UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO
CLISTEN FÁTIMA STAFFEN
POLIMORFISMOS DA REGIÃO PROMOTORA (5’URR) DO GENE HLA-G EM PACIENTES COM LESÕES DE COLO DO
ÚTERO
FLORIANÓPOLIS 2017
Clisten Fátima Staffen
POLIMORFISMOS DA REGIÃO PROMOTORA (5’URR) DO GENE HLA-G EM PACIENTES COM LESÕES DE COLO DO
ÚTERO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de mestra em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
Orientadora: Profª. Drª. Yara Costa Netto Muniz
Florianópolis 2017
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária
Clisten Fátima Staffen
POLIMORFISMOS DA REGIÃO PROMOTORA (5’URR) DO GENE HLA-G EM PACIENTES COM LESÕES DE COLO DO
ÚTERO
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de “Mestra”, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento.
Florianópolis, 11 de agosto de 2017.
________________________ Prof. Geison de Souza Izídio, Dr.
Coordenador do Curso
Banca Examinadora:
________________________ Prof.ª Yara Costa Netto Muniz, Dra.
Orientadora
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Franceli Rodrigues Kulcheski, Dra.
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Norma Machado da Silva, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Profª. Sara Emelie Löfgren, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
AGRADECIMENTOS
Durante a minha trajetória no mestrado, pude contar com o apoio e carinho de muitas pessoas, as quais agradeço sinceramente.
Agradecimento mais do que especial a minha orientadora, Dra. Yara Costa Netto Muniz, pela amizade, atenção, apoio, ensinamentos e por demonstrar exemplos valorosos nestes últimos dois anos. Todo meu carinho e respeito. Sou uma mestranda muito sortuda por ter tido você como orientadora. Muito obrigada!
À Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, em nome de todos os funcionários.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, representado pelo atual coordenador Dr. Geison de Souza Izídio.
Aos professores desse Programa de Pós-Graduação, que contribuíram significativamente para ampliar meu conhecimento.
À Dra. Ilíada Rainha de Souza, coordenadora do LAPOGE pelo carinho, ensinamentos, apoio e amizade. Obrigada!
Às professoras do LAPOGE, entre elas a Dra. Andrea Rita Marrero que sempre me incentivou a continuar na vida acadêmica.
Agradeço, também, a todos os colegas de laboratório, em especial a Ma. Leili Daiane Hausmann pela amizade, carinho, por dividir comigo as angústias e alegrias, e ajudar durante a realização e correção desse trabalho. Ma. Bibiana Sgorla de Almeida pela amizade, dedicação, carinho e apoio desde o início, na concretização deste trabalho. Às Ma. Emily Bruna Justino e Alice Heidrich Prompt, pelo carinho, conhecimento compartilhado e ajuda. A todos pela convivência extrovertida e constante trocas de experiências e conhecimentos
À Dra Renata Toscano Simões e Instituto de Ensino e Pesquisa – IEP, Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, pela colaboração inestimável, concedendo as amostras. À Istéfani Luciene Dayse da Silva, Lorena Mendes Maia; Cinthya Regina de Medeiros Borém, Kênia Cristina Magalhães e a todos que de forma direta ou indireta auxiliaram na concretização deste trabalho.
A todas as mulheres que doaram suas amostras, confiaram na pesquisa e contribuíram de forma determinante para a concretização deste trabalho.
Ao LAMEB e todos os colaboradores que fazem deste um exemplo de laboratório multiusuários. Obrigada!
À Dra Sandra Rachadel Torres pela dedicação, carinho e apoio na condução deste trabalho.
ensinamentos: Dra. Norma Machado da Silva, Dra. Sara Emelie Löfgren, Dra. Franceli Rodrigues Kulcheski e Dra. Cláudia Beatriz Nedel Mendes de Aguiar. Muito obrigada!
Agradeço à FAPESC pelo financiamento de parte deste projeto de pesquisa (FAPESC3649/2013), bem como a FAPEMIG (PPM00476/10) e a Capes pela concessão da bolsa.
Sem citar nomes, para não correr o risco de cometer algum esquecimento, agradeço a todos os amigos.
Por fim, gostaria de fazer um agradecimento especial aos meus pais, Ewaldo e Cecilia, e aos meus irmãos, Elcio e Valdemar e sobrinhos Albert e Adson, por serem meus exemplos, me mostrarem o valor da educação, me incentivarem a sempre buscar a realização dos meus sonhos. À minha querida irmã Mari, pela amizade, por estar ao meu lado, incentivar a superar meus limites, me “aguentar”. Obrigada por compartilhar este sonho! Amo muito vocês!
Ninguém vence sozinho... OBRIGADA A TODOS! .
“Se procurar bem, você acaba encontrando. Não a explicação (duvidosa) da vida, mas a poesia (inexplicável) da vida.”
RESUMO
O câncer de colo do útero é o terceiro câncer mais comum em mulheres em todo o mundo, sendo assim, uma das principais causas de morbidade e mortalidade em países em desenvolvimento. O principal fator de risco é a infecção persistente com certos tipos oncogênicos de papilomavírus humano (HPV), que podem induzir neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC) graus 1, 2 e 3. Não tratadas, essas lesões podem progredir para o câncer de colo do útero. O desenvolvimento de tumores depende de diferentes estratégias de escape do reconhecimento por células imunes. O gene HLA-G expressa moléculas de mesmo nome, com papel de regulação da imuno tolerância, envolvidas na inibição de respostas imunes. Sua expressão, em condições patológicas, pode permitir o desenvolvimento da infecção do HPV no trato cervical feminino e desenvolvimento de células tumorais. É proposto que variações de nucleotídeo único (SNVs) presente na região promotora 5' (5'URR) do gene podem influenciar os níveis de HLA-G, modificando a afinidade com fatores de transcrição. O objetivo deste estudo foi verificar a influência de vinte e um SNVs, localizados na 5'URR do HLA-G sobre a suscetibilidade à lesões de colo do útero e fatores de risco em pacientes. As amostras do estudo foram compostas por 83 pacientes e 83 mulheres saudáveis. A genotipagem foi realizada por sequenciamentoe 14 SNVs (−725G/C/T G e CC; −689A/G G, GG e GA; −646A/G G, GG e GA;
−539A/G A e AA; −509C/G G, GG e CG; −486A/C CA; −483A/G A e AA; −477C/G G e GG; −443G/A A e AA; −400G/A A e AA; −399G/A A
e AA; −391G/A A e AA; −369C/A A e AA; −284G/A A e AA) foram associados ao risco de desenvolvimento de câncer. Além disso, os resultados indicam uma associação entre o gene HLA-G (alelo G nos sítios −539A/G e −477 C/G ) com diferentes graus da lesão (NIC e câncer de colo do útero) e presença/ausência de infecção por HPV. Concluindo, este estudo sugere um possível envolvimento de polimorfismos da 5’URR com risco de infecção por HPV, associada ao desenvolvimento de câncer do colo de útero.
Palavras-chave: Variações de nucleotídeo único. Fatores de risco. Câncer. Sistema imune.
