UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de biologia
ROBSON TRAMONTINA
CARACTERIZAÇÃO DE ENZIMAS AUXILIARES (REDOX) DO
CUPIM COPTOTERMES GESTROI QUE ATUAM EM
CONJUNTO COM HIDROLASES GLICOLÍTICAS
CHARACTERIZATION OF AUXILIARY (REDOX) ENZYMES
FROM THE TERMITE COPTOTERMES GESTROI THAT
COOPERATE WITH GLYCOLYTIC HYDROLASES
CAMPINAS 2016
ROBSON TRAMONTINA
CARACTERIZAÇÃO DE ENZIMAS AUXILIARES (REDOX)
DO CUPIM COPTOTERMES GESTROI QUE ATUAM EM
CONJUNTO COM HIDROLASES GLICOLÍTICAS
CHARACTERIZATION OF AUXILIARY (REDOX) ENZYMES
FROM THE TERMITE COPTOTERMES GESTROI THAT
COOPERATE WITH GLYCOLYTIC HYDROLASES
Dissertação apresentada ao Instituto
de Biologia da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências, na área de concentração em Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Dissertation presented to the
Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the Master’s degree of Sciences, in the field of concentration of Drugs, Medicines and Supplies for Health.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO ROBSON TRAMONTINA, E ORIENTADA PELO DR FABIO MARCIO SQUINA COM COORIENTAÇÃO PELO PROF DR ANDRÉ RICARDO DE LIMA DAMÁSIO.
Orientador: FABIO MARCIO SQUINA
Co-orientaodor: ANDRÉ RICARDO DE LIMA DAMÁSIO
CAMPINAS 2016
Campinas, 08 de julho de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Fabio Marcio Squina Prof. Dr. Valdeir Arantes
Dra. Juliana Velasco de Castro Oliveira Dr. Roberto Ruller
Os membros da comissão organizadora acima assinaram a Ata da Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
À dona Celitinha e seu Tramontina Pelos 26 anos de compaixão, suporte,
compreensão e liberdade de escolha
AGRADECIMENTOS
Caríssimos amigos, mestres e familiares, não haveria nenhuma condição de eu chegar até aqui e sem dúvidas eu não teria forças para finalizar este trabalho, sem vocês. Portanto, sou profundamente grato a todos, e gostaria de homenagear vocês que fizeram parte desta obra e de minha vida.
Ao meu orientador, Dr. Fabio Squina, pela sua excelência, oportunidade, confiança, incentivo e a liberdade de escolha, que tornaram este trabalho tão próspero e motivador. Ao meu coorientador Dr. André Ricardo de Lima Damásio, pela amizade, dedicação, e pelo exemplo de veterano que ele é.
Ao João Paulo Franco Cairo, “a casta doutoranda” que ensinou a “casta mestranda” a crescer e se diferenciar, espero que um dia sejamos todos reis na “colônia da pesquisa”.
Aos meus amigos e colaboradores fundamentais para este trabalho Fernanda Mandelli e Marcelo Liberato, obrigado pela atenção e experiência compartilhada. Ao CNPEM/CTBE pela infraestrutura e o suporte técnico dos melhores profissionais. Em especial a: Jaciane Lenczac, Roberto Ruller, Sindelia Freitas, José Pradella, Juliana Velasco, Sarita Rebelo e Silvio Consonni.
À Dra. Ana Maria Costa-Leonardo, por ter disponibilizado os cupins.
À universidade estadual de Campinas (UNICAMP), uma universidade pública e de qualidade. Desejo que a UNICAMP sempre seja referência mundial.
Aos meus amigos do CTBE: Agnes; Amanda; Bruna Campos; Bruna Soares; Carla Botelho; Carol; Douglas; Eduardo; Emerson; Fabiano; Gisele; Gabriela Felix; Gabriela Ematsu; Juliana; Lívia; Lucas; Marcelo Rúbio; Mariana; Rebeca; Roberta; Samantha; Thabata; Thiago; Pedro; Renan; Erica, que tanto me ajudaram, motivaram e tornaram meus dias mais felizes. Cada um de vocês sabe o quão eu sou grato!
Aos amigos do programa de pós-graduação em biociência e tecnologia de produtos bioativos: Daniela Mizobuti (Mitsubishi) pelo BITEC e os SOS, Marcos Salvador, Elaine Minatel e Rafael Chagas Pessoa pela simpatia e paternalismo mesmo em uma universidade tão grande.
Ao Bruno Leite Silva por segurar comigo esta marimba que é a vida! Você é fundamental.
Aos amigos que Campinas me proporcionou e levarei para a vida: Alejandro; Guilherme e Djalma. Em especial à Antonielle, Carla Portela e Diogo que me aconselharam de bom coração. Além dos amigos de sempre, Ewerton e Lucas. Aos meus pais Valdecir, Celita e irmão Renan Tramontina; aos meus tios e primos. A todos aqueles que direta ou indiretamente se envolveram na realização deste trabalho.
"A melhor maneira de prever o futuro é criá-lo." Peter F. Drucker
RESUMO
A descoberta de novas fontes enzimáticas para degradação e detoxificação da lignocelulose em açúcares fermentescíveis é considerada o maior gargalo para a viabilidade das biorefinarias de etanol de segunda geração (2G). Na natureza, os cupins são sistemas biológicos modelos para o estudo da conversão da biomassa vegetal. Deste modo, o cupim inferior Coptotermes gestroi utiliza como fonte de nutrientes a madeira, fazendo o uso desta biomassa recalcitrante através de uma complexa simbiose entre si como hospedeiro e seus simbiontes procarióticos e eucarióticos. Após o uso das tecnologias “ômicas”, pose-se explorar melhor a biologia dos cupins, em especial aspectos enigmáticos sobre a relação holobiôntica, bioquímica e fisiológica relacionada à sua dieta. Há muitos indícios sobre uma classe inexplorada de proteínas endógenas, enzimas pró-oxidantes antioxidantes e detoxificantes (PADs) e enzimas auxiliares (AAs), que demonstram que estas enzimas poderiam ter um papel fundamental na conversão de lignocelulose pelos cupins inferiores. Portanto, a hipótese deste trabalho versa sobre o cupim C. gestroi quanto à presença de um sistema de degradação e detoxificação de biomassa lignocelulósica que complementa as hidrolases glicolíticas. Para isso, neste trabalho foram conduzidos estudos enzimáticos, eletroquímicos, fermentativos e microscópicos visando o estudo das enzimas endógenas de cupim, de maneira a atribui-las potencial de aplicação biotecnológica. As enzimas endógenas do cupim, endoglucanase (CgGH9-1), aldoketo redutase (CgAKR-1-1) e superóxido dismutase (CgSOD-1) foram imunolocalizadas no aparelho digestivo de C. gestroi, confirmando a presença destas na digestômica do inseto. Foi encontrado que, CgSOD-1, CgAKR-1, CgADH-1 (Álcool desidrogenase), CgLAC-1 (Lacase) atuam em sinergismo dependente de espécies reativas de oxigênio (EROs) durante a suplementação de coquetéis celulásicos. Outra aplicação encontrada para CgAKR-1 foi sua capacidade de agente detoxificante de biomassas contra os fenólicos aldeídicos inibidores de fermentação. Foi identificada a primeira LPMO da família AA10 em animais (CgAA10-2), que foi caracterizada e capaz de oxidar a celulose. CgGOX-1 apresentou atividade de glicose oxidase, o que permitiu o desenvolvimento de uma biopilha de açúcares provenientes de bagaço de cana de açúcar hidrolisado. CgCAT-1 uma catalase, apresentou alta similaridade com uma catalase de R. flavipes. Em vias gerais todas estas enzimas identificadas apresentaram relação com a digestômica do inseto, reforçando o papel das enzimas endógenas do cupim para a degradação da biomassa, detoxificação de xenobióticos e atividade pró e antioxidante, ampliando o conhecimento da biologia deste inseto. Por último, estas enzimas apresentam um grande potencial para as biorefinarias, como enzimas com múltiplos propósitos e com características integrativas, visando à consolidação dos processos envolvendo a produção de etanol 2G.
