Maria Isabel Galbiatti
Estudo da anatomia, morfologia e perfil químico do óleo essencial de
Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)
Study of the anatomy, morphology and chemical profiles of the
essential oils of Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)
Campinas 2019
Maria Isabel Galbiatti
Estudo da anatomia, morfologia e perfil químico do óleo essencial de
Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)
Study of the anatomy, morphology and chemical profiles of the
essential oils of Plectranthus neochilus Schltr. (Lamiaceae)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Vegetal.
Dissertation presented to the Graduate Program in Plant Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master, in the area of Plant Biology.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARIA ISABEL GALBIATTI E ORIENTADA PELA PROF.ª DRA. ALEXANDRA CHRISTINE HELENA FRANKLAND SAWAYA E COORIENTAÇÃO DE PROF.ª DRA. JULIANA LISCHKA SAMPAIO MAYER.
Orientadora: Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya Co-orientadora: Juliana Lischka Sampaio Mayer
Campinas 2019
Profª. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya
Profª. Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques
Profª. Dra. Sara Adrián López de Andrade
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica da aluna.
O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Código de Financiamento 001, processo 132849/ 2018-6.
Ao Universo e a todo o sagrado existente.
A mim, pela coragem de mudar a direção da minha vida profissional e me dedicar ao mestrado nesse momento.
À minha família que me incentivou e contribuiu para que eu pudesse realizar o sonho de fazer o mestrado.
À professora Dra. Alexandra Sawaya por toda orientação, dedicação, ensinamentos e principalmente pela paciência com minhas dificuldades.
À professora Dra. Juliana Mayer por toda orientação, pelo carinho, ensinamentos e prontidão em me auxiliar.
Á UNICAMP por toda infraestrutura, em especial ao Instituto de Biologia e Instituto de Química. Ao laboratório ThoMSon do IQ pelo uso do GC-MS com injetor automático, pois sem essa ferramenta seria impossível realizar as análises de metabolômica. Ao David, José e Vinicius por terem me ensinado sobre o GC-MS e ajudado nos momentos finais.
À pesquisadora Márcia Ortiz pela parceria, conversas científicas e uso do laboratório de Fitoquímica do Instituto Agronômico de Campinas para as extrações do óleo essencial. A técnica Daniela e os alunos queridos da Márcia, Dayane, Ana Paula e Júlio, que juntos trocamos muitas informações. Ao Herbário da UNICAMP (UEC) pelo estágio e pelos ensinamentos.
À querida taxonomista Julie Dutilh que carinhosamente e pacientemente sentou comigo para discutir taxonomia e confirmou características da espécie.
Á Amanda Mesquista pela parceria na citogenética.
Aos colegas do departamento de Biologia Vegetal (Botânica e Fisiologia Vegetal) pelas conversas nos corredores, nos cafés, pelos momentos de diversão e por todo o apoio. Ao Luciano pela ajuda no uso de equipamento e ao Carlão pelo auxílio gentil prestado no campo.
Aos colegas de laboratório LabMetaMass: Vanessa, Mara, Guilherme e Elisa por toda ajuda, pelas dúvidas discutidas, pelos socorros e pelo mais especial, nossa amizade.
Aos amigos da Anatomia Vegetal: Fábio, Elimar, Edimar, Mariana, Gleyce, Deni, Lais, Thainá, Marília que me ajudaram com as dificuldades do laboratório, me ensinaram do zero as técnicas pacientemente e, além disso, pelas conversas e convivência especial que tivemos nesse período. Ao técnico do laboratório Tião, pelo suporte técnico, auxílio nas preparações de reagentes e companheirismo, sempre disposto a ajudar.
Lamiaceae é uma família que abriga um dos maiores gêneros, Plectranthus L'Hér., que possui espécies ornamentais, comestíveis, medicinais, de interesse econômico e diversos usos etnobotânicos. Plectranthus neochilus Schltr. é uma espécie introduzida, mas amplamente cultivada no Brasil, popularmente conhecido como boldo gambá, boldinho e boldo miúdo. A revisão bibliográfica apontou certa dificuldade em identificar a espécie devida às semelhanças morfológicas com Plectranthus ornatus. O óleo essencial da espécie apresenta monoterpenos e sesquiterpenos com atividades biológicas pouco exploradas. Além disso, há uma variação entre os compostos químicos identificados para a espécie. Por isso, o objetivo do trabalho foi utilizar quatro indivíduos em dois ambientes de cultivo, ao sol pleno no campo e na estufa, com coletas ao longo de um ano nos períodos manhã e tarde e verificar, com bases em estudos anatômicos e citogenéticos, possíveis características para a identidade da espécie; avaliar o perfil químico do óleo essencial e suas atividades biológicas; e, através da análise metabolômica untargeted, avaliar os voláteis da espécie nos dois ambientes ao longo de um ano e verificar se há variação mensal entre eles. Os estudos anatômicos e citogenéticos forneceram características que confirmam que os indivíduos utilizados nesse trabalho são todos da mesma espécie, Plectranthus neochilus e características para a identidade da espécie. O óleo essencial apresentou como composto majoritário o trans-cariofileno e -tujeno, e atividade antimicrobiana, porém sem potencial antioxidante quando avaliado por DPPH. A análise metabolômica untargeted apontou que não há variação mensal dos voláteis estatisticamente significantes mesmo em meses de altas temperaturas e ausência de chuva, mas que há diferenças estatisticamente significantes entre os ambientes de cultivo. O composto 1-octen-3-ol se apresentou mais intenso no cultivo na estufa e no período da tarde quando cultivada a sol pleno. Tal fato pode ser devido a um provável estresse ambiental sofrido pela espécie nessas condições.
Palavras-chave: Plectranthus neochilus, análise metabolômica untargeted, cromatografia gasosa, headspace por SPME, óleo essencial, anatomia vegetal.
Lamiaceae is a family that houses one of the largest genera, Plectranthus L'Hér., which has ornamental, edible, medicinal species of economic interest and various ethnobotanical uses.
Plectranthus neochilus Schltr. is an introduced species, but widely cultivated in Brazil, popularly
known as boldo gambá, boldinho and small boldo. A review of the literature pointed out a certain difficulty in identifying the species due to the morphological similarities with Plectranthus ornatus. The essential oil of the species presents monoterpenes and sesquiterpenes with little explored biological activities. In addition, there is a variation between the chemical compounds identified for the species. Therefore, the objective of the study was to use four individuals in two growth environments, in full sun on the field and in the greenhouse, with yeal-long collections in the morning and afternoon, and to verify, based on anatomical and cytogenetic studies, possible characteristics for the identity of the species; to evaluate the chemical profile of the essential oil and its biological activities; and, through untargeted metabolomic analysis, to evaluate the volatiles of the species in the two environments over a year and to verify if there is monthly variation between them. The anatomical and cytogenetic studies provided characteristics that confirm that the individuals used in this work are all of the same species, Plectranthus neochilus and characteristics to identify the species. The essential oil had, as main compounds, trans-caryophyllene and -tujene, presented antimicrobial activity but no antioxidant potential when evaluated by DPPH. The untargeted metabolomic analysis indicated that there is no statistically significant monthly variation of volatiles even in months of high temperatures and absence of rain, but that there are statistically significant differences between the growth environments. The 1-octen-3-ol compound was more intense in the greenhouse and in the afternoon when grown in full sun. This fact may be due to a probable environmental stress suffered by the species under these conditions.
Keywords: Plectranthus neochilus, untargeted metabolomic analysis, gas chromatography, SPME headspace, essential oil, plant anatomy.
