podem modular marcadores de alergia (13). Além disso, acredita-se que essas infecções podem mediar o efeito dos polimorfismos sobre os desfechos de interesse, no caso asma e atopia. Alguns polimorfismos são fortemente associados negativamente à atopia e essa associação ocorre apenas em indivíduos que tenham sido expostos previamente a infecções virais (14).
13 têm realizado esforços para determinar a arquitetura genética de doenças complexas, assim como para investigar os efeitos conjuntos da genética e do ambiente na ocorrência dessas doenças. O estudo dos determinantes genéticos em fenótipo e traços definidos com precisão e das interações gene-ambiente representa uma das prioridades de investigação para compreender as causas da asma. Neste contexto, o presente trabalho objetiva avaliar o impacto de polimorfismos presentes no cromossomo X na asma e atopia. Para isso, a tese encontra-se dividida em três capítulos, sendo cada um escrito na forma de artigo. O primeiro capítulo refere-se ao estudo de associação ampla dos polimorfismos localizados no cromossomo X com asma, artigo submetido. No segundo capítulo, é abordado o impacto da proteína e gene FOXP3 no desenvolvimento de alergias, artigo publicado. Por fim, o terceiro capítulo refere-se ao estudo de associação dos polimorfismos presentes no gene FOXP3 com asma e atopia.
14
REVISÃO DE LITERATURA
Impacto da asma
A asma é uma doença complexa determinada por interações entre fatores genéticos do hospedeiro e influências ambientais (15, 16). A prevalência da asma vem crescendo em ritmo acelerado em todo o mundo, especialmente nos países recém-industrializados, como o Brasil (17). Estima-se que 334 milhões de pessoas em todo o mundo tenham asma (18), e a prevalência desta doença vem aumentando nas últimas décadas entre crianças que vivem em países industrializados e mais recentemente nos países em desenvolvimento, onde esse aumento pode estar ligado a mudanças ambientais associadas à urbanização e à aquisição de um estilo de vida "moderno" (19) Figura 1. Uma observação notável de um grande estudo internacional sobre asma foi a alta prevalência de sintomas de asma relatados nos centros urbanos na América Latina, tão elevada quanto os Estados Unidos e o Reino Unido (20).
Figura 1. Prevalência de sintomas de asma no mundo em crianças entre 13-14 anos. A estrela mostra centros que relataram prevalência alta de
15 A asma é caracterizada por episódios recorrentes de obstrução das vias aéreas podendo reverter espontaneamente ou após uso de medicação e é, geralmente, associada a hiper-responsividade brônquica e evidência de inflamação crônica das vias aéreas (21). Definições mais elaboradas tem sido propostas e não há um consenso claro sobre a forma de definição de asma, embora a maioria dos casos sejam leves e de fácil tratamento, embora possam existir casos de resistência ao tratamento, podendo levar a hospitalizações (21). Na maioria dos casos, os primeiros sintomas de asma ocorrem durante os anos pré-escolares (22) e até mesmo entre os pacientes que desenvolvem sintomas crônicos na adolescência, maiores taxas de sibilância episódica e hiper-responsividade brônquica são detectados nas fases inicias de vida (23).
Dado o impacto de doenças alérgicas na Saúde Pública, diversos países têm realizados esforços para determinar a arquitetura genética de doenças complexas, assim como para investigar os efeitos conjuntos da genética e do ambiente na ocorrência dessas doenças. Os estudos da variação genética subjacente a uma doença podem contribuir não apenas para a compreensão dos mecanismos causais biológicos, mas também para fundamentar o desenvolvimento das intervenções (24).
Imunopatogênese das doenças alérgicas
A patogênese das doenças alérgicas está relacionada ao envolvimento dos linfócitos T CD4+ (células T helper) que desempenham um papel central como reguladores e efetores da resposta imune. Nos últimos anos, diversas novas subpopulações de linfócitos T helper (Th) foram descritas, e hoje já se conhece: Th1, Th2, Th17, células T reguladoras (Treg), Th9, e Thf (Figura 2) (25).
16
Figura 2. Caracterização dos fenótipos de células T helper. A célula naïve ativada (em cinza) pode se diferenciar em subtipos celulares com perfil de
produção de citocinas e fatores de transcrição (itálico) específicos. Modificado de Van Den Ham, 2013.
Após o clássico trabalho de Mossman e Coffman (26) descrevendo os fenótipos Th1 e Th2, uma série de estudos foi dedicada à compreensão dessas duas populações celulares, evidenciando o papel das células Th1 na imunidade contra microrganismos intracelulares e as células Th2 para imunidade contra patógenos extracelulares, incluindo helmintos. Enquanto que a ativação anormal de células Th1 é considerada evento crítico para a maioria das doenças autoimunes órgãos específicas, as células Th2 são responsáveis por efeitos deletérios em doenças inflamatórias alérgicas e asma (27).
