CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO
GENÉTICO (-1082 G/A) DA INTERLEUCINA-10 COM O
RISCO DESENVOLVIMENTO DA TUBERCULOSE
PULMONAR
ANDRÉ LUIZ ALVES DO NASCIMENTO
RECIFE/PE
2013
ANDRÉ LUIZ ALVES DO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DO POLIMORFISMO
GENÉTICO (-1082 G/A) DA INTERLEUCINA-10 COM O
RISCO DE DESENVOLVIMENTO DA TUBERCULOSE
PULMONAR
.
Orientadora: Profª. Dra. Valdênia Maria Oliveira de Souza, MD, PhD
Co-orientadora: Profª. Dra. Clarice Neuenschwander Lins de Morais, MD, PhD
RECIFE/PE 2013
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre na área de conhecimento em Medicina Tropical.
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Nicodemos Teles de Pontes Filho
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Valdênia Maria Oliveira de Souza
CORPO DOCENTE PERMANENTE
Ana Lúcia Coutinho Domingues Célia Maria Machado Barbosa de Castro Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Fábio André dos Santos Brayner Heloísa Ramos Lacerda de Melo Maria Rosângela Cunha Duarte Coelho
Marli Tenório Cordeiro
Ricardo Arraes de Alencar Ximenes Valdênia Maria Oliveira de Souza
Vláudia Maria Assis Costa Vera Magalhães de Silveira
CORPO DOCENTE COLABORADOR
Ana Catarina de Souza Lopes Maria Amélia Vieira Maciel
Família e amigos, Dedico este trabalho a todos vocês que acreditaram em meu potencial, sempre me apoiando e estando comigo durante todo esse tempo. E, hoje, desfrutam comigo desse momento maravilhoso!!!!
Agradeço a Deus, pelo seu amor incondicional por mim. O qual meu deu forças e sabedoria para concluir este trabalho, sempre estando ao meu lado todos os momentos da minha vida.
À minha família, em especial, ao meu pai e minha mãe por toda educação, sustento e
formação escolar, e que, também, sempre me apoiaram dando-me conselhos para que eu nunca desistisse de alcançar meus objetivos.
Às minhas queridas orientadoras Profª Valdênia e Profª Clarice. Agradeço pelos votos de confiança e, por fazerem parte da concretização desse trabalho.
Às minhas chefes e também orientadoras, Haiana Schindler e Lílian Montenegro.
Responsáveis pelo meu ingresso na vida científica na área da tuberculose e pelo meu amadurecimento profissional. Em especial, mais uma vez, quero agradecer a Lílian, por estarmos juntos nos serviços de saúde, nos experimentos e, claro, puxando “todos os cabelos possíveis” durante “o parto” que foi nossa pesquisa.
Aos amigos científicos, ou melhor, às tuberculetes. Essa galera que faz parte do meu dia-a-dia e que o deixa muito mais alegre: Aline, Andrea (Deinha), Fabiana (a louca), Gabriela (a agoniada), Heidi (maguinha), Jú (a menina apaixonada), Klarissa (a ranzinza), Laís (a pikena), Marcela (marcelinha), Márcia (a viajada), Rosana (Ró). Como também, as IC’s novatas Bárbara (tapioca) e Nathália (a mulher casada). Vocês são demais!!!
Aos agregados da TB: Bruna (Bubu), Kaly (a outra louca), Neide Xavier (a prefeita de
San Martin), Romero (o fazendeiro), o qual me ajudou bastante, Simone Souza (a mulher da baile). Vocês também completam a alegria do meu dia-a-dia!
Aos amigos do Mestrado, especialmente aqueles que tivemos maiores laços de
amizade: Lilian, Dani, Érica, Joanne e Vivi. “#TamuJuntoPorMaisQuatroAnos”.
À minha outra família, minha banda Geração Louvor. Obrigado por fazerem a música correr no sangue de nossas veias. E, principalmente, por me permitirem extravar na minha batera!
estudamos é em busca de melhores métodos para ajudar no desenvolvimento dessa enfermidade que tanto assola o mundo.
Ao corpo Docente do Programa de Pós-graduação em Medicina tropical. Pelo aprendizado repassado em todo esse período.
À CAPES pelo suporte financeiro, essencial para o desenvolvimento desse trabalho.
À todos vocês que contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho, AQUELE ABRAÇO!!
“Acho impossível que um indivíduo contemplando o céu possa dizer que não existe um Criador”
Por tratar-se de uma doença crônica que essencialmente afeta os pulmões, a tuberculose (TB) produz em seu curso profundas alterações no sistema imunológico. A susceptibilidade à TB tem sido associada com polimorfismos de citocinas em diferentes populações. Polimorfismos de Base Única na região promotora do gene da citocina imunoregulatória IL-10 (-1082 G/A) tem sido associados com diferentes níveis circulantes desta molécula. O presente estudo objetivou a avaliar associação entre o polimorfismo genético da IL-10 com o risco de desenvolvimento da TB pulmonar em indivíduos sintomáticos respiratórios (SRs) provenientes de unidades de saúde da cidade do Recife-PE. Foi realizado um estudo do tipo caso-controle, envolvendo 71 pacientes com TB pulmonar (caso), 53 indivíduos SRs com prova tuberculínica reatora (controle 1) e 57 SRs com prova tuberculínica não reatora (controle 2). O estudo foi realizado no período de fevereiro a dezembro de 2012. Nossos resultados mostraram que a média de idade entre os pacientes com TB pulmonar foi 43 ±15.2 anos, enquanto que para os controles 1 e 2 foi de 48 ± 20.2 e 51 ±16.8 anos, respectivamente. Observamos que tanto o alelo A (p = 0.014; odds ratio [OR] 2.0; intervalo de confiança (IC) 95% [1.11-3.65] como genótipo -1082 AA (p= 0.02; OR = 4.55; IC95% [1.1-27.52] estavam associados com o aumento do risco de susceptibilidade à TB pulmonar. Nossos achados sugerem que tanto o alelo A quanto o genótipo -1082AA podem ser importantes marcadores genéticos relacionados com o aumento da susceptibilidade à TB.
Since it is a chronic infectious disease that primarily affects the lungs, tuberculosis (TB) produces profound changes in its course in the immune system. The Susceptibility to TB has been associated with cytokine polymorphisms in different populations. Single nucleotide polymorphisms in the Interleukin-10 gene promoter region (-1082 G/A) have been associated with different levels of this cytokine. The present study aimed to evaluate the association between IL-10 genetic polymorphism with the risk of developing pulmonary tuberculosis in individuals with respiratory symptoms (SRs) from health services in Recife-PE. It was conducted a case-control study, involving 71patiens with pulmonary tuberculosis (case), 53 individuals with SRs and reactor tuberculin skin test (TST) (control 1) and 57 individuals with SRs and non-reactor TST (control 2). The study was conducted from February to December 2012. Our results showed that the mean age among patients with pulmonary TB was 43 ±15.2 years, while for the control 1 and control 2 was 48 ± 20.2 and 51 ±16.8 years, respectively. We found that both A allele ((p = 0.014; odds ratio [OR] 2.0; 95% confidence interval (CI) 95% [1.11-3.65]) as -1082AA genotype (p= 0.02; OR = 4.55; 95% CI [1.1-27.52]) were associated with an increase risk of susceptibility to pulmonary TB. Our findings suggest that both A allele as -1082AA genotype may be important genetic markers associated with increased susceptibility to TB.
Figura 1. Incidência global de tuberculose. Número de novos casos da doença por 100.000 habitantes em 2011...
20
Figura 2. Percentual de casos bacíliferos notificados por região. Brasil, 2011...
20
Figura 3. Esquema representativo da formação do granuloma epitelióide em um indivíduo infectado pelo M. tuberculosis...