Figura 1. Plectranthus ornatus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Fonte: Dissertação de mestrado de Fernanda Rodrigues Nascimento, 2014 – UFV. ... 26
Figura 2. Plectranthus neochilus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Casa de vegetação do Instituto de Biologia da Unicamp. Arquivo pessoal. ... 26
Figura 3. A- Plectranthus caninus. B – Plectranthus neochilus. C - Plectranthus orntus. Imagens extraída de Codd, 1961, 1975. ... 28
Figura 1.1. A – Indivíduos provenientes da UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa quando plantados no canteiro. B – Indivíduos já adultos. ... 33
Figura 1.2. Perfil das folhas de Plectranthus neochilus coletadas para microscopia eletrônica de varredura. A – Folha jovem coletada entre o primeiro e segundo entrenó. B- Folha madura coletada entre o quarto e quinto entrenó. ... 34
Figura 1.3. Secções transversais do caule (A, B), pecíolo (C, D), folha (E, F, G, H e I) de Plectranthus neochilus cultivado a sol pleno. A - Secção quadrangular do caule; B - felogênio, epiderme, colênquima angular e parênquima cortical. C - Secção reniforme do pecíolo – Esfera: vasos colaterais nas extremidades. D – epiderme, colênquima angular e parênquima cortical do pecíolo. E – nervura central. F – margem (*) câmeras subestomática. G - mesofilo, epiderme e parênquima cortical. (*) câmeras subestomática. H – estômato. (seta) cutícula estriada; I – estômato diacítico. (seta) células subsidiárias; Fe = felogênio; Ep = epiderme; Co = colênquima; Pa = parênquima. Barras de escalas: A = 500 m; B = 200 m; C= 500 m; D = 200 m; E= 500 m; F = 200 m; G = 200 m; H e I = 20 m. ... 39
Figura 1.4. Dissociação do mesofilo de Plectranthus neochilus pelo método Franklin (1946), tecido corado com safranina. A e C: Células arredondadoas e alongadas. B: Células alongadas com cloroplastas próximos a parede celular. Escala: A e B: 100 m, C: 50 m. ... 40
Figura 1.5. Presença de antocianina do caule de Plectranthus neochilus. A e B – Corte transversal a mão livre do caule. ... 41
face adaxial. B- Margem jovem face abaxial. C- Nervura jovem face adaxial. D – Nervura jovem face abaxial. E – Margem madura face adaxial. F- Margem madura face abaxial. G- Nervura madura face adaxial. H – Nervura madura face abaxial. TNG: tricoma não glandular. TGP: tricoma glandular peltado. TGC: tricoma glandular capitado. Barras: A a D= 200 m; E= 100 m. F, G e H=200 m .42
Figura 1.7. Eletromicrografias de varredura dos tricomas Plectranthus neochilus. A – Margem jovem face adaxial. B – Margem madura face abaxial. C – Nervura jovem face abaxial. D – Nervura madura face abaxial. Barras: A, C e D= 50 m; B= 100 m. ... 43
Figura 1.8. Folha jovem de Plectranthus neochilus. A – Face abaxial com tricomas glandulares peltados alaranjados visíveis a olho nu. B – Face adaxial. ... 43
Figura 1.9. Tricomas não glandulares de Plectranthus neochilus. A e B – Microscopia eletrônica de varredura. C – Corte a mão livre, sem reagente. Barras: A e B= 50 m; C= 20 m. ... 44
Figura 1.10. Coloração do conteúdo secretado pelo tricoma peltado de Plectranthus neochilus (A, B, C e D). A – Limbo corado com reagente de NADI. B – Limbo corado com Sudan IV. C e D – Corte a mão livre do limbo, sem reagente. Número de células do tricoma peltado de Plectranthus neochilus (E e F). E – Dissociação da epiderme corada com safranina. F – Microscopia eletrônica de varredura. Barras: A e C= 100 m; B, D e F= 50 m; E= 20 m. ... 45
Figura 1.11. Comparação do tamanho entre os tricomas peltado e o capitado de Plectranthus neochilus. A e B – Corte a mão livre do limbo, sem reagente. C – Microscopia eletrônica de varredura. Barras: A e B= 20 m; C= 100 m. ... 46
Figura 1.12. Tricomas short-stalked capitados de Plectranthus neochilus. A- Microscopia eletrônica de luz do limbo corada com azul de toluidina. B- Corte a mão livre do limbo, sem reagente. C- Microscopia eletrônica de varredura. D - Corte a mão livre do limbo, sem reagente, mostrando o tricoma sem cutícula, com cutícula rompendo e com cutícula. Barras: A e C= 50 m; B= 20 m e D= 200 m. ... 47
Figura 1.13. Tricoma long-stalked capitados de Plectranthus neochilus. A- Corte a mão livre do limbo, sem reagente. Tricoma com a cutícula rompida. B - Microscopia eletrônica de luz do limbo corada com azul de toluidina. Tricoma com a cutícula rompida. C- Microscopia eletrônica de
D- Microscopia eletrônica de varredura com os tricomas long e short-stalked capitados mostrando os tricomas com e sem a cutícula. Barras: A e B= 20 m e C= 50 m. ... 48
Figura 1.14. Testes histoquímicos realizados nas folhas de Plectranthus neochilus. Sudan black em A, B, C evidenciando lipideos totais. Sudan IV em D e E em tricomas e em F no mesofilo evidenciando lipídeos. NADI em G, H em tricomas e I e J no mesofilo, evidenciando terpenos. Sulfato azul do nilo em L, M em tricomas e em N no mesofilo, evidenciando lipídeos neutros. Barras de escalas: A, D, J, G, H, L e M= 20 m; B, E, I= 50 m, C, F= 100 m; N= 200 m. ... 51
Figura 1.15. Cromossomos dos indivíduos de Plectranthus neochilus. A – CPQBA. B – Guará. C – UNICAMP. D – Nova Odessa. Barra: 10 m. ... 52
Figura 2.1. A – Extração de óleo essencial de Plectranthus neochilus por hidrodestilação em aparelho de Clevenger. B- Extração de óleo essencial de Plectranthus neochilus por destilação por arraste a vapor. (Foto: Arquivo pessoal, Instituto Agronômico de Campinas – Fitoquímica)...58
Figura 2.2. Reação de oxirredução do DPPH na presença de quercetina ... 61
Figura 2.3. Cromatogramas emitidos pelo GC-MS destacando o tempo de retenção dos picos. A - Cromatograma do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus obtido pela hidrodestilação em aparelho de Clevenger. B - Cromatograma do óleo essencial das folhas de Plectranthus neochilus obtido pela destilação por arraste a vapor...62
Figura 2.4. A - Atividade antioxidante do óleo essencial de Plectranthus neochilus avaliada em placa de sílica revelada com DPPH, Pn= Plectranthus neochilus e Q= quercetina. B – Fases móveis testadas em placa de sílica e reveladas com anisaldeído. Pn= Plectranthus neochilus e Pa= Plectranthus amboinicus. C - Fases móveis testadas em placa de sílica e reveladas com vanilina...68
Figura 2.5. Cromatografia de camada delgada, revelada com DPPH (A) e revelada com anisaldeído (B). Em ambas as figuras a sequência utilizada foi de 1: 1, 1: 4 e 1: 9 de óleo essencial diluído em etanol, e 5,2 mg/ mL de quercetina em solução. ( ) destacam as bandas brancas identificadas na placa revelada com DPPH e setas pretas destacam as bandas que também foram identificadas na placa revelada com DPPH. ... 69
de Labsphere), no qual o vial com amostra é aquecido, a fibra é introduzida, os analitos orgânicos volatilizados são concentrados no revestimento da fibra, esta é retirada do vial e introduzida no instrumento analítico para dessorção e análise. ...77
Figura 3.2. A – Indivíduos provenientes da UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa quando plantados no canteiro. B e C – Indivíduos já adultos. D- Indivíduos plantados no vaso no ambiente de estufa...80
Figura 3.3. A - Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS/ CAR. B - Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS/ DVB. C - Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra DVD/ PDMS/ CAR. D- Cromatograma com de Plectranthus neochilus com fibra PDMS (vermelha)...130
Figura 3.4. Cromatograma de P. neochilus do método cromatográfico definido: 65 ºC seguindo a 150 ºC em uma taxa de 3 ºC / min, com Split 1:3, num total de 28,34 minutos de duração...89