ABSTRACT
Cervical cancer is the third most common cancer in women worldwide and one of the main causes of morbidity and mortality in developing countries. The major risk factor is related with the persistent infection with certain types of oncogenic human papillomavirus (HPV), that can induce cervical intraepithelial neoplasias (CIN) grades 1, 2 and 3. If untreated, these lesions may progress to cervical cancer. The tumor development depends on different strategies to escape recognition by immune cells. In this context, the HLA-G molecule has immune tolerance properties, including the inhibition of immune responses. HLA-G expression, under pathological conditions, may allow the development of HPV infection in the female cervical tract and allow the development of tumor cells. It is proposed that, single nucleotide variations (SNVs) present in the 5 'promoter region (5'URR) can influence HLA-G levels modifying the affinity for transcription factors. The aim of this study was to explore the possible association between twenty-one SNVs located on the 5’URR HLA-G, the susceptibility to cervical lesions and patients risk factors. The samples were composed by 83 patients and 83 healthy women. SNVs identification was performed by capillary sequencing and 14 SNVs (−725 G/C/T, −689
A/G, −646 A/G, −539 A/G, −509 C/G, −486 A/C, −483 A/G, −477 C/G, −443 G/A, −400 G/A, −399 G/A, −391 G/A, −369 C/A e −284 G/A)
were associated as risk for cervical cancer developing. In addition, it was observed an association between two SNVs (allele G in −539A/G and −477C/G) with different degrees of lesion (CIN and cervical cancer) and the presence or absence of HPV infection. Concluding, this study suggests a possible involvement of HLA-G 5’URR SNVs with HPV infection risk and cervical cancer.
Keywords: Single nucleotide variations. Risk factors. Cancer. Imune system.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1– Representação esquemática do colo do útero normal com a identificação de suas partes... 28 Figura 2 – Representação da organização genômica do HPV, um vírus de DNA, que possuí uma região controladora (LCR) e duas regiões codificantes, early com seis genes (E1, E2, E4-E7) e late com dois genes (L1 e L2)... 32 Figura 3 – Representação esquemática do MHC humano. A localização do MHC humano no cromossomo 6 (6p22.1) e a disposição de alguns genes dentro das classes II, III e I. Em destaque na cor amarela a localização do gene HLA-G, onde localiza-se a região estudada nesse trabalho... 36 Figura 4 - Representação esquemática do gene HLA-G e das sete isoformas proteicas do HLA-G geradas por processamento alternativo, sendo quatro ligadas à membrana plasmática e três solúveis... 40 Figura 5 - Representação esquemática do gene HLA-G, demonstrando a região codificadora (éxons e íntrons), e as regiões reguladoras do gene, compostas pelas regiões 3’ não traduzida (3’UTR, do inglês 3’ untranslated region) e com destaque a região promotora 5’ (5’URR, do inglês 5’ upstream regulatory region) com as posições dos elementos regulatórios conhecidos, descritos em Castelli e colaboradores (2014a)... 45 Figura 6 - Cromatografia obtida a partir do alinhamento de uma das amostras sequenciadas. Estão exibidos os SNP 725 G/C/T, 716 T/G e -689 A/G. No cromatograma em questão têm-se os genótipos heterozigotos -725 GC, -716 TG e -689 AG. Código IUPAC: B = G ou C ou T; K = T ou G; R = A ou G...59
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Lista dos sítios de variação encontrados na região promotora 5’ do HLA-G, descrito por Castelli e colaboradores (2017), identificando os alelos referência e alternativo. ... 43 Quadro 2 - Lista com demais pontos de variação encontrados na região promotora 5’ do HLA-G, identificando os alelos referência e alternativo. A referência está informada ao lado dos respectivos sítios. ... 43 Quadro 3 – Polimorfismos da 5’URR do gene HLA-G analisadas. ... 58 Quadro 4 - Classificação da amostra, de acordo com a idade, faixa etária e ancestralidade, de mulheres com câncer de colo do útero (grupo casos) e mulheres sem a doença (grupo populacional). ... 63 Quadro 5 – Classificação das amostras casos de acordo com o Grau da Lesão e presença ou ausência do HPV. ... 64 Quadro 6 - Dados de distribuição da presença de HPV de acordo com o grau da lesão em amostras casos. ... 65 Quadro 7 - Frequências alélicas e genotípicas para os grupos casos e populacional e valor de p para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) estimadas para os 21 sítios de variações polimórficas considerados no presente estudo. ... 68 Quadro 8 - Diferenciação alélica e genotípica baseadas nos 21 loci estudados. ... 79 Quadro 9 - Resultados significativos dos cálculos de associação (OR) entre a presença de alelos e/ou genótipos dos polimorfismos na região promotora do gene HLA-G e o desenvolvimento do câncer do colo do útero, com seus respectivos valores de intervalo de confiança (IC 95%) e valor de p. ... 81 Quadro 10 – Resultados significativos dos cálculos de associação (OR) entre a presença dos polimorfismos do gene HLA-G com modelos de herança e o desenvolvimento do câncer de mama, valores de intervalo de confiança (IC 95%) e de p para OR. ... 84
colo do útero, com seus respectivos valores de IC e p. ... 87 Quadro 12 – Resultados significativos das análises de associação (OR), com seus respectivos valores de CI e p, entre os grupos AG HPV+ versus AG HPV-, IN HPV+ versus IN HPV- e AG e IN HPV+ versus AG e IN HPV- para os polimorfismos 5’UUR do gene HLA-G. ... 88 Quadro 13 – Resumo comparativo das análises que apresentaram resultados significativos, associados com risco de desenvolvimento de câncer do colo do útero. ... 89 Quadro 14 - Probabilidade (p) do teste exato de desequilíbrio de ligação para os vinte e um sítios polimórficos detectados nos grupos casos e populacional (p ≤ 0,05). ... 90
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Adenina
ACS American Cancer Society
APC Células apresentadoras de antígenos, do inglês
antigen-presenting cells
AG Alto Grau
ATF1 Fator ativador de transcrição 1, do inglês Activating
Transcription Fator 1
C Citosina
cAMP Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico, do inglês Cyclic
Adenosine Monophosphate
CCU Câncer do Colo do Útero CD Células Dendríticas
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CEPSH Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos IC Intervalo de confiança
CL Células de Langerhans CNS Conselho Nacional de Saúde
CRE Elemento responsivo ao cAMP, do inglês cAMP Response
Elements
CREB1 Nome dado ao gene, sem tradução para o português, do inglês
cAMP Response Element Binding Protein 1
CTL Linfócitos T Citotóxicos, do inglês Cytotoxic T Lymphocytes
Del Alelo deleção
DL Desequilíbrio de Ligação
DNA Ácido desoxirribonucleico, do inglês desoxyribonucleic acid EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético, do inglês Ethylenediamine
tetraacetic acid
EGF Fator de Crescimento Epidermal, do inglês Epidermal Growth
Factor
EnhA Acentuador A, do inglês Enhancer A et al. “e outros”, do latim et alii
EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg
F Nome dado à direção jusante, do inglês Forward G Alelo guanina
g Gramas
GAS Nome dado ao elemento de ligação dos fatores de transcrição, sem tradução para o português, do inglês Interferon
Gamma-activated Site
HLA Antígeno Leucocitário Humano, do inglês Human Leucocyte
Antigen