Durante a última década, a compreensão da patogênese da asma passou por uma mudança significativa. Em 2002, no seminário da The Lancet, foi apresentada a visão clássica da asma caracterizada pela presença de células T-helper tipo 2 (Th2) (28). Além disso, a patologia da asma (especialmente em casos mais graves) é caracterizada por hiperplasia de células produtoras de muco e infiltração de células inflamatórias, dentre as quais, destacam-se as células TCD4+, eosinófilos e mastócitos (29) . Além disso, é observada a presença de citocinas Th2, tais como a IL (Interleucina) -13, IL-4 e IL-5 (30-32) que coordenadamente regulam muitos aspectos da inflamação alérgica (33) . Mais
17 recentemente, este paradigma centrado em células T foi enriquecido pela identificação de células Treg com a capacidade de controlar respostas Th2 (34-36).
A ativação de respostas aberrantes envolvendo citocinas tipo Th2 em respostas a antígenos inócuos desencadeia uma inflamação crônica e dano tecidual que caracterizam estes distúrbios imunopatológicos (37). As células Th2 são importantes tanto para a resposta IgE-específica quanto para a resposta eosinofílica que caracterizam as doenças alérgicas (38). A IL-4 é a citocina que promove um feedback positivo para a diferenciação das células Th2 e é o principal mediador para a mudança de classe dos anticorpos produzidos pelas células B para IgE. Por outro lado, a IL-5 é a principal citocina ativadora de eosinófilos in vivo (39). A coordenação desses fatores solúveis e de células, especialmente orquestradas pelo linfócito Th2 determinam a patogenia das doenças alérgicas dentre elas, a asma.
Com o objetivo de evitar a ativação crônica de células e processos inflamatórios gerados por antígenos não patogênicos expostos ao organismo via ingestão e inalação, o sistema imunológico desenvolveu ao longo dos anos mecanismos periféricos de tolerância eficientes. Tem sido demonstrado que diferentes subtipos de células regulatórias e supressoras podem desempenhar um papel na tolerância periférica, e sua biologia tem sido objeto de intensa investigação (40). Um dos principais mecanismos relacionados a esta modulação se dá através das células Treg que suprimem respostas imunológicas especialmente através de interações célula-célula e / ou a produção de Fator de transformação do crescimento beta- (TGF- b) e IL-10 (41). Em estudos de associação genética, variações nos genes que codificam proteínas envolvidas no desenvolvimento e função das células Treg tais como Toll-like receptor (TLR-2), TGF-b1, IL-10, e hemeoxygenase 1 (HMOX1), foram previamente associados a atopia e fenótipos de asma (42).
Ambas as citocinas regulatórias, TGF-b e IL-10, são especialmente produzidas por células T regulatórias (Treg) CD4+ CD25+ FOXP3+ que são as principais células responsáveis pela regulação das respostais imunes. Mutação no gene do fator transcripcional FOXP3, responsável pela ativação de células Treg, é associada a uma síndrome generalizada, denominada IPEX (do inglês,
18 immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked). A síndrome é caracterizada por reações de autoimunidade sistêmicas, além de diarréia, dermatite eritematosa, endocrinopatia e disregulação imunológica com alterações nos níveis de IgE (43)
Proteína e gene FOXP3 nas doenças alérgicas
Forkhead box (Fox) constitui uma família de proteínas conservadas de fatores de transcrição com um papel central não só durante o desenvolvimento embrionário, mas também no organismo adulto (44). A proteína FOXP3 é expressa por células T e promove a diferenciação de linfócitos TCD4 + CD25 +, além de estimular a sua atividade supressora (7, 45). Esta proteína codificada pelo gene FOXP3 contém 431 aminoácidos com quatro domínios funcionais.
O gene FOXP3 humano está localizado no cromossoma X (Xp11.23), possui 1296pb de tamanho, e contém 11 éxons codificantes e 3 éxons não codificantes (46, 47). Diversos polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNP) tem sido identificados para este gene (48-51). Os SNPs são as variações mais comuns no genoma e são responsáveis pelas diferenças fenotípicas individuais. As sequências de codificação de genes, em geral, são conservadas, mas a presença de SNPs ou mutações genéticas podem estar relacionados com a susceptibilidade a doenças complexas. O papel dos fatores genéticos do hospedeiro na etiologia de doenças complexas pode ser estudada através de Estudos de Associação ampla do Genoma (Genome-Wide Association Studies -
GWAS) ou estudo de gene candidato que investigaram a influência de polimorfismos genéticos no desenvolvimento de doenças alérgicas (4-6). Chips de
DNA contendo centenas de milhares de variantes genéticas tornaram-se amplamente disponíveis e têm sido utilizados em GWAS para identificar associações entre casos de asma e controles (6, 52-56) . Estes estudos tem relatado associações com asma para loci ou regiões próximas de diversos genes (Figura 3) (21). Devido a análise de um grande número de marcadores, os GWAS precisam contar com algumas particularidades na sua realização, tais como, utilização de valores de p mais baixo que os estudos convencionais, para evitar as chances de associações expúrias, além da exigência de replicações em outras
19 amostras ou outras populações para os principais achados. Além disso, em populações miscigenadas como a população brasileira, é importante incluir nas análises, marcadores informativos de ancestralidade para evitar viés de confudimento por SNPs ligados a ancestralidade.
Figura 3. Genes identificados para asma através de GWAS. Modificado
de Martinez e Vercelli, 2013.