24
Figura 4. Diagrama estéreo da estrutura da IL-10... 26
Figura 5. Fluxograma da pesquisa... 33
Artigo 1
Figura 1. Diagnóstico final dos indivíduos sintomáticos respiratórios (controles 1 e 2)
realizados pelo médico assistente do serviço de
saúde... 53
Article 1
Figure1. Final diagnosis of symptomatic respiratory (controls 1 and 2) performed by the doctor of the health service... 72
Artigo 1
Tabela 1. Características demográficas dos pacientes sintomáticos respiratórios provenientes de unidades de saúde da cidade do Recife-PE... 52
Tabela 2. Realização e resultado de exames laboratoriais realizados pelos pacientes sintomáticos respiratórios do Recife-PE... 53
Tabela 3. Frequências alélicas e genotípicas do gene promotor da IL-10 (-1082 G/A) em pacientes com TB pulmonar e em indivíduos com TB latente (controle 1)... 54
Tabela 4. Análise das frequências alélicas e genotípicas dos pacientes com TB pulmonar e em pacientes sem infecção pelo Mtb (controle 2)... 54
Tabela 5. Análise das frequências alélicas e genotípicas entre os pacientes com TB pulmonar/TB latente e pacientes sem infecção pelo Mtb (controle 2)... 54
Article 1
Table 1: Demographic characteristics of patients with respiratory symptoms from health services in the city of Recife-PE………. 71
Table 2: Achievement and results of laboratory tests performed by patients with
respiratory symptoms of Recife-PE... 72
Table 3: Allele and genotype frequencies of the gene promoter of IL-10 (-1082 G/A) in
patients with pulmonary TB and in individuals with latent TB (control 1)... 73
Table 4: Analysis of allele and genotype frequencies of patients with pulmonary TB and
in patients without tuberculosis infection (control 2)... 73
Table 5: Analysis of allele and genotype frequencies between patients with pulmonary
µl Microlitro
APC Antingen-Presenting Cell (Células Apresentadoras de Antígenos) BK Bacilo de Koch
C3b Molécula do Complemento, fração 3b
CD Cluster of diferentiation (grupo de diferenciação) CEP Comitê de ética em Pesquisa
CFP-10 Culture Filtrate Protein-10 (Filtrado de Cultura da Proteína-10) CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
CR3 Receptor do complemento 3 CR4 Receptor do complemento 4
CSIF Synthesis Inhibitory Factor (Fator inibidor de Citocinas) DC’s Dendritic Cells (Células Dendríticas)
DM Diabetes Mellitus
DNA Desoxi nucleic acid (Ácido Desoxirribonucléioco) ECD Ectodomain (Ectodomínio)
EDTA ácido etilenodiamino tetraacético
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ensaio imuno-absorvente ligado à Enzima) ESAT-6 Early Secretory Antigen Target-6
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz HAS Hipertensão Arterial Sistêmica HC Hospital das Clínicas
HIV Human Immunedeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana) HLA Human Leukocyte Antigen (Antígeno Leucocitário Humano)
HOF Hospital Otávio de Freitas IIP-10 Interferon Inducible Protein-10 IL Interleucina
INOS Óxido Nítrico Indutível LAM Lipoarabinomananas
LIBM Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular LIE Laboratório de Imunoepidemiologia
MIP-1 Macrophage inflamatory Protein-1 ML Mililitro
Mtb Mycobacterium tuberculosis
NESC Núcleo de Epidemiologica e Saúde Coletiva NK Natural Killer (assassinas naturais)
NO Óxido Nítrico
NOS2A Óxido Nítrico Sintase 2ª
OMS Organização Mundial da Saúde
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cell (Células Mononucleares do sangue periférico) PBS Tampão Fosfato Salina
PG Picograma
PNB Ácido para-nitrobenzóico PSF Posto de Saúde da Família PT Prova tuberculínica qPCR PCR em Tempo Real RPM Rotações Por Minuto
SNP Single Nucleotide Polymorphism SR Sintomático Respiratório
SUS Sistema Único de Saúde TB Tuberculose
TCH Hidrazida do ácido 2 carboxílico
TGF-β Transforming Growth Factor-beta (Fator de Crescimento Tumoral Beta) Th1 Célula T helper 1
Th2 Célula T helper 2
TLR Toll Like Receptors (Receptor de homologia Toll)
1. INTRODUÇÃO... 17
2. REVISAO DA LITERATURA... 19
2.1 Uma Visão geral da tuberculose... 19
2.2 A resposta imunológica ao M. tuberculosis... 21
2.3 O papel da citocina IL-10... 25
2.4 Fatores Genéticos Envolvidos na Susceptibilidade à Tuberculose.... 27
2.5 Polimorfismos na região promotora do gene da IL-10... 30
3. OBJETIVOS... 32
3.1. Geral... 32
3.2. Específicos... 32
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Desenho do estudo... 33
4.2. População alvo e período do estudo...33
4.3. Local do estudo... 33
4.4. Definição das Variáveis... 34
4.4.1 Variáveis independentes... 34
4.4.2 Variáveis dependentes... 35
4.5. Critérios de Inclusão... 35
4.6. Critérios de Exclusão... 36
4.7. Métodos de Coleta e processamento dos dados... 36
4.8. Padronização das técnicas... 36
4.8.1 Separação do plasma e obtenção de células PBMC... 36
4.8.2 Extração do DNA... 37
4.8.3 Determinação do polimorfismo genético... 37
4.8.4 Cultura e identificação de micobactérias em meio L.J... 38
4.9. Análise estatística... 38
4.10. Considerações éticas... 38
5. RESULTADOS... 40
5.1. ARTIGO 1... 40
Associação do polimorfismo da Interleucina-10 (-1082 G/A) com risco de desenvolvimento da tuberculose pulmonar em pacientes sintomáticos
5.2 Article 1: Interleukine-10 polymorphism in patients with pulmonary
Tuberculosis………... 60
6. CONCLUSÕES DA DISSERTAÇÃO... 79
REFERÊNCIAS... 80
APÊNDICES... 90
Apêndice A – Ficha clínica-epidemiológica. ... 90
Apêndice B – Termo de consentimento livre e esclarecido ... 91
ANEXOS... 93
Anexo A – Aprovação do CEP do CPqAM/Fiocruz... 93
Anexo B – Normas de publicação da revista Infection, genetics, Evolution... 94
1 INTRODUÇÃO
Por tratar-se de uma doença crônica que essencialmente afeta os pulmões, a tuberculose (TB) produz em seu curso profundas alterações no sistema imunológico. Dessa forma, o papel que a resposta imunológica desempenha na TB é de fundamental importância no controle da infecção pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) (HERNANDEZ-PANDO et al., 2009). A Evolução da doença, por sua vez, depende também do indivíduo estar sendo infectado pela primeira vez (primo-infecção) ou re-infectado. A Probabilidade de adoecimento em uma primo-infecção depende da virulência do bacilo, da fonte infectante e das características imunológicas e genéticas dos indivíduos (TEIXEIRA et al., 2007). A Contribuição do “background” genético de citocinas imunoregulatórias, na resistência e susceptibilidade à primo-infecção e progressão do estado latente para a TB ativa tem sido demonstrada em alguns estudos em humanos (STEAD et al., 2001; DELGADO et al., 2002; ATES et al, 2008).
Dentre as citocinas envolvidas na imunopatogenia da TB, a interleucina-10 (IL-10) tem apresentado uma importância relevante, pois apresenta uma potente ação inibitória na produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1, Fator de Necrose Tumoral- alfa (TNF-α), Interferon-gamma (IFN- γ) e IL-6) através de sua ação em células Th1 e macrófagos (ATES, 2008). Alguns trabalhos têm associado o aumento do número de células T regulatórias, secretoras de IL-10 e Transforming Growth Factor-beta (TGF-β) (HENAO et al., 2006; CHEN et al., 2007; CHIACCHIO et al., 2009). Estas células promovem um ambiente imunossupressor, no qual células do sistema imunológico recém-recrutadas ficam refratárias aos sinais de ativação imunológica pelo Mtb. De acordo com o aumento diferencial na produção de IL-10 em diversos estudos, esta citocina se tornou alvo de estudos de polimorfismos genéticos (HENAO et al., 2006; CHEN et al., 2007; CHIACCHIO et al., 2009).
Na região promotora do gene da IL-10 podem ser encontrados três polimorfismos de base única (SNP) na região proximal mais bem estudado, localizados nas posições -1082 (G/A), -819 (C/T) e -592 (A/C) (TURNER et al., 1997). Os genótipos -1082 (G/A): GG, GA e AA, correspondem aos fenótipos alto, intermediário e baixo produtor desta citocina, respectivamente, independente das variações nucleotídicas presentes nas posições -819 e -592 do gene da IL-10 (TAMBUR et al., 2001).
