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TÍTULO: ANÁLISE DA PRESENÇA E CONCENTRAÇÃO DE COBRE, ZINCO E SELÊNIO NA URINA DE INDIVÍDUOS COM CÂNCER DE PRÓSTATA
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): EDUARDO ERIYO HIRAI
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): MARIA HELENA BELLINI MARUMO, TANIA REGINA DE BORBA
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): DANIEL RIANI GOTARDELO, JULIO TAKEHIRO MARUMO
1 1. RESUMO
Este trabalho visou observar se existem diferenças significativas entre amostras de urina de indivíduos sadios e de indivíduos afetados pelo câncer de próstata em relação às concentrações de cobre, zinco e selênio, assim observando se a análise dessas concentrações na urina possui relevância no diagnóstico do câncer de próstata. Amostras de urina de 27 indivíduos sadios e de 26 indivíduos com câncer de próstata foram preparadas por digestão ácida e analisadas por Espectrometria de Emissão Óptica por Plasma Acoplado Indutivamente. Não foram encontradas diferenças significativas para os três elementos estudados.
2. INTRODUÇÃO
O câncer de próstata é o mais incidente entre os homens no Brasil e no mundo. Em 2012, a última estimativa considerou 1,1 milhão de casos novos no mundo. No Brasil, estimam-se 68.800 casos novos para o ano de 2014 e, nos Estados Unidos, acredita-se que esse tipo de câncer tenha levado ao óbito 29.720 pessoas apenas no ano de 2013. (1,2)
A idade é o principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer de próstata, sendo que a etnia e a história familiar também podem contribuir para o aparecimento da enfermidade. Acredita-se que dietas à base de frutas e vegetais, ricas em fitoquímicos e antioxidantes, poderiam interferir no desenvolvimento desse tipo de tumor por reduzirem potencialmente o dano genômico causado por espécies reativas de oxigênio e pelo aumento de enzimas antioxidantes. A ingesta de carotenoides, vitaminas C e E, polifenóis existentes em cafés e chás, flavonoides e licopenos também tem sido estudada com resultados variáveis - ora positivos, ora negativos, ora sem associação com o risco de desenvolvimento do tumor. (2,3,4) Algumas investigações têm avaliado relações entre alguns microelementos e o câncer, sendo que cobre, zinco e selênio são os mais estudados. (5,6,7)
Estudo recente verificou a associação entre os níveis de traços de metais em espécimes de biópsia e a recorrência bioquímica do câncer de próstata, por meio da
2 dosagem do PSA. Encontraram-se baixos níveis de zinco e ferro relacionados à recorrência do tumor. (8,9) A quantificação de traços de metais em cabelos foi proposta como método complementar para o screening do câncer prostático em outro estudo do tipo caso-controle. Nesse estudo, apesar dos níveis de 20 elementos terem sido identificados, comprovou-se que a dosagem de apenas 9 deles proporcionaria acurácia de 98,2%, sensibilidade de 100% e especificidade de 96,4% para o diagnóstico de câncer de próstata. (10)
Diante do exposto, ressalta-se a importância da realização de pesquisas que permitam uma melhor compreensão de processos patogênicos possivelmente relacionados ao câncer de próstata. Nesse sentido, a determinação de microelementos na urina de indivíduos com esse câncer pode ser relevante para o desenvolvimento de novos métodos diagnósticos.
3. OBJETIVOS
Utilizar Espectrometria de Emissão Óptica por Plasma Acoplado Indutivamente (ICP-OES) para avaliação qualitativa e quantitativa das concentrações de cobre, zinco e selênio presentes em amostras de urina de indivíduos com câncer prostático e de indivíduos sadios.
Comparar os valores encontrados nas amostras de indivíduos com câncer prostático com os valores encontrados em amostras de indivíduos sadios, visando observar se existe diferença significativa entre os valores.
4. METODOLOGIA
As amostras que foram utilizadas neste projeto estavam armazenadas no laboratório de Biologia Celular e Molecular do Câncer do Centro de Biotecnologia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). As mesmas foram obtidas mediante aprovação do comitê de ética (N. 784.592 ).
3 A pesquisa utilizou amostras de urina de 26 pacientes com câncer prostático e de 27 indivíduos sadios. Por se tratar de amostra orgânica a preparação das amostras por digestão ácida foi realizada antes do início das análises por ICP-OES para obter melhor qualidade de análise. (11) Entretanto, para a análise das concentrações de selênio as amostras foram apenas diluídas e não passaram pelo processo de digestão ácida, pois análises preliminares apresentaram redução na qualidade das análises de selênio após a digestão.
O método de análise por ICP-OES foi escolhido por ser rápido, capaz de analisar múltiplos elementos simultaneamente e por apresentar alta sensibilidade na determinação de concentrações.
As comparações entre as concentrações foram realizadas pelo Teste T de Student, usando o programa GraphPadPrism versão 5.0 do Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Em todos os testes os valores de probabilidade (P) inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente diferentes.