Embora os GWAS forneçam importantes informações sobre polimorfismos presentes ao longo do genoma, poucos estudos têm reportado o cromossomo X, devido a dificuldade nas análises (57). No entanto, o cromossomo X contém mais de 300.000 SNPs em 2.300 genes, muitos codificantes de proteínas, tais como gene FOXP3 (58, 59), desta forma, polimorfismos presentes no gene FOXP3 são pouco representados em estudos de associação ampla do genoma. Diversos GWAS para asma tem sido realizados, no entanto, pouca informação sobre o cromossomo X foi relatada, e nenhuma informação sobre a associação de gene FOXP3 com doenças alérgicas foi encontrada (4-6).
20
Embora o gene FOXP3 tenha sido pouco representado nos estudos GWAS, polimorfismos neste gene tem sido relatado em estudos de associação para muitas doenças (48-50). Esses dados sugerem que as variações genéticas no gene FOXP3 podem estar associadas a disfunção de células T. Deste modo, fatores genéticos que afetam o gene FOXP3 podem determinar as diferenças em susceptibilidade a doenças alérgicas, tais como a asma. Ao longo dos últimos anos, os polimorfismos neste gene foram avaliadas em estudos de associação para várias alergias (60-62), entretanto, poucos estudos foram realizados para asma ou atopia e em população miscigenada como a população brasileira.
Interações gene-ambiente na asma e atopia
Interações entre genes e ambiente podem resultar no aparecimento de associações genéticas apenas em ambientes específicos (63). Um exemplo clássico é o efeito da interação entre os polimorfismos de CD14 e a exposição a endotoxinas na determinação de desfechos atópicos (64, 65). Efeitos diferentes foram observados para polimorfismos específicos que são dependentes dos níveis de endotoxinas e que são diferentes para diferentes traços alérgicos (65). Há um crescente reconhecimento da importância da interação gene-ambiente na determinação da asma (66, 67).
Moradias e condições ambientais precárias, especialmente, em ambientes urbanos (falta de saneamento básico, água potável, etc) de países em desenvolvimento, como o Brasil, predispõe a exposição a bactérias (e endotoxina), vírus e helmintos que já foram previamente ligados à modulação de doenças alérgicas (68, 69). Além disso, o nível de exposição aos alérgenos no ambiente e poluição, especialmente, no domicílio já foi ligado a marcadores de asma em vários estudos de base populacional (70, 71)
Uma série de organismos e exposições estão relacionados à indução e modulação de mecanismos regulatórios, dentre eles, destacam-se: infecções por protozoário (72), bactérias (73), fungos (74), perfil da microbiota intestinal (75), aleitamento materno (76), e vírus (10), sendo a compreensão dos mecanismos moleculares de como estas modulações ocorrem, de alta prioridade.
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OBJETIVOS
Geral
Realizar um estudo de associação de polimorfismos presentes no cromossomo X com asma e atopia.
Específicos
Realizar um Estudo de Associação Ampla do Cromossomo X (X-WAS) para asma;
Replicar os achados do X-WAS em outras populações;
Revisar o impacto de polimorfismos e função do gene FOXP3 nas doenças alérgicas.
Avaliar a associação de polimorfismos presentes no gene FOXP3 com asma e atopia;
Avaliar se há interação gene-ambiente entre infecções virais com polimorfismos no gene FOXP3 para o desenvolvimento de asma e atopia.
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MANUSCRITO 1: X Chromosome Wide Association Study reveals a member of the IL1R’s family associated with asthma
Running head: X-WAS, asthma and IL1RAPL
AUTHORS: Cintia Rodrigues Marques1, Gustavo Nunes de Oliveira Costa2,3, Thiago Magalhães da Silva2,3,4, Pablo Oliveira2,3, Alvaro A. Cruz5, Neuza Maria Alcantara-Neves1, Rosemeire L. Fiaccone6, Bernardo L Horta7, Fernando A Proietti8, Esteban Burchard9,10; Maria Pino-Yanes11,12 Laura C Rodrigues13, Maria Fernanda Lima-Costa8, Alexandre C Pereira14, Mateus H. Gouveia15, Hanaisa P. Sant Anna15, Eduardo Tarazona-Santos15, Maurício Lima Barreto2,3, Camila Alexandrina Figueiredo1
1
Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Brasil 2
Centro de Pesquisas Gonçalo Muniz, FIOCRUZ, Salvador, Brazil 3
Instituto de Saúde Coletiva, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Brasil 4
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Brasil
5
ProAR-Center of Excellence in Asthma, Federal University of Bahia School of Medicine, Salvador, Brazil.
6
Departamento de Estatística, Instituto de Matemática, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Bahia, Brasil
7
Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia, Universidade Federal de Pelotas, CP 464, 96001-970 Pelotas, RS
8
Instituto de Pesquisa Rene Rachou, Fundação Oswaldo Cruz. Av. Augusto de Lima, 1715, 30190002 – Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil
9
Department of Medicine, University of California, San Francisco, United States of America
10
Department of Bioengineering & Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, United States of America
11
Research Unit, Hospital Universitario N.S. de Candelaria, Tenerife, Spain 12
CIBER de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain
13
Department of Infectious Disease Epidemiology, Faculty of Epidemiology, London School of Hygiene and Tropical Medicine.