ABSTRACT
Discovering novel enzymes sources for lignocellulose degradation and detoxification into fermentable sugars is considered one of the biggest bottlenecks towards the sustainable production of second-generation ethanol. In nature, termites are biological models for plant biomass conversion. Accordingly, the termite Coptotermes
gestroi degrades hardwoods to harness their nutrients, through a complex symbiosis
between the host termite and prokaryotic and eukaryotic symbionts. A deep insight into the unknown termite biology was obtained by applying "omics" technologies, especially with respect to holobiontic, biochemical and physiological aspects applied to its diet. Many hypotheses about a class of endogenous proteins – the so called pro-oxidant antioxidant and detoxifying enzymes (PADs) and auxiliary enzymes (AAs) – indicate that such enzymes may play a key role in the bioconversion of lignocellulose by termites. This work considers the presence of a redox lignocellulosic degradation and detoxification system supporting glicosil hydrolases. Enzymatic, electrochemical, microscopic and fermentative approaches were used in order to support this consideration. The host enzymes, endoglucanase (CgGH9-1), aldoketo reductase (CgAKR-1) and superoxide dismutase (CgSOD-1) were immunolocalizated in C. gestroi's digestive tract, confirming their presence in the insect digestomics. It was also found that supplementation with CgSOD-1, CgAKR-1, CgADH-1 (alcohol dehydrogenase) and CgLAC-1 (Laccase) enhanced saccharification of sugarcane bagasse performed by cellulosic cocktails. This synergism was based on reactive oxygen species generation. CgAKR-1 also showed to be a detoxifying agent against phenolic aldehydic inhibitors found in pretreated lignocelulose. A first putative animal LPMO from the family AA10 (CgAA10-2) was characterized and found capable of oxidizing cellulose. A glucose oxidase (CgGOX-1) was used in the development of a biobattery composed of sugars from sugarcane bagasse enzymatic hydrolysate. The catalase (CgCAT-1) showed high similarity with a catalase from R. flavipes. In general all identified enzymes could be related to the insect digestomics, reinforcing the role of termite endogenous redox enzymes on biomass degradation, xenobiotics detoxification and pro/anti-oxidant which contributes to understanding the termite biology. Finally, these enzymes present a great potential in biorefinaries, serving for multi-purpose applications and being considered as integrative enzymes by consolidating all processes in the production of second-generation ethanol.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figuras
Figura 1 - Parede celular vegetal e seus principias componentes. ... 24
Figura 2 - Processo de produção de etanol 2G. ... 25
Figura 3 - Parâmetros físico-químicos no intestino de cupins inferiores.. ... 32
Figura 4 - Mapa do vetor Pet28a ... 43
Figura 5 - representação da biopilha de glicose e CgGOX-1. ... 52
Figura 6 - Imunolocalização de CgGH9-1 no tecido intestinal de C. gestroi. .. 59
Figura 7 - Suplementação de extrato enzimático de P. echinolatum (0,4FPU/g BEX) com diferentes concentrações da proteína CgGH1-1. t. ... 60
Figura 8 - Eletroforese em gel de agarose 1 % do produto de PCR de colônia de ArcticExpress (DE3) para as construções do gene CgsymGH7-1 em pET28a. ... 61
Figura 9 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos correspondente à ORF (CgsymGH7-1) ... 62
Figura 11 - Imunolocalização de CgSOD-1 no tecido intestinal de C. gestroi. 63 Figura 12 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 1FPU por grama de BEX com a proteína CgSOD-1 (1,3mg/g BEX). ... 64
Figura 13 - Suplementação de extrato enzimático de P. echinolatum (0,4FPU/g BEX) com diferentes concentrações da proteína CgGH1-1. ... 65
Figura 14 - Inibição pelo furfural do crescimento de E. coli BL21 (DE3) (PeT28A) com o gene de CgAKR-1 ou o vetor vazio. ... 68
Figura 15 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão em Rosetta-gami 2 (DE3) e purificação de CgAA10-2. ... 69
Figura 16 - Domínio conservado identificado na sequência de nucleotídeos correspondente à ORF (CgAA10-2) ... 70
Figura 17 - Figura - Análise filogenética de CgAA10-2 de insetos. ... 71
Figura 19 - (A) Efeito do pH sobre a atividade de CgAA10-2. ... 73 Figura 20 - Análise de clivagem de BG por CgAA10-2 ... 74 Figura 21 - Análises de eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR TouchDown de CgALOX-1. ... 75 Figura 22 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos correspondente à ORF (CgALOX-1) ... 76 Figura 23 - Análise filogenética de AOX e XDHs. ... 77 Figura 24 - Análise de SDS-PAGE 12% da expressão do gene CgGOX-1 .... 78 Figura 25 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos correspondente à ORF (CgGOX.1) ... 79 Figura 26 - Análise filogenética de GMC oxidorredutases de insetos. ... 80 Figura 27 - Confecção da biopilha de glicose. ... 82 Figura 28 - Análise da produção de energia elétrica a partir da biopilha composta com o sistema (CgGOX-1+ glicose de BEX sacarificado + eletrodos de carbono). ... 83 Figura 29 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e purificação de CgADH-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). ... 85 Figura 30 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos correspondente à ORF (CgADH-1) ... 86 Figura 31 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 0,5 FPU/g PASB com CgLAC-1 (0,5 mg/g PASB). ... 87 Figura 32 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e purificação de CgCAT-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). ... 88 Figura 33 - Domínio conservado identificado na sequencia de nucleotídeos correspondente à ORF (CgCAT-1) ... 89 Figura 34 - Detecção da atividade de catalase através do ensaio com o reagente Amplex Red. ... 90 Figura 35 - Análise por SDS-PAGE 12% da expressão heteróloga e purificação de CgLAC-1 em sistema de expressão ArcticExpress (DE3). ... 91 Figura 36 - Domínio conservado identificado na sequência de nucleotídeos correspondente à ORF (CgALOX-1) ... 93
Figura 37 - A atividade CgLAC-1. ... 94 Figura 38 - Suplementação de ®Celluclast 1,5L (Novozymes) 0,5 FPU/g PASB com CgLAC-1 (0,5 mg/g PASB). ... 95 Figura 39 - Exemplificação do digestoma de cupins inferiores. ... 98 Figura 40 – Mecanismos propostos de atuação das enzimas auxiliares redox de C. gestroi aplicáveis em biorefinarias. ... 99
Tabelas
Tabela 1 – Primers utilizados para amplificação de genes ... 41 Tabela 2 - Composição dos bagaços de cana-de-açúcar ... 48 Tabela 3 Comparativo entre as enzimas identificadas no metatranscriptôma de C. gestroi. ... 55 Tabela 4 - Panorama dos resultados obtidos com as enzimas GHs, PADs e AAs de C. gestroi. ... 57
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
•OH – Radical hidroxila
AA – Enzima de atividade auxiliar aa. – Aminoácido
APTS – Ácido 8-aminopireno-1, 3,6-trisulfônico ATP – Adenina Trifosfato
BG – Beta Glucano
BIN – Bagaço de cana-de-açúcar In-natura C. GESTROI – Coptotermes gestroi.