5. DESENVOLVIMENTO
5.1. Preparo das amostras urinárias 5.1.1. Digestão ácida das amostras:
Para cada amostra 15 mL de urina foram transferidos para um béquer em chapa aquecedora dentro de uma capela. Em seguida ácido nítrico 65% e peróxido de hidrogênio 34% foram adicionados e a amostra foi aquecida a 200ºC até todo o líquido vaporizar. A adição de ácido nítrico e peróxido de hidrogênio, seguida de aquecimento, foi repetida até o precipitado adquirir coloração branca.
O precipitado foi então dissolvido em 10 mL de ácido nítrico 5%, transferido para tubo cônico e analisado por ICP-OES para determinar as concentrações de cobre e zinco.
4 5.1.2 Diluição:
Para a determinação das concentrações de selênio em cada amostra, 5 mL de amostra de urina foram misturados com 5 mL de ácido nítrico 10% em tubo cônico e analisados por ICP-OES.
5.2. Análise por ICP-OES 5.2.1. Preparo de padrões:
Para a calibração do ICP-OES foram preparados quatro padrões de calibração de 20 mL nas concentrações 0,1 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm e 5 ppm.
Os padrões foram preparados a partir de uma solução-mãe (Merck) contendo 30 elementos (cobre, zinco e selênio entre eles) em concentração de 10 ppm. Cálculos prévios determinaram o volume necessário da solução-mãe para o preparo de 20 mL dos quatro padrões nas concentrações desejadas. Para o preparo de cada padrão o volume necessário da solução-mãe foi transferido com o uso de micropipeta para um tubo cônico em uma balança analítica tarada, onde a massa foi observada. Em seguida ácido nítrico suprapur (Merck) 5% foi pipetado ao tubo cônico até a massa da solução estar o mais próximo possível de 20 g e a massa final da solução foi observada. Com os valores das massas da solução-mãe pipetada e da solução final a concentração real do padrão pôde ser calculada e utilizada na calibração do espectrômetro para maior precisão.
5.2.2. Condições de análise:
As análises foram realizadas com o espectrômetro PerkinElmer Optima 7000 DV alimentado pelos gases argônio, nitrogênio e oxigênio e conectado a um computador contendo o software WinLab32 for ICP-OES. As condições instrumentais de operação encontram-se na Tabela 1.
5 Tabela 1 - Condições de operação do ICP-OES
Fluxo de gás do plasma 15 L/min Fluxo de gás auxiliar 0,2 L/min Potência 1300 Watts Fluxo de gás nebulizador 0,8 L/min
Vazão de amostra 1 mL/min Visão do plasma Axial
Os comprimentos de onda escolhidos para observação dos elementos no espectrômetro estão representados na Tabela 2.
Tabela 2 - Comprimentos de onda escolhidos para as análises
Elemento Comprimento de onda (λ)
Cobre 327,393
Zinco 206,200
Selênio 196,026
5.2.3. Processo de análise:
Primeiramente uma solução de ácido nítrico suprapur 5% foi analisada no espectrômetro como solução branco, seguida por análise dos quatro padrões de calibração para que uma curva de calibração seja formada. Por fim, foram realizadas as análises das amostras de urina tratadas pelo processo de digestão ácida, seguidas pelas análises das amostras que foram diluídas em ácido nítrico 10%. Cada análise consumiu aproximadamente 1 mL de amostra.
6 6. RESULTADOS
As concentrações médias de cobre, zinco e selênio que foram observadas nas análises estão representadas, respectivamente, nas tabelas 3, 4 e 5 em µg de elemento por g de urina, juntamente com os desvios padrões.
Tabela 3 - Concentrações médias e desvios padrões das concentrações de cobre (µg/g)
Grupo Concentração média Desvio padrão
Indivíduos afetados 0,0382 0,0188 Indivíduos sadios 0,0432 0,0238
Tabela 4 - Concentrações médias e desvios padrões das concentrações de zinco (µg/g)
Grupo Concentração média Desvio padrão
Indivíduos afetados 0,2668 0,2023
Indivíduos sadios 0,2358 0,1509
Tabela 5 - Concentrações médias e desvios padrões das concentrações de selênio (µg/g)
Grupo Concentração média Desvio padrão
Indivíduos afetados 0,1286 0,0631
7 A tabela 6 apresenta os valores de probabilidade (P) obtidos no Teste T de Student. Nenhuma das concentrações estudadas foi considerada estatisticamente diferente com o câncer de próstata, pois todos os valores de probabilidade encontrados foram superiores a 0,05.