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana, do inglês Human
Immunodeficiency Virus
HPV Papilomavírus humano, do inglês Human Papiloma Virus HU Hospital Universitário Professor Polydoro Ernani de São
Thiago
HSE Elemento de choque térmico, do inglês Heat Shock Element HSF-1 Fator de transcrição para HSP, do inglês Heat Shock Factor -1 HSP Proteína de Choque Térmico, do inglês Heat Shock Proteins IARC Agência Internacional para Pesquisa em Câncer, do inglês
Internacional Agency for Research on Cancer
IDH Índice de Desenvolvimento Humano IFN Interferon
IFN-γ Interferon gama IFN-β Interferon beta IL Interleucina
ILT Receptor de leucócito semelhante à imunoglobulina, do inglês
Immunoglobulin-Like Transcript
IMC Índice de massa corpórea
IMGT Nome do projeto internacional sem tradução para o português, do inglês ImMunoGeneTics project
In Alelo inserção
In/Del Inserção e deleção
IN Invasor
INCA Instituto Nacional de Câncer
IRF1 Fator regulatório de interferon 1, do inglês Interferon
Regulatory Fator 1
ISRE Elemento responsável pela estimulação de interferon, do inglês Interferon-Stimulated Response Element
IST Infecção sexualmente transmissível
Kb Kilobases
KCl Cloreto de potássio
KIR Receptor semelhante à imunoglobulina das células natural
killer, do inglês killer-cell immunoglobulin-like receptor
LAPOGE Laboratório de Polimorfismos Genéticos
LCR Região controladora de locus, do inglês Locus Control Region
M Molar
Mb Megabase
MgCl² Cloreto de magnésio
MHC Complexo principal de histocompatibilidade, do inglês major
histocompatibility complex
miRNA micro RNA mL militros
mM Milimolar
mRNA RNA mensageiro
NCBI Centro Nacional de Informação Biotecnológica, do inglês
National Center for Biotechnology Information
NF- Fator nuclear Kappa , do inglês Nuclear Factor Kappa
ng Nanogramas
NIC Neoplasias Cervicais Intraepiteliais
NK Nome dado à célula, sem tradução para o português, do inglês
Natural Killer cells
n Número amostral
OR Razão de Chances, do inglês Odds Ratio OMS Organização Mundial da Saúde
p Braço curto, do francês petit
p Probabilidade pb Pares de base
PCR Reação em cadeia da polimerase, do inglês Polymerase Chain
Reaction
pH Potencial de hidrogênio pmol Picomol
PR Receptor de progesterona, do inglês Progesterone Receptor pRb Proteína Retinoblastoma, do inglês retinoblastoma protein
PRE Elemento de resposta à progesterona, do inglês Progesterone
Response Element
PTEN Nome dado ao gene, sem tradução para o português, do inglês
Phosphatase and Tensin Homolog
R Nome dado à direção montante, do inglês Reverse
RCF Força Centrífuga Relativa, do inglês Relative Centrifugal
Force
RFX Complexo multiproteico regulador do fator X, do inglês
Regulatory Factor X
RNA Ácido ribonucleico, do inglês Ribonucleic Acid RPM Rotações por minuto
RRE Elemento de resposta Ras, do inglês Ras Response Element RREB1 Nome dado ao gene, sem tradução para o português, do inglês
SNP Polimorfismo de nucleotídeo único, do inglês
Single-Nucleotide Polymorphism
SNV Variações de nucleotídeo único, do inglês Single Nucleotide
Variation
SXY Nome dado ao módulo SXY, do inglês SXY module
T Alelo timina
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido TCD4+ Linfócito T Auxiliar
TCD8+ Linfócito T Citotóxico
TGF β Fator de Crescimento Tumoral β
TNF Fator de Necrose Tumoral, do inglês Tumor necrosis factor
TP53 Gene supressor tumoral p 53, do inglês Tumor Protein p53
TRH Terapia de reposição hormonal
U Unidade
UFSC Universidade Federal de Santa Catarina
URR Região Promotora, do inglês upstream regulatory region UTR Região não traduzida, do inglês untranslated region
V Voltagem
W Unidade de potência (Watt) β2m β2-microglobulina
µL Microlitro ºC Grau Celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 27 1.1 CÂNCER DO COLO DO ÚTERO ... 28 1.2 LESÕES NEOPLÁSICAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS (NIC) ... 29 1.3 FATORES DE RISCO DO CÂNCER DO COLO DO ÚTERO . 30 1.4 HPV E O CÂNCER DO COLO DO ÚTERO ... 31 1.5 RESPOSTA IMUNE VERSUS HPV ... 33 1.6 COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE .. 36 1.7 HISTÓRICO E ESTRUTURA GÊNICA DO HLA-G ... 37 1.8 HLA-G: GENE E MOLÉCULA ... 41
1.9 POLIMORFISMOS DA 5’URR E ELEMENTOS
REGULATÓRIOS DA EXPRESSÃO DO HLA-G ... 42 1.10 HLA-G e CCU ... 47 2 JUSTIFICATIVA ... 49 3 OBJETIVOS ... 51 3.1 OBJETIVO GERAL ... 51 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 51 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 53 4.1 ASPECTOS ÉTICOS ... 53 4.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 53 4.3 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO (gDNA) ... 54 4.4 DETECÇÃO DE HPV ... 54 4.5 GENOTIPAGEM DA REGIÃO 5’UR DO GENE HLA-G ... 54 4.5.1 Reação em cadeia da polimerase... 54 4.5.2 Análise dos Produtos de Amplificação ... 55 4.5.3 Purificação dos Produtos Amplificados ... 56 4.5.4 PCR para a Reação de Sequenciamento ... 56 4.5.5 Precipitação dos Fragmentos Sequenciados ... 57
4.6 TRATAMENTO DOS DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA .. 59 4.6.1 Aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg ... 59 4.6.2 Estimativas das Frequências Alélicas e Genotípicas ... 59 4.6.3 Diferenciação genética dos grupos amostrais ... 60 4.6.4 Análises de Associação ... 60 4.6.5 Desequilíbrio de Ligação ... 61 5 RESULTADOS ... 63 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 63 5.2 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 65 5.2.1 Equilíbrio de Hardy-Weinberg ... 65 5.2.2 Frequências Alélicas e Genotípicas ... 66 5.2.3 Diferenciação Genética dos Grupos Amostrais ... 79 5.2.4 Análises de Associação ... 80 5.2.5 Desequilíbrio de Ligação ... 89 6 DISCUSSÃO ... 91 6.1 CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGIA E GENÉTICA ... 91 6.2 ANÁLISES DE ASSOCIAÇÃO ... 94 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...101 REFERÊNCIAS ...103 APÊNDICE A – Cálculos de associação (OR) entre a presença de polimorfismos na região promotora do gene HLA-G e o desenvolvimento do câncer do colo do útero, com seus respectivos valores de intervalo de confiança (IC) e de p. ...115 APÊNDICE B - Cálculos de associação entre a presença de polimorfismos na região promotora do gene HLA-G com modelos de herança e o desenvolvimento do câncer de colo do útero, valores de intervalo de confiança (IC) e de p para OR. ...126 APÊNDICE C – Análises de associação (OR) e seus valores de IC e p, entre Grupo Alto Grau (AG) ,Grupo Invasor (IN) e a presença/ausência do vírus HPV em mulheres com câncer de colo do útero para 21 polimorfismos da 5’URR do gene HLA-G. ...148
ANEXO I – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte. ... 181 ANEXO II – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) ... 182 ANEXO III – Questionário Indivíduos com Lesões de Colo do Útero ... 183 ANEXO IV – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Indivíduos-Controles ... 184 ANEXO V – Questionário Indivíduos-Controles ... 186 ANEXO VI –Protocolo Salting-out modificado (HIGUCHI; OCHMAN, 1989). ... 190 ANEXO VII – Extração do DNA Genômico – Método Salting-out (MILLER; DYKES; POLESKY, 1988). ... 191 ANEXO VIII – Detecção de DNA de HPV e tipificação ... 193
1 INTRODUÇÃO
Séculos antes de Cristo, egípcios, persas e indianos, já se referiam aos tumores malignos que acometiam o ser humano. Ao longo da história, o câncer foi visto das mais variadas formas, como tragédia individual, doenças que levavam sofrimento e morte, a problema de saúde pública (TEIXEIRA; FONSECA, 2007).