Em um estudo realizado por Delgado et al. (2002) foi avaliada a freqüência dos genótipos do promotor do gene da IL-10 na posição -1082 em pacientes do Camboja, onde foi encontrado uma maior freqüência de indivíduos heterozigotos entre os pacientes com TB pulmonar. Estudando pacientes italianos, Scola et al. (2003) observaram uma tendência de diminuição do alelo A nos pacientes com TB pulmonar. Um estudo mais recente, realizado no Paquistão por Afzal et al. (2011), demonstrou uma maior freqüência do genótipo GG na posição -1082 nos pacientes com TB pulmonar, em relação a indivíduos sem histórico ou evidência radiológica de TB.
Estudos de análise genética de populações têm indicado que diferenças na constituição genética do sistema imune do hospedeiro podem afetar a susceptibilidade da infecção micobacteriana (SHASTRY,2002). Estudos realizados em outros países apontam para a importância da constituição genética do indivíduo no desenvolvimento da TB pulmonar (SELVARAJ ET AL.,2008; AFZAL et al., 2011. Acredita-se que, no caso do estudo do gene da citocina IL-10 e seus polimorfismos, se um indivíduo infectado tiver uma predisposição genética a produzir maior quantidade de IL-10, este poderá ter mais chance de desenvolver a doença (LAPA e SILVA, 2004). Assim, os polimorfismos genéticos que alteram a produção de citocinas poderão ser usados no futuro como marcadores genéticos para identificar grupos com maior ou menor risco de desenvolver a TB pulmonar.
Diante do exposto, o presente estudo avaliou associação entre um polimorfismo genético da IL-10 com o risco de desenvolvimento da TB pulmonar. Sabendo que nenhum estudo com o intuito de relacionar polimorfismos genéticos da IL-10 com a susceptibilidade à TB pulmonar foi realizado no Brasil, todo conhecimento gerado será de fundamental importância para o entendimento dos fatores genéticos e imunológicos que podem estar influenciando na susceptibilidade à TB.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 UMA VISÃO GERAL DA TUBERCULOSE
A TB é uma doença infecciosa crônica que possui como agente etiológico o M.
tuberculosis. Acredita-se que esta micobactéria, também conhecida como bacilo de Koch, seja anterior ao próprio homem, sucedendo formas mais elementares da vida microscópica (BERTOLLI-FILHO, 2001). Os Primeiros registros a cerca de casos da doença remetem ao período neolítico (7.000-3.000 a.C.) no Egito, Índia e China, respectivamente (DANIEL, 1997). Incluindo casos de tuberculose vertebral, intestinal e pulmonar (HASS; HASS, 1996).
O Mtb é o principal agente etiológico da TB em humanos. É um bacilo imóvel, ligeiramente encurvado de 1,0 a 4,0 µm de comprimento e 0,3 a 0,6 µm de diâmetro, não esporulado e que não produz toxinas. É uma espécie aeróbica estrita, cujo único reservatório é o ser humano, necessitando de oxigênio para crescer e se multiplicar (KRITSKI et al., 2000). É um parasita intracelular facultativo, podendo viver no interior de células fagocitárias, estabelecendo sua infecção, preferencialmente, no sistema pulmonar, onde normalmente acondiciona-se em um estado de latência enquanto o sistema imunológico do hospedeiro prevalece e mantém a infecção sob controle. (DUCATI et al., 2006).
A TB permanece ainda neste milênio, como a doença infecciosa que mais mata no mundo. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de um terço da população mundial estava infectada pelo M. tuberculosis no ano de 2011. Nesse mesmo ano ocorreram cerca de 8,7 milhões de casos em todo o mundo (125 por 100.000 habitantes) resultando em 1,1 milhões de mortes (Figura 1) (WHO, 2012).
A Maioria dos casos de TB ocorridos em 2011 está em países localizados na Ásia (59%) e África (26%); menores proporções de casos ocorreram na região leste do mediterrâneo (7%), Europa (5%) e na América Latina (3%) (WHO, 2012). Desde o ano 2000, 22 nações têm recebido uma atenção especial, pois, estas, respondem por 81% dos casos estimados no mundo inteiro. Índia, China, África do Sul, Indonésia e Paquistão ocupam, respectivamente, as primeiras posições em números de casos da doença (WHO, 2012).
Figura 1- Incidência global de tuberculose. Número de novos casos da Doença por 100.000 habitantes em 2011.
Fonte: WHO (2012)
Apesar dos esforços que têm sido empregados para o controle da TB pulmonar no Brasil, os números de casos da doença, ainda, são extremamente preocupantes. Estima-se que em 2011, ocorreram cerca de 90.000 casos novos da doença (85% da forma pulmonar). Do total de casos bacilíferos notificados, 44,6% concentram-se na região Sudeste, 27,9% no Nordeste, 12,1% no Sul, 11% no Norte e 4,3% na região Centro-Oeste (Figura 2). Os Estados responsáveis pelas maiores taxas de incidência da doença foram: Rio de Janeiro (62,7%) Amazonas (61%), Pará (48%) e Pernambuco (47%) (BRASIL, 2012).
No estado de Pernambuco foram notificados, no ano de 2011, 4.096 casos da doença, sendo cerca de 3910 casos de TB pulmonar (86% dos casos) (SVS, 2012). Atualmente, o estado ocupa a 4ª posição em incidência e o 2º em mortalidade entre os estados brasileiros (BRASIL, 2012).
2.2 A RESPOSTA IMUNOLÓGICA AO M. TUBERCULOSIS
Cerca de dois bilhões de indivíduos albergam em seus organismos o Bacilo de Koch, entretanto, apenas 5 a 10% desses desenvolvem a tuberculose ativa (LAPA e SILVA, 2004). Portanto, a grande maioria da população convive com o bacilo estabelecendo uma efetiva relação hospedeiro-parasita.
A TB pulmonar caracteriza-se por infecção pelo M. tuberculosis associada ao surgimento dos sintomas clínicos e/ou alterações radiográficas, além das alterações do complexo primário (foco pulmonar, hiperplasia do linfonodo infectado e foco ganglionar) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011). Na TB latente, sem progressão para a doença, supõe-se uma resposta imune efetiva, visto que o indivíduo não desenvolve os sintomas clínicos ou radiográficos, apresentando apenas a prova tuberculínica (PT) reatora.
O M. tuberculosis é o principal agente etiológico da TB em humanos. É um bacilo imóvel, ligeiramente encurvado de 1,0 a 4,0 µm de comprimento e 0,3 a 0,6 µm de diâmetro, não esporulado e que não produz toxinas. É uma espécie aeróbica estrita, cujo único reservatório é o ser humano, necessitando de oxigênio para crescer e se multiplicar (KRITSKI et al., 2000). É um parasita intracelular facultativo, podendo viver no interior de células fagocitárias, estabelecendo sua infecção, preferencialmente, no sistema pulmonar, onde normalmente acondiciona-se em um estado de latência enquanto o sistema imunológico do hospedeiro prevalece e mantém a infecção sob controle. (DUCATI et al., 2006).
A Infecção pelo M. tuberculosis pode estar relacionada a três mecanismos fisiopatológicos: controle na porta de entrada (imunidade inata), doença ativa e tuberculose latente. A Evolução da doença depende também do indivíduo estar sendo infectado pela primeira vez (primo-infecção) ou re-infectado. A Probabilidade de adoecimento em uma primo-infecção depende da virulência do bacilo, da fonte infectante e das características imunológicas e genéticas dos indivíduos infectados. A Contribuição do “background” genético na resistência e susceptibilidade a primo-infecção e progressão do estado latente para a TB ativa tem sido demonstrada em alguns estudos em humanos (STEAD et al., 2001; ANAND et al., 2007; ANSARI ET al., 2009).
Por tratar-se de uma doença crônica, que essencialmente afeta os pulmões, a TB produz em seu curso profundas alterações no sistema imunológico. Existem evidências de que o Mtb secreta algumas proteínas, como o ESAT-6 (early secretory antigen target-6) e o CFP-10 (culture filtrate protein-10), em sua fase de crescimento, que são capazes de interferir fortemente na resposta imune do hospedeiro (LAPA e SILVA, 2004). Estudos recentes têm demonstrado que o ESAT-6 induz a apoptose de macrófagos e pode contribuir para a translocação micobacteriana dos fagolisossomas para o citoplasma das células mieloides (KINHIKAR et al., 2010). Dessa forma, o papel que a resposta imunológica apresenta contra a TB é de fundamental importância no controle da infecção pelo M. tuberculosis (HERNANDEZ-PANDO et al., 2009).