Tabela 6 - Valores de probabilidade (P) encontrados no Teste T de Student
Elemento Valor de P
Cobre 0,4037
Zinco 0,5288
Selênio 0,6436
As figuras 1, 2 e 3 apresentam as comparações entre as concentrações médias do grupo de indivíduos com câncer de próstata (N) e do grupo de indivíduos sadios (CTL). Cobre-N Cobre-CTL 0.00 0.02 0.04 0.06 Co n c e n tr a ç ã o d e Co b re ( g /g )
8 Zinco-N Zinco-CTL 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 Co n c e n tr a ç ã o d e Z in c o ( g /g )
Figura 2 - Comparação entre as concentrações médias de zinco Selênio-N Selênio-CTL 0.00 0.05 0.10 0.15 C o n c e n tr a ç ã o d e S e lê n io ( g /g )
Figura 3 - Comparação entre as concentrações médias de selênio
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diversas pesquisas relacionam cobre, zinco e selênio com o câncer em geral, no entanto as concentrações encontradas nesta pesquisa não foram consideradas estatisticamente diferentes. Os resultados então sugerem que o câncer de próstata não altera as concentrações desses elementos na urina, o que não tornaria essa análise relevante no diagnóstico do câncer de próstata.
9 8. FONTES CONSULTADAS
1. NATIONAL CANCER INSTITUTE. SEER Stat Fact Sheets: Prostate Cancer. Estados Unidos, 2016. Disponível em:
<http://www.seer.cancer.gov/statfacts/html/prost.html>. Acesso em: 5 mar. 2016. 2. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA. Estimativa 2014: Incidência de Câncer no Brasil. INCA, Rio de Janeiro, 2014. p.33. Disponível em:
<http://www.inca.gov.br/bvscontrolecancer/publicacoes/Estimativa_2014.pdf>. Acesso em: 10 abr. 2016.
3. VANCE, T.M. et al. Dietary antioxidants and prostate cancer: a review. Nutrition and cancer, v. 65, n. 6, p. 793-801, ago. 2013. Disponível em: <
https://www.researchgate.net/publication/255174781_Dietary_Antioxidants_and_Pro state_Cancer_A_Review>. Acesso em: 13 abr. 2016.
4. NICASTRO, H.L.; DUNN, B.K. Selenium and prostate cancer prevention: insights from the selenium and vitamin E cancer prevention trial (SELECT). Nutrients, v. 5, n. 4, p. 1122-1148, 1 abr. 2013. Disponível em:
<http://www.mdpi.com/2072-6643/5/4/1122/htm>. Acesso em: 15 abr. 2016.
5. MARGALIOTH, E.J.; SCHENKER, J.G.; CHEVION, M. Copper and Zinc levels in normal and malignant tissues. Cancer, v. 52, n. 5, p. 868-872, 1 set. 1983.
Disponível em:
<http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1097-0142(19830901)52:5%3C868::AID-CNCR2820520521%3E3.0.CO;2-K/pdf>. Acesso em: 5 ago. 2016.
6. STRATTON, J.; GODWIN, M. The effect of supplemental vitamins and minerals on the development of prostate cancer: a systematic review and meta-analysis. Family Practice, v. 28, p. 243-252, jan. 2011. Disponível em:
<https://fampra.oxfordjournals.org/content/early/2011/01/27/fampra.cmq115.full>. Acesso em: 10 abr. 2016.
7. CALVO, F.B. et al. Variation in the distribution of trace elements in renal cell carcinoma. Biological Trace Element Research, v.130, n. 2, p. 107-130, 2009. Disponível em:
10 <https://www.researchgate.net/publication/24005426_Variation_in_the_Distribution_o f_Trace_Elements_in_Renal_Cell_Carcinoma>. Acesso em: 14 abr. 2016.
8. OBORT, A.S.; AJADI, M.B.; AKINLOVE, O. Prostate-Specific Antigen: Any Successor in Sight? Reviews in urology, v. 15, n. 3, p.97-107, 2013. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3821988/>. Acesso em: 15 abr. 2016. 9. COSTELLO, L.C.; FRANKLIN, R.B. Zinc is decreased in prostate cancer: an established relationship of prostate cancer! JBIC: Journal of Biological Inorganic Chemistry, v. 16, n. 1, p. 3-8, jan. 2011. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3735606/ >. Acesso em: 18 abr. 2016. 10. TAN, C.; CHEN, H. Screening of Prostate Cancer by Analyzing Trace
Elements in Hair and Chemometrics. Biological Trace Element Research, v. 144, n. 1, p. 97-108, 2011. Disponível em: <http://link.springer.com/article/10.1007/s12011-011-9038-5>. Acesso em: 2 jun. 2016.
11. WANG, J. et al. Microwave digestion with HNO3/H2O2 mixture at high temperatures for determination of trace elements in coal by ICP-OES and ICP-MS. Analytica Chimica Acta, v. 514, n. 1, p. 115-124, jun. 2004. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267004003496>. Acesso em: 10 mai. 2016
12. PETRY, C.F. Determinação de elementos traço em amostras ambientais por ICP OES. Universidade Federal do Rio Grande do Sul. 2005. Disponível em: <http://www.lume.ufrgs.br/handle/10183/4604>. Acesso em: 5 ago. 2016.
