TÍTULO: ANÁLISE IN VITRO DO POTENCIAL GENOTÓXICO DA LICOCHALCONA A, UM FLAVONÓIDE DO ALCAÇUZ
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): UNIVERSIDADE DE FRANCA - UNIFRAN INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): TABATA RODRIGUES ESPERANDIM AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): DENISE CRISPIM TAVARES BARBOSA ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ADEMAR ALVES DA SILVA FILHO, DENISE CRISPIM TAVARES, HELOIZA DINIZ NICOLELLA, IARA SILVA SQUARISI, KAROL SOARES DE FREITAS, NATÁLIA OLIVEIRA ACESIO, SAULO DUARTE OZELIN
1 1. RESUMO
Ao longo dos tempos, os seres humanos têm contado com a natureza para suas necessidades básicas, como para a produção de alimentos, abrigos, roupas, meios de transporte, fertilizantes, aromas e fragrâncias, e medicamentos. As plantas têm formado a base da medicina tradicional que já existe há milhares de anos e continua a fornecer à humanidade novos fármacos. A raiz de alcaçuz consiste em uma das mais importantes plantas utilizadas pela Medicina Tradicional Chinesa para o tratamento de úlcera gástrica, asma brônquica e inflamação. Licochalcona A (LCA) é uma importante chalcona isolada a partir da raiz de alcaçuz Chinês, Glycyrrhiza inflata Batalin. A literatura relata que LCA apresenta atividades antitumoral, antiobesidade, antiparasitária, antioxidante, antibacteriana, anti-inflamatória e osteogênica. Em face das várias atividades biológicas, o presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial genotóxico da LCA pelo teste do micronúcleo em fibroblastos de ovário de hamster Chinês (células CHO). Para tanto, as culturas celulares foram tratadas com 1,5; 2,5 e 3,5 µg/mL. As culturas tratadas com as diferentes concentrações de LCA apresentraram frequências de micronúcleos que não diferiram daquela observada no grupo controle negativo. Adicionalmente, os índices de divisão nuclear, empregado para a avalição da citotoxicidade dos tratamentos, obtidos nas culturas tratadas com LCA também não foram diferentes significativamente em relação aos índices do grupo controle negativo, revelando ausência de citotoxicidade. Portanto, os resultados obtidos revelaram que a LCA não demonstrou genotoxicidade e nem citotoxicidade, nas condições experimentais utilizadas.
2 2. INTRODUÇÃO.
2.1. Alcaçuz
O termo “alcaçuz” (Gan-Cao, em Chinês) compreende as raízes de três espécies de
Glycyrrhiza (Glycyrrhiza uralensis Fisch. Ex DC., Glycyrrhiza glabra L. e Glycyrrhiza inflata Batalin). O alcaçuz consiste em uma das mais importantes plantas utilizadas pela
Medicina Tradicional Chinesa por ter efeitos que aliviam a dor, tonifica o baço e o estômago, eliminando o fleuma, e aliviam a tosse (1). O alcaçuz tem uma longa história de uso medicinal na Europa e na Ásia. A raiz do alcaçuz tem sido usada principalmente para o tratamento oral de úlceras bucal, gástrica, duodenal e esofágica; inflamação, aumento da evacuação intestinal, como espasmolítico, antitussígeno, demulcente, expectorante, laxante e desordenação respiratória (2). É também utilizado no tratamento da doença de Addison (3).
Mesmo sendo benéfico para a saúde e uso individual, a ingestão excessiva de alcaçuz requer atenção, uma vez que pode causar hipocalemia e hipertensão. O aparecimento e a gravidade dos sintomas dependem da dose e do tempo de ingestão de alcaçuz, considerando a suscetibilidade individual (4).
2.2. Licochalcona A
A licochalcona A (LCA) é um flavonoide pertencente à classe das chalconas, isolada do alcaçuz, Glycyrrhiza inflata (5). Nos últimos 30 anos estudos farmacológicos tem mostrado que a LCA possui várias atividades biológicas como antiparasitária (6), osteogênica (7), antimicrobiana (8), antiviral (9), imunomoduladora (10), anti-inflamatória (11) e possui efeito inibitório da diabetes (1). A LCA é uma molécula que está sendo considerada para o tratamento de câncer (12), e tem demonstrado exercer efeitos citoprotetores ao diminuir o estresse oxidativo (13). Considerando as diversas atividades biológicas da LCA, torna-se relevante a avaliação toxicogenética, que é um componente básico da avaliação do uso seguro pela população (14).