Figura 3.5. Cromatogramas dos compostos voláteis de Plectranthus neochilus dos grupos de estudo Sol, QC e Estufa capturas por SPME e analisado em GC-MS...92
Figura 3.6. Total Usefull Signal (TUS) da análise metabolômica. Em azul estão às amostras, em vermelho a média mais duas vezes o desvio padrão, em verde a média menos duas vezes o desvio padrão, o eixo Y é a soma das intensidades e o eixo X é a quantidade de amostras. ...95
Figura 3.7. A - PCA com as scores das coletas mensais de Plectranthus neochilus cultivadas ao sol (verde), estufa (azul) e os QC (vermelho) – B- PCA biplot, gráfico exploratório no qual as features se apresentam como vetores. ... 97
Figura 3.8. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância dentre as 22 mais intensas da análise metabolômica. A legenda de cores à direita apresenta os compostos que estão mais intensos no grupo (vermelho), menos intensos (verde), e à esquerda do gráfico estão os compostos em ordem de intensidade. ... 99
significância do composto 1-octen-3-ol para o grupo estufa. B – Relação entre sol e estufa nos messes coletas em comum. ... 100
Figura 3.10. PCA de scores das amostras coletadas nos períodos manhã (SLM – vermelho) e tarde (SLT – verde) ... 101
Figura 3.11. Análise estatística dos grupos sol manhã (azul) e sol tarde (vermelho). ... 101
Figura 3.12. Variação média da temperatura e precipitação do período de coleta (Fonte: CEPAGRI, 2018). T. máx.: temperatura máxima; T. min.: temperatura mínima. ... 102
Figura 3.13. A - PCA de scores das amostras coletadas ao longo do ano, iniciando em junho de 2017 e finalizando em junho de 2018. B - PCA biplot, gráfico exploratório no qual as features se apresentam como vetores. ... 104
Figura 3.14. PCA de scores das amostras coletadas ao longo do ano, iniciando em junho de 2017 e finalizando em junho de 2018 para cada indivíduo. ... 105
Figura 3.15. PCA biplot de cada individuo para as amostras coletadas ao longo do ano. Neste gráfico exploratório as features se apresentam como vetores. ... 106
Figura 3.16. PLS VIP scores com as 15 features de maior relevância para cada indivíduo ao longo do ano. ... 107
Figura 3.17. Esquema proposto por Akakabe (2005) para elucidar a biogeração do composto 1-octen-3-ol através dos cogumelos Lentinula edoles e Tricholoma matsutake de scores das amostras coletadasna estufa por quatro meses ao longo do ano. ... 109
Figura 3.18. PCA de scores das amostras coletadasna estufa por quatro meses ao longo do ano. A – Scores de amostras da estufa coletas nos períodos da manhã e da tarde. B – Scores das amostras pelos meses de coleta. ... 131
Figura 3.19. PCA biplot das amostras coletadasna estufa. Neste gráfico exploratório as features se apresentam como vetores. ... 131
períodos manhã e tarde (A) e ao longo do ano (B). ... 132
Figura 3.21. Gráfico com as intensidades dos voláteis pelos meses de coleta com média e desvio padrão. ... 133
Tabela 1.1. Tricomas identificados na literatura para Plectranthus neochilus e Plectranthus ornatus 49
Tabela 2.1. Proposta de identificação do óleo essencial de Plectranthus neochilus obtido por
hidrodestilação em aparelho de Clevenger e destilação por arraste a vapor. ... 126
Tabela 2.2. Composição química do óleo essencial de Plectranthus neochilus obtido por GC-M ...63
Tabela 2.3. Ação antimicrobiana do óleo essencial de Plectranthus neochilus...66
Tabela 2.4. Porcentagem de neutralização do radical DPPH do óleo essencial de Plectranthus neochilus e quercetina (como controle positivo) em Ensaio de DPPH ...70
Tabela 3.1. Parâmetros avaliados no método cromatográfico otimizado. ...82
Tabela 3.2. Análise metabolômica de Plectranthus neochilus. ...84
Tabela 3.3. Análise da variação mensal dos voláteis de Plectranthus neochilus. ...85
Tabela 3.4. Parâmetros do XCMS verificados para melhor obtenção de features. ... 129
Tabela 3.5. Compostos obtidos por GC-MS pelas fibras de SPME avaliadas. ... 87
Tabela 3.6. Parâmetros definidos para o método cromatográfico otimizado...88
Tabela 3.7. Proposta de identificação dos compostos obtidos por GC-MS pelo método otimizado com fibra PDMS/ DVB por SPME. ... 90
Tabrela 3.8. Proposta de identificação dos compostos voláteis dos grupos Sol, QC e Estufa obtidos por SPME. E em GC-MS. O número do sinal se refere à Figura 3.5. ... 93
Quadro 1. Características que distinguem as espécies do complexo Plectranhus caninus. ... 28
Quadro 1.1. Estudos desenvolvidos com os indivíduos de Plectranthus neochilus. ... 32
Quadro 1.2. Testes histoquímicos realizados em Plectranthus neochilus. ... 35
Quadro 3.1. Composição química e porcentagem do óleo essencial das folhas de Plectranthus
neochilus identificada por GC-MS...74 Quadro 3.2. Estudos desenvolvidos com os indivíduos de Plectranthus neochilus...79
Equação 2.1. Fórmula para cálculo do índice de retenção dos compostos voláteis do óleo essencial obtidos pela hidrodestilação, no qual IR= índice de retenção do composto de interesse, i= composto volátil analisado, n= número de carbono do alcano que elui antes de i, m= número de carbono do alcano que elui depois de i, tri= tempo de retenção de i, trn= tempo de retenção do carbono que elui antes de i, trm= tempo de retenção do alcano que elui depois de i. ... 59
Equação 2.2. Equação para cálculo da porcentagem de redução do DPPH, no qual A amostra= absorbância da reação entre a solução do radical DPPH e a amostra antioxidante, Abranco= absorbância da solução de solvente utilizado para preparar a amostra antioxidante, Acontrole= absorbância do radical DPPH com uma pequena alíquota do solvente utilizado para preparar a amostra, em substituição à solução da própria amostra em estudo...62
Equação 3.1. Fórmula para cálculo do índice de retenção dos compostos voláteis, no qual IR= índice de retenção do composto de interesse, i= composto volátil analisado, n= número de carbono do alcano que elui antes de i, m= número de carbono do alcano que elui depois de i, tri= tempo de retenção de i, trn= tempo de retenção do carbono que elui antes de i, trm= tempo de retenção do alcano que elui depois de i. ...81
Equação 3.2. Equação para cálculo do coeficiente de variação, no qual CV= coeficiente de variação, s= desvio padrão e x= média. ... 85
2n: Célula vegetal diploide ABTS: 2,2'-azino-bis
ANOVA: Análise de Variância cm: Centímetro
ºC: Graus Celcius CAR: Carboxen
CCD: Cromatografia em Camada Delgada CE50: Concentração Eficiente em 50 % CE25: Concentração Eficiente em 25 %
CEPAGRI: Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura CI50: Concentração Inibitória em 50 %
CO2: Dióxido de carbono
CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas CQ: Classe química do composto
CV: Coeficiente de Variação
DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila DVB: Divinilbenzeno
eV: Eletrovolt
FAA50: Formaldeído, Ácido Acético Glacial e Etanol 50 % g: Gramas
GC-MS: Cromatografia a Gás acoplada a Espectrometria de Massas (do inglês: Gas Chromatography with Mass Spectrometry)
h: Horas H2O: Água HS: Headspace
IAC: Instituto Agronômico de Campinas IB: Instituto de Biologia
IQ: Instituto de Química IR: Índice de Retenção Kg: Quilogramas kV: Quilovolt m: Metros
min.: Minutos mL: Mililitros mm: Milímetros Mo: Monoterpenos m/z: Relação massa/ carga µg: Microgramas
µL: Microlitros µM: Micromolar µmol: Micromol nm: Nanômetro
nº picos: Número de picos do cromatograma
NIST: National Institute of Standards and Technology
PAR: Porcentagem de Radiação Fotossinteticamente Ativa (do inglês: Percentage of Photosynthetically Active Radiation)