Hoje em dia, câncer é o nome genérico dado a um conjunto de doenças, cuja principal característica é decorrente do descontrole do crescimento e divisão celular (AMERICAN CANCER SOCIETY - ACS, 2015; NATIONAL CANCER INSTITUTE - NCI, 2015).
As células cancerosas são definidas como menos especializadas que as células normais. Essas células se dividem continuamente, além de serem capazes de ignorar os sinais que levam a apoptose (morte celular programada), processo pelo qual o corpo elimina as células (NCI, 2017). Elas também são capazes de escapar do sistema imunológico, que reconhece e remove células danificadas ou anormais do corpo, permanecendo vivas e crescendo (NCI, 2017). Assim, quebram as regras mais básicas do comportamento celular (ALBERTS; et al., 2015).
É inquestionável que o câncer é um problema emergencial mundial, de alto custo, tanto financeiro, como humano, estando entre as principais causas de óbito (TORRE et al., 2016). De acordo com o documento World Cancer Report 2014, da Internacional Agency for
Research on Cancer (IARC), da Organização Mundial da Saúde (OMS),
a incidência do câncer é maior entre os países em desenvolvimento (STEWART; WILD, 2014), estes dados são preocupantes, uma vez que 75% da população mundial vive nestas regiões (MARRAZZO e HOLMES, 2013).
O projeto GLOBOCAN, da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC) e da OMS, apontou em 2012, uma estimativa de 14 milhões de novos casos de câncer em todo o mundo. Desses mais de 60% ocorreriam em países em desenvolvimento, havendo um total de 8,2 milhões de mortes por câncer no mundo, afetando todos os países e populações (STEWART; WILD, 2014; TORRE et al., 2016).
O Câncer do Colo do Útero (CCU), também chamado de Câncer Cervical, é o terceiro tipo de câncer mais comum na população feminina mundial (TORRE et al., 2016). Considerando países com baixo índice de desenvolvimento humano (IDH), é a segunda causa de incidência e mortalidade por câncer, e é estimada a morte de uma mulher em cada
cinco, devido principalmente ao diagnóstico em fases tardias da doença (STEWART; WILD, 2014).
Pressupõe-se que no biênio 2016/2017, no Brasil, seja registrada a ocorrência de 600 mil novos casos de câncer. Excetuando-se os casos de câncer de pele não melanoma, serão cerca de 420 mil novos casos (INCA, 2015). Entre esses novos casos são estimados 16.340 casos de CCU no Brasil, com um risco de 15,85 casos a cada 100 mil mulheres. De acordo com a última estimativa, em 2013, no Brasil foram registradas 5.430 mortes por CCU. A sobrevida em cinco anos ficou em torno de 61%, para o período de 2005 a 2009 (INCA, 2015).
1.1 CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
O CCU é uma proliferação desordenada do epitélio de revestimento do órgão (Figura 1), que pode levar ao comprometimento do tecido subjacente (estroma), atingindo outras estruturas e órgãos (INCA, 2015).
Figura 1– Representação esquemática do colo do útero normal com a identificação de suas partes.
Fonte: Desenho elaborado por Mari Dalva Staffen, 2017.
A OMS reconhece dois tipos principais de cânceres cervicais: o carcinoma de células escamosas, que representa de 85 a 95% dos casos, e o adenocarcinoma, menos comum (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2016; INCA, 2015). Assim a classificação das neoplasias
malignas do colo uterino é dividida em: (I) adenocarcinoma in situ, origina-se geralmente de uma lesão precursora no epitélio glandular, proveniente da endocérvice de crescimento restrito; (II) adenocarcinoma invasor, proveniente da endocérvice ou endométrio com aspecto poliploide ou raramente ulcerado; (III) Carcinoma de células escamosas queratinizantes origina-se a partir do epitélio da ectocérvice (parte do colo do útero mais próximo da vagina), onde ocorre a produção de queratina pelas células neoplásicas; (IV) e o carcinoma de células escamosas não queratinizantes (AIDÉ et al., 2009; AMERICAN CANCER SOCIETY, 2016; INCA, 2015, 2016).
O principal fator de risco para o desenvolvimento de lesões precursoras do CCU (lesões intraepiteliais de alto grau) e do CCU é a infecção pelo Papilomavírus humano (HPV, do inglês Human Papiloma
Virus) (INCA, 2015). É importante ressaltar que o HPV é a infecção
sexualmente transmissível (IST) mais comum em todo o mundo, cerca de 291 milhões de mulheres, em algum período da vida, apresenta infecção por HPV. Porém, a maioria dessas infecções regride espontaneamente, não progredindo para um processo invasor (CORDEIRO et al., 2017; INCA, 2015, 2016).
É descrito que após a infecção pelo HPV eventos moleculares biológicos podem resultar na eliminação completa do vírus ou progredir para as lesões precursoras. Quando há a permanência do vírus, esse desencadeia alterações no DNA nuclear da célula infectada, iniciando um processo lento, que interrompe a diferenciação normal das células do epitélio escamoso cervical, gerando alterações estruturais e fisiológicas (STANLEY, 2010).
Evoluindo lenta e progressivamente, as lesões precursoras apresentam as seguintes fases: inicialmente displasia leve, seguido de moderada e posteriormente avançada, ou carcinoma in situ, presente à superfície epitelial, podendo então, atingir o estágio de carcinoma invasor, onde as células extrapolam a lâmina basal (SAAVEDRA; BREBI; ROA, 2012).
1.2 LESÕES NEOPLÁSICAS INTRAEPITELIAIS CERVICAIS (NIC)
Lesões pré-cancerígenas do colo do útero, denominadas Neoplasias Cervicais Intraepiteliais (NIC), que podem ser divididas em graus de I a III, surgem quando ocorre a persistência da infecção pelo HPV, cuja nomenclatura segue a classificação histológica (GUDLEVIÈIENË et al., 2010; IARC, 2005; INCA, 2015; TORRE et al., 2016; TROTTIER; FRANCO, 2006).