Nas vias aéreas terminais, o Mtb entra nos macrófagos alveolares através da endocitose mediada por vários receptores do macrófago: os receptores de manose ligam-se à lipoarabinomananas (LAM), um glicopeptídio de parede celular bacteriana, enquanto os receptores de complemento (CR3 e CR4) ligam-se à bactéria opsonisada, dando início à resposta inata ou inespecífica (KRITSKI et al., 2005). Uma vez fagocitadas, as micobactérias replicam-se dentro dos vacúolos citoplasmáticos, podendo ocorrer o bloqueio da fusão do fagossomo com o lissossomo por meio de alguns mecanismos, tais como: a inibição de sinais de cálcio e o bloqueio do recrutamento de proteínas (GLICKMAN, 2001). Entretanto, quando há a formação do fagolisossomo, os antígenos micobacterianos podem ser processados e apresentados aos linfócitos T auxiliares (CD4+) (T helpers- (Th), por meio do MHC (Major Histocompability Complex) de classe II, presente nos macrófagos e células dendríticas (DC’s). Estas células são conhecidas como células apresentadoras de antígenos (APC’s) e produzem citocinas inflamatórias, como o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α) e a IL-1, capazes de recrutar neutrófilos e monócitos para o local da infecção (FERRAZ et al., 2006; MOUTINHO, 2011).
No que diz respeito à imunidade inata, os neutrófilos são as primeiras células inflamatórias a migrarem para o local da infecção micobacteriana, seguidos das células natural killer (NK) e dos macrófagos, respectivamente. As Células NK são capazes de eliminar o Mtb diretamente ou destruir os monócitos infectados e ativar células fagocíticas no sítio da infecção (NORTH, 2004). Através de receptores de reconhecimento, como o receptor de manose, receptores para a porção Fc de anticorpos (FcRs) e receptores para produtos de ativação do sistema complemento, como o C3b e o
C4b, ocorrerá o reconhecimento e a fagocitose das micobactérias pelos neutrófilos, macrófagos e DC’s (células da imunidade inespecífica) (NORTH, 2004).
Os Receptores de reconhecimento padrão tipo Toll (TLR) desempenham um papel-chave na ligação entre a imunidade inata e adquirida (ERNST, 2012). Eles estão diretamente envolvidos no reconhecimento de antígenos do Mtb. A Expressão de moléculas co-estimulatórias, como o CD80 e CD86, na superfície de macrófagos e células dendríticas só é induzida após o reconhecimento pelos TLR de moléculas específicas dos patógenos, como a LAM, lipoproteínas e outros derivados lipídicos do Mtb (KRUTZIK, 2004). A ativação dos linfócitos T CD4+ está relacionada, principalmente, com o reconhecimento do peptídeo ligado ao MHC de classe II e com a interação entre moléculas co-estimuladoras, como a ligação entre o CD80/CD86 com o CD28). Dessa forma, a interação entre os antígenos específicos micobacterianos, TLRs e outros receptores presentes na superfície de macrófagos e DC’s, induz a uma resposta celular predominantemente pró-inflamatória (TEIXEIRA, 2007).
A Resposta imune contra a TB depende de uma resposta mediada por células, cuja interação de linfócitos e monócitos culmina com a produção de mediadores pró e anti-inflamatórios. Estudos de causa e efeito em modelos animais evidenciam que a imunidade anti-TB é mediada especialmente por linfócitos TCD4+, do tipo Th1, e TCD8+, já que elementos como a produção de TNF-α e Interferon-gamma (IFN-γ) estão presentes e são de suma importância para o controle da infecção (FLYNN, 1993; FLYNN, 1995; MOUTINHO, 2011).
Aproximadamente três semanas após a infecção, inicia-se uma resposta Th1 contra o Mtb, onde ocorrerá ativação dos macrófagos a tornarem-se mais bactericidas (YOUNG, 2002). O Macrófago desempenha um importante papel para o controle da infecção. Pois, o bacilo pode se multiplicar e ficar latente no interior do fagócito como também, pode ser inibido ou morto quando ocorrer ativação macrofágica (TEIXEIRA, 2007).
Após o estímulo de células Th1, ocorrerá a produção de IFN-γ, uma potente citocina inflamatória, que irá direcionar os macrófagos a tornarem-se competentes no combate à infecção (PIETERS, 2002). O IFN-γ, ativa o macrófagos, estimulando a formação do fagolisossoma nas células infectadas, expondo o Mtb a um ambiente ácido (COOPER, 2008). Adicionalmente, esta citocina estimula a síntese de óxido nítrico induzível (iNOS), que produz o óxido nítrico (NO). O NO, junto aos radicais livres,
derivados da “explosão oxidativa” do oxigênio intracelular, são bactericidas e participam da resistência à infecção pelo Mtb (KHADER et al., 2007).
A Resposta Th1 induz a formação do granuloma e da necrose caseosa. Os Macrófagos ativados, estimulados pelo IFN-γ, produzem TNF-α, o qual recruta os monócitos. Estes, por sua vez, diferenciam-se em “histiócitos epitelióides” que caracterizam a resposta granulomatosa (Figura 3) (PIETERS, 2002).
O Granuloma é formado em resposta à infecção micobacteriana, e é caracterizado pelo acúmulo de células inflamatórias ao redor do microrganismo. É formado por células do sistema fagocítico-mononuclear (monócitos e macrófagos), células epitelióides, células gigantes multinucleadas, granulócitos, linfócitos T e B, e fibroblastos (CAMPOS, 2006). A Formação do granuloma é essencial para contenção da infecção, uma vez que, funciona como uma barreira delimitando o sítio da infecção (TEIXEIRA, 2007). Com a manutenção da imunidade celular, o centro do granuloma sofre um processo de necrose de caseificação, o que também pode ser induzido pelo BK, através do TNF-α. O Meio necrótico é adverso à micobactéria, que deprime sua atividade metabólica e fica dormente, condição, esta, que pode permanecer várias décadas (CAMPOS, 2006).
Figura 3: Esquema representativo da formação do granuloma epitelióide em um indivíduo infectado pelo M. tuberculosis. FONTE: Graça, 2009. Adaptado.
Em indivíduos sadios infectados com o Mtb (sem progressão para doença ativa), o granuloma primário é visualizado por radiografia no ápice pulmonar, limitado por fibrose e frequentemente calcificado. Nestes indivíduos ocorre uma resposta inflamatória de alta intensidade, permanecendo uma potente memória imunológica contra o Mtb, após a eliminação da micobactéria, contendo o bacilo no foco primário da infecção, caracterizando, dessa forma, uma resposta imune eficaz (ORME, 2001; KAUFMANN, 2005).
Dentre as diversas moléculas envolvidas na regulação da resposta contra a micobactéria, destacam-se as quimiocinas: Macrophage Inflamatory Protein-1 (MIP-1) e Interferon inducible Protein-10 (IIP-10), responsáveis pelo recrutamento das células para formação do granuloma (TEIXEIRA, 2007), as citocinas e outros mediadores pró-inflamatórios, que estimulam a produção de moléculas de adesão, favorecendo a migração das células, atuando como co-estimuladores na ativação celular (RAGNO, 2001). A Citocinas do tipo Th1, tais como o IFN-γ e a IL-12, são moléculas pró-inflamatórias e atuam sobre o macrófago aumentando sua capacidade de eliminação do bacilo. Por outro lado, as citocinas do perfil Th2, tais como a IL-10, Fator de Transformação de Crescimento-Beta (TGF-β) e IL-4, são citocinas imunorregulatórias capazes de suprimir a resposta do tipo Th1, diminuindo a resposta inflamatória, favorecendo a progressão da infecção pelo Mtb (HASAN et al., 2008).