CAZy – Banco de Dados de Enzimas Ativas em Carboidrato cDNA – Ácido Desoxiribonucléico Complementar
CGAKR-1– Aldoketo redutase de C. gestroi CGGH1-1– Beta glicosidase de C. gestroi CGGH9-1– Endoglucanase de C. gestroi CGLAC-1 – lacase de C. gestroi
CGSOD-1 – superóxido dismutase de C. gestroi CGADH-1– álcool desidrogenase de C. gestroi CGALOX-1– Aldeído oxidase de C. gestroi CGAA10-2 – AA10 de C. gestroi
CGGOX-1– Glicose oxidase de C. gestroi CGCAT-1 – Catalase de C. gestroi CIs – Compostos inibitórios
CTBE – Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido Desoxiribonucléico DNS – Ácido Dinitrosalicílico
ETECAP – Escola Técnica Estadual Conselheiro Antonio Prado EROs – Espécies Reativas do Oxigênio
GH – Família de Hidrolase Glicolítica H2O2 – Peróxido de Hidrogênio HMF – Hidroximetilfurfural HPF– sensor peroxinitrito
IMAC – Cromatografia de Afinidade com Metal Imobilizado IPTG – Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
kDa – Kilo Daltons LB – Meio Luria-Bertani
LC-MS/MS – Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas LGE-Laboratório de Genômica e Expressão
LNBio – Laboratório Nacional de Biociências Mix – CgGH9-1 + CgAKR-1+ NADPH
mV – milivolt
MW. – Peso Molecular
NADP+ – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada NADPH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NCBI – Centro Nacional de Informação Biotecnológica NM– nanômetro
PAD – Enzimas pró-oxidantes, antioxidantes e detoxificantes PASB – Bagaço de cana de açúcar tratado com ácido fosfórico PBS – Tampão fosfato-salina
PCR – Reação em cadeia da polimerase pH – Potencial Hidrogeniônico
PMSF – Fenilmetilsulfonilflúor RNA – Ácido ribonucléico
S. STIPISIS – Scheffersomyces stipisis; SCB – Bagaço de cana de açúcar; SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida e SDS Taq – DNA Polimerase de Alta Fidelidade
SUMÁRIO RESUMO ... 9 ABSTRACT ... 10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES ... 11 FIGURAS ... 11 TABELAS ... 13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 14
INTRODUÇÃO GERAL ... 21
CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 23
1.1. A biomassa lignocelulósica e o estado da arte das biorrefinarias ... 23
1.2. Enzimas e proteínas acessórias envolvidas na hidrólise de biomassa lignocelulósica para produção de bioetanol ... 27
1.3. Enzimas oxidativas para sacarificação biomassa lignicelulósica .... 29
1.4. Enzimas Pró-oxidantes Antioxidantes e Detoxificantes (PADs): Um novo conceito no tratamento da lignocelulose ... 30
1.5. A biologia do cupim aplicada a biorrefinaria ... 31
1.6. Enzimas PADs e AAs encontradas em C. gestroi ... 32
1.6.1. Aldoketo redutase (AKR) ... 33
1.6.2. Superóxido dismutase (SOD) ... 34
1.6.3. Lacases (LAC) ... 34
1.6.4. Monooxigenases líticas de polissacarídeos da família 10 ... 35
1.6.5. Glicose desidrogenase (GOXs) ... 35
1.6.6. Aldeído oxidase (AOX) ... 35
1.6.7. Álcool desidrogenase (ADHs) ... 36
CAPÍTULO 2 – OBJETIVOS ... 37
2.1. Objetivos Gerais ... 37
2.2. Objetivos Específicos ... 37
CAPÍTULO 3 – CLONAGEM, OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE ENZIMAS DE COPTOTERMES GESTROI ... 37
3.1. Introdução ... 37
3.2. Objetivos do capítulo ... Erro! Indicador não definido. 3.3. Materiais e métodos ... 39
3.3.1. O cupim ... 39
3.3.2. Identificação de genes alvos através de análise da expressão diferencial gênica e proteica ... 39
3.3.3. Seleção dos genes ... 40
3.3.4. Desenho de oligonucleotídeos para amplificação de sequências alvos... ... 41
3.3.5. Amplificação dos genes ... 41
3.3.6. Purificação e digestão dos genes amplificados ... 42
3.3.7. Quantificação de DNA ... 42
3.3.8. Preparação do vetor pET28a e ligação do gene ... 43
3.3.9. Clonagem em Escherichia coli ... 44
3.3.10. Seleção das colônias transformantes por CS-PCR (Colony Screening by PCR) ... 44
3.3.11. Extração do DNA plasmidial ... 44
3.3.12. Cultivo dos transformantes e expressão das proteínas ... 45
3.3.13. Lise celular para obtenção das proteínas recombinantes ... 46
3.3.14. Purificação das enzimas em colunas cromatográficas ... 46 3.3.15. Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições
desnaturantes (SDS-PAGE) ... 47
3.3.16. Dosagem de proteínas ... 47
3.3.17. Biomassas vegetais hidrolisadas ... 47
3.3.18. Estudo de suplementação de coquetéis celulósicos comerciais e extratos fúngicos... 48
3.3.19. Determinação de açúcares ... 49
3.3.20. Avaliação da oxidação de carboidratos pelas enzimas ... 50
3.3.21. Análises filogenéticas ... 50
3.3.22. Caracterização de CgGOX-1 ... 51
3.3.22.1. Atividade de glicose oxidase de CgGOX-1 ... 51
3.3.22.2. Confecção de uma biopilha de CgGOX- ... 51
3.3.23. Caracterização de AA10-2 ... 52
3.3.23.1. Atividade de LPMO ... 52
3.3.23.2. Predição de estrutura tridimensional ... 53
3.3.24. Atividade de CgLAC-1 ... 54
3.3.25. Atividade de CgCAT-1 ... 54
3.4. Resultados e Discussão ... 55
3.4.1. Investigação e seleção de enzimas de C. gestroi com potencial biotecnológico ... 55
3.4.2. Clonagem, obtenção e caracterização de enzimas de C. gestroi 58 3.4.3. Glicosil hidrolases: CgGH1-1; CgGH9-1 e CgsymGH7-1 ... 58
3.4.3.1. Imunolocalização de CgGH9-1 ... 58
3.4.3.2. Suplementação enzimática com CgGH1-1 ... 59
3.4.3.3. Exoglucanase (CgsymGH7-1) ... 61
3.4.4. CgSOD-1 – Superóxido Dismutase ... 62
3.4.4.2. Suplementação de coquetéis enzimáticos com CgSOD-1 ... 63
3.4.5.CgAKR-1 - Aldoketo Redutase ... 66
3.4.5.1. .... A expressão de CgAKR-1 em E. coli BL21 (DE3) promove maior tolerância ao furfural ... 66
3.4.6. CgAA10-2 - (LPMO - AA10) ... 69
3.4.6.1.Análises bioinformáticas de CgAA10-2 ... 70
3.4.6.2.Caracterização bioquímica de CgAA10-2 ... 73
3.4.7. CgALOX-1 - Aldeído Oxidase (AA5) - Xantina Oxidase ... 75
3.4.8. CgGOX.1- Glicose Desidrogenase/Oxidase (AA3) ... 78
3.4.8.1.Análises bioinformáticas e bioquímicas de CgGOX.1... 79
3.4.8.2.Desenvolvimento de uma biopilha a partir de CgGOX-1 e glicose de bagaço de cana de açúcar ... 81
3.4.9. CgADH-1 - Álcool desidrogenase ... 84
3.4.10.CgCAT-1 – Catalase ... 88
3.4.10.1.Caracterização Bioquímica de CgCAT-1 ... 90
3.4.11. CgLAC-1 – Lacase ... 91
3.4.11.1.Caracterização bioquímica de CgLAC-1 ... 93
3.4.11.2.Suplementação de ®Celluclast 1,5L com CgLAC-1 ... 94
3.5. Discussão Geral ... 96
CAPÍTULO 4 – ARTIGO EM PREPARAÇÃO ... 100
CONCLUSÕES GERAIS ... 149
ANEXOS ... 150
1 - CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA CBIO ... 155
2 - PUBLICAÇÕES... 150
INTRODUÇÃO GERAL
A lignocelulose é a biomassa mais abundante no planeta, atuando como uma matriz de função estrutural na parede celular de plantas, considerada uma fonte de matérias primas renováveis, ilimitadas e biodegradáveis [1]. A lignocelulose pode ser convertida em biocombustíveis, produzidos por uma unidade industrial que integra equipamentos e processos de conversão de biomassa, denominada de biorrefinaria, segundo o National Renewable Energy Laboratory (USA) [1].
O etanol celulósico ou etanol de segunda geração (2G) é o principal candidato para combustível líquido a ser produzido por uma biorrefinaria lignocelulolítica, pois atualmente este é o biocombustível mais comercializado no mercado nacional e internacional [2]. Atualmente, são necessários grandes avanços para que os processos de produção de etanol 2G se tornem economicamente viáveis nas biorrefinarias. Entre eles, a utilização de ferramentas enzimáticas é uma das vias mais promissoras nos setores de biorrefinaria para a produção de etanol 2G [1,3]. Os setores privados, universidades e laboratórios do governo fazem uso da pesquisa e desenvolvimento para a descoberta de enzimas e a formulação de coquetéis enzimáticos mais eficientes e mais específicos para degradação de lignocelulose, como por exemplo a da cana de açúcar, reduzindo os custos da conversão desta biomassa em monossacarídeos [4].
Em relação à bioprospecção de enzimas que atuam na lignocelulose e suas fontes naturais, os cupins são tidos como um modelo de reator biológico para desconstrução da biomassa vegetal. Os cupins alimentam-se de uma dieta rica em material lignocelulósico, onde o processo de degradação deste material é altamente eficiente, embora permanece ainda pouco elucidado. Neste contexto, estudos de genômica e proteômica foram efetuados pelo nosso grupo de pesquisa e revelaram a presença de enzimas auxiliares (AA) e enzimas pró-oxidantes antioxidantes e detoxificantes (PADs) em cupins da espécie Coptotermes gestroi, e a relação destas com sua dieta [5].