PCA: Análise de Componentes Principais (do inglês: Principal Components Analysis) PC: Componente Principal (do inglês: Principal Component)
PDB: Paradiclorobenzeno PDMS: Polidimetilsiloxano
PLS: Mínimos Quadrados Parciais (do inglês, Partial Least Squares Discriminant Analysis) QC: Controle de Qualidade (do inglês: Quality Control)
Se: Sesquiterpenos
Sim.: Porcentagem de similaridade
SPME: Microextração em Fase Sólida (do inglês: Solid Phase Micro Extraction) SOM_M:Estufa manhã
SOM_T: Estufa tarde SL: Sol
SLM: Sol manhã SLT: Sol tarde
TBARS: Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (do inglês: Thiobarbituric Acid Reactive Substances)
T. min.: Temperatura mínima T. máx.: Temperatura máxima TR: Tempo de retenção
UFC: Unidade Formadora de Colônia UI: Unidade Internacional
UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas
AGRADECIMENTOS ...5 RESUMO ...6 ABSTRACT ...7 LISTA DE FIGURAS ...8 LISTA DE TABELAS ... 14 LISTA DE QUADROS ... 15
LISTA FÓRMULAS E EQUAÇÕES ... 16
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ... 17
SUMÁRIO ... 20
INTRODUÇÃO GERAL ... 24
JUSTIFICATIVA DOS CAPÍTULOS ... 28
OBJETIVO GERAL ... 29
Objetivos específicos ... 29
CAPÍTULO 1 – IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS... 30
1. INTRODUÇÃO ... 30 1. 1 Plectranthus neochilus Schltr. ... 30 2. OBJETIVO ... 31 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 31 3.1 Material vegetal ... 31 3.2 Produção de mudas ... 32 3.3 Descrição anatômica ... 33
3.3.1 Microscopia eletrônica de luz ... 33
3.3.2 Dissociação de tecido ... 33
3.3.3 Microscopia eletrônica de varredura ... 34
3.3.4 Proposta de identificação de tricomas ... 34
3.4 Histoquímica ... 35
3.5 Citogenética ... 35
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 36
4.1 Descrição anatômica ... 36
4.1.1 Microscopia eletrônica de luz, Dissociação de tecido e Microscopia eletrônica de varredura ... 36
4.3 Citogenética ... 52
5. CONCLUSÃO ... 53
CAPÍTULO 2 – PERFIL QUÍMICO DO ÓLEO ESSENCIAL DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS E SUA ATIVIDADE BIOLÓGICA ... 54
1. INTRODUÇÃO ... 54
1.1 Uso popular ... 54
1.2 Óleo essencial ... 54
1.3 Extração de óleo essencial ... 56
1.4 Atividade biológica do óleo essencial ... 56
2. OBJETIVO ... 57
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 57
3.1 Material vegetal ... 57
3.2 Produção de mudas ... 57
3.3 Extração de óleo essencial ... 57
3.4 Identificação dos compostos ... 59
3.5 Atividade biológica do óleo essencial ... 59
3.5.1 Atividade antimicrobiana ... 59
3.5.2 Atividade antioxidante ... 60
3.5.2.1 Cromatografia em camada delgada ... 60
3.5.2.2 Ensaio de DPPH ... 60
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 62
4.1 Extração de óleo essencial de Plectranthus neochilus ... 62
4.2 Identificação dos compostos ... 63
4.3 Atividade biológica do óleo essencial ... 65
4.3.1 Atividade antimicrobiana ... 65
4.3.2 Atividade antioxidante ... 67
4.3.2.1 Cromatografia em camada delgada ... 67
4.3.2.2 Ensaio de DPPH ... 69
5. CONCLUSÃO ... 71
CAPÍTULO 3 – ANÁLISE METABOLÔMICA DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS ... 72
1. INTRODUÇÃO ... 72
1.2.1 Headspace por microextração em fase sólida ... 76 2. OBJETIVO ... 78 Objetivo geral ... 78 Objetivos específicos ... 78 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 78 3.1 Material vegetal ... 78 3.2 Produção de mudas ... 79 3.3 Desenvolvimento do método cromatográfico e extração de voláteis de P. neochilus ... 80 3.3.1 Avaliação de fibras de HS-SPME e identificação dos compostos ... 80 3.3.2 Otimização do método cromatográfico ... 82 3.3.3 Análise cromatográfica ... 82 3.4 Análise metabolômica e variação mensal dos voláteis ... 83 3.4.1 Obtenção de dados meteorológicos ... 83 3.4.2 Análise metabolômica de Plectranthus neochilus ... 83 3.4.3 Análise da variação mensal dos voláteis ... 84 3.4.4 Análise estatística dos dados ... 85 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 88 4.1 Desenvolvimento do método cromatográfico e extração de voláteis de P. neochilus ... 86 4.1.1 Avaliação de fibras de HS-SPME e identificação dos compostos ... 86 4.1.2 Otimização do método cromatográfico ... 88 4.2 Análise metabolômica e variação mensal dos voláteis ... 91 4.2.1 Análise metabolômica ... 91 4.2.2 Análise estatística metabolômica ... 94 4.2.3 Análise da variação mensal dos voláteis ... 100 4.2.3.1 Dados meteorológicos ... 102 4.2.4 Análise estatística da variação mensal dos voláteis ... 102 4.2.5 Composto 1-Octen-3-ol ... 108 4.2.6 Análise estatística da variação mensal de cada volátil ... 109 5. CONCLUSÃO ... 110
CONCLUSÃO GERAL ... 111 REFERÊNCIAS ... 112 ANEXOS ... 125 Capítulo 2 – Resultados e Discussão ... 125
Capítulo 3 – Resultados e Discussão ... 130 Declaração de Bioética e Biossegurança ... 135 Declaração de Direitos Autorais ... 136
INTRODUÇÃO GERAL
No século passado, o uso das plantas medicinais foi à base para o tratamento de enfermidades entre populações carentes. Porém, mesmo com a grande disponibilidade de medicamentos sintéticos no mercado, algumas populações mantêm o consumo de plantas medicinais por motivos financeiros e culturais. E assim, o uso tradicional destas espécies é passado de gerações a gerações, embora em menor escala (MARCHESE et al., 2009).
Para a ciência, o consumo popular de plantas se torna um alvo para a investigação de novas drogas, embora ainda haja carência de estudos e ensaios clínicos para essa área, como também estudos que avaliem a segurança no consumo de plantas medicinais (MARCHESE et al., 2009; BALBINO e DIAS, 2010). Entretanto, a busca constante por novos compostos bioativos, principalmente advindos do metabolismo secundário, vem despertando o interesse em estudar as plantas medicinais de forma pluridisciplinar e/ ou quimissistemática, ou seja, unindo conhecimentos químicos, farmacológicos, botânicos e socioantropológico. Desta forma, se espera gerar um produto de baixo custo à população e comercialmente viável à indústria, que atualmente vem se apresentando mais diversificada (ASCENSÃO, 2007; RODRIGUES et al., 2016).
Lamiaceae é uma família amplamente distribuída na região do Mediterrâneo, Ásia Central e Sudeste, África do Sul, China, Austrália, América do Sul, América do Norte e México, o que mostra sua capacidade de se adaptar a diversos habitats, exceto regiões frias de alta latitude ou altitude (KUBITZKI, 2004; RAJA, 2012). Entre os 236 gêneros da família, destacam-se Mentha, Salvia, Ocimum, Clorodendrum e Plectranthus explorados por suas flores ornamentais, pelo potencial para extração de óleos essenciais aromáticos e o seu vasto uso culinário. São mais de 7200 espécies que compreendem arbustos, árvores, folhagens, herbáceas aromáticas e algumas trepadeiras lenhosas. Além disso, São características compartilhadas entres as espécies da família inflorescências verticiladas, geralmente brácteas, flores simetricamente bilaterais com 5 sépalas e pétalas, um lábio inferior e superior, e folhas que emergem de forma oposta (HUSAIN et al., 1989; KUBITZKI, 2004; RAJA, 2012; PEREIRA et al., 2015). A maioria das plantas possuem bioativos voláteis responsáveis pelos aromas que as tornam tão conhecidas, utilizadas e consumidas (RAJA, 2012). Esse fato faz com que Lamiaceae apareça nos levantamentos etnobotânicos como a segunda família com maior número de espécies utilizadas ornamentalmente ou consumidas na culinária (HUSAIN et al., 1990; DI STASI et al., 2002; FUCK et al., 2005; ZENI e BOSIO, 2006; PINTO et al., 2006; VENDRUSCOLO e MENTZ, 2006).