Em um prazo médio de 2 a 5 anos, após a infecção por HPV, o vírus pode levar a formação de NIC I, que corresponde à displasia leve. Essa pode regredir espontaneamente ou progredir em um prazo médio de 4 a 5 anos após a infecção, para NIC II, displasia moderada. E por fim chegar a NIC III, ou displasia avançada (ZHOU et al., 2006).
Ao infectarem as células basais do epitélio cervical, o vírus HPV interage com o genoma do hospedeiro, causando alterações no DNA nuclear da célula infectada, incluindo a tetraploidização (NIC I), e o desenvolvimento de clones celulares aneuplóides (NIC II e NIC III). É importante ressaltar que a ausência de diagnóstico e tratamento da NIC II e/ou NIC III, na maioria dos casos, pode resultar em câncer invasivo (STANLEY, 2010).
1.3 FATORES DE RISCO DO CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
O CCU é uma doença multifatorial que possui diversos fatores ambientais de risco, além da infecção por HPV, que pode variar o risco dependendo da capacidade oncogênica das diferentes cepas virais, sendo um risco maior quando há infecção pelas formas mais oncogênicos. Temos ainda a dieta, o uso de contraceptivos hormonais, imunossupressão pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), tabagismo, gestações múltiplas, início precoce da atividade sexual, trauma cervical , hormônios endógenos (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2017; FONSECA-MOUTINHO, 2011; INCA, 2015; SILVA et al., 2013; TORRE et al., 2016).
Além dos fatores ambientais, temos os fatores genéticos, como mutações em genes de reparo e de controle do ciclo celular e apoptose, assim como nos genes que compõe o sistema imune, incluindo os do Antígeno Leucocitário Humano (HLA), entre outros fatores relacionados à resposta imune do hospedeiro (FONSECA-MOUTINHO, 2011; INCA, 2015; SILVA et al., 2013; TORRE et al., 2016).
A idade também interfere no processo, a doença é rara antes dos 30 anos. A maioria das infecções por HPV em mulheres abaixo dessa faixa etária regride espontaneamente, ao passo que, o risco aumenta rapidamente até atingir seu pico nas faixas etárias acima de 40 anos, na qual, a persistência é mais frequente (INCA, 2014).
Aspectos relacionados ao HPV, incluindo fatores genéticos, especialmente a imunidade, apresentam-se como contribuintes nos mecanismos que influenciam o desenvolvimento da doença. Porém, ainda não são completamente conhecidos esses mecanismos que determinam a regressão ou persistência da infecção e, também sua
progressão para lesões precursoras e o câncer (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2017; FERGUSON et al., 2012).
1.4 HPV E O CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
O HPV é um grupo de vírus de DNA, sendo que alguns são altamente oncogênicos e de importância médica (HARARI; BURK, 2014).
Analisando as certidões de óbito de mulheres em Verona, entre os anos de 1760 e 1839, o médico italiano Rigoni-Stern (1840), observou uma alta frequência de CCU em mulheres casadas, viúvas e prostitutas, e raras ocorrências em freiras e virgens. Concluindo que este tipo de câncer estaria relacionado ao contato sexual (HARARI; BURK, 2014; zur HAUSEN, 2009).
Cerca de 150 anos após a constatação de Rigoni-Stern, foi validado o papel do HPV no desenvolvimento de CCU, com os experimentos iniciados em 1972 pelo virologista Harald zur Hausen (HARARI; BURK, 2014; zur HAUSEN, 2009).
Em 1982, foram publicados os três primeiros relatórios sobre as sequências do HPV em tumores humanos (ZUR HAUSEN, 2009). Em 2006, Tran e colaboradores reconheceram, pela primeira vez, o papel do HPV como agente etiológico do CCU. Atualmente sabe-se que a infecção por alguns tipos específicos de HPV de alto risco contribuem para a origem do CCU (JEMAL et al., 2013; SCHIFFMAN et al., 2007; SCHIFFMAN; WENTZENSEN, 2013; TRAN; ROSE; O’BRIEN, 2006).
Existem cerca de 100 tipos de HPV com diferentes variações em seu genoma e relevante potencial oncogênico. É um vírus pequeno, não envelopado (ABREU et al., 2012). Atualmente, a IARC reconhece 13 tipos de HPV como oncogênicos, sendo o HPV 16 e o HPV 18 os mais frequentes e considerados de alto risco. Isso porque, a infecção com esses tipos específicos de HPV levam a uma expressão contínua de oncoproteínas virais, que desregulam a proliferação celular, levando a formação de pré-cânceres que apresentam instabilidade cromossômica (IARC, 2005; STANLEY, 2008).
Na Figura 2 está representada a organização genômica do HPV, com 7.906 pares de bases (pb) em conformação de dupla fita de DNA circular, cuja estrutura física e organização são bem conhecidas (ABREU et al., 2012). O HPV possui uma região controladora de locus (LCR – do inglês long control region) ou super regulatória (URR – do inglês upstream regulatory region), uma região precoce (do inglês
Early) composta por seis genes referidos como E1, E2, E4, E5, E6 e E7,
e uma região tardia (do inglês Late) com dois genes que codificam proteínas estruturais L1 e L2 (HO et al., 1998; HOWLEY, 2006; SAAVEDRA; BREBI; ROA, 2012).
Figura 2 – Representação da organização genômica do HPV, um vírus de DNA, que possuí uma região controladora (LCR) e duas regiões codificantes, early com seis genes (E1, E2, E4-E7) e late com dois genes (L1 e L2).
Fonte: UICC HPV and Cervical Cancer Curriculum The role of HPV
Cada um desses genes virais codifica uma proteína com distintas funções celulares. Os genes E1 e E2 são responsáveis pela replicação do DNA viral, nas células das camadas basais epiteliais. A proteína E1 também é responsável por sinalizar à DNA polimerase o ponto de origem de replicação, possuindo ainda atividade de helicase, sendo responsável pela abertura do DNA. A proteína E2 atua como repressora da transcrição da E6. Enquanto que, a proteína E4 é produzida e fundida com E1 antes da montagem completa do capsídeo viral, interagindo com proteínas do citoesqueleto formando um alo perinuclear, que caracteriza os coilócitos evidenciados em esfregaço. E5 é uma proteína transmembrana, com papel importante na transformação celular, provavelmente contribuindo para a sinalização celular. As oncoproteínas virais E6 e E7, dos HPVs de alto risco, exercem o efeito oncogênico nas células, através da interação com proteínas de controle de ciclo celular do hospedeiro, que tornam-se capazes de imortalização e transformação neoplásica (BRENNA; SYRJÄNEN, 2003; CHEN; MOUNTS, 1990; INCASSATI; PATEL; MCCANCE, 2006; PRENDIVILLE; DAVIES, 2004).
As proteínas L1 e L2 atuam na maturação do vírus e orquestram o empacotamento do genoma viral, para a liberação no epitélio superior. Essas proteínas não são expressas durante os estágios finais do pré-câncer e do pré-câncer (HARARI; BURK, 2014).