Como não há evidencias da ação destas enzimas em conjunto com holocelulases clássicas, este trabalho de mestrado foi desenvolvido para compreender melhor estas enzimas e suas possíveis aplicações em química verde. Neste contexto, o trabalho desenvolvido encontra-se dividido em capítulos, visando dar maior ênfase aos objetivos de cada etapa.
Abaixo encontra-se uma breve descrição sobre os capítulos propostos e resultados obtidos:
Capítulo 1 - Revisão bibliográfica apresentando as informações que contextualizam o leitor sobre biorrefinarias, sacarificação e detoxificação de biomassa através de enzimas, a biologia do cupim C.
gestroi, bem como as recentes descobertas que motivaram a
realização deste estudo e que justificam os esforços neste trabalho;
Capítulo 2 - Objetivos que motivaram cada etapa do trabalho;
Capítulo 3 – Clonagem, obtenção, caracterização parcial e aplicação biotecnológica das Glicosil Hidrolases, AAs e PADs de C. gestroi.
Capítulo 4 - Trabalho submetido para publicação mais anexos: The Coptotermes gestroi Aldoketo reductase: A multi-purpose enzyme on Biorefinery applications
CAPÍTULO 1 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. A biomassa lignocelulósica e o estado da arte das biorrefinarias
Atualmente as principais fontes de energia e matéria prima para síntese de compostos químicos e combustíveis são derivadas do petróleo [6]. A queima dos combustíveis fósseis libera gás carbônico na atmosfera, e por se tratarem de uma fonte não renovável, acabam afetando o meio ambiente, principalmente através do efeito estufa, causando indiretamente também problemas econômicos e sociais [6]. O esgotamento destes recursos não renováveis, e os demais danos causados pela indústria petroquímica tem despertado a atenção mundial na busca de fontes de energia renováveis para atender as necessidades da matriz energética e de novos materiais para as gerações presentes e futuras [1]. Atualmente, a ênfase no uso de biocombustíveis é uma promissora estratégia para a redução da poluição, e desta forma, atender as demandas do protocolo de Kyoto [6].
As plantas são organismos heterotróficos que captam os fótons originários da luz solar, dióxido carbono e água convertendo-os em energia armazenada em forma de biomassa vegetal formada principalmente por lignocelulose [3]. A lignocelulose por sua vez atua como uma matriz de função estrutural na parede celular de plantas. Ela é constituída por polissacarídeos como a celulose, hemicelulose e pectina, além de polímeros fenólicos denominados de lignina (Figura 1) [7]. A forma de organização da celulose é feita através de microfibrilas constituídas por monômeros de glicose unidos por meio de ligações β-1,4 que estão envolvidas em uma matriz lignossacarídica formando uma estrutura rígida. A hemicelulose é o segundo polissacarídeo mais abundante na parede celular das plantas, sendo mais heterogênea que a celulose. Os dois principais constituintes deste grupo são o xilano, sendo a maioria da hemicelulose de gramíneas e formado principalmente por monômeros de xilose unidos por ligações β-1,4 na cadeia principal, e a galacto (gluco) manana que é a hemicelulose mais presente em plantas lenhosas. A pectina é o terceiro grupo predominante da parede celular de plantas, formado de cadeias
principais de resíduos de ácido galacturônico com ligações do tipo α-1, 4 e cadeias laterais com diversos resíduos de monossacarídeos e outros componentes [8].
Figura 1 - Parede celular vegetal e seus principais componentes. Adaptado de
Rubin (2008)[7].
Através de enzimas hidrolíticas e oxidativas, estes polissacarídeos podem ser desconstruídos em açúcares monoméricos [3].Todos estes monossacarídeos podem ser utilizados como matérias primas fundamentais para a obtenção de uma imensa gama de produtos, que abrange desde biocombustíveis até polímeros, sendo o etanol lignocelulósico uma das moléculas de maior interesse atualmente. Desta forma, o conceito de biorrefinaria lignocelulósica enquadra-se nessa tecnologia, visando o aproveitamento integral dos resíduos agroindustriais gerados em uma determinada cadeia produtiva, de modo a agregar valor à mesma [9,10].
O Brasil possui um amplo conhecimento técnico e institucional para a produção de etanol a partir da cana de açúcar há mais de 30 anos [9,10]. E tem sido um exemplo dos requisitos para o desenvolvimento sustentável de produção de etanol lignocelulósico [9,10]. De acordo com o US Energy Information Administration, (2016) o Brasil e os EUA são os dois maiores produtores e exportadores de etanol do mundo, com o etanol sendo produzido a partir de matérias-primas de milho nos EUA e de cana de açúcar no Brasil. Em ambos os processos, a lignocelulose gerada como um resíduo na forma de bagaço de cana de açúcar ou palha de milho pode ainda ser convertida em etanol em um processo denominado de segunda geração (2G). A Figura 2 demonstra um esquema de biorrefinaria de etanol 2G utilizando hexoses e pentoses derivadas da lignocelulose de cana de açúcar para a produção de etanol.
Figura 2 – Esquema de processo de produção de etanol 2G a partir de bagaço de cana de açúcar (SCB) . 1 (Moagem): O SCB é recolhido, transportado e moído; 2 (Pré-tratamento): O SCB é livre de impurezas e passa por um pré-tratamento
físico-químico para remover a lignina e separar a celulose em fração sólida da fração hemicelulósica líquida, diminuindo a recalcitrância deste material; 3 (Sacarificação): Os materiais pré-tratados são enzimáticamente hidrolisados através de coquetéis lignocelulolíticos; 4 (Fermentação): Os açúcares liberados durante a etapa de sacarificação são fermentados a etanol por leveduras fermentadoras de C5 e C6 juntamente com o açúcar gerado por tecnologias 1G; 5 (Destilação): O produto fermentado é destilado e o etanol é recuperado. Fonte: Baseado em infográfico da empresa Raízen (Acesso 26/04/2016 – direito de imagem cedido).
A complexidade químico-estrutural da lignocelulose está relacionada com as diversas funções biológicas desta (suporte mecânico, proteção contra patógenos e regulação da homeostase vegetal), porém, dificulta o processamento deste material. Assim, a complexidade das ligações químicas, a recalcitrância das fibras de holocelulose e a presença de compostos inibidores resultantes do processamento deste material são os principais problemas enfrentados na sacarificação e fermentação da biomassa vegetal [11,12].
A fim de reduzir estes problemas, diferentes processos de pré-tratamento são utilizados para aumentar a degradação enzimática da lignocelulose, alterando a estrutura destas biomassas e por consequência separando-as em frações sólidas e liquidas [13–15].
Componentes aromáticos derivados da degradação da lignina e de açúcares, bem como metabólitos secundários de plantas, são encontrados na biomassa
in-natura e em quantidades elevadas nas biomassas pré-tratadas (ex: pré-tratamento
hidrotérmico) [16]. Estes componentes inibidores (CIs) são capazes de inibir a atividade de enzimas lignocelulolíticas e prejudicam a fermentação alcoólica de leveduras [11]. Estes químicos incluem derivados de açucares (furfural e hidroximetilfurfural) e compostos aromáticos derivados da lignina (aldeído benzóico, seringaldeído).
A presença de 20 mmol/L de furfural, por exemplo, pode inibir totalmente o crescimento de muitas cepas de leveduras fermentadoras [11]. Dentre alguns dos mecanismos que inibem o crescimento celular e a fermentação alcoólica, o furfural causa danos na parede e membrana celular, inibe a atividade de diversas enzimas, causa danos ao DNA, RNA e síntese de proteínas, além de promover uma produção acentuada de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) intracelularmente [11]. Desta forma, os CIs encontrados nas frações hemicelulolíticas da biomassa pré-tratada (ex: fração solúvel após o pré-tratamento térmico do bagaço de cana de açúcar, também designado por Licor C5) dificultam o processo fermentativo deste material rico em açucares fermentecisveis [11,17].
De uma forma global, para tornar o processo de produção de etanol lignocelulósico viável, é necessário resolver alguns problemas de processo: 1) A
disponibilidade de biomassas hidrolisáveis como matérias-primas; 2) Desenvolvimento de novas técnicas viáveis para degradar a lignocelulose (ex: pré-tratamento físico-químico); 3) Seleção de enzimas eficientes e de baixo custo e de produção em escala industrial para sacarificar os polissacarídeos em açucares fermentescíveis; 4) Desenvolvimento de processos detoxificantes de biomassa lignocelulósica contendo inibidores da hidrílise e fermentação; 5) Seleção e desenvolvimento de leveduras fermentadoras de pentoses e resistentes a inibidores da fermentação [2,11].