Plectranthus é um dos dez gêneros que abriga 50% das espécies conhecidas da família. Distribuídas pela África, Ásia e Austrália, as 300 espécies do gênero compreendem arbustos,
herbáceas, espécies ornamentais, comestíveis, com propriedades medicinais, de interesse econômico e de diversos usos etnobotânicos. São espécies de crescimento rápido, fácil adaptação, geralmente tolerantes a luz e a seca, o que as faz desenvolver rápidas respostas as condições ambientais, como exemplo, apresentar folhas suculentas (ABDEL-MOGIB et al., 2002; KUBITZKI, 2004; GRAYER et al., 2010; WALDIA et al., 2011; RICE et al., 2011, 2012; KHALIK e KARAKISH, 2016).
Há um importante potencial medicinal do gênero, segundo Lukhoba et al. (2006) tais propriedades representam mais de 85% dos usos etnobotânicos. Esse fato está relacionado à composição química dessas espécies. Embora em contínuo estudo, os principais constituintes são os óleos essenciais (mono e sesquiterpenos) que fornecem uma variedade de aromas, diterpenoides com ação antimicrobiana, antifúngica, antiplasmodial, antitumoral e resistência a insetos, como também compostos fenólicos, todos armazenados nos tricomas das plantas. Um gênero a explorar por conta de seus compostos de potencial farmacológico (ABDEL-MOGIB et al., 2002; GRAYER et al., 2010; RIJO et al., 2010, 2012; RICE et al., 2011; WALDIA et al., 2011).
Entretanto, o gênero possui questões taxonômicas ainda em discussão. A inserção do gênero Coleus é um ponto discutido por autores desde 1962, pois inicialmente acreditava-se que ambos apresentavam características morfológicas distintas. Com estudos posteriores, as espécies de Coleus foram aceitas e agregadas à Plectranthus, embora ainda haja certa dificuldade para distinguí-las (MORTON, 1962, 1998; VAN JAARSVELD e EDWARDS, 1997; ABDEL-MOGIB et al., 2002). Ainda sim, depois desse fato, Plectranthus continuou com a questão de delimitação, mas de espécies, pois novas espécies foram descritas ao longo do tempo (FORSTER, 1992; LUKHOBA e PATON, 2003). Tal questão taxonômica de identificação de gêneros e espécies ocorre devido à ausência de critérios morfológicos que auxiliem na diferenciação, gerando dificuldades taxonômicas na nomeação de espécies (KHALIK, 2016).
O gênero abriga os chamados falsos boldos, são eles Plectranthus barbatus, Plectranthus grandis, Plectranthus amboinicus, Plectranthus neochilus e Plectranthus ornatus todos cultivados no Brasil. Porém, o verdadeiro boldo, Peumus boldus (Monimiaceae), é uma árvore originária do Chile e que não é cultivado no Brasil. Além dos citados, a Vernonia condensata, da família Asteraceae, é outra espécie também conhecida e utilizada no país como boldo (LORENZI e MATOS, 2002, 2008).
Com relação ao óleo essencial, este apresentou potencial esquistossomicida e antimicrobiano (CAIXETA et al., 2011; MOTA et al., 2014). Além disso, a planta tem atividade contra o nematoide
Meloidogyne spp., o extrato metanólico apresentou atividade contra leishmania e contra a levedura Candida krusei (TEMPONE et al., 2008; BAIDA et al., 2011; ANTINARELLI et al., 2015). O extrato acetônico apresentou atividade contra bactérias Gram positivas, porém com pouca atividade frente a bactérias Gram negativas e leveduras (PEREIRA et al., 2015). A revisão bibliográfica
apontou que dentre os falsos boldos há um recente interesse por P. neochilus e uma escassa produção científica. Portanto, Plectranthus neochilus foi o foco deste trabalho.
Ao realizar a revisão, foi observado um conflito entre os artigos com relação à descrição e identificação da espécie utilizada. Os pesquisadores Lorenzi e Matos possuem duas edições do livro “Plantas Medicinais no Brasil: nativas e exóticas”. A primeira edição (2002) apresenta foto com o nome da espécie Plectranthus neochilus, já a segunda edição (2008), apresenta uma errata e o nome da espécie foi alterado para Plectrathus ornatus. Ao pesquisar fotos das duas espécies verificou-se que morfologicamente não há como distingui-las como apresentam as Figuras 1 e Figura 2.
Figura 1. Plectranthus ornatus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Fonte: Dissertação de mestrado de Fernanda Rodrigues Nascimento, 2014 – UFV.
Figura 2. Plectranthus neochilus. A – Parte vegetativa da espécie. B – Inflorescência. Casa de vegetação do Instituto de Biologia da Unicamp. Arquivo pessoal.
A questão é que os artigos publicados após o ano de 2008, mesmo depois da errata de Lorenzi e Matos (2008), ainda utilizam a referência de 2002 para descrever a planta como P. neochilus. Não obstante, ao utilizar a chave de identificação de espécies, o grupo de pesquisa junto a taxonomistas do Instituto de Biologia, ficou em dúvida na identificação, uma vez que apenas um dos quatro
A
B
indivíduos utilizados no estudo estava com inflorescência. Diante desses fatos ficou claro que há uma dificuldade em diferenciar ambas as espécies. Em revisões taxonômicas de Cood (1961, 1975) foi citado que P. neochilus pertence a um complexo de três espécies que possuem características morfológicas muito próximas. Segundo Zheng et al. (2017) um complexo é formado por espécies que compartilham características intimamente relacionadas, o que gera a dificuldade em diferenciá-las. Para verificar as diferenças dessas espécies é necessário estudos com uma grande amostragem populacional e o uso de diferentes critérios operacionais, que podem ser análises genéticas, moleculares e químicas, diferenciação morfológica e de habitat, entre outras. Caso o resultado desses critérios esteja em comum acordo é possível reconhecê-las como mesma espécie ou espécies diferentes (ZHENG et al., 2017).
O complexo em questão é formado por Plectranthus caninus, P. ornatus e P. neochilus, que juntos constituem o complexo P. caninus (Figura 3). Estas espécies foram distinguidas pelos botânicos da época de acordo com a forma da folha e comprimento da inflorescência, como apresenta o Quadro 1. Dentre as características abordadas, a que foi escolhida como um fator decisivo para separar as espécies foi o comprimento da inflorescência. Desta forma, nota-se que o estudo morfológico foi o único critério operacional utilizado na época, sendo necessária uma nova revisão (CODD, 1975).
A maior dificuldade atualmente reside em distinguir P. ornatus de P. neochilus. Diante da existência de um complexo de espécies e da dificuldade que autores apresentaram para identificar P. neochilus surgiram às dúvidas, “Com qual espécie o estudo estava sendo conduzido? Todos os indivíduos pertencem a mesma espécie?”. Portanto, outros critérios precisam ser estudados para se conhecer as características que podem ser utilizadas como identidade para P. neochilus, como também novas discussões na comunidade científica a fim de revisar se há relevância em separá-las em duas espécies.
Quadro 1. Características que distinguem as espécies do complexo Plectranhus caninus.
Características Plectranthus caninus Roth, 1871. Plectranthus ornatus Codd, 1894. Plectranthus neochilus Schltr., 1896. Referência Morfologia folha Ovada-lanceolada, elíptica longa ou oblanceoladas moderadamente recortada na metade superior, ápice agudo
para obtuso
Obovada, ápice arredondado pouco recortado
Obovada para elíptica-ovada, ápice arredondado ou obtuso pouco recortado e estreitamente cuneado
na base CODD, 1961, 1975 Inflorescência De 2,5 – 6 cm, raramente até 9 cm de comprimento, denso na base De 4 a 6 cm, raramente acima de 9 cm de comprimento De 7 a 15 cm de comprimento Morfologia flor
Estames: unidos na base por 1,5 mm e de 5 - 6 mm comprimento; Corola: 8 – 10 mm de comprimento; Cálice: 2
mm de comprimento
Estames: unidos na base por 3 – 4 mm e de 12 -14 mm comprimento; Corola: 2 – 2,5 cm de comprimento; Cálice: 3
mm comprimento
Estames: unidos na base por 2 – 3 mm e de 8 -11 mm comprimento;
Corola: 1,2 – 2 cm de comprimento; Cálice: 3 mm
comprimento Fonte: Codd, 1961, 1975
Figura 3. A- Plectranthus caninus. B – Plectranthus neochilus. C - Plectranthus orntus. Imagens extraída de Codd, 1961, 1975.