3 O presente trabalho teve como objetivo avaliar a genotoxicidade da LCA em fibroblastos de ovário de hamster Chinês (células CHO).
4. METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO. 4.1. Linhagem celular e condições de cultivo
A linhagem celular CHO (fibroblastos pulmonares de hamster Chinês) foi utilizada para avaliação da genotoxicidade pelo teste do micronúcleo. Esta linhagem foi gentilmente cedida pelo Laboratório de Citogenética e Mutagênese da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. As células CHO foram mantidas em frascos de cultura (25 cm2, Corning) contendo meio HAMF10 + DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Nutricell, Campinas, São Paulo, Brasil), 0,1 g/mL de estreptomicina (Sigma-Aldrich) e 0,06 g/mL de penicilina (Sigma-Aldrich).
4.2 Avaliação da genotoxicidade
O texto do micronúcleo foi empregado para o estudo da genotoxicidade da LCA. As concentrações foram escolhidas a partir dos resultados obtidos no ensaio de XTT, utilizando-se a citotoxicidade como critério de escolha. Assim, as culturas celulares foram tratadas com LCA nas concentrações de 1,5; 2,5 e 3,5µg/mL. Grupos controle negativo (sem tratamento), solvente DMSO 1% (dimetilsulfóxido) e positivo (doxorrubicina, DXR, Bergamo Ltda., 0,5 µg/mL) foram incluídos.
As células CHO foram semeadas em frascos de cultura com superfície de 25 cm2 (Corning) onde ficaram por 1 h para aderir à parede do frasco e continuaram incubadas por dois ciclos celulares (24 h) com meio completo. Então, foram submetidas aos diferentes tratamentos durante 3 h em meio de cultura sem soro. Após esse período, as células foram lavadas duas vezes com PBS (phosphate buffer-saline, tampão fosfato-salino) e foram incubadas novamente durante 17 h em meio de cultura completo, contendo citocalasina na concentração de 3 μg/mL. Os experimentos foram realizados em três repetições.
Os procedimentos de fixação das células foram baseados em Fenech (2000). A análise das lâminas foi feita em microscópico de campo claro com o objetivo de se
4 detectar a frequência de micronúcleos nas células submetidas aos diferentes tratamentos e respectivos controles. Para tanto, foi realidade a análise das células com a objetiva de imersão (aumento total: 1000X). Para cada cultura foram contadas 1.000 células binucleadas (um total de 3.000 células por tratamento), sendo distribuídas de acordo com a quantidade de micronúcleos que contiverem 0, 1, 2 e 3 ou mais micronúcleos. Para a avaliação da citotoxicidade dos tratamentos, foi calculado o índice de divisão nuclear (IDN), sendo analisadas 500 células (um total de 1.500 por tratamento).
Os dados foram analisados estatisticamente por análise de variância (ANOVA) para experimentos inteiramente aleatorizados, com o cálculo da estatística F e de seu respectivo “pvalue”. Nos casos em que P < 0,05, as médias de tratamentos foram comparadas pelo método de Tukey, com o cálculo da diferença mínima significativa para α=0,05.
5. RESULTADOS.
As culturas tratadas com 4,0 µg/mL de LCA não apresentaram células para análise, revelando a citotoxicidade da LCA nesta concentração. Assim, as frequências de células binucleadas micronucleadas obtidas em culturas tratadas com 1,5; 2,5 e 3,5 µg/mL de LCA e seus respectivos controles são mostradas na Tabela 1. Nenhuma diferença significativa na frequência de células binucleadas micronucleadas foi observada nas culturas tratadas com as diferentes concentrações de LCA quando comparadas ao grupo controle negativo. As culturas tratadas com LCA apresentaram IDN que não diferiram siginificativamente do grupo controle negativo, demonstrando ausência de citotoxicidade dos tratamentos.
5 Tabela 1. Médias da frequência de células binucleadas micronucleadas (CBMNs) e
índice de divisão nuclear (IDN) obtidos nas culturas de células CHO tratadas com LCA, e respectivos controles.