1.2. Enzimas e proteínas acessórias envolvidas na hidrólise de biomassa
lignocelulósica para produção de bioetanol
As proteínas ativas em carboidratos caracterizam-se principalmente pela sua capacidade de transformar, desestabilizar e/ou reorganizar essas classes de macromoléculas [18]. Entre essas proteínas destacam-se as glicosil hidrolases (GHs) (EC 3.2.1.), que são um amplo grupo de enzimas que hidrolisam as ligações glicosídicas entre dois ou mais carboidratos ou entre um carboidrato e outra molécula. As GHs podem ser de origem vegetal, microbiana ou animal, e são responsáveis pela hidrólise de polissacarídeos contidos nas paredes celulares dos vegetais, tais como celulose, hemiceluloses e pectinas. Essas enzimas são comumente conhecidas por celulases, xilanases, pectinases dentre outras [18]. Além das GHs, outras proteínas chamadas de acessórias atuam em carboidratos, tais como as glicosil transferases, expansinas (Swollenin), módulos de ligação a carboidratos (CBM - Carbohydrate Binding Module), polissacarídeos liases (PL), carboidrato esterases (CE) e as enzimas de atividades auxiliar (AA), de acordo com o sistema de classificação desenvolvido por Henrissat e colaboradores denominado de Carbohydrate Active enzymes database (CAZy) [19,20].
Devido à complexidade da parede celular vegetal, interações sinérgicas entre uma grande quantidade de enzimas se fazem necessárias para que possa ocorrer uma eficiente quebra de todos os polissacarídeos presentes na parede celular vegetal [21]. A celulose cristalina, o principal constituinte da biomassa, necessita
para sua completa degradação, enzimas essenciais como as endoglucanases, que são capazes de degradar a molécula de celulose de forma aleatória; as monooxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) que são capazes de oxidar moléculas de celulose e xilano e atuam principalmente na porção cristalina destes polímeros; as celobiohidrolases (CBH) que degradam a celulose em celobiose a partir de suas extremidades redutoras; e as β-glicosidases (BG) que são capazes de degradar celobiose em glicose livre. Já para a despolimerização da hemicelulose, um conjunto maior de enzimas é necessário, incluindo endoxilanases (EX), β-xilosidases (BX), arabinofuranosidases, β-glucuronidases, esterases, entre várias outras dependendo da composição desse polissacarídeo [18].
Neste contexto, o estudo de enzimas hidrolíticas e oxidativas são peças chave na produção de etanol celulósico. Atualmente a bioprospecção de novas enzimas através de sistemas clássicos como ferramentas ômicas, expressão heteróloga, engenharia de proteínas e o desenvolvimento racional de misturas enzimáticas, estão sendo realizados para esta finalidade [22–24]. Sabe-se hoje que as misturas enzimáticas devem ser racionalizadas e adaptadas de acordo com a biomassa lignocelulósica específica e os tipos de pré-tratamentos empregados nesta [25].
Na evolução dos coquetéis celulolíticos de enzimas da empresa Novozymes (Celluclast; CTec 1; CTec 2, CTec 3 e HTec3), foi verificado que algumas enzimas foram adicionadas ao longo dos anos. Alguns exemplos de enzimas observadas são as monooxigenases líticas de polissacarídeos dependentes de cobre (AA9), β-glucosidases modificadas por engenharia de proteínas e hemicelulases como componentes destes coquetéis [25,26]. É importe ressaltar também que não foi criado nenhum coquetel enzimático formulado especialmente para o bagaço da cana de açúcar, pois a maioria destes coquetéis comerciais foi formulado para hidrólise de resíduos lignocelulósicos de milho [25]. Portanto, é possível desenvolver o estudo da suplementação enzimática destes coquetéis visando seu maior rendimento, em especial focado no cenário nacional para a hidrólise de bagaço de cana de açúcar.
1.3. Enzimas oxidativas para sacarificação biomassa lignicelulósica
A literatura originalmente propõe dois tipos de sistemas de degradação da parede celular vegetal: o sistema hidrolítico já mencionado acima, e o sistema oxidativo, responsável pela despolimerização da lignina e diminuição da recalcitrância da holocelulose [3].
Recentemente, a descoberta de que monooxigenases (LPMOs) são fundamentais para a degradação de carboidratos, revolucionou as pesquisas na área de química verde [27,28]. Este sistema oxidativo apresenta enzimas não clássicas para degradação da lignocelulosese, que atuam por oxidação de forma direta e indireta tanto nas fibras lignocelulósicas, como nas ligações carboidrato-carboidrato, carboidrato-lignina, lignina-lignina ou de forma aleatória [29–32].
As LPMOs e outras enzimas oxidativas ativas em carboidratos são classificadas pelo banco de dados CAZy em uma categoria adequada denominada “Auxiliary Activities” (AAs) [27]. São exemplos de AAs as lacases, manganês peroxidases, celobiose desidrogenase e LPMOs da família 9 (GH61), 10 (CBM33), 11 e 13. Todas estas proteínas atuam oxidativamente na desconstrução da biomassa [27,33].
Muitas outras oxidases que atuam em lignocelulose foram identificadas, embora predominantemente em fungos [27]. Durante o ataque microbiano, estas oxidases promovem um clivagem mais eficiente componentes da parede celular das plantas, produzindo ou consumindo EROs (por exemplo, peróxido de hidrogênio - H2O2) [34]. Os fungos dos gêneros Postia sp., Phanerochaete sp., Wolfiporia sp. e
Perenniporia sp. utilizam os chamados componentes de fenton para complementar o
seu repertório enzimático, alcançando uma melhor eficiência na desconstrução da parede celular vegetal [35]. A reação de Fenton (Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH· + OH−) é uma potente reação de oxidação de compostos orgânicos na presença de H2O2 que são capazes atuar diretamente na quebra das ligações químicas e/ou oxidação dos carbonos em diversos tipos de biomoléculas.[36].
Para isto, enzimas redutoras de oxigênio (O2), tais como da família GMC oxiredutase, oxidases de álcool e açúcares e oxidases dependentes de cobre são
utilizadas por estes fungos, tanto intra quanto extracelularmente para iniciar a reação de Fenton [27,33].
1.4. Enzimas Pró-oxidantes Antioxidantes e Detoxificantes (PADs): Um novo
conceito no tratamento da lignocelulose
Recentemente, Liu et al. (2016) [11] destacou a importância para o desenvolvimento de um método de detoxificação viável, in-situ e simples, a fim de se produzir etanol 2G de baixo custo, visto que nenhum processo de detoxificação biológico além de lacases tem sido estudado para esta abordagem [11].
Neste sentido, as enzimas descritas como PADs são uma classe de proteínas que promovem a degradação e/ou eliminação de toxinas endógenas e exógenas, bem como a geração ou degradação de espécies reativas de oxigênio (EROs) [38]. As superóxido dismutases, peroxidases, catalases, p450, Aldoketo redutases, aldeído desidrogenases são exemplos de PADs [39]. A maioria destas PADs são expressas em resposta à estimulação de xenobióticos, bem como ao stress oxidativo [38,40], onde o banco de dados DetoxiProt agrupa grande parte destas proteínas [39].
As enzimas PADs são fortes candidatas para reduzir a ação negativa dos CIs, uma vez que muitas PADs são capazes de convertê-los nos seus metabólitos menos reativos e menos tóxicos, bem como participar da geração de EROs que atuam na diminuição da recalcitrância da lignocelulose por degradação oxidativa destas biomassas [11,41]. O estudo das vias metabólicas e a expressão diferencial frente ao estresse causado pelos CIs poderiam ser utilizados como fonte de descobertas de novas PADs, visando o melhor aproveitamento da lignocelulose [42]. O National
Center for Agricultural Utilization Research (EUA) tem obtido bons resultados com
microrganismos fermentadores (bactérias e leveduras) identificando, caracterizando e expressando enzimas PADs como as álcool desidrogenases, metilglioxal redutases e outras PADs de origem microbiana [43–46]. Além disso, proteínas como
as aldoketo redutases, por exemplo, encontram-se mais expressas em resposta aos CIs em leveduras e bactérias fermentadoras, bem como em insetos degradadores da madeira [39,44,47]. Portanto as PADs são muito promissoras para a criação de coquetéis enzimáticos detoxificantes.