JUSTIFICATIVA DOS CAPÍTULOS
Devido à dificuldade em identificar a espécie, percebeu-se que o estudo metabolômico não poderia ser iniciado sem a identificação dos indivíduos utilizados. Além dos fatos apontados com relação à dificuldade de identificação da espécie por alguns autores, no presente estudo apenas um dos indivíduos utilizados no trabalho estava com inflorescênia no momento em que foi utilizada a chave de identificação com taxonomistas. Por isso, este estudo foi dividido em três capítulos, dedicando o primeiro a questão da identificação dos indivíduos, bem como a verificação de características que pudessem fornecer a identidade da espécie. O segundo e o terceiro capítulo foram atribuídos ao perfil químico do óleo essencial e sua atividade biológica, e a análise metabolômica dos
voláteis, respectivamente.
OBJETIVO GERAL
Análise da variabilidade da composição dos voláteis de Plectranthus neochilus ao longo de um ano.
Objetivos específicos
Identificar os indivíduos utilizados e verificar características anatômicas e citogenética como possíveis identidades da espécie.
Avaliar o perfil químico óleo essencial e suas atividades biológicas. Realizar análise metabolômica dos voláteis por headspace.
CAPÍTULO 1
IDENTIFICAÇÃO BOTÂNICA DE PLECTRANTHUS NEOCHILUS
1. INTRODUÇÃO
1.1 Plectranthus neochilus Schltr.
Plectranthus neochilus é uma planta exótica, originária do sul da África e introduzida no Brasil durante o período colonial (BRITTEN, 1896; CODD, 1961 e 1975; LIMA et al., 2017). Popularmente é conhecida como boldo gambá, boldo miúdo, boldinho ou boldo rasteiro (TOMAZZONI, 2004; BOCARDI, 2008; BORGES et al., 2011). Devido à reestruturação taxonômica do gênero, P. neochilus apresenta sinônimos, são eles: Coleus neochilus e Coleus schinzii, que ainda são utilizados (MOTA et al., 2014).
P. neochilus é uma planta perene, de hábito herbáceo possuindo de 12 a 50 cm de altura, podendo ser encontrada sob árvores em florestas e entre rochas (BRITTEN, 1896; CODD, 1961 e 1975). Apesar de ser conhecida como boldo a espécie é cultivada em jardins como planta ornamental (VAN JAARSVELD e KIRSTENBOSCH, 1997), atraindo um número considerável de polinizadores como abelhas, borboletas e moscas das famílias Megachilidae, Anthophoridae, Syrphidae, Bombyliidae, Sphingidae e Apidae (STIRTON, 1977). Não foi encontrado na literatura o hábitat que a espécie ocupa, porém é citado que as espécies de Plectranthus se distribuem por vários hábitats e desta forma desenvolvem adaptações como caules ascendentes com estolões ou rizomas especializados. Além disso, muitas espécies são adaptadas a condições xéricas apresentando folhas suculentas como resposta (KADEREIT, 1956).
Morfologicamente, a planta possui folhas suculentas, opostas, com cerca de 2,5 cm de comprimento, e 1,5 a 3,5 cm de largura. As folhas são pouco pubescentes, em sua face abaxial apresentam glândulas laranja espalhadas pelo limbo, visíveis a olho nu. Tais glândulas se concentram na margem foliar, que é crenada da metade até a parte superior. Seu ápice é obtuso, podendo se apresentar de forma arredondada (CODD, 1961, 1975).
Os pecíolos são pubescentes e possuem de 5 a 15 mm de comprimento. Os caules geralmente são ascendentes medindo de 30 a 50 cm de altura e visivelmente vilosos. A inflorescência é em forma de espiga floral, com um racemo terminal de 7 a 15 cm de comprimento e de coloração azulada ou violeta. A inflorescência possui brácteas embricadas em estágio jovem com 6 a 10 mm de comprimento, 4 a 6 mm de largura, coloração branca esverdeada e púrpura, com ráquis (eixo)
glandular tomentosa e densa (CODD, 1961, 1975).
Duarte e Lopes (2007) realizaram o primeiro estudo sobre a anatomia do caule, pecíolo e folha do boldo, descrevendo seus tecidos, epiderme, estômato e numerosos tricomas: glandulares capitados e peltados, e não glandulares. Realizaram alguns testes histoquímicos que revelaram elementos lignificados e presença de amido, substâncias lipofílicas e compostos fenólicos. Além disso, comparou algumas características anatômicas de P. neochilus com a dos outros boldos conhecidos popularmente, P. barbatus, Pemus boldus e Vernonia condensata.
Outro estudo inédito para Plectranthus neochilus foi de Nani (2011), que realizou as primeiras análises cariotípicas da espécie, análises de conteúdo de DNA nuclear e palinologia, técnicas que auxiliam na identificação de espécies, como também na confirmação de indivíduos da mesma espécie. Outra vantagem dessa análise é de contribuir para as revisões de grupos com problemas taxonômicos, como ocorre no gênero Plectranthus. Para o autor, tais estudos se tornam imprecendíveis, visto que poucas espécies foram citogenéticamente avaliadas e destas poucas o número cromossômico encontrado foi muito diverso (NANI, 2011).
2. OBJETIVO
Verificar se todos os indivíduos utilizados no estudo pertencem à mesma espécie, Plectranthus neochilus, através das técnicas de citogenética e microscipia eletrônica de luz. Avaliar se as características anatômicas verificadas no estudo auxiliam em uma possível identidade para espécie.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
Este estudo foi realizado com quatro indivíduos de P. neochilus provenientes de diferentes localidades: Atibaia, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da UNICAMP (CPQBA), do bairro Guará do distrito de Barão Geraldo, Campinas e de Nova Odessa. O indivíduo coletado na cidade de Atibaia foi nomeado de indivíduo UNICAMP. As matrizes de cada indivíduo encontram-se no campo experimental do Instituto de Biologia da UNICAMP. As respectivas exsicatas foram depositadas no Herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC)
sob os seguintes números de acesso: UEC 150953, UEC 1938817, UEC 193819, UEC 193818, respectivamente. As atividades realizadas com os indivíduos estão descritas no Quadro 1.1.
Quadro 1.1. Estudos desenvolvidos com os indivíduos de Plectranthus neochilus cultivados a sol pleno em canteiro.
Atividades Técnicas utilizadas para identificar
espécie
Indivíduos
UNICAMP CPQBA Guará Nova Odessa
Sol Sol Sol Sol
Microscopia eletrônica de luz x x x x x Dissociação de tecido x Microscopia eletrônica de varredura x Proposta de identificação de tricomas x x x x x Histoquímica x Citogenética x x x x x 3.2 Produção de mudas
Foram feitas mudas por propagação vegetativa e o material foi preparado de acordo com a técnica usual de estaquia, no qual o corte na extremidade inferior em forma de bisel. As estacas, com aproximadamente 10 cm de comprimento, foram cultivadas em substrato de vermiculita de granulação média em casa de vegetação. A irrigação foi automática por nebulização, quatro vezes ao dia durante dois minutos cada. Na região superior da estaca foi deixado um par de folhas inteiras. Após o período de enraizamento de 45-60 dias as mudas foram plantadas no canteiro para o cultivo em sol pleno. Foi utilizada a mistura de matéria orgânica: areia, terra vermelha e vermiculita na proporção de 1: 1: 1 (v: v: v) inserida nas covas do canteiro. Nele, as mudas não foram irrigadas, como também não receberam nenhum tipo de recobrimento como mostra a Figura 1.1.
Figura 1.1. A – Indivíduos provenientes da UNICAMP, CPQBA, Guará e Nova Odessa quando plantados no canteiro. B – Indivíduos já adultos.