De forma mais específica, as oncoproteínas, E6 e E7, causam alterações no ciclo celular, com proliferação anormal, pela ligação destas a sítios específicos nas proteínas, conhecidas como supressores tumorais (FU et al., 2010) pRb, produto do gene RB1 (Retinoblastoma 1) (DYSON, 1989) e p53, produto do gene TP53 (do inglês Tumor
Protein p53) (WERNESS; LEVINE; HOWLEY, 1990), respectivamente
pelas proteínas E7 e E6 (FU et al., 2010). Assim, a instabilidade genética das células infectadas ocorre devido a interferência das oncoproteínas virais em vários mecanismos celulares, como o controle do ciclo celular, o reparo do DNA, o fuso mitótico, a apoptose e a estabilização dos telômeros (INCASSATI; PATEL; MCCANCE, 2006). O primeiro indício da importância dos genes na tumorigênese associado ao HPV é a ocorrência, continuamente observada, em carcinomas cervicais, da transcrição dos genes E6 e E7 de alto risco. As proteínas E6 dos HPVs de baixo risco, na maioria das vezes, não se ligam à proteína p53, e com isso, não ocorre a inibição da sua atividade e consequentemente não há efeito negativo no controle do ciclo celular (PRENDIVILLE; DAVIES, 2004).
1.5 RESPOSTA IMUNE VERSUS HPV
O processo de evolução da infecção viral e o desenvolvimento neoplásico são determinados pela resposta imune do hospedeiro. Mulheres imunodeficientes apresentam uma frequência da infecção genital e progressão das lesões causadas pelo HPV, bem como casos de câncer, muito maior quando comparado a mulheres imunocompetentes (PANTANOWITZ; MICHELOW, 2010).
A imunidade local natural contra vírus e bactérias no epitélio cervical uterino conta com a participação dos bacilos de Doderlein, naturais da vagina, que dificultam as infecções, pela secreção do ácido lático, que contribui na redução do pH. Além disso, as células epiteliais secretam peptídeos, as defensinas, com atividade antibacteriana e antiviral, que são drenados através do muco cervicovaginal (HO et al., 1998).
A infecção viral das células basais ocorre quando a imunidade local não é suficiente para impedir a infecção por HPV. O período de incubação viral, desde a infecção até a liberação do vírus, é de, em
média, três semanas, período em que os queratinócitos completam sua diferenciação e descamam de maneira natural (MIDDLETON et al., 2003; ORIEL, 1971).
Respostas imunes, específica e adaptativa, são ativadas na presença de uma infecção viral, desencadeando a secreção de citocinas pró-inflamatórias, entre elas o Fator de Necrose Tumoral (TNF), que é sintetizado por macrófagos e linfócitos T e possui uma forte atividade antitumoral e antiviral. Essa interação é responsável pela regressão, persistência ou progressão das lesões associadas ao HPV (GONÇALVES; DONADI, 2004). O HPV diminui a produção de TNF e, consequentemente, a capacidade de apresentação de antígenos das Células Apresentadoras de Antígeno (APCs do inglês
Antigen-presenting Cells) diminui (MAJEWSKI, MALEJCZYK e
JABLONSKA, 1996).
As células natural killer (NK), que induzem a apoptose em células infectadas pelo vírus e em células cancerosas, requerem a participação dos receptores Tipo Imunoglobulina das NK (KIR). Esses receptores permitem que estas células distingam células normais, das infectadas por vírus ou tumorais (IARC, 2005; MARTIN et al., 2010). De tal forma que, as células NK possuem a habilidade de reconhecer e eliminar o alvo sem a necessidade de uma sensibilização prévia (SUN; LANIER, 2009).
As moléculas HLA de Classe I são os ligantes dos receptores KIR presentes nas células NK, por meio dos quais, monitoram nas células alvo em estados de normalidade ou transformação neoplásica, demonstrando grande importância na resposta imune contra HPV (IARC, 2005; MARTIN et al., 2010).
Em maior concentração no epitélio da mucosa cervical que na vagina, as Células de Langerhans (CL) que são células dendríticas (CD), os macrófagos e formações linfoides no córion, participam ativamente na apresentação de antígenos, através da expressão de moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de classe II e de classe I, ativando assim, linfócitos TCD4+ e TCD8+ (GRESLIN, MOUGIN e SEILLES, 1998; RONCALI et al., 1988).
Segundo Gonçalves e Donadi (2004), os queratinócitos do epitélio cervical também gerariam uma fonte de citocinas, que induziriam a resposta imune pela ativação de células T, através da expressão de moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC, do inglês Major Histocompatibility Complex), MHC II, sob indução do interferon-γ (IFN- γ) (GONÇALVES; DONADI, 2004).
Com atividade antiviral, antiproliferativa, antiangiogênica e propriedades imunoestimulatórias, que ativam as células dendríticas imaturas, os interferons de tipo 1, interferon-α (IFN-α) e interferon-β (IFN-β), são sintetizados pelas células infectadas pelo vírus (THEOFILOPOULOS et al., 2005).
Necessários para respostas efetivas no caso de patógenos intracelulares, como o HPV, o Fator de Crescimento Tumoral β (TGFβ) inibe a proliferação celular, e a Interleucina 2 (IL-2), do tipo TH1, também muito importante na imunidade celular (BOCCARDO; LEPIQUE; VILLA, 2010; KIM et al., 2000; VIEIRA; GOLDSTEIN; VILLA, 1996).
Dessa forma, após a infecção viral, a célula desencadeia uma série de ações, os antígenos virais são ubiquitinados e encaminhados para a degradação no proteassoma. Os fragmentos do peptídeo viral são transportados ao retículo endoplasmático, onde se associam as moléculas MHC I. O complexo resultante é expresso na membrana celular, e o peptídeo viral é apresentado aos linfócitos TCD8+. Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) são ativados pela interação das células apresentadoras de antígeno (APC, do inglês antigen-presenting cells) com o linfócito TCD8+, e esta ativação, leva a secreção de enzimas que causam a lise da célula infectada (ALBERTS; et al., 2015; ABBAS et al., 2015).
Por outro lado, alguns vírus, assim como as células tumorais, são capazes de desenvolver mecanismos de escape da vigilância imunológica. Assim, na infecção por HPV, pode haver pouca ou nenhuma liberação de citocinas pró-inflamatórias, que ativam células dendríticas locais e desencadeando a resposta imune no epitélio escamoso (BOCCARDO; LEPIQUE; VILLA, 2010; KUPPER; FUHLBRIGGE, 2004).
Na infecção por HPV, com superexpressão das proteínas virais E6 e E7, os linfócitos T citotóxicos parecem não reconhecê-los, resultado da deficiência na apresentação dos epítopos virais entre o início da infecção e o aparecimento do câncer. Diante disso, a atividade das moléculas do MHC parece ser um fator determinante na indução de uma resposta imune adaptativa.
Fatores importantes para a aquisição e persistência da infecção são o sistema imunológico, como descrito, e a genética do hospedeiro (FERGUSON et al., 2012). Os genes que codificam proteínas envolvidas com a resposta imune dirigida às células infectadas pelo HPV, apresentam grande importância, conferindo maior suscetibilidade
ou proteção no desenvolvimento de lesões precursoras do câncer, em resposta a ação das oncoproteínas virais (ROUAS-FREISS et al., 2005).