14
Instituto do Coração, Universidade de São Paulo. São Paulo, São Paulo, Brasil. 15
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.
Corresponding author: Camila Alexandrina Figueiredo, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Avenida Reitor Miguel Calmon, s/ no,
23 Canela, CEP – 40110-100, Salvador, Bahia, Brazil, E-mail:
cavfigueiredo@gmail.com
This work was supported by EPIGEN Consortium (MCT/DECIT). The EPIGEN Brazil initiative is funded by the Brazilian Ministry of Health (Department of Science and Technology from the Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos) through Financiadora de Estudos e Projetos. The EPIGEN Brazil investigators received funding from the Brazilian Ministry of Education (CAPES Agency), Brazilian National Research Council (CNPq), Pró-Reitoria de Pesquisa from the Universidade Federal de Minas Gerais, and the Minas Gerais State Agency for Support of Research (FAPEMIG).
24
Abstract
Background: Asthma affects over 334 million people worldwide. Several Genome
Wide Association Studies (GWAS) have been conducted to investigate the influence of genetic polymorphisms in the development of allergic diseases, but few of them have included the X chromosome.
Objectives: To perform an X Wide Association Study (X-WAS) for asthma
symptoms in children.
Methods: This study included 1,307 (705 males) children including 294 asthma
cases. DNA was extracted from peripheral blood and the samples were genotyped using 2.5HumanOmni Beadchip from Illumina. Statistical analyses were performed in PLINK 1.9, MACH 1.0 and Minimac2. We followed-up this finding in three independent Brazilian and US Latino samples.
Results: Two variants (rs12007907 and rs199522937) were associated with
asthma symptoms considering P-value < 7.14x10-6 in discovery population. These results were replicated in the ProAr cohort for rs12007907 in men only. Furthermore, investigating the functional role of the rs12007907 on the production a Th2-type cytokine, IL-13, we found a negative association between the A allele with IL-13 production in the discovery sample.
Conclusion: The rs12007907 variant in IL1RAPL gene was negatively associated
with asthma and IL-13 production in our study and a sex-specific association was observed in one of the validation samples. It suggests an effect on asthma susceptibility and may explain differences in severe asthma frequency between women and men.
Key messages:
rs12007907 in IL1RAPL was associated with asthma;
In replication studies, rs12007907was associated with asthma in ProAR cohort;
rs12007907 was associated with with IL-13 production.
Capsule summary:
This work explores the association of polymorphisms in X Chromosome and asthma.
Keywords: asthma, IL-1R, polymorphisms, X-WAS, EPIGEN, IL-13 Abbreviations
GWAS: Many Genome Wide Association Studies SNP: single-nucleotide polymorphisms
25 TLR: Toll Like Receptor
X-WAS: X Chromosome Association Study
SCAALA: Social Changes Asthma and Allergy in Latin America DNA: Deoxyribonucleic acid
MAF: minnor allele frequence MIF: missing frequency Chr: Chromossome
GALA II: Genes-environments & Admixture in Latino Americans study ProAR: Asthma and Allergic Rhinitis Control Program in Bahia
PWM: pokeweed IL: interleukin
IL1RAPL1: IL-1R acessory protein-like
DACH2: Dachshund Family Transcription Factor OR: Odds ratio
CI: confidence intervals
QQ-plot: quantile-quantile-plot LD: linkage disequilibrium
26
Introduction
Asthma affects the low airways resulting in airflow obstruction, bronchial hyperresponsiveness and inflammation 1. The most recent Global Asthma Report estimates that over 334 million people are affected by asthma worldwide 2. This prevalence is increasing in recent decades among individuals living in industrialized countries and, more recently, in developing countries. Therefore, asthma is considered a public health problem 3-6. Asthma is a complex disease and the mechanisms responsible for its causation are not fully understood, although it is clear that genetic and environment factors play an important role in its pathogenicity 7, 8.
Many Genome Wide Association Studies (GWAS) have been conducted to investigate the influence of genetic polymorphisms in the development of several diseases. It is estimated that almost 1,400 GWAS have identified around 2,800 peak associations (P≤5.10-8
) 9. However, less than 30% of these studies report the X chromosome in their analysis. This may happened for several reasons, including the limited number of X chromosome SNPs presented in some genotyping platforms and the difference in the number of X chromosome copies between men and women, which difficult the association analysis.
The X chromosome contains 1,669 genes 10 and almost 1,3M SNPs 11. Genes present in the X chromosome are associated with different genetic diseases such as Duchenne muscular dystrophy 12, Hemophylia A 13 and IPEX (immune dysfunction, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked) syndrome 14. In addition, this chromosome includes genes that have been associated with allergic diseases, such as FOXP3 15 and others which may be of relevance in the context of asthma, such as the TLR7 and TLR8 16. Thus, analyzing SNPs present in this chromosome may provide important insights regarding genetic variants associated with diseases and should not be neglected. This is of special interest in the asthma context, where differences in prevalence, morbidity and severity of the disease according to gender have been reported 17, 18. These studies have shown that males are more affected during early childhood but a gender shift has been observed at puberty, with a higher prevalence of asthma in females at adulthood.