3.3 Descrição anatômica
3.3.1 Microscopia eletrônica de luz
A análise da microscopia de luz foi realizada para todos os indivíduos cultivados nos canteiros a sol pleno. Foram coletadas três plantas (triplicata) de cada indivíduo e realizados cortes nos 4º e 5º entrenó de caules, pecíolos e limbos de P. neochilus, e fixados em FAA50 (formaldeído, ácido acético glacial, etanol 50%, 1:1:18 (v/v)) (JOHANSEN, 1940) por 48 horas e, posteriormente, desidratados em série etílica (50%, 70%, 80%, 96%, 100%, 100%) permanecendo por 1 hora em cada solução. Tanto para a fixação quanto para a desidratação o material foi colocado em dessecador acoplado à bomba de vácuo.
As amostras foram infiltradas em resina plástica (Leica Historesin®), emblocadas, seccionadas longitudinal e transversalmente com navalha descartável em micrótomo rotativo manual (Leica®), na espessura de 7 μm, e coradas com azul de toluidina a 0,05% em tampão fosfato pH 4,5 (SAKAI, 1973). As secções foram montadas entre lâmina e lamínula em resina sintética Entellan® (Merck®). As lâminas foram analisadas em microscópio óptico Leica DM 750 e fotografadas com auxílio da câmera de vídeo Leica DFC/295.
3.3.2 Dissociação de tecido
A dissociação de tecido é uma técnica de maceração que separa as células do tecido vegetal possibilitando a individualização dos elementos. A dissociação foi utilizada para visualizar o formato das células do mesofilo e verificar se as mesmas possuem ou não formatos diferentes (KRAUS e ARDUIN, 1997). A dissociação foi realizada por duas técnicas, a de Jeffrey (JOHANSEN, 1940) e a de Franklin, 1946 (modificado segundo KRAUS e ARDUIN, 1997). A primeira consiste na imersão dos cortes em uma mistura de ácido nítrico (10 %) e ácido crômico (10 %) de 12 a 48 h para isolar as epidermes foliares, e a segunda consiste na imersão dos cortes em água oxigenada (30 %) e ácido
acético (30 %), manter a mistura com os cortes em estufa de 60 °C. Em ambos os procedimentos, depois de lavados os cortes em água destilada, o frasco pode ser agitado ou dissociado com a ajuda de um estilete e corados com safranina.
3.3.3 Microscopia eletrônica de varredura
A análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi realizada apenas com o indivíduo UNICAMP, dele foram coletados folhas jovens entre o primeiro e segundo entrenó e maduras entre o quarto e quinto entrenó. As folhas coletadas foram medidas em seu comprimento e largura, como apresenta a Figura 1.2. Foram feitos cortes da margem e nervura central de ambas as folhas coletadas. O material botânico foi fixado em solução FAA50 (formaldeído, ácido acético glacial, etanol 50%, 1:1:18 (v/v)) (JOHANSEN, 1940), desidratado em série etílica e seco pelo método do ponto crítico com CO2 no equipamento Balzers, modelo CPD 030. Em seguida, o material foi montado em suportes metálicos e recoberto com ouro coloidal por 170 segundos no equipamento Bal-Tec modelo SCD 050. A análise e o registro eletromicrográfico foram realizados no microscópio eletrônico de varredura LEO, modelo VP 435, operado a 20 kV, no Departamento de Microscopia Eletrônica do IB - UNICAMP.
Figura 1.2. Perfil das folhas de Plectranthus neochilus coletadas para microscopia eletrônica de varredura. A – Folha jovem coletada entre o primeiro e segundo entrenó. B- Folha madura coletada entre o quarto e quinto entrenó.
3.3.4. Proposta de identificação de tricomas
Os tricomas da espécie foram observados com base em todos os estudos de anatomia realizados (microscopia eletrônica de luz, microscopia eletrônica de varredura e histoquímica) e comparados com as descrições de tricomas da literatura já realizadas para a espécie e para o gênero. Este trabalho não realizou análises dos tipos de tricomas nem de secreção, por isso apresenta uma proposta de identificação dos tricomas observados na anatomia da espécie.
3.4 Histoquímica
Para a realização das análises histoquímicas, foram colhidas de três a quatro folhas maduras e realizados cortes transversais à mão livre do limbo e caule, ambos frescos, do indivíduo UNICAMP em cultivo a sol pleno. As análises foram executadas aplicando-se os reagentes descritos no Quadro 1.2. Para a documentação dos resultados, foi realizada a captura de imagens usando câmera de vídeo Olympus DP71 acoplada ao microscópio Olympus BX 51 e Leica DM 750, fotografadas com auxílio da câmera de vídeo Leica DFC/295.
Quadro 1.2. Testes histoquímicos realizados em Plectranthus neochilus.
Reagentes Grupos metabólitos Coloracão Referência
Cloreto de
Alumínio Compostos fenólicos: flavonoide Fluorescência
CHARRIÈRE-LADREIX,
1976 Cloreto Férrico
III Compostos fenólicos: geral Negro-azulada ou verde escuro
JOHANSEN, 1940 Reagente de
Nadi
Terpenoides: óleos essênciais e ácidos resiníferos
Essências de azul; ácidos resiníferos de vermelho; mistura de ambos de violeta a púrpura
DAVID e CARDE, 1964
Sudan IV Lipídeos Laranja a Vermelho MILLE, 1968
Sudan Black B Lipídeos: totais Azul marinho a preto PEARSE, 1968 Sulfato Azul do
Nilo Lipídeos: neutros
Lipídeos neutros em rosa; lipídeos ácidos de azul - Para algumas plantas: terpenos neutros de rosa e
ácidos resiníferos de violeta a azul
CAIN, 1947
3.5 Citogenética
O estudo citogenético da espécie foi realizado no Laboratório de Biossistemática e Polinização do Instituto de Biologia da UNICAMP sob supervisão da professora Eliana Regina Forni Martins. Para realizar a contagem do número cromossômico de P. neochilus foram feitas estacas de todos os indivíduos e enraizadas em água para a coleta das extremidades radiculares, local de intensa atividade meristemática. Após a coleta, o material foi tratado com solução saturada de paradiclorobenzeno (PDB), que atua no bloqueio do ciclo celular, por 2 horas em temperatura ambiente. Para a fixação do material, as raízes de todos os indivíduos foram colocadas em solução Farmer 3:1 (etanol: ácido acético, v: v) por no mínimo 12 horas em temperatura ambiente sob agitação e armazenadas a -10 ºC até o preparo das lâminas.
As lâminas foram preparadas segundo (GUERRA e SOUZA, 2002) com modificações. Os materiais fixados foram lavados em água destilada por 3 vezes de 10 minutos e em seguida, realizada a digestão enzimática (1 % macerozima, 2 % celulase e 20 % pectinase) por 10 minutos a 37 ºC em banho seco. As regiões meristemáticas das raízes foram isoladas e maceradas sobre uma lâmina, em
ácido acético 45 %. Em seguida, foi realizado esmagamento com uma lamínula de vidro de 18x 18 mm. O conjunto lâmina/lamínula foi colocado em nitrogênio líquido por no mínimo 15 minutos para a remoção da lamínula e adesão permanente do material à lâmina.
Para a coloração cromossômica, as lâminas foram colocadas em uma cuba contendo solução Giemsa 2 % (GUERRA, 1983) por 10 minutos e lavadas em água destilada por 2 vezes para a realização da secagem ao ar, em temperatura ambiente por 24 horas. Por fim, as lâminas foram montadas com Entellan® e lamínula de vidro 20x 20 mm e armazenadas a -10 ºC. Serão selecionadas pelo menos 10 metáfases por indivíduo para a contagem cromossômica. As melhores lâminas serão selecionadas e fotografadas em microscópio Olympus® BX51, com câmera DP72 acoplada utilizando programa Olympus® DP2 BSW (Olympus Corporation).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Descrição anatômica
4.1.1 Microscopia eletrônica de luz, dissociação do tecido e microscopia eletrônica de varredura.
Com relação às análises realizadas em todos os indivíduos para cada corte observou-se:
Caule: em secção transversal pode-se observar a epiderme uniestratificada, tricomas glandulares e tricomas não glandulares em abundância. O córtex é composto por três a quatro camadas de cordões de colênquima angular e de cinco a oito camadas de parênquima cortical, com poucos espaços intercelulares (Figura 1.3A). Nos entrenós analisados, o caule apresenta os feixes vasculares colaterais e início de câmbio. No cilindro vascular, os feixes formam um cilindro delimitando o parênquima cortical e o medular. Nas camadas subepidérmicas, observou-se a instalação de algo semelhante a felogênio não contínuo. A medula é composta de células parenquimáticas com pouquíssimos espaços intercelulares (Figura 1.3B).