1.6 COMPLEXO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDADE
Em 1948 George Snell e colaboradores descreveram, em linhagens endogâmicas de camundongos, o primeiro sistema gênico referido como MHC. Essa denominação foi atribuída a quantificação de produtos moleculares associados à aceitação/rejeição de tecidos transplantados nesses animais (CROUAU-ROY et al., 1994). Por esse motivo, a região e os genes correspondentes foram nominados genes de histocompatibilidade (MCDEVITT, 2000).
Em humanos, o MHC é a região onde estão os genes que codificam os Antígenos Leucocitários Humanos (HLA, do inglês
Human Leucocyte Antigen), descrito na década de 1950 em pacientes
politransfundidos (HVIID et al., 2006). Com mais de 220 genes, o MHC humano está localizado no braço curto do cromossomo 6, na posição 22.1, sendo subdividido em regiões I, II e III conforme sua estrutura genica e função das proteínas (Figura 3) (CASTELLI et al., 2011; HORTON et al., 2004).
Figura 3 – Representação esquemática do MHC humano. A localização do MHC humano no cromossomo 6 (6p22.1) e a disposição de alguns genes dentro das classes II, III e I. Em destaque na cor amarela a localização do gene HLA-G, onde localiza-se a região estudada nesse trabalho.
Os genes HLA-A, -B e –C, chamados de clássicos ou de classe Ia, são altamente polimórficos e com expressão constitutiva na membrana celular de quase todas as células nucleadas. As moléculas produzidas por esses genes estão envolvidas na apresentação de antígenos às células T CD8+ (KLEIN; SATO, 2000; ROBINSON et al., 2015). Existem ainda os genes HLA-E, -F e –G, não clássicos ou de classe Ib, considerados menos polimórficos em comparação com os de classe Ia, podendo apresentar expressão celular restrita (CASTELLI et al., 2009; DA SILVA et al., 2014; FAINARDI et al., 2003; IMGT, 2017; FISHER e MAYR, 2001). As moléculas HLA de classe Ia e Ib se associam a cadeia leve da β2-microglobulina (β2m) cujo gene codificador, está localizado no cromossomo 15 (CASTELLI et al., 2011; PARHAM et al., 2012; ROBINSON et al., 2015).
Além desses, a classe I apresenta 11 pseudogenes, isto é, sem produto proteico associado, nomeados como HLAH, J, K, L,P, T,
-U, -V, -W, -X e -Y (IMGT, 2017).
As moléculas de classe II estão contidas na região HLA-D do MHC, e são divididos em sub-regiões, DR, DQ, DP, DM e DO, sendo esta região composta atualmente por 12 genes (IMGT, 2017). A expressão desses está limitada às APCs, que apresentam os peptídeos às células T CD4+ (ROBINSON et al., 2015).
Entre as regiões de classe I e classe II encontra-se a região de classe III, onde estão localizados vários genes não-HLA, que codificam moléculas importantes para a imunidade inata (ROBINSON et al., 2015; LEWIN, 2009).
1.7 HISTÓRICO E ESTRUTURA GÊNICA DO HLA-G
Um componente não clássico do MHC, o gene HLA-G, foi primeiramente descrito por Geraghty e colaboradores em 1987, quando realizavam uma análise de DNA genômico em células de trofoblasto e coriocarcinoma (GERAGHTY; KOLLER; ORR, 1987). Esse estudo revelou genes similares aos então conhecidos genes HLA de classe Ia (HUNT et al., 2000). Por ser identificado através de uma sequência genômica localizada num fragmento de restrição de 6.0 Kb, foi inicialmente referido como HLA-6.0. Somente em 1990 foi designado como HLA-G, apresentando organização gênica semelhante aos genes
HLA classe Ia: oito éxons, 7 íntrons e uma região 3’ não traduzida
(3’UTR, do inglês 3’ Untranslated Region) (HVIID et al., 2006). Entretanto, foi observado no sexto éxon do gene HLA-G um códon de término da tradução, que gera uma proteína com segmento
citoplasmático reduzido, com apenas seis aminoácidos, diferindo assim das outras proteínas HLA clássicas, que apresentam esse segmento citoplasmático com aproximadamente 30 aminoácidos altamente conservados na proteína (HVIID et al., 2006).
O gene HLA-G codifica uma proteína de mesmo nome ligada à membrana plasmática e associada com a β2m, com os mesmos domínios extracelulares presentes nas moléculas de classe Ia. Porém, outra característica que difere o gene HLA-G dos genes de classe Ia, é quanto a sua função, que não é a apresentação de antígenos (CASTELLI et al., 2014a, 2014b; DONADI et al., 2011). Mas sim, a inibição das funções citolíticas das células NK, da maturação de células dendríticas, das funções citolíticas antígenos-específicas das células T CD8, das respostas aloproliferativas das células T CD4 e, da produção de citocinas por células T, além de induzir a apoptose celular (DONADI et al., 2011). Considerando isso, essa molécula tem a capacidade de atuar diretamente na atividade das células participantes da resposta imune.
De acordo com Castelli et al., 2014b, não há um consenso quanto ao local de início da transcrição do HLA-G. É possível que esse gene apresente múltiplos pontos de início da transcrição, dependendo da expressão de mecanismos de indução ou presença de fatores específicos. O autor ainda propõe que, existam três possíveis pontos de início da tradução, dois na região anotada como 5’ não traduzida (5’UTR, do inglês 5’ Untranslated Region) e um terceiro no início da sequência descrita com codificadora (CASTELLI et al., 2014b)
O HLA-G apresenta 4.164 pb (EMBL-EBI, 2017) e sua estrutura até então, vem sendo descrita com uma denominação semelhante ao dos genes HLA de classe Ia, composta por oito éxons e sete íntrons. Entretanto, a porção final do éxon 7 e o éxon 8 não são traduzidos, sendo assim considerados a 3’UTR do RNA mensageiro (mRNA – Ácido Ribonucleico mensageiro) maduro (CASTELLI et al., 2014b; DONADI et al., 2011; MOREAU; FLAJOLLET; CAROSELLA, 2009).
Então, em 2014b, Castelli e colaboradores questionam a nomenclatura dos éxons e íntrons entre os bancos de dados IMGT e NCBI/Ensembl e atribuíram a nomenclatura definida pelo NCBI/Ensembl como a mais completa. Segundo Castelli e colaboradores (2014b), na nova nomenclatura, o éxon 1 é a parte inicial da 5’UTR que se mantém no mRNA maduro. O éxon 2 codifica a porção final da 5’UTR e contém o ponto de início da tradução. Os éxons 3, 4 e 5 codificam, respectivamente, os domínios α-1, α-2 e α-3. O éxon 6 codifica o domínio transmembranar e o éxon 7 a cauda citoplasmática. Essa cauda, considerada curta, quando comparada com outras moléculas
de classe Ia, é gerada pela presença de um códon de parada prematuro no éxon 7. E a porção 3’UTR é formada pelo segmento que se estende do éxon 7 ao éxon 8. (CASTELLI et al., 2014b).
Os transcritos primários do HLA-G sofrem processamento (em inglês splicing) alternativo, que geram sete isoformas proteicas distintas (Figura 4). Quatro isoformas são ligadas a membrana e apresentam o domínio transmembranar e a cauda citoplasmática curta (HLA-G1, forma completa da proteína, HLA-G2, HLA-G3 e HLA-G4) e outras três isoformas solúveis devido a falta do domínio transmembranar (HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7) (CAROSELLA et al., 2008a; DONADI et al., 2011).