27 Factors contributing to such sex difference remain unclear and may involve hormonal changes together with genetic predisposition.
Considering the presence of important genes on the X chromosome, possible associations with complex diseases and difficulty in analyzing X Chr markers in GWAS, several studies have analyzed the X chromosome separately 19-21.
Therefore, the aim of this study was to perform an X Chromosome Association Study (X-WAS) for asthma symptoms in childhood. To our knowledge, this is the first X-WAS for asthma conducted in worldwide.
Methods
Study design and population characterization
As described in previous publications 22-24, Social Changes, Asthma and Allergy in Latin America (SCAALA) is a research program conducted in Brazil and Equador. The Brazilian component comprised a cohort of 1,307 (705 males) unrelated children between 4 and 11 years old. Asthma symptoms were defined and classified as reported in a previous publication of SCAALA Salvador studies 25. Briefly, children were classified as having current wheeze as previously described 26, 27
by using phase II International Study of Asthma and Allergies in Childhood questionnaire (wheezing in the last 12 months) and were considered to have current wheeze plus symptoms if parents reported wheezing in the previous 12 months and at least 1 of the following: (1) diagnosis of asthma ever; (2) wheezing with exercise in the last 12 months; (3) 4 or more episodes of wheezing in the last 12 months; and (4) waking up at night because of wheezing in the last 12 months. Ethical approval for this study was obtained from the Brazilian National Ethical Council, and written informed consent was obtained from the guardian of each child.
Genotyping and quality control
DNA was extracted from peripheral blood using a commercial kit (Gentra® Puregene® Blood Kit (Qiagen). Subjects were genotyped using the 2.5HumanOmni Beadchip from Illumina. Initially we got 46,945 SNPs present in the X chromosome and 391 SNPs in pseudoautossomal regions between the X
28 and Y chromosomes. Genotyping quality control and data cleaning was performed as specified in Kehdy et al 2015 28. Closely related individuals (n = 64) identified as in Kehdy et al 2015 were excluded. SNPs were removed if MAF (minnor allele frequence) ≤1% in males and females separately. SNPs were also excluded if MIF (missing frequency) was ≤2% threshold either the separated missing frequencies in males and females (MIF males – MIF females).
Sequence annotations
Comparative genomic data and regulatory features for the IL1RAPL1 gene (X: 29418224- 29545784; GRCh37/hg19 reference sequence) were obtained from both the Ensembl (http://www.ensembl.org) and University of California Santa Cruz (http://genome.ucsc.edu) genome browsers. SNP positions were cross-referenced with sequence annotations, including genomic evolutionary rate profiling–constrained elements for 36 eutherian mammals (GERP-EPO low coverage) 29, chromatin segmentation state, and enrichment for marks of open chromatin (DNase I hypersensitive sites). These last two types of information were obtained from the ENCODE project 30.
Validation Studies
Validation analyses were performed in independent Brazil and US Latin American populations. The US Latin American samples dates were collected from Genes-environments & Admixture in Latino Americans study (GALA II). The GALA II study is an ongoing multicenter case-control study of asthma in Latino children and adolescents (1,893 asthma cases and 1,881 controls), organized from the coordinating center based at the University of California, San Francisco 31. Subjects were eligible if they were 8 to 21 years old and had no history of other lung or other chronic illnesses. Asthma was defined based on physician diagnosis and report of symptoms and medication use within the last two years prior to the recruitment. Controls had no reported history of asthma, lung disease or chronic illness, allergic disease (eczema, hives, hay fever, allergic rhinitis), no reported use of medication for allergies, and no reported symptoms of coughing, wheezing, or shortness of breath in their lifetime.
29 The second replication set was the Pelotas birth cohort from Brazil 32. It is comprised of 1,151participants (343 asthma cases and 808 health individuals), which were interviewed when they were 18 years of age. Asthma was defined based on the same criteria used to case definition in the SCAALA cohort.
The third replication set was the Asthma and Allergic Rhinitis Control Program in Bahia (ProAR). Cases were comprised 420 patients with severe asthma and 305 patients with mild or intermittent control persistent asthma according to the Global Initiative rating against Asthma 33 from both genders and age ≥ 18 years, living in Salvador. Controls were comprised with 398 subjects without history of asthma, residing in Salvador and unrelated of the cases. In this replication study, the rs12007907 genotyping was performed using TaqMan probe-based 5´-nuclease assays (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in QuantStudio 12k Flex equipment.
Cytokine production
Venous blood was collected into heparinised tubes and cultured the collected cells, previously described by Figueiredo et al, 2011 34. The production 5 and IL-13 upon pokeweed (PWM) stimulation was measured in whole-blood culture supernatants using commercially available antibody pairs and recombinant cytokine standards (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA) by sandwich ELISA according to the manufacturer’s instructions. Cytokine concentrations were determined by interpolation of standard curves 34.