Pressupõe-se que respostas diferenciais na produção de citocinas/quimiocinas são mediadas por lipídios presentes na parede celular do Mtb, sugerindo um papel importante destes antígenos na resposta do hospedeiro à infecção pelo bacilo de Koch (ROCHA-RAMIREZ et al., 2008; MOUTINHO, 2011). A Participação de citocinas imunorregulatórias tem sido bastante estudada na resposta imune celular contra o M. tuberculosis em modelos experimentais e na infecção humana, fazendo com que alguns estudos pudessem correlacionar a presença ou os níveis altos dessas moléculas com a gravidade da doença (SHIN, 2005; ORAL, 2006; ATES, 2008; BEM-SELMA, 2011).
2.3 O PAPEL DA CITOCINA IL-10
A IL-10 é membro de uma família de citocinas pertencentes à classe II identificado no início da década de 90. Esta classificação baseia-se, principalmente, nas particularidades de seus receptores, caracterizados por uma única ponte dissulfeto em cada (N- e C-Terminal) subdomínio do ECD (Ectodomain) (ZDANOV, 2010). É
constituída por dímeros intercalados, formados por dois domínios idênticos, ligados não-covalentemente. Cada cadeia da qual contém um domínio com um feixe de seis hélices que se intercala com o da outra hélice (Figura 4) (ABBAS, 2005). A IL-10 é produzida por macrófagos e linfócitos T durante a infecção pelo Mtb.
Devido à sua capacidade de diminuir a produção de citocinas pelos linfócitos T, a IL-10 foi descrita, inicialmente, como um fator inibidor da síntese de citocinas (CSIF) (TURNER et al., 2002). Contudo, atualmente é sabido que a IL-10 atua limitando a produção de mediadores pró-inflamatórios de linfócitos T (TNF-α, IFN-γ, IL-2), bem como de macrófagos (TNF-α, IL-12, NO, espécies reativas de O2). A IL-10 tem ação
nas APC inibindo a expressão de moléculas de MHC de classe II e co-estimulatórias CD80 e CD86 (RAJA, 2004), bloqueando a ativação de linfócitos T e tendo como principal função a imunorregulação negativa do sistema imune.
Então, esta citocina por apresentar uma potente ação inibitória de citocinas pró-inflamatórias, através de sua ação supressora em células Th1 e macrófagos, o aumento dos seus níveis pode estar relacionado com a sobrevivência da micobactéria dentro do hospedeiro, contribuindo para o agravamento da TB (ATES, 2008).
De fato, diversos trabalhos têm demonstrado a presença de níveis elevados da IL-10 em pacientes com TB pulmonar (HENAO et al., 2006; CHEN et al., 2007; CHIACCHIO et al., 2009). Em um estudo realizado por Boussiotis et al. (2000) foi demonstrado que a IL-10 está aumentada em pacientes com TB, e que a capacidade de uma maior produção desta citocina está associada com o aumento da incidência da doença. Em experimentos realizados em modelos animais, observou-se que esta citocina
Figura 4: Diagrama estéreo da estrutura da IL-10. Os dois monômeros (1 e 2) que formam um dímero de domínio permutado são mostrados em violeta e verde, respectivamente, e as pontes dissulfureto em amarelo. FONTE: Zdanov, 2010. Adaptado.
reduz a resposta imune protetora contra o Mtb, através da redução da expressão de TNF-α e IL-12 (MURRAY, 1999). Além disso, tem-se verificado que a IL-10 também é capaz de induzir a reativação da TB em animais (TURNER et al, 2002).
2.4 FATORES GENÉTICOS ENVOLVIDOS NA SUSCEPTIBILIDADE À TUBERCULOSE
Embora a infecção pelo Mtb seja necessária, ela por si só não é suficiente para causar a doença na maioria das pessoas. Isto se deve ao fato de que apenas 10% dos indivíduos imunocompetentes que foram expostos ao bacilo irão desenvolver a TB ativa, enquanto a grande maioria da população controla a bactéria de forma eficaz (MOLLER, 2009). Fatores do hospedeiro, que governam se o indivíduo infectado irá ou não desenvolver a doença ativa, se encontram diretamente relacionados com o estado imunológico do indivíduo, que são, geralmente, determinados por sua constituição genética (FERGUSON et al., 2007; MOLLER, 2009).
A Idéia de que a influência genética está relacionada com a susceptibilidade ou resistência ao Mycobacterium tem sido estabelecida há pelo menos 100 anos, sendo reconhecidas diferenças na vulnerabilidade a doenças em diferentes populações (BELLAMY, 1998). Antes da descoberta do M. tuberculosis, era observado que a TB ocorria, frequentemente, em muitos membros de uma mesma família, aparentando ser uma doença hereditária. Contudo, a descoberta da micobactéria chamou a atenção para o patógeno, enquanto o genoma do hospedeiro foi largamente ignorado (MOLLER, 2009).
Evidências mais convincentes que mostravam a importância da constituição genética do hospedeiro foram demonstradas através de estudos realizados em gêmeos. Gêmeos mono e dizigotos foram comparados com relação à concordância de desenvolvimento da TB. Verificou-se que gêmeos monozigotos (essencialmente idênticos na composição genética) eram mais prováveis de demonstrar concordância para o desenvolvimento da tuberculose que gêmeos dizigotos (COMSTOCK, 1978; SORENSEN, 1988; SIMONDS 1993). De acordo com Comstock (1978), esses achados evidenciam que os fatores genéticos são os principais contribuintes para a progressão da doença, uma vez que gêmeos partilham de um ambiente similar.
O Desenho de estudo ideal para avaliar a susceptibilidade genética à TB pode ser baseado no resequenciamento completo do genoma humano, em um grande conjunto de casos e controles, pois isso permite a genotipagem de todas as variações, raras ou
comuns, no genoma do indivíduo. Entretanto, nesta fase, a aplicação de tal método seria caro, demorado e computacionalmente inviável (MOLLER, 2009). Diante destas limitações, diversos desenhos de estudo e abordagens alternativas foram criadas para doenças complexas, como a TB. Tais abordagens incluem análises de ligação do genoma completo e estudos de associação de possíveis genes-candidatos, utilizados na maioria das pesquisas de susceptibilidade (MOLLER, 2009).
No caso de estudos de associação do tipo caso-controle, a frequência de um alelo específico é comparada entre a população de indivíduos afetados (casos) com a de indivíduos não-afetados (controle), quando estas populações encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (LANDER e SCHORCK, 2006). Estudos de associação em populações caso-controle podem detectar pequenos efeitos de determinados genes e muito desses estudos foram capazes de detectar a associação de genes com o padrão de susceptibilidade/resistência ou encontrar novos caminhos, envolvidos na patogênese de inúmeras doenças (MAARTEN, 2007). O Desenho de estudo que tem apresentado melhores resultados na investigação da susceptibilidade à tuberculose é o estudo de associação (tipo caso-controle), uma vez que foi demonstrado o poder de detecção de pequenos efeitos gênicos quando comparados com os estudos de ligação do genoma completo, desde que o tamanho da amostra analisada seja adequado (RISCH e MERIKANGAS, 1996).
O Componente genético envolvido na susceptibilidade à TB parece estar disperso por inúmeros genes, os quais têm sido extensivamente estudados nos últimos anos, resultando em grande quantidade de informação. Vários genes, entre outros, como HLA (Antígeno Leucocitário Humano), IFN-γ, MBL (Lectina Ligadora da Manose), TLR, IL-10 e o Óxido Nítrico Sintase 2A (NOS2A) têm sido associados com a TB, alguns repetidamente, enquanto outros não apresentaram associação de acordo com a população estudada (BURGNER et al., 2006). Isso enfatiza a complexidade da caracterização da susceptibilidade do hospedeiro em diferentes populações étnicas (ARDLIE et al., 2002).
Em dois estudos randomizados do genoma humano, 99,9% das sequências gênicas encontradas serão idênticas. O Restante, 0,1% do DNA (Ácido Desoxirribonucléico) apresentará diferenças em suas sequencias gênicas. Estas variações são conhecidas como polimorfismos, e aparecem devido a mutações (SHASTRY, 2002). Os SNP são os tipos mais comuns dessas variações genéticas, os quais se caracterizam pela substituição de um único nucleotídeo por outro. SNP
ocorrem com uma frequência de 1 em cada 1000 pares de bases por todo o genoma humano (regiões promotoras, sequencias codificantes e sequências intrónicas). Estão normalmente associados à diversidade populacional, individualidade, susceptibilidade a doenças e resposta individual a medicamentos (SHASTRY, 2002).