1.5. A biologia do cupim aplicada a biorrefinaria
A espécie em estudo, C. gestroi, pertence à família Rhinotermitidae e é um cupim xilófago, ou seja, se nutre principalmente de madeira. Por ser uma espécie exótica, logo encontrou nichos disponíveis e começou a se expandir pelo território nacional, causando sérios problemas e ganhando o status de praga urbana, gerando um prejuízo multimilionário [48]. A habilidade desses insetos em digerir materiais lignocelulósicos pode ser comparada a uma “micro biorrefinaria” de origem natural [49]. Este processo inicia-se por uma eficiente quebra física da parede celular vegetal executada pelas suas mandíbulas, facilitando a passagem do material pelo seu minúsculo trato digestivo, aumentando a área da superfície para a ação das enzimas que irão atuar na biomassa (Figura 3). À medida que esse material é triturado, dois sistemas enzimáticos irão agir, um caracterizado como o arsenal de enzimas endógenas e outro de enzimas simbiônticas [50] (Figura 3). O trato digestivo dos cupins possui microambientes com grande fluxo de matéria orgânica, enzimas, variações de regiões anaeróbicas (no centro do tubo digestivo) e de regiões microóxicas (regiões epiteliais do tubo digestivo), variações de pH (pH > 12 no início do intestino médio - midgut - com pH neutro ou levemente ácido - pH 6.5 na câmera fermentativa - hindgut) além de zonas com potencial redox alto [51]. Todos estes fatores geram um ambiente propício a uma eficiente degradação da biomassa vegetal. Uma vez mimetizado, esse microambiente poderá ser agregado a processos biotecnológicos de grande importância, tal como a produção de bioprodutos lignocelulósicos [51].
Figura 3 - Parâmetros físico-químicos no intestino de cupins inferiores.
Medidas de pH, pressão parcial – P (kPa) de O2. Adaptado de Brune 2014 [51].
Entretanto a eficiência na degradação da lignocelulose pelos cupins não está totalmente esclarecida. Portanto, os estudos em larga escala dos genes, proteínas e componentes relacionados com a dieta do cupim são denominados de “Digestômica” e estão sendo realizados a fim de se obter maior conhecimento da biologia deste inseto [52].
1.6. Enzimas PADs e AAs encontradas em C. gestroi
O processo de como os cupins degradam a lignina e os polissacarídeos, tolerando seus subprodutos tóxicos, permanece pouco conhecido. Através do metatranscriptoma do cupim Reticulitermes flavipes e seus simbiontes, foram identificados muitos genes envolvidos no uso da biomassa [39,53,54]. Os dados demonstraram a superexpressão de enzimas PAD, tais como catalases, lacases e
aldoketo redutases em cupins submetidos à dieta uma dieta rica em lignina [39]. Além disso, a clonagem e expressão de uma catalase e uma aldoketo redutase neste mesmo estudo evidenciaram que as mesmas atuaram em sinergia com celulases e lacases endógenas para a degradação de lignocelulose [39]. Porém nenhum mecanismo foi proposto para tal fenômeno, ficando evidente a necessidade de mais estudos para entender o papel dessas enzimas redox na conversão da biomassa por cupins.
Dentro desse contexto, em 2006 foi iniciado o projeto do sequenciamento do genoma de C. gestroi (lge.ibi.unicamp.br/cupim/). Em sequência, Leonardo e
colaboradores (2010) descreveram o metatranscriptoma para operários e soldados de C. gestroi, onde a análise de unigenes revelou que cerca de 600 deles estão relacionados a proteínas ativas em carboidratos entre hidrolases glicosídicas e proteínas acessórias [48].
Recentemente, outras análises dos genes de C. gestroi foram feitas por Do et.
al. (2014) e análises bioquímicas e metaproteômica foram efetuadas por nosso
grupo de pesquisa [5,54].Foram identificados no cupim C. gestroi, a presença de vários genes que codificam CAZys e PADs que poderiam contribuir para a degradação da lignocelulose com potencial aplicação biotecnológica [5]. As sequências em estudo serão descritas em detalhes no item abaixo.
1.6.1. Aldoketo redutase (AKR)
AKRs pertencem à superfamília de enzimas que desempenha a oxirredução de uma ampla variedade de compostos [56]. A nomenclatura sistemática para a superfamília AKR foi adotada e encontra-se em bancos de dados específico (ver: www.med.upenn.edu/akr) [56]. Em vias gerais estas enzimas reduzem grupamentos aldeídos ou cetônicos a álcoois utilizando NAD[P]H como cofator [56].
AKRs estão envolvidas em múltiplas reações em vários organismos, desde o metabolismo de carboidratos à desintoxicação de xenobióticos, além de possuírem amplas aplicações industriais e clínicas [57,58]. AKRs são comprovadamente capazes de degradar carboidratos, e assim como as aryl-álcool desidrogenases,
auxiliam na degradação da lignina [59].
Sendo assim, esta classe de enzimas torna-se um forte ponto de partida para novos estudos aplicados a biorrefinarias de etanol 2G, pois estas PADs apresentam a capacidade de reduzir os aldeídos fenólicos inibidores da fermentação, tais como o furfural, aos seus respectivos álcoois menos tóxicos e menos reativos, para leveduras fermentadoras e aos coquetéis celulolíticos [60,61].
1.6.2. Superóxido dismutase (SOD)
As SODs são enzimas que catalisam a dismutação do ânion superóxido (O2 •) em peróxido de hidrogênio e oxigênio. SOD é ubíqua para todas as formas de vida, possuindo quatro tipos diferentes de centros metálicos, dividindo estas famílias em SODs contendo Cu/Zn, Ni, Mn e Fe [62]. O sítio catalítico de cobre das SODs assemelham-se às enzimas classificadas como CBM33 (AA10) que são enzimas capazes de oxidar a celulose [63]. Também foi reportado que SOD é uma enzima geradora de radical hidroxila na presença de altas concentrações de peróxido de hidrogênio, e tem ação efetiva na transformação da lignina [64].
1.6.3. Lacases (LAC)
Lacases (EC1.10.3.2) são uma família de oxidases “azuis” dependentes de cobre pertencentes à família AA1 do CAZy; são capazes de oxidar uma grande variedade de compostos fenólicos e aromáticos, com concomitante redução do oxigênio molecular em água [53]. Recentemente, sequências endógenas de lacases foram encontradas em insetos degradadores da madeira [53]. Além disso, o tratamento enzimático com lacases tem sido sugerido como uma abordagem promissora na detoxificação e sacarificação de biomassa lignocelulósica [53].
1.6.4. Monooxigenases líticas de polissacarídeos da família 10 (AA10)
Esse domínio proteico codifica enzimas chamadas de LPMOs da família de atividade auxiliar 10 (AA10 - antiga CBM33) [65]. Estas enzimas atuam principalmente na porção cristalina de celulose, onde, após a redução de seu sítio catalítico contendo cobre, este acaba por oxidar os carbonos 1 ou 4 das moléculas de glicose neste polímero [35,65]. O ácido aldónico resultante na molécula de celulose, leva a uma desestabilização da ligação glicosídica, favorecendo a ação de celulases clássicas [35,65]. Portanto, LPMOs são o novo paradigma para a desconstrução da biomassa lignocelulósica, pois estas enzimas oxidativas suplementam coquetéis celulásicos, levando a diminuição da carga enzimática utilizada, consequentemente, reduzindo os custos da etapa de hidrólise na cadeia de produção de etanol de segunda geração [3,65].
1.6.5. Glicose desidrogenase (GOXs)
As GOXs (CE 1.1.1.47) pertencem a uma classe de enzimas que catalisam a reação química da glicose + NADP+ em D-glucono-1,5-lactona + NADPH, atuando no grupo CH-OH desta molécula [66]. Além disso, estas enzimas foram classificadas no banco de dados do CAZy como pertencentes da família AA3. GOX possuem diversas aplicações biotecnológicas, que vão desde o desenvolvimento de sensores colorimétricos, biossensores eletroquímicos, desenvolvimento de biopilhas e a remoção de O2 nos alimentos [67].
1.6.6. Aldeído oxidase (AOX)
As superfamílias de enzimas aldeído oxidase/desidrogenase (AOX-XDH) catalisam a oxidação irreversível dependente de NAD(P)+ de um amplo espectro de aldeídos endógenos e exógenos aos seus respectivos ácidos carboxílicos [68]. Estas enzimas contêm três domínios: O domínio ligante de NADP+; o domínio catalítico e um domínio ligante. A parte superior de sua estrutura é composta de resíduos de todos os três domínios e confere a especificidade aos seus substratos aldeídicos [68].