Pecíolo: em secção transversal pode-se observar um formato reniforme, epiderme uniestratificada, com tricomas não glandulares e poucos tricomas glandulares. O córtex é composto de duas a três camadas de colênquima angular e de oito a dez camadas de parênquima cortical com poucos espaços intercelulares (Figura 1.3C e 1.3D). Há dois feixes vasculares colaterais de grande porte no centro do tecido e dois menores, cada um em uma extremidade.
Limbo: em secção transversal pode-se observar epiderme uniestratificada em ambas as faces, cutícula fina e estriada (Figura 1.3G). Há tricomas glandulares peltados, tricomas glandulares capitados e tricomas não glandulares. O mesofilo apresentou células parenquimáticas irregulares
(Figura 1.3E, 1.3F e 1.3G), de diferentes tamanhos e formatos, que também se dispõem alinhadas em série. Há espaços intercelulares, principalmente próximos as câmeras subestomáticas (Figuras 1.3G). Em visão paradérmica, os estômatos são diacíticos e estão presentes em ambas as faces, abaxial e adaxial (Figura 1.3 H e 1.3 I). Com relação ao mesofilo, ao analisar as células e seus formatos houve dúvida se ele seria um mesofilo homogêneo como Duarte e Lopes (2007) descreveram. Segundo Glória e Guerreiro (2006), o mesofilo é considerado homogêneo quando não se distingue dois tipos de parênquima, ou seja, quando há apenas um tipo de célula presente na lâmina foliar. Esse fato não foi possível de comprovar (Figura 1.3 E e 1.3 F). Por isso, foi realizada a dissociação do tecido para verificar se as células apresentam um único tipo.
Entre as duas técnicas utilizadas para dissociar o tecido, o método de Franklin (1946) se mostrou mais compatível com as células do mesofilo da espécie. Com essa técnica foi possível observar que as células do mesofilo não apresentam um único formato. A Figura 1.4 apresenta células alongadas com cloroplastos próximos à parede celular dispostos em camada uniforme, o que caracteriza um parênquima clorofiliano (GLÓRIA e GUERREIRO, 2006). Diante disso, as células da Figura 1.3 A e 1.3 C que se apresentam arredondadas e alongadas se assemelha às células do parênquima lacunoso e paliçádico, respectivamente.
Pelas Figuras 1.3 E, 1.3 F e 1.3 G, observa-se que na face adaxial do mesofilo há tanto células alongadas quanto arredondadas dispostas em série e poucos espaços intercelulares. Já na face abaxial, observam-se células mais arredondadas, porém de diferentes formatos e tamanhos, não dispostas em série. Nessa face são visualizados mais espaços intercelulares que a face adaxial. Em ambas as faces o mesofilo não apresenta um perfil contínuo de células. Embora não seja o objetivo em realizar a dissociação, mas os diferentes tipos celulares da espécie dificultam a identificação da classe de parênquima que a espécie possui. Os resultados adquiridos através da dissociação dão subsídeos para discordar de Duarte e Lopes (2007), pois o mesofilo da espécie não é homogêneo.
Com a MEV foram analisados os estágios jovens e maduros de ambas as faces da margem e nervura central das folhas da espécie. O estágio jovem foi coletado entre o primeiro e segundo entrenó com uma média de tamanho de 1,6 cm de comprimento e 1,1 cm de lagura. E o estágio maduro foi coletado entre o quarto e quinto entrenó com uma média de tamanho de 4,3 cm de comprimento e 2,3 cm de largura, como mostra a Figura 1.2 A e 1.2 B.
As Figuras 1.6 A a 1.6 D revelam que em estágio jovem a folha já apresenta uma concentração abundante de tricomas. É possível notar a presença de tricomas não glandulares, dos gladulares capitados afundados na epiderme, dos capitados short e long stalked, como também dos peltados. A margem abaxial tanto jovem quanto madura (Figura 1.6 B, 1.6 F) apresentou uma concentração muito maior de tricomas glandulares peltados do que quando comparada à face adaxial (Figura 1.6 A) e nervura (Figura 1.6 C e 1.6 D). Essa concentração de tricomas peltados é visível a olho nu (Figura
1.8A e 1.8B). Nas eletromicrografias da folha madura observou-se que com o limbo expandido há mais espaços entre os tricomas (Figura 1.6G e 1.6H). Na margem foi possível visualizar a presença de hifas entrelaçadas aos tricomas (Figura 1.7B). Foi possível notar também que na margem jovem a cutícula dos tricomas glandulares permanece aderida ao pedúnculo (Figura 1.6A e 1.6B), assim como a estrutura do tricoma não glandular que permanece íntegra. Já a nervura, tanto jovem como madura (Figura 1.6C, 1.6D, 1.6G e 1.6H) os tricomas apresentam-se danificados e cutículas rompidas.
Todos os tricomas encontrados para a espécie são apresentados em tópico posterior. De modo geral, tanto em secção transversal quanto em paradérmico dos tecidos, foram visualizados tricomas glandulares capitados, glandulares peltados e tricomas não glandulares. Entretanto, não foram observados tricomas conoidais, como ocorre em P. ornatus (Tabela 1.1) (ASCENSÃO et al., 1999). Os mais abundantes são os tricomas não glandulares, distribuídos por todo o vegetal. Em menor abundância encontram-se os capitados e peltados.
A presença de tricomas capitados e peltados é uma característica compartilhada entre as espécies de Lamiaceae e podem ser observadas, por exemplo, em P. madagascariensi, P. ornatus, P. barbatus, P. grandis, Leonitis leonurus, Rosmarinus officinais, Ocimum basilicum, Melissa officinalis, podendo haver algumas variações no tipo de tricoma dependendo da espécie. Tais variações geram alterações nas funções, o que geralmente ocorre entre os tricomas capitados que possui vários tipos, ao contrário dos tricomas peltados que apresentam uma morfologia uniforme (ASCENSÃO et al., 1995, 1998, 1999; MARTINS e PASTORI, 2004; MILANEZE-GUTIERRE et al., 2007; BOIX et al., 2011). Assim como em espécies de Mentha notou-se nas microscopias realizadas que há predominância de tricomas capitados em relação aos tricomas peltados (MARTINS, 2002). Embora Plectranthus possua um número expressivo de espécies, poucas foram estudadas quanto aos tipos de tricomas e suas funções. Esse estudo é de grande relevância, uma vez que os tricomas e suas classes de metabólitos são muito importantes como ferramenta taxonômica e o gênero apresenta um potencial aromático considerável (ASCENSÃO, 2007; KHALIK, 2016).
Devido à dificuldade de identificação de P. ornatus e P. neochilus observada na literatura, percebeu-se a importância de analisar as características anatômicas de todos os indivíduos utilizados. As características discutidas nesse tópico foram observadas em todos os indivíduos, revelando que todos eles se tratavam da mesma espécie, P. neochilus. Os resultados obtidos corroboram com algumas características descritas por Duarte e Lopes (2007), principalmente nos quesitos: cutícula estriada e estômatos diacíticos no limbo (Figura 1.3H e 1.3I), o que a difere de P. ornatus que possui epiderme com cutícula lisa e estômatos anomocíticos (Tabela 1.1) (MAURO et al., 2008). Porém, com relação ao tipo de mesofilo o presente estudo discorda da descrição anatômica da espécie identificando um mesofilo heterogêneo.
Figura 1.3. Secções transversais do caule (A, B), pecíolo (C, D), folha (E, F, G, H e I) observadas em todos os indivíduos de Plectranthus neochilus cultivado a sol pleno. A - Secção quadrangular do caule; B - felogênio, epiderme, colênquima angular e parênquima cortical. C - Secção reniforme do pecíolo –