Atualmente, há mais de 10 milhões de SNP disponibilizados e depositados em um banco de dados público (National Center Biotechnology Information (NCBI). A Definição de SNP consiste na alteração de um único par de bases (substituição/deleção ou inserção de um único nucleotídeo) em um locus específico, geralmente consistindo de dois alelos (KUBISTOVA et al., 2009). Dentro de uma população, a frequência de um alelo pode ser atribuída a cada SNP, sendo a variante mais comum presente em uma maior frequência do que as raras. É importante notar que existem diferenças marcantes na população humana em termos de distribuição das variantes dos SNP. Por esta razão, um alelo comum em uma região demográfica ou grupo étnico pode ser mais raro em outra região (KUBISTOVA et al., 2009).
“Polimorfismos de genes funcionais” é um termo utilizado para os
polimorfismos que mudam de alguma forma, a expressão e/ou a estrutura de um produto gênico (proteínas ou RNAs especializados). Os SNP podem ocorrer tanto em regiões codificantes ou em sequências não-codificantes (KUBISTOVA et al., 2009). Em geral, polimorfismos localizados em regiões codificantes do gene podem alterar a estrutura primária de uma proteína ou ainda causar falhas funcionais, produzindo uma sequência nucleotídica diferente da esperada. Estes SNP são denominados de “não-sinônimos”. Por outro lado, existem polimorfismos presentes em sequências codificantes que não alteram, necessariamente, os aminoácidos da proteína final e não estão sujeitos à seleção natural. Estes são denominados de “sinônimos” (SHASTRY, 2002). Embora SNP sinônimos não alterem a sequência protéica, eles podem modificar a estrutura e a estabilidade do RNA mensageiro e, consequentemente afetar a quantidade de proteína produzida (SHASTRY, 2002; KUBISTOVA et al., 2009).
SNP que não estão em regiões codificadoras podem apresentar consequências na transcrição, processamento dos transcritos (splicing), instabilidade nos fatores de transcrição e instabilidade dos RNAs não-codificantes, afetando significativamente a expressão gênica. Inúmeros polimorfismos em regiões não-codificantes do gene tem apresentado uma associação com a desregulação das moléculas codificadas na resposta imune tanto in vitro quanto in vivo. Como consequência, esses polimorfismos em sequências regulatórias dos genes são, provavelmente, responsáveis pelas variações
interindividuais nos níveis de muitas citocinas. Um fenômeno descrito como “altos” versus “baixos” produtores específicos de citocinas (KUBISTOVA et al., 2009).
2.5 POLIMORFISMOS NA REGIÃO PROMOTORA DO GENE DA IL-10
O Envolvimento de SNP nas infecções por patógenos vem sendo amplamente estudado nos últimos anos. Por apresentarem um papel fundamental na proteção contra diversas enfermidades, os experimentos, que analisam e comparam o perfil genético de uma população saudável e outra doente, são desenvolvidos com o objetivo de revelar os principais marcadores genéticos associados à susceptibilidade (KLOTMAN et al., 2006).
O Resultado de uma doença infecciosa grave é determinado, em parte, pela intensidade da resposta inflamatória, o qual varia entre os indivíduos e pode ser controlada a nível genético. Desta forma, a constituição genética do hospedeiro infectado é importante para o entendimento do desenvolvimento de certas doenças (OPDAL, 2004).
A IL-10 tem sido cada vez mais associada tanto na influência quanto na progressão do curso de várias doenças infecciosas, e os diferentes polimorfismos encontrados na região promotora do gene desta citocina têm sido associados com a prevalência e a gravidade dessas enfermidades (OPDAL, 2004).
Em uma população com indivíduos portadores do vírus da Hepatite C (HCV), uma das principais causas de doença do fígado no mundo, foi verificada uma associação entre o polimorfismo genético da IL-10 e a susceptibilidade à infecção ao HCV. Um estudo com 188 pacientes revelou que os indivíduos portadores do genótipo -1082GG eram mais suscetíveis a infecção pelo HCV quando comparados com os genótipos GA e AA (AFZAL et al., 2011).
O vírus Epstein-Barr (EBV) é o agente etiológico da mononucleose infecciosa, uma doença que é transmitida por gotículas salivares. Acredita-se que as citocinas desempenham um papel importante na infecção pelo EBV (OPDAL, 2004). Em um estudo foi realizada a comparação entre pacientes com Linfoma de Burkitt e indivíduos doadores de sangue (soronegativos para o EBV) e foi observada uma maior frequência do genótipo -1082GG nos pacientes do que nos controles, sugerindo que a presença do genótipo GG pode estar associada com o aumento do risco do desenvolvimento do Linfoma de Burkitt (MINNICELLI et al., 2012).
Em um estudo realizado por Sunder et al. (2012) também foi realizada a associação do SNP das posições -1082G/A, -819C/T e -592A/C e o risco de desenvolvimento da TB em pacientes infectados pelo HIV, onde foi observado que os indivíduos portadores do genótipo -1082GG apresentavam cerca de quatro vezes mais de desenvolver a TB quando comparados com os outros genótipos. Quando as freqüências alélicas foram comparadas, o alelo A apresentou uma associação positiva com a TB e o alelo G com o HIV (SUNDER et al., 2012).
O Gene da IL-10 está localizado no cromossomo 1 (1q31-32). O Promotor se estende por uma região de 5 kilobases (kb) acima do local de início da transcrição. Esta região é reconhecida por conter inúmeros polimorfismos (TURNER et al., 1997; KUBE et al., 2001). Contudo, na região promotora do gene da IL-10 existem três polimorfismos de base única na região proximal que são mais bem estudados, localizados nas posições -1082 (G/A), -819 (C/T) e -592 (A/C) (TURNER et al., 1997). Os Genótipos -1082: GG, GA e AA, correspondem aos fenótipos alto, intermediário e baixo produtor desta citocina, respectivamente, independente das variações nucleotídicas presentes nas posições -819 e -592 do gene da IL-10 (TAMBUR et al., 2001).
Vários estudos têm demonstrado que polimorfismos no gene da IL-10 estão implicados com a susceptibilidade à TB (DELGADO et al., 2002; SCOLA et al., 2003; ATES., 2008; AFZAL et al., 2011). Em uma linha de pesquisa, que visou avaliar a frequência do genótipo do promotor do gene da IL-10 na posição -1082 G/A em pacientes da Tunísia, encontrou-se uma maior frequência de indivíduos heterozigotos entre os pacientes com TB pulmonar ativa (BEN-SELMA et al., 2011).
Desta forma, os estudos de polimorfismos genéticos do gene da IL-10 poderão, possivelmente, ser usados como marcadores genéticos para identificação de grupos com maior ou menor risco de desenvolverem a tuberculose ativa.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a associação entre o polimorfismo genético (-1082 G/A) da IL-10 e o risco de desenvolvimento da tuberculose pulmonar em pacientes sintomáticos respiratórios provenientes de unidades de saúde da cidade do Recife-PE.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar as freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo genético -1082 G/A do gene da IL-10 em pacientes sintomáticos respiratórios;
• Verificar se existe a associação entre o polimorfismo genético -1082 G/A na região promotora do gene da IL-10 com o risco de desenvolvimento da TB pulmonar em pacientes sintomáticos respiratórios.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
O Desenho deste estudo é do tipo caso-controle que visa avaliar a associação entre o polimorfismo genético -1082 G/A da IL-10 com o risco de desenvolvimento da TB pulmonar em pacientes sintomáticos respiratórios.
4.2 POPULAÇÃO ALVO E PERÍODO DO ESTUDO
Foram incluídas nesta pesquisa, as amostras biológicas de 181 indivíduos sintomáticos respiratórios (SR), sendo 71 pacientes previamente diagnosticados com tuberculose pulmonar, segundo as recomendações do Ministério da Saúde adotados pelo médico acompanhante do serviço de saúde, baseados nos sintomas clínicos, achados radiológicos e exames laboratoriais (Ministério da Saúde, 2011). Os Grupos controle serão formados por 53 indivíduos SR (apenas TB latente) e 57 indivíduos SR sem sintomatologia para TB (não infectados pelo Mtb) (Figura 5). O Estudo foi realizado no período de fevereiro a dezembro de 2012.