Statistical Analysis
Logistic regression analyses using additive genetic model for asthma were performed in PLINK 1.9 after filters application for quality control procedures. Analyses were adjusted by sex, age and the first three principal components delineated through Eigenstrat on 370,539 genome-wide autosomal SNPs as covariates. Due to sex-biased pattern of admixture in Brazilian populations, with preferential mating between males with predominant European ancestry and women with predominant African or Amerindian ancestry 35, the non-European ancestry inferred to the X-chromosome tend to be higher than estimated for the autosomes 28. For this reason, the average local ancestry inferred for
X-30 chromosome has been used as covariate in some analyzes. Details about the methodology used to infer X-chromosome ancestry are described elsewhere 28. Based on the default of PLINK, the analysis were performed assuming no dosage compensation. Thus male genotypes were coded as 0 or 1 and female genotypes were coded as 0,1 or 2. We adopted the p-value threshold <7.14 x10-6, calculated as described elsewhere 36. The parameters considered to use this significance level were: posterior odds for true association = 1:10; prior odds of true association = 7,000:1; and power = 0.5. The SNP imputation pre-phase for the first step was performed in MACH 1.0 and the second phase in Minimac2 37, 38 and was run separately for males and females. For imputation we used as reference the African population (1000G.AFR,20100804.tgz) according 1000 genomes 11. We imputed with high confidence (R2=0.3). To obtain a normal distribution of cytokines values a log transformation was applied and the differences in cytokines concentration among the rs12007907 genotypes were analyzed using linear regression adjusted for sex, age and the 3 principal components of genetic ancestry using 370,539 genome-wide autosomal SNPs.
Results
The final dataset, after quality control for SNPs and individuals, included 35,410 SNPs and 1,246 samples (280 cases). We have identified two markers in X chromosome significantly associated with asthma symptoms (p-value<7.14x10-6) (Figure 1). Table 1 presents the top 20 SNPs ranked according the p-value. The strongest association was observed for the SNP rs12007907 (P = 3.33x10-6; OR=0.49, 95% CI= 0.37 - 0.67) which is an intronic variant located in the
IL1RAPL1 (IL-1R acessory protein-like) gene. The second most significantly
associated variant was the rs199522937 (P = 5.11x10-6; OR=1.71, 95% CI= 1.35 - 2.14) located in an intergenic region 5kb upstream of the DACH2 gene (Dachshund Family Transcription Factor). These results were virtually unchanged when using the ancestry inferred to the X-chromosome to adjust by population stratification (P = 3.10x10-6; OR=0.49, 95% CI= 0.36 - 0.66 for rs12007907 and P = 4.57x10-6; OR=1.71, 95% CI= 1.36 - 2.15 for rs199522937).
31 The quantile-quantile-plot (QQ-plot) of the p-values illustrates that the observed significant associations were beyond those expected by chance (Figure 2). Furthermore, estimated genomic inflation factor (λ) was = 1, indicating that population genetic structure had negligible impact on association results. Regional plot of logistic regression in genotyped and imputed data were performed for the most associated region with asthma symptoms in X chromosome (Figure 3). Since the rs12007907 and other SNPs of IL1RAPL1 gene are very rare in non-African populations, we performed the imputation using the African population (1000G.AFR,20100804.tgz) according 1000 genomes as the reference population.
The SNP rs12007907 is in high linkage disequilibrium (LD) with other SNPs in the
IL1RAPL1, suggesting that variants of this gene are most likely associated with asthma symptoms in this genomic region. We carried out an in silico analysis of the SNPs correlated (r2 ≥0.6) with rs12007907 to identify putative functional variants in the IL1RAPL1 region. We evaluated various functional annotations in our sets of polymorphisms, including predicted chromatin state segmentation, predicted DNAse hypersensitivity, and sequence conservation across mammals (Supplemental Table 1). This analysis revealed that rs714723 was the best candidate for a functional variant in the rs12007907 linkage disequilibrium block. This SNP is located within a CCCTC-binding transcription factor (CTCF) sequence and can alter CTCF affinity to this genomic region. Analysis using imputed data confirmed the association of rs714723 and other variants in the rs12007907 LD block with symptoms of asthma in our population (Figure 3 and Supplemental Table 1).
We followed-up the association of rs12007907 with asthma in three independent validation cohorts for which information about this SNP were available. (Supplemental Table 2). In GALA II and Pelotas populations the rs12007907 was not associated with asthma (OR=1.06, 95%CI: 0.92-1.23; p=0.420 and OR= 1.26, 95% CI: 0.91 - 1.73; p=0.164, respectively). In the cohort of ProAr, which was recruited in the same city and is ethnically similar to the discovery sample of this study, although no significant association was observed between rs12007907 and asthma in general analysis (OR=0.96, 95%CI: 0.78 - 1.18; p=0.707), the rs12007907 was negatively associated with asthma among men (OR=0.45, 95%CI: 0.21-0.95; p=0.038) but not among women (OR=1.02,
32
95%CI: 0.82-1.26; p=0.862). Otherwise, in the GALA II and Pelotas populations the results remained no significant when stratifying by sex. Also in the discovery set no differences according to sex were observed for the association between rs12007907 and asthma (OR=0.59, 95%CI: 0.38 - 0.95; p=2,9x10-2 and OR= 0.43, 95% CI: 0.29 - 0.64; p=2.4x10-5 among men and women, respectively).