AOX e XDHs são enzimas detoxificantes do tipo não citocromo P450 (CYP450). Estas enzimas são importantes agentes antioxidantes, atuando na regeneração de NADPH e a eliminação de radicais hidroxilas através de seus grupamentos cisteína e a metionina [68]. Embora em humanos AOX1 seja mais conhecida como uma enzima de metabolização de drogas e xenobióticos, as AOX correspondentes de insetos também foram encontradas na degradação de compostos odorantes aldeídicos, como feromônios e compostos voláteis de plantas - alguns destes também reportados como CIs [69,70].
1.6.7. Álcool desidrogenase (ADHs)
ADHs (EC 1.1.1.1) fazem parte de um grupo de enzimas desidrogenases que ocorrem em muitos organismos e facilitam a interconversão entre álcoois e aldeídos ou cetonas com a redução/oxidação de NAD+ e NADH [45]. As ADHs de
Scheffersomyces stipiti, por exemplo, estão envolvidas na redução de furfural e HMF
e na produção de etanol durante a fermentação de hidrolisados lignocelulósicos [45]. Contudo, as funções de muitas ADHs de cupins ainda permanecem desconhecidas.
1.6.8. Catalases (CATs)
Embora os EROs desempenhem papéis importantes na biologia de organismos degradadores da lignocelulose, sua acumulação provoca danos oxidativos nas macromoléculas do próprio organismo. As catalases constituem o sistema de defesa principal contra o peróxido de hidrogênio, um dos mais frequentes EROs presentes durante a degradação de lignocelulose [71].
As catalases são metaloenzimas que decompõe o H2O2 em água e oxigênio molecular. Algumas catalases são superexpressas em fungos filamentosos, bem com em insetos degradadores da madeira como uma forma de proteção contra EROS do próprio organismo durante a degradação oxidativa da lignocelulose [53,71].
CAPÍTULO 2 – OBJETIVOS
1.1. Objetivos Gerais
Nossa hipótese de trabalho versa sobre o cupim C. gestroi quanto à presença de um sistema oxidativo de degradação de biomassa lignocelulósica que complementa as hidrolases glicolíticas. Neste sentido, nossos objetivos contemplam desenvolver um estudo sistemático da degradação do bagaço de cana de açúcar, utilizando enzimas hidrolíticas clássicas e as enzimas oxidativas provenientes do cupim C. gestroi. Objetivando compreender a ação e a sinergia destas enzimas, além de descobrir novas aplicações biotecnológicas para proteínas.
1.2. Objetivos Específicos e plano de trabalho
1. Clonar e expressar em sistema heterólogo genes alvos de C. gestroi; 2. Produzir, purificar e caracterizar as enzimas recombinantes;
3. Entender a sinergia de enzimas PADs e AAs atuando em conjunto com glicosil hidrolases para a desconstrução da parede celular vegetal;
4. Investigar a aplicação biotecnológica das enzimas destacadas.
CAPÍTULO 3 – CLONAGEM, OBTENÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E APLICAÇÃO DE ENZIMAS DE COPTOTERMES GESTROI
1.3. Introdução
enzimas provenientes da digestômica de mais de 13 espécies cupins. Dentre as espécies mais estudadas, os cupins: Reticulitermes speratus (24%), Coptotermes
formosanus (17%), R. flavipes (15%) e Nasutitermes costalis (11%) foram
analisados [72]. Sendo então, 60% de enzimas recombinantes de origem bacteriana, 29% são provenientes do cupim e 11% de Protistas [72].
Portanto, a digestômica, principalmente do hospedeiro C. gestroi, é uma fonte de enzimas pouco explorada, visto que esta espécie é a maior praga urbana encontrada no Brasil [73]. Sabe-se hoje que C. gestroi faz uso de enzimas como GH1 (BG1Cg), GH3, GH5, GH7, GH9 (EG1Cg) e GH16 na conversão celulose; GH 2, 10, 11, 26, 27, 38 e 43 para a hidrólise de hemicelulose; E as GH 28, 29 e 42 atuam na degradação de pectinas [74].
A triagem funcional da biblioteca metagenômica construída a partir de dados de genômica, transcriptômica e proteômica do cupim C. gestroi resultou na identificação de novas enzimas que poderiam auxiliar o cupim na degradação da lignocelulose. Em sequencia, as ORFs selecionadas para este trabalho foram amplificadas a partir do cDNA de C. gestroi, e então clonadas e expressas em sistema procariótico.
Portanto, este capítulo traz uma nova perspectiva na área, pois, atualmente fenoloxidases, esterases, demais AAs e PADs, são menos de 5% do total das enzimas investigados em todas as espécies de cupins [72]. O papel destas enzimas é desconhecido na biologia do inseto, bem como, poucos são os estudos empregando tais proteínas em aplicações biotecnológicas. Deste modo, após a identificação, a expressão heteróloga em sistema procariótico e a purificação das enzimas PAD, AAs e GHs de C. gestroi, foi possível realizar estudos de caracterização funcional de algumas destas enzimas com os componentes da lignocelulose e demais aplicações em química verde. Em súmula, este capítulo traz alguns indícios de que enzimas REDOX têm um papel muito importante na biologia dos cupins inferiores, além de apresentarem grande potencial em aplicações em processos biotecnológicos.
1.4. Materiais e métodos 1.4.1. O cupim
Espécimes de cupins da espécie C. gestroi foram obtidos no Laboratório de cupins do Departamento de Biologia da UNESP, Rio Claro, São Paulo, Brasil (22º 23'S, 47° 31'W). Os cupins da casta operária foram mantidos a 25 ± 2°C e alimentados com papel cartão com 10% de humidade até a extração de seu material genético para clonagem e expressão das enzimas.
1.4.2. Identificação de genes alvos através de análise da expressão diferencial gênica e proteica do experimento de “feeding” em bagaço de cana
in-natura (BIN) x bagaço de cana pré-tratado com ácido fosfórico (PASB) *Os dados pertencem ao Doutorando João Paulo Franco Cairo e a Análise de bioinformática referente ao RNAseq foi realizada pela pós-doc. Luciana Mofatto, do laboratório de Genômica e
Expressão - LGE do IB/Unicamp, sobre a supervisão do Dr. Marcelo Carazzole e Prof. Gonçalo Pereira e se fazem presente apenas para esclarecer a origem dos genes deste trabalho.
O genoma de C. gestroi encontra-se sequenciado e anotado estando presente em banco de dados do laboratório de genômica e expressão da UNICAMP (http://www.lge.ibi.unicamp.br/cupim/). O sequenciamento, anotação, mapeamento, e o agrupamento dos reads dos genes de C. gestroi possibilitaram os cálculos de expressão diferencial de genes PADs, AAs e GHs. Dois experimentos foram realizados: (1) A expressão gênica diferencial entre as dietas com bagaço de cana
in-natura e bagaço de cana pré-tratado com ácido fosfórico (BIN X PASB) aos que
os operários de C. gestroi foram submetidos; (2) A expressão gênica diferencial entre a casta dos operários e dos soldados submetidos à mesma dieta com papel cartão [5].
A montagem do transcriptoma foi baseada no agrupamento de reads curtos, na tentativa de obter uma sequência maior para cada transcrito (contig). Para finalizar a montagem ab-initio do transcriptoma, foi realizada a etapa de anotação funcional através da comparação contra diversos bancos de dados biológicos como o NCBI (banco de dados com todas as proteínas conhecidas), CDD (banco de dados de domínios proteicos conservados), CAZy (banco de dados de enzimas ativas em carboidratos) [27] e Pfam (banco de famílias gênicas) específicos para enzimas classificadas como pró-oxidantes, antioxidantes e detoxificantes - PAD.
A expressão gênica diferencial foi realizada através do cálculo da razão dos valores de Fragmentos por Kilobase de éxon por milhão de fragmentos mapeados (FPKM) entre as diferentes amostras e essa métrica representou o número de transcritos expressos de um gene. Para tal análise foi necessário sequenciar o metatranscriptoma dos cupins em triplicatas biológicas [5].
1.4.3. Seleção dos genes
Os genes alvos foram selecionados a partir da expressão diferencial conforme o item 3.3.2. Foi levada em consideração a escolha dos genes mais expressos na casta operária do cupim. Também foi levado em consideração os genes mais
expressos quando a casta operária do cupim recebeu uma deita de lignocelulose pré-tratada (PASB) em relação à lignocelulose in-natura.