Fonte: Autor (2013)
4.3 LOCAL DO ESTUDO
O Estudo foi realizado na cidade do Recife, Pernambuco, com seleção dos pacientes nos seguintes serviços de saúde: Hospital Otávio de Freitas/SUS (HOF),
Hospital das Clínicas (HC/UFPE), Posto de Saúde da Família (PSF) Joaquim Cavalcanti policlínica Albert Sabin e a policlínica Lessa de Andrade. Os Testes laboratoriais (incluindo testes moleculares e imunológicos) foram executados nos Laboratórios de Imunoepidemiologia (LIE) e Imunopatologia e Biologia Molecular (LIBM) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz (CPqAM/Fiocruz), situado na Região Metropolitana do Recife, Pernambuco.
4.4 DEFINIÇÃO DA VARIÁVEIS
4.4.1 Variáveis independentes
Variável Conceito Categorização
Polimorfismo -1082 G/A Variação genotípica, no qual ocorrerá a substituição de uma única base nitrogenada do DNA por outra.
G/A G/G A/A
Idade Idade do paciente (em anos) auto-referida no momento da inclusão do
estudo 9-14 15-29 30-44 45- 59 >60
Sexo Gênero do paciente Masculino
Feminino Tabagista Indivíduo que possui o hábito de fumar Sim
Não Ignorado Etilista Indivíduo que faz uso excessivo de
álcool ( >3 vezes por semana)
Sim Não Ignorado Teste rápido anti-HIV Realização do teste anti-HIV 1 e 2 no
serviço de saúde
Sim Não Ignorado Baciloscopia Realização da baciloscopia no serviço
de saúde
Sim Não Ignorado Cultura Realização de cultura para o Mtb no
LIE do CPqAM
Sim Não Ignorado
Raios-X Realização de Raios-X do tórax Sim
Não Ignorado
Prova Tuberculínica Resultado da PT 0-4mm
5-9mm >10mm
4.4.2 Variáveis dependentes
Pacientes Sintomáticos respiratórios (Ministério da Saúde, 2011)
1) TB Pulmonar (Caso):
Indivíduo com sintomatologia clínica sugestiva: tosse com expectoração por 3 ou mais semanas, febre, perda de peso e apetite, ou suspeito ao exame radiológico, com imagem compatível com tuberculose.
Confirmado por critério clínico-laboratorial
a) TB pulmonar bacilífera - Paciente com duas baciloscopias diretas positivas, ou
uma baciloscopia direta positiva e cultura positiva, ou uma baciloscopia direta positiva e imagem radiológica sugestiva de tuberculose ou duas ou mais baciloscopias negativas e cultura positiva;
b) TB pulmonar negativa - Paciente com duas baciloscopias negativas, com
imagem radiológica sugestiva e achados clínicos ou outros exames complementares que permitam ao médico efetuar um diagnóstico de tuberculose além da cura terapêutica;
2) Controle 1 (Tuberculose latente) (Ministério da Saúde, 2011)
Indivíduos com PT reator >10 mm, com achados radiológicos normais, sem sintomatologia clínica compatível com tuberculose e que apresentem contato domiciliar com pacientes portadores de tuberculose pulmonar.
3) Controle 2 (SR não infectado pelo Mtb)
Indivíduos sintomáticos respiratórios que apresentem PT não reator e exames laboratoriais (baciloscopia e cultura) negativos para tuberculose pulmonar e diagnóstico confirmado de outra patologia respiratória (asma, bronquite, pneumonia, DPOC, etc).
4.5 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO
Foram incluídos no estudo indivíduos portadores de doenças clínicas respiratórias com tosse por tempo igual ou superior a 3 semanas, febre, perda de peso e apetite ou que apresentassem alterações ao exame radiológico de imagem.
4.6 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Foram excluídos da pesquisa os pacientes portadores de doenças auto-imune ou que estavam fazendo uso de drogas que interferiram no sistema imunológico (ANEXO 1). Devido à alta taxa de prevalência da coinfecção do Vírus de Imunodeficiência Humana (HIV) em indivíduos portadores de TB pulmonar foi realizado teste rápido para a detecção do HIV, em todos os pacientes participantes da pesquisa (protocolo de rotina para os pacientes sintomáticos respiratórios, realizado por profissional capacitado do serviço de saúde), para exclusão dos soropositivos.
4.7 MÉTODOS DE COLETA E PROCESSAMENTO DOS DADOS
Após concordar em participar da pesquisa, mediante assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (ANEXO 2), foi coletado 4ml do sangue periférico do indivíduo voluntário em um tubo contendo anticoagulante, além de 5 a 10ml de escarro em um pote de coleta universal.
Após a coleta do sangue, foi realizado o isolamento de PBMC através de gradiente de densidade do sangue periférico utilizando Ficoll-histopaque. O sangue foi centifugado à 179G durante 30 min. Posteriormente, as PBMC foram utilizadas para extração do DNA genômico (QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)) e amplificação por PCR em tempo Real para determinação dos polimorfismos genéticos.
Os Dados foram armazenados no programa estatístico SPSS 18.0.
4.8 PADRONIZAÇÃO DAS TÉCNICAS
4.8.1 Obtenção de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC)
Foi coletado 4ml de sangue periférico do paciente em um tubo (Vacutainer®, Becton and Dickson, England) contendo ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA). Após a coleta, o sangue foi diluído em 4ml de solução solução Tampão Fosfato Salino (PBS) pH 7,2 em um tubo cônico de polipropileno de 15ml previamente identificado
com os dados do paciente. Foi colocado em outro tubo cônico (15ml) 3ml de Ficoll Histopaque gelado. Após essa etapa, o sangue homogeneizado com PBS foi adicionado ao tubo com Ficoll-Histopaque lentamente pela parede do tubo, tendo o cuidado para não misturar. O Tubo foi centrifugado por 30 minutos à 179G. Após a centrifugação, foram retiradas as PBMC, onde foram armazenadas em um tubo rosqueado de 2ml, devidamente identificado e mantido a -70ºC.
As PBMC foram utilizadas para extração do DNA genômico e amplificação por PCR em tempo Real (qPCR) para determinação dos polimorfismos genéticos.
4.8.2 Extração do DNA
Foi realizada a técnica de purificação de DNA do paciente através do QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), seguindo os protocolo dos fabricantes. Essa técnica já foi otimizada e vem sendo utilizada com amostras de sangue em diferentes estudos desenvolvidos Laboratório de ImunoEpidemiologia do CPqAM/Fiocruz.
4.8.3 Determinação do Polimorfismo Genético
Foi utilizada a técnica de discriminação alélica pelo sistema TaqMan para PCR em tempo real. Foi utilizado o kit da Applied Biosystems de número de identificação de C___1747360_10 (rs1800896), que emprega um conjunto de primers e sondas específicos para o SNP da posição -1082 da IL-10, utilizando condições universais de reação e de amplificação. A Amplificação foi realizada no equipamento de PCR em tempo real ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems), e a reação de amplificação foi realizada em duas etapas: 95ºC por 10 minutos, seguida de 40 repetições de 92º C por quinze segundos e 60º C por um minuto. A Reação de PCR foi realizada com um volume total de 12,5µ L contendo 6,25µ L de Mix universal para o sistema TaqMan (contendo tampão, referência passiva dye ROX, deoxinucleotídeos, uridina, uracil-N-glicosilase e DNA polimerase ampliTaq Gold – Applied Biosystems), 0,312µ L do conjunto primer/ sonda (TaqMan SNP Genotyping Assay Mix) a 1X e 5,937µ L da amostra de DNA diluída em água.
A Técnica de discriminação alélica consiste em utilizar um conjunto combinando de duas sondas marcadas com diferentes fluoróforos, uma complementar para cada um dos alelos (mais freqüente e menos frequente). A Sonda se liga ao seu
alelo específico e a fluorescência será lida para o alelo presente na amostra. Se os dois alelos estiverem presentes, são lidos os dois tipos de fluorescência.