Since Th2-type cytokine are associated with atopic asthma 39 and considering that IL1 family members such as (IL33/ST2) components induce Th2 polarization 40, we analyzed the production of IL-5 and IL-13 in PWM-stimulated whole blood cultures according to the genotypes for our top SNP (rs12007907). As can be seen in Figure 4, the homozygote for A allele had a lower production of IL-13 in comparison to homozygote for C allele. The geometric mean of IL-13 concentration in AA genotype was 36% lower compared to the CC genotype (p = 0.045). No statistically significant differences were observed comparing the heterozygous (CA) to the CC genotype (p = 0.278). The Kruskal-Wallis test also showed significant differences for IL-13 production between the different genotypic groups of rs1200797 (p = 0.044). No significant trend was found for IL-5 production according to rs12007907 genotype (data not shown).
Figure 1. Manhattan plot of X chromosome-wide association results. The blue line
corresponds to the the p-value threshold <7.14 x10-6 adopted for logistic regression analyses performed using additive genetic model for asthma and adjusted by sex, age and the first three principal components of ancestry markers.
33
Tabela 1. The twenty most associated SNPs in the X chromosome-wide association with asthma symptoms
SNP Gene Annotation Minor
Allele MAF OR CI (95%) P* rs12007907 IL1RAPL1 A 0.25 0.49 0.37 0.67 3.33E-06 rs199522937 5.3kb 5' of DACH2 C 0.36 1.71 1.36 2.15 5.11E-06 rs11798204 IL1RAPL1 A 0.24 0.52 0.38 0.70 1.26E-05 rs200054562 Intergenic T 0.31 1.68 1.33 2.13 1.38E-05 rs138033925 NRXN1 A 0.06 2.29 1.49 3.52 1.58E-04 rs5937530 Intergenic A 0.14 1.74 1.30 2.33 1.76E-04 rs73217711 LOC10192846 9 G 0.14 1.74 1.30 2.33 1.79E-04 rs5938545 Intergenic T 0.14 1.74 1.30 2.32 1.84E-04 rs61343550 LOC10192846 9 T 0.14 1.73 1.30 2.32 1.96E-04 rs5913230 Intergenic T 0.46 1.54 1.22 1.93 2.15E-04 rs60956073 Intergenic A 0.12 1.79 1.31 2.43 2.28E-04 rs12008592 Intergenic G 0.10 0.42 0.26 0.67 2.65E-04 rs6617245 DACH2 G 0.42 1.54 1.22 1.94 2.92E-04 rs4828133 Intergenic G 0.24 1.58 1.23 2.02 3.10E-04 rs1453329 Intergenic T 0.31 1.56 1.22 1.99 3.83E-04 rs5906181 Intergenic G 0.28 0.62 0.48 0.81 4.18E-04 rs1503783 LOC10537320 4 T 0.33 0.62 0.48 0.81 4.18E-04 rs59169505 IL1RAPL1 A 0.14 0.51 0.35 0.74 4.35E-04 rs5925278 PNMA5 T 0.24 1.58 1.22 2.03 5.09E-04 rs6625807 Intergenic T 0.21 0.58 0.43 0.79 5.09E-04
*P-value of logistic regression adjusted by sex, age and three genetic principal components (PCs)
Figure 2. Quantile-quantile plot for childhood asthma symptoms in the discovery population.
34 Figure 3. Regional plot for logistic regression results. The picture on the left (A) represents the results for genotyped SNPs in region most associated with asthma symptoms of X chromosome. On the right (B) is represented the results for imputed SNPs in the same region. The top SNP rs12007907 is showed in purple in both (A) and (B).
Figure 4. Geometric means for IL-13 production according to rs12007907 genotypes. Footnote: The p-value refers to the Kruskal-Wallis test for multiple comparisons.
35
Discussion
The X chromosome has been often overlooked in GWAS to date. However, X-WAS studies can help clarify the role of several genes in the development of many diseases, including complex illnesses such as asthma. In this context, this is, to the best of our knowledge, one of the first initiatives to perform an X-WAS for asthma symptoms in children to date.