LCA, licochalcona A; DXR: doxorrubicina (0,5 μg/mL); DMSO: dimetilsulfóxido (1%). Os valores são médias ± DP.
aTotal de 3000 células binucleadas foram analisadas por grupo de tratamento. bTotal de 1500 células foram analisadas por grupo de tratamento.
cSignificativamente diferente do grupo de controle negativo (P <0,05).
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS.
Os resultados obtidos, sob as condições experimentais empregadas no presente estudo, permitem concluir que LCA não aumentou significativamente a frequência de micronúcleos, revelando ausência de genotoxicidade.
7. REFERÊNCIAS
1. Yang R, Wang L, Yuan B, Liu Y. The pharmacological activities of licorice. Planta Medica. 2015; 81: 1654-1669. Tratamentos (µg/mL) CBMNsa Média ± DP IDNb Média ± DP Negative Control 6,67 ± 1,15 1,57 ± 0,06 DMSO LCA 1,5 5,67 ± 2,52 6,33 ± 3,06 1,66 ± 0,09 1,66 ± 0,03 LCA 2,5 LCA 3,5 11,33 ± 2,31 7,00 ± 2,00 1,59 ± 0,08 1,64 ± 0,01 DXR 39,33 ± 3,51c 1,66 ± 0,06
6 2. Anilkumar DI, Hemang J and Nishteswar K. Review of Glycyrrhiza glabra (yastimadhu) – abroad spectrum herbal drug. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2012; 3: 3171-3195.
3. Methlie P, Husebye EES, Husebye S, Lien EA, Lovas K. Grapefruit juice and licorice increase cortisol availability in patients with Addison´s disease. European Journal of Endocrinology. 2011; 165: 761-769.
4. Mumoli N, Cei M. Licorice induce hypokalemia. International Journal of Cardiology. 2008; 124: e42-e44.
5. Tsai JP, Lee CH, Ying TH, Lin CL, Lin CL, Hsueh JT, Hsieh YH. Licochalcone A induces autophagy through PI3K/Akt/mTOR inactivation and autophagy suppression enhances Licochalcone A-induced apoptosis of human cervical cancer cells. Oncotarget. 2015; 6: 28851-28866.
6. Liu M, Wilairat P, Croft SL, Tan AL, Go ML. Structure-activity relationships of antileishmanial and antimalarial chalcones. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2003; 11: 2729–2738.
7. Kim SN, Bae SJ, Kwak HB, Min YK, Jung SH, Kim CH, Kim SH. In vitro and in vivo osteogenic activity of licochalcone A. Amino Acids. 2012; 42: 1455-1465. 8. Zhao H, Jiang JT, Zheng QS. Advance in studies on pharmacological effects of
licochalcone A. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2013; 38: 3814-3818.
9. Kao TC, Wu CH, Yen GC. Bioactivity and potencial health benefits of licorice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2014; 62: 542-553.
10. Fontes LB, Dos Santos Dias D, de Carvalho LS, Mesquita HL, da Silva Reis L, Dias AT, Da Silva Filho AA, do Amaral Correa JO. Immunomodulatory effects of licochalcone A on experimental autoimmune encephalomyelitis.Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2014; 66: 886-894.
11. Dunlap TL, Wang S, Simmler C, Chen SN, Pauli GF, Dietz BM, Bolton JL: Differential Effects of Glycyrrhiza Species on Genotoxic Estrogen Metabolism: Licochalcone A Downregulates P450 1B1, whereas Isoliquiritigenin Stimulates It Chemical Research in Toxicology 2015; 28: 1584-1594.
12. Park SY, Kim EJ, Choi HJ, Seon MR, Lim SS, Kang YH, Choi MS, Lee KW, Yoon Park JH: Anti-carcinogenic effects of non-polar components containing licochalcone A in roasted licorice root. Nutrition Research and Practice. 2014a; 8: 257-266. 13. Kuhnl J, Roggenkamp D, Gehrke SA, Stab F, Wenck H, Kolbe L, Neufang G.
Licochalcone A activates Nrf2 in vitro and contributes to licorice extract-induced lowered cutaneous oxidative stress in vivo. Experimental Dermatology. 2015; 24: 42-47.
14. Witte I, Plappert U, Wall H, Hartmann A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative
7 to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological Sciences. 2007; 97: 21-26.