4.8.4 Cultura e identificação de micobactérias em meio Lowenstein-Jensen
Após descontaminação, 0,2ml do sedimento de escarro foi semeado em três tubos
contendo o meio Löwenstein-Jensen, um tubo de meio Löwenstein-Jensen (simples), um tubo de meio Löwenstein-Jensen com PNB (ácido para-nitrobenzóico), um tubo de meio Löwenstein-Jensen com TCH (Hidrazida do ácido 2 carboxílico). Os Tubos foram colocados em estufa a 37ºC onde foram lidos uma vez por semana até a 8ª semana, ou antes, assim que derem positivos (crescimento de colônias em algum tubo). Os Meios de Löwestein-Jensen (simples, PNB e TCH) foram preparados pela equipe do Laboratório de Imunoepidemiologia do CPqAM/FIOCRUZ. Todos os meios preparados passaram por testes de esterilidade (estufa a 37ºC sem inoculação de amostra) e controle de qualidade do meio (inoculação de cepa de referência H37Rv de M. tuberculosis), seguindo o Manual Nacional de Vigilância da Tuberculose e outras Micobactérias, MS, 1ª edição, 2008.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As Frequências alélicas e genotípicas foram calculadas a partir da contagem direta e comparada entre os pacientes sintomáticos respiratórios. As Frequências entre os indivíduos SRs foram determinadas para a conformidade do equilíbrio de Hardy-Weinberg através do software Genotype Transposer. A Análise estatística foi calculada pelo teste do qui-quadrado e teste exato de Fisher usando o programa R. Avaliação do Risco Relativo para os alelo e genótipos foi realizada calculando o Odds Ratio (OR) com intervalo de confiança (CI) de 95%. A Diferença entre os resultados obtidos foi considerada significativa quando p<0,05.
4.10 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O Presente estudo é parte integrante do projeto de pesquisa intitulado “Avaliação da associação entre polimorfismo genéticos e níveis séricos das
citocinas TNF-α e IL-10 com a susceptibilidade a tuberculose pulmonar”, que foi
submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do CPqAM/Fiocruz (parecer nº 03/12) (Anexo 3), observando-se os cuidados necessários para preservar a liberdade de consentimento e a privacidade das informações dos indivíduos envolvidos e seguirá o descrito pela Resolução 196/96, que apresenta as diretrizes e normas regulamentadores de pesquisas envolvendo seres humanos.
Artigo 1: Polimorfismo (-1082 G/A) da Interleucina-10 em pacientes com tuberculose pulmonar.
(Artigo que será submetido para publicação na Revista Infection, Genetics and Evolution)
André Luiz Alves do Nascimento1 Valdênia Maria Oliveira de Souza2 Haiana Charifker Schndler3
Marcus Vinícius Cardoso4 Clarice Neuenschwander Lins de Morais5 Lilian Maria Lapa Montenegro5
1
Mestrando do Programa de Pós-graduação em Medicina tropical – UFPE
2
Professora do Depto de Ciências Farmacêuticas e Setor de Imunologia-LIKA – UFPE
3
Pesquisadora Titular em Saúde Pública – CPqAM/Fiocruz
4
Dourando do Programa de Pós-graduação em Genética - UFPE
5
Tecnologista em Saúde Pública – CPqAM/Fiocruz
Endereço para correspondência: Lílian Maria Lapa Montenegro
Av. Professor Moraes Rêgo, s/n – Cidade Universitária, Recife/PE. CEP 50.670-420 Email: lilian@cpqam.fiocruz.br
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença crônica, que essencialmente afeta os pulmões e tem a resposta imunológica desempenhando fundamental importância no controle da infecção pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb) [1]. A resposta imune contra a TB depende de uma resposta mediada por células, cuja interação de linfócitos e monócitos culmina com a produção de mediadores pró e anti-inflamatórios. Estudos de causa e efeito em modelos animais evidenciam que a imunidade anti-TB é mediada especialmente por linfócitos TCD4+, do tipo Th1, e TCD8+, já que elementos como a produção de TNF-α e Interferon-gamma (IFN-γ) estão presentes e são de suma importância na ativação de macrófagos e o controle da infecção [2,3,4].
A Interleucina-10 (IL-10) é um citocina imunossupressora que limita a produção de mediadores pró-inflamatórios de linfócitos T (TNF-α, IFN-γ, IL-2), bem como de macrófagos (TNF-α, IL-12, NO, espécies reativas de O2). De fato, alguns trabalhos têm
demonstrado a presença de níveis elevados níveis da IL-10 em pacientes com TB pulmonar [6-8].
A IL-10 tem sido cada vez mais associada na progressão do curso de várias doenças infecciosas como pneumonia, mononucleose infecciosa e hepatites B e C, e os diferentes polimorfismos encontrados na região promotora do gene desta citocina [9] têm sido associados com a gravidade dessas enfermidades [10]. Um vários estudos tem demonstrado que polimorfismos no gene da IL-10 estão implicados com a susceptibilidade à TB [11-14]. Contudo, a relação entre o polimorfismo genético do gene da IL-10 (-1082 G/A) com a susceptibilidade TB pulmonar não foi ainda avaliada no Brasil. Desta forma, investigamos a possível associação entre o SNP (-1082 G/A) da
IL-10 e o risco de desenvolvimento da tuberculose pulmonar em pacientes sintomáticos respiratórios provenientes de unidades de saúde da cidade do Recife-PE, Brasil.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1População do estudo
Foram incluídas nesta pesquisa, as amostras biológicas de 71 pacientes previamente diagnosticados com tuberculose pulmonar, com diagnóstico confirmado da doença por meio dos sintomas clínicos, achados radiológicos e exames laboratoriais (baciloscopia ou cultura positivos), no período de fevereiro a dezembro de 2012. Como grupos controle foram selecionados 53 indivíduos sintomáticos respiratórios (SRs) (apenas TB latente/controle 1) e 57 SRs sem sintomatologia para TB (não infectados pelo Mtb/controle 2). Foram excluídos da pesquisa os pacientes portadores de doenças auto-imunes, portadores do HIV ou indivíduos que estavam fazendo uso de drogas imunossupressoras. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do CPqAM/FIOCRUZ-PE (CAAE 0056.0.095.000-11).
2.2 Obtenção das células Mononucleares do sangue periférico (PBMC).
O isolamento de PBMC foi realizado através de gradiente de densidade do sangue periférico utilizando Ficoll-Histopaque (GE Healthcare, Uppsala) seguindo as instruções do fabricante. O sangue foi centrifugado à 179G durante 30 min. Em seguida, as PBMC foram retiradas e estocadas à -70ºC.
2.3Determinação do polimorfismo genético
O DNA genômico foi extraído das células PBMC utilizando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Duesseldorf). Foi realizada a genotipagem pelo sistema TaqMan para PCR em tempo real, utilizando o kit da Applied Biosystems de número de identificação
de C___1747360_10 (rs1800896), que empregou um conjunto de primers e sondas específicos para o SNP da posição -1082 da IL-10, utilizando condições universais de reação e de amplificação. Foi utilizado um conjunto combinado de duas sondas marcadas com diferentes fluoróforos (VIC e FAM) uma complementar para cada um dos alelos (mais freqüente e menos frequente). A sonda se ligou ao seu alelo específico e a fluorescência foi lida para o alelo presente na amostra. Se os dois alelos estiverem presentes, são lidos os dois tipos de fluorescência.
2.4Análise estatística
A freqüência genética e a análise de associação entre os grupos de comparação foram realizados com UNPHASED v.3.121 (Dudbridge, 2008), enquanto que a análise de associação entre esses grupos e fatores de risco foi realizada com SNPStats. Este software implementa um teste de probabilidade retrospectiva (a probabilidade de observar genótipos dadas fenótipos), utilizando um modelo de regressão logística multinomial. As frequências entre os indivíduos SRs foram determinadas para a conformidade do equilíbrio de Hardy-Weinberg através do software Genotype Transposer. A diferença entre os resultados obtidos foi considerada significativa quando p<0,05.
3 RESULTADOS
3.1 Características demográficas dos pacientes
Foram incluídos no estudo 181 indivíduos sintomáticos respiratórios. A média de idade entre os pacientes com TB pulmonar foi 43 ±15.2 anos, enquanto que para os controles 1 e controle 2 foi de 48 ± 20.2 e 51 ±16.8 anos, respectivamente. Entre os 71 portadores de TB pulmonar, 41 (48%) eram do sexo masculino, onde destes, 33 (47%)