In our discovery sample two SNPs were statistically associated with asthma symptoms. The SNP rs199522937 are intergenic and located in an upstream region of DACH2 gene that encodes a 599 aminoacid protein that is a transcriptional cofactor 41. DACH2 sequences suggest a role in abnormalities like cleft palate and megalocornea 42 While the association of this intergenic SNP with asthma seems unclear, the top SNP in our study, located in the IL1RAPL1 gene region, suggest a possible causal effect on asthma susceptibility. The IL1RAPL1 (IL-1R accessory protein-like) is a gene that encodes a protein with 696 aminoacids homologous to IL-1 receptor accessory proteins. IL1RAPL was first identified in patients with X-linked mental retardation 43. Mutations in this gene were also identified in patients with cognitive impairment. In these cases, a loss-of-function mutation in this gene impacts on an interleukin/MAP kinase cascade of modulatory neurotransmitters affecting synapse structure leading to cognitive impairment 43. The exact function of IL1RAPL1 is not fully understood, but it is abundantly expressed in postnatal brain structures and may interact with neuronal calcium sensor, thus possibly acting in regulation of exocytosis of secretory substances. The expression of IL1RAPL protein has been detected in the brain, heart and muscle 44. Khan et al. showed that IL1RAPL can active JNK but not the ERK neither MAP kinase 45. Whereas IL1R have high affinities for their ligands, the accessory proteins cannot do it directly. Furthermore, the function of IL1RAPL might be more related to the Toll-like receptors subfamily than IL1R subfamily 44. Interesting, IL1RAPL1 has already been reported in two previous GWAS to be associated with cardiovascular disease 46 and autism 20. Although this gene belongs to the IL1R family, it has been poorly studied, possible due to its localization in the X chromosome and consequent exclusion from Genome Wide analysis. The rs12007907 is an intronic SNP which is in LD with others SNPs
36 located in a regulatory region of the IL1RAPL1 gene, such as the rs714723 variant located within a CTCF sequence. Binding of target sequence elements by CTCF can block the interaction between enhancers and promoters, therefore limiting the activity of enhancers to certain functional domains. CTCF can also act as a chromatin barrier by preventing the spread of heterochromatin structures 47. The primary role of CTCF is thought to be in regulating the structure of chromatin. Therefore, SNPs located in these regions could influence gene expression. However, further analyzes including functional assays are required to identify potential causal polymorphisms located in IL1RAPL gene or even in nearby genomic regions.
Different IL-1 receptors, such as IL-1R, are found in the human genome and the IL1RAPL is a member of this subfamily. IL-1R is potential regulator of inflammation and is critical for innate immunity and host defense against infections (31). IL-1R also play an important role in the regulation of TH2 cell in allergic airway inflammation 40. Previous GWASs reported associations of IL1R SNPs with asthma in different populations 48-50, suggesting that IL1R gene may be involved in asthma susceptibility. Assuming that IL1RAPL gene may play a similar role of
IL1R in inflammatory responses mediated by TH2 cells, we decided to evaluate
the association between the rs12007907 genotypes and the production of Th2-type cytokines (IL-5 and IL-13) in our study population. Interestingly, the homozygous genotype for the rs1200797 allele negatively associated with asthma symptoms (AA genotype) was negatively associated with IL-13 production. These results suggest a possible involvement of SNPs in IL1RAPL1 gene regulating IL-13 production, which needs to be further, investigated. However, that could also explain the negative association observed for rs12007907 with asthma since IL-13 is a classical cytokine related to allergic asthma leading to bronchial hyper reactivity as well as mucus production 51.
In our validation samples we did not observe significant associations in general analysis. This can be explained, at least in part, by differential frequencies of
IL1RAPL1 SNPs between the populations evaluated. In fact, a pattern of
biogeographical variation is observed for rs12007907, with allele frequencies varying from 37% among Africans, 3% among Europeans and 7% among Amerindians. In SCAALA (the discovery sample) rs12007907 MAF (corresponding
37 to the A allele) was 25%, reflecting the remarkable African contribution to this admixed population 52. In the ProAr cohort the frequency of this SNP was 23%, which reflects the closest genetic similarity of this population with the discovery sample. However, in the GALA II and Pelotas cohorts the MAF was 7% and 11%, respectively, which may result in a lack of statistical power to detect an association. In addition, in the Pelotas cohort the outcome of asthma symptoms was investigated during adolescence 32. Also GALA II consists of adolescents and young adults 31, while the ProAr cohort is exclusively composed of adult individuals. Given the heterogeneity of asthma across different stages of the life course, it is possible that genetic variants associated with childhood-onset disease are not the same implicated in late-onset disease, which is in accordance to evidence from GWAS 53. Interestingly, in the analysis stratified by sex the rs12007907 was negatively associated with asthma among men in ProAR cohort, in agreement with that observed in the discovery set. These results suggest that studies in admixed populations with predominantly non-European ancestry can shed light on genetic factors involved in gender differences for asthma prevalence. An important limitation of the present study is the relatively small sample size, which can lead to lack of power, especially because SNPs generally have small effect size. Nevertheless, significant associations were detected when correcting for multiple testing. However, these results require further replication in more similar samples regarding their genetic background and age, which shall be complemented with functional data to understand the impact of this recently described gene in asthma.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors want to thank Brazilian agencies who supported this work and also all the individuals that participated of this work.
AUTHOR´S CONTRIBUTIONS
CRM participated in statistical analysis, preparation of the tables in drafting the manuscript. GNOC participated in statistical analysis in drafting the manuscript. TMS participated in statistical analysis in drafting the manuscript. PO participated in statistical analysis in drafting the manuscript. AAC participated in validation
38 studies. NMA-N participated in drafting the manuscript. RLF participated in drafting the manuscript. BLH participated in validation studies, drafting the manuscript. FAP participated in statistical analysis and drafting the manuscript. EB participated in validation studies. MP-Y participated in validation studies. LCR participated in drafting the manuscript. MFL-C participated in validation studies. ACP participated in drafting the manuscript. MHG participated in statistical analysis and drafting the manuscript. HPSA participated in statistical analysis and drafting the manuscript. ET-S participated in drafting the manuscript. MLB participated in drafting the manuscript. CAF participated in drafting the manuscript, and gave final approval of the version to be published. All authors reviewed the manuscript.
CONFLICT OF INTEREST: None declared.
39
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