1.4.4. Desenho de oligonucleotídeos para amplificação de sequências alvos
A região codificante de cada gene escolhido para expressão foi primeiramente submetido à análise de enzimas de restrição na plataforma NEBCUTTER (disponível em: http://tools.neb.com/NEBcutter2/). Nesta análise foi avaliada a ocorrência de sítios de restrição nessa região para as seguintes endonucleases: NheI e BamHI para clonagem em vetor pET28a. Caso houvesse sítios de restrição para uma das enzimas listadas, as endonuclease foram modificadas e listadas ao lado de cada sequência de primers. Segue abaixo a lista dos primers para cada gene alvo selecionado para ser caracterizado funcionalmente.
Tabela 1 – Primers utilizados para amplificação de genes a partir do cDNA de C.
gestroi
1.4.5. Amplificação dos genes
A extração de RNA do cupim e a construção de cDNA foi realizada de acordo com Franco-Cairo (2013) [73]. Em seguida, a amplificação dos genes foi executada através da reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) touchdown, onde a temperatura de anelamento é gradualmente diminuída. A reação de amplificação
Gene Nome , vetor e enzimas de restrição Primer Forward Primer reverse
Exoglucanase CgGH7-1_PET281 – NHEI e BAMH1 - Amplicon – 1080 pb 5’ATATAGCTAGCACTAACCAAGCAGAGAGCC 3’ 5’TATATGGATCCTTAGTAGGTTGAATCAATTGGTC 3’ Aldoketo redutase
CgAKR-1_pET28a - NHEI e BAMHI - Amplicon 1005 pb
5’TAAAATG/CTAGCATGCCTAA ACAACTGAGCAGT 3’ ’
5’TATG/GATCCCTAATAAGGCT CATCATACGGGT 3’
Superóxido dismutase
CgSOD-1_PET28a – NHEI e BAMH1 - Amplicon - 465 pb
5’TATAG/CTAGCATGCCGATAA AAGCTGTATGTGTTC 3’
5’TATAG/GATCCTTAGATCTTA GCAATTCCCAC 3’
Glicose oxidase
CgGDH_pET28a - NHEI e XBAI - Amplicon 1808 pb
5’ATATATAG/CTAGCATGGAGA GCTGCACGACA 3’
5’TATG/GACTCTTATCCAGATAT CCAATACCATAT 3’
LPMO AA10
CgAA10-2_PET281 – NHEI e BAMH1 - Amplicon - 1083 pb
5’TATAG/CTAG/CATGTTGAAGC CCATGGACGTC 3’
5’TATTAGGATCCTTAAATATCT GGATTGATG 3’
Lacase
CgLAC-12Cg_pET28a - NHEI e BAMHI - Amplicon 1005 pb
5’ATATAG/CTGCCGCGACATCA GTGCTGCTGAATTC 3’
5’ATATAG/GATCCTTACTGTTTT CCTTAGGGGC 3’
Aldeído oxidase
CgALOX-1_ pET28a - NHEI e SALI - Amplicon 3700 pb
5’TAAAATG/CTAGCCATGAGG GGGGCTGTATAG 3’
5’ATTCCG/TCGACCTACAAGGT AAACAAGTCGATG 3’ Álcool desidrogenase
CgADH-1_pET28a - NHEI e BAMHI - Amplicon - 1014 pb
5’TAAAATG/CTAGCATGGTGAA AACAAAGAAATTTATTCT 3’
5’TATGGATC/CTTAGGCCTTCAC AACGGCTTT 3’
envolveu uma mistura dos seguintes reagentes: 2µL do cDNA de C. gestroi sintetizado conforme as instruções do fabricante (INVITROGEN), 1µL da solução de desoxinucleotídeos (dNPTs) 10mM, 1µL de primer forward 10pmol, 1µL de primer reverse 10pmol, 10µL da solução de tampão 10x já contendo MgCl2, 0,3µL da enzima Phusion® High-Fidelity DNA Polymerasee (New England) e água estéril completando para volume final da reação de 50µL. A reação de PCR foi realizada em termociclador, no qual se programou uma etapa inicial a 98°C durante 3 minutos, seguido de uma etapa de 10 ciclos: 98°C por 1 minuto, anelamento iniciando em 60,5°C com diminuição de 1°C /ciclo, por 40 segundos, e 72°C por 2 minutos. Após os 10 ciclos, realizou-se uma etapa de 98°C durante 40 segundos e 30 ciclos a 98 °C por 1 minuto, 55°C por 40 segundos e 72°C por 2 minutos. Por fim, realizou-se uma etapa a 72°C por 15 minutos. A reação de amplificação foi comprovada por eletroforese em gel de agarose 1,0%.
1.4.6. Purificação e digestão dos genes amplificados
A banda contendo o produto amplificado foi purificada através do kit illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) de acordo com as recomendações do fabricante. Obteve-se 30µL de DNA purificado, que foi digerido com 0,5µL de cada uma das enzimas (NheI e BamHI/ SALI/XBAI - Fermentas), 0,5µL de BSA (1µg/µl),5µL de buffer D, e água estéril, completando-se o volume final para 50 µL. A reação foi incubada a 37°C durante 1 hora, e posteriormente a 70°C por 15 minutos, de forma a inativar as enzimas.
1.4.7. Quantificação de DNA
Os ácidos nucleicos foram quantificados através do método espectrofotométrico por medidas de absorbância a 260nm realizadas no espectrofotômetro NanoDrop modelo 2000c (Thermo Scientific).
1.4.8. Preparação do vetor pET28a e ligação do gene
O vetor pET28a utilizado contém uma região que codifica para uma sequência de resíduos de histidina, que se adiciona na porção amino-terminal, permitindo a purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (Figura 4). Esse vetor foi digerido com as mesmas enzimas, NheI e BamHI ou SALI ou XBAI, utilizadas na digestão do DNA amplificado. Para a reação foram utilizados 1µg do vetor, 0,5µL de cada uma das enzimas (5U), 0,5µL de BSA, 5µL de buffer D, e água estéril, completando o volume final para 50µL. A reação foi incubada a 37°C durante 1 hora, e posteriormente a 70°C por 15 minutos, de forma a inativar as enzimas.
Para a ligação dos genes de interesse no vetor de expressão pET28a, utilizou-se 10µL do fragmento de DNA amplificado, purificado e digerido com as respectivas enzimas de restrição, 2,5µL do vetor digerido, 1,5µL de tampão de ligase, 1µL da T4 DNA ligase (Invitrogen) e completou-se o volume com água estéril para 20µL de reação. A reação de ligação ocorreu à temperatura de 4ºC durante 16 horas. A proporção de vetor para fragmento foi de 3:1, seguindo-se especificações do fabricante do vetor (Novagen) e da literatura de Sambrook et al. (2001)[75].
1.4.9. Clonagem em Escherichia coli
Uma alíquota de 75L de células competentes foi descongelada e mantida em gelo onde recebeu a adição de 50 a 100ng de DNA transformante. Esta mistura foi mantida em gelo por 30 minutos e posteriormente aquecida a 42C por 45 segundos. As células foram imediatamente incubadas em gelo por 2 minutos e foram adicionados 800µL de meio LB (extrato de levedura 5g/L; peptona bacteriana 10g/L; NaCl 10g/L) às células transformadas, que foram incubadas por 1 hora a 37C. Alíquotas da transformação foram inoculadas em placas de Petri contendo meio ágar LB adicionado de 50g/mL de kanamicina, por 18 horas a 37C.
1.4.10. Seleção das colônias transformantes por CS-PCR (Colony
Screening by PCR)
Tendo-se como finalidade a escolha das colônias que possuíam o vetor clonado com os genes de interesse, foi realizada uma PCR de colônia. Para isso, foram selecionadas aleatoriamente 5 colônias, que foram individualmente diluídas em 10µL de água esterilizada e filtrada. A reação de PCR consistiu de 1µL da colônia diluída em água, 1µL da solução de desoxinucleotídeos (dNPTs) 10mM, 1µL de primer F T7, 1µL de primer R T7, 5µL da solução de tampão 10x já contendo MgCl2, 0,5µL da enzima Taq polimerase (Fermentas) e água estéril, completando o volume final da reação para 50µL. A reação foi submetida a uma etapa inicial de 95°C por 5 minutos, para a lise da bactéria e liberação do DNA de seu interior. Posteriormente, realizou-se um ciclo de 30 vezes (95°C por 45 segundos, 50°C por 45 segundos e 72°C por 2 minutos). Ao final, a mistura foi mantida a 72°C durante 5 minutos, para extensão final. A reação de amplificação foi comprovada com eletroforese em gel de agarose 1,0%. Os clones positivos tiveram alíquotas estocadas a -80ºC, bem como, o DNA plasmidial extraído.
1.4.11. Extração do DNA plasmidial