Mesmo sendo pouco compreendidas, as funções das isoformas, é proposto que podem estar envolvidas na modulação da resposta imune em situações fisiológicas distintas, podendo ser expressas ou não devido aos mecanismos de regulação, das situações fisiológicas e do tipo celular envolvido (CAMPBELL; ANTONY; POWIS, 2012).
Além disso, fatores ambientais podem estar relacionados com a expressão dessas isoformas nos diferentes tipos celulares. Alguns desses fatores podem ser endógenos como estresse, privação de nutrientes, hormônios e citocinas, como por exemplo, o Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos e Granulócitos (GM-CSF), IFNs (Interferons), IL-10 (Interleucina 10), TNFα, TGFβ e o Fator de Crescimento Epidermal (EGF). E outros fatores podem ser exógenos como, por exemplo, fármacos. Esses fatores, aliados aos polimorfismos do HLA-G, podem regular a expressão deste gene, tanto no nível transcricional, quanto no nível pós-transcricional (CAROSELLA et al., 2011).
Além da região transcrita, composta pela região codificadora, introns e as região 5’ e 3’ não traduzida (UTR, do inglês untranslated
region), é conhecida também a região promotora (5’URR, do inglês 5′ upstream regulatory region) (CASTELLI et al., 2011; MOREAU;
Figura 4 - Representação esquemática do gene HLA-G e das sete isoformas proteicas do HLA-G geradas por processamento alternativo, sendo quatro ligadas à membrana plasmática e três solúveis.
5’URR: região promotora 5’ (do inglês 5’ upstream regulatory region); 5’UTR: região 5’ não traduzida (do inglês 5’ untranslated region); 3’UTR: região 3’ não traduzida (do inglês 3’ untranslated region); *: ATG; : Códon de parada; retângulos contornados: regiões não traduzidas; ---: íntrons removidos. Fonte: Elaborado por Mari Dalva Staffen, 2017, baseado em (CASTELLI et al., 2014b).
1.8 HLA-G: GENE E MOLÉCULA
O HLA-G é um gene que codifica proteínas envolvidas nos mecanismos imunossupressores. Esse papel é bem descrito na tolerância materno-fetal e células imaturas (GILLIO-TOS et al., 2012; HUNT; LANGAT, 2009). Um nível basal da transcrição do gene HLA-G é observado na maioria das células e tecidos de indivíduos saudáveis, mas pode haver uma expressão importante nas células do timo, córnea, ilhotas pancreáticas e em precursores endoteliais e eritróides (CASTELLI et al., 2011; MOREAU; FLAJOLLET; CAROSELLA, 2009). Além disso, sua expressão pode ser induzida em algumas situações específicas, como por exemplo, em transplantes de órgãos, doenças inflamatórias e autoimunes, transformações malignas e infecções virais (CAROSELLA et al., 2008a).
A proteína interage com receptores de membrana, presentes em diversos tipos celulares, atuando na modulação da resposta imunológica. Pode inibir, por exemplo, as funções citolíticas das células NK; a maturação de células dendríticas; as funções citolíticas antígeno-específicas das células T CD8+, as respostas aloproliferativas das células T CD4+; a produção de citocinas por células T, além de induzir a apoptose celular (DONADI et al., 2011).
Sabe-se ainda, que há uma interação direta entre o HLA-G e os receptores inibidores: (1) O receptor de leucócito semelhante à imunoglobulina 2 (ILT2), expresso por monócitos, células B, algumas linhagens de células T e células NK; (2) O receptor de leucócito semelhante à imunoglobulina 4 (ILT4), expresso apenas por monócitos e células dendríticas; e (3) o receptor de célula NK semelhante à imunoglobulina KIR2DL4 que tem uma expressão restrita a células NK CD56+ (KAMISHIKIRYO; MAENAKA, 2009; MENIER et al., 2004; RAJAGOPALAN; LONG, 1999; ROUAS-FREISS et al., 1997; SHIROISHI et al., 2006).
Desta forma, sabendo que a expressão de HLA-G reduz a resposta imune, ela pode ser benéfica ou prejudicial ao organismo dependendo da situação. Em condições patológicas, nas quais uma resposta imune vigorosa e prolongada é necessária, a sua expressão é prejudicial, como nos casos de câncer e infecções virais. De modo oposto, nos casos em que uma resposta imune vigorosa é indesejável, a presença de HLA-G é benéfica, como nos casos de transplantes e de doenças autoimunes (CASTELLI et al., 2014b; DONADI et al., 2011).
O HLA-G é composto de 56 alelos na região codificadora, 18 variantes proteicas podem ser codificadas e duas proteínas truncadas modificadas por alelos nulos (IMGT/HLA Database, 2017). É considerado com poucos polimorfismos quando comparado com os antígenos HLA de classe Ia e II (AGRAWAL et al., 2015).
Por outro lado, a 5’URR do HLA-G, alvo de estudo do presente trabalho, que participa da regulação da transcrição deste gene, tem sido avaliada (BERGER et al., 2010; CASTELLI et al., 2011, 2014a; HVIID et al., 2006; TAN; SHON; OBER, 2005). Acredita-se que a variabilidade de nucleotídeos da região promotora pode estar envolvida na regulação da expressão da molécula, pela modificação da afinidade de fatores transcricionais em suas sequências alvo (DONADI et al., 2011; GIMENES et al., 2014).
1.9 POLIMORFISMOS DA 5’URR E ELEMENTOS REGULATÓRIOS DA EXPRESSÃO DO HLA-G
A variabilidade da região promotora, assim como sua grande extensão (1,5Kb), é maior que a encontrada para os demais genes HLA I (CASTELLI et al., 2014a; GINEAU et al., 2015; MOREAU; FLAJOLLET; CAROSELLA, 2009). Até a presente data foram descritos 43 variações de nucleotídeos únicos (SNVs, do inglês Single
Nucleotide Variations), na 5’URR do gene HLA-G, sendo a maioria, 36
polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) foram descritos por Castelli e colaboradores (2017) em análises in silico (Quadro 1).
Quadro 1 – Lista dos sítios de variação encontrados na região promotora 5’ do HLA-G, descrito por Castelli e colaboradores (2017), identificando os alelos referência e alternativo.
Fonte: Material suplementar (CASTELLI et al., 2017).
Além dos sítios acima citados, foram identificados outros pontos de variação (Quadro 2), cuja referência foi anotada ao lado.
Quadro 2 - Lista com demais pontos de variação encontrados na região promotora 5’ do HLA-G, identificando os alelos referência e alternativo. A referência está informada ao lado dos respectivos sítios.
SNPid Posição relatada IMGT/HLA Alelo referência Alelo alternativo Referência . -1310 C T 1000 Genomes Project . -1306 G A Tan et al., 2005 . -990 G A Tan et al., 2005
rs112940953 -539 A G Castelli et al., 2014a rs138987412 -521 C A Castelli et al., 2014a
. -284 G A Castelli et al., 2014a
. -150 C T Castelli et al., 2014a
Fonte: Elaborado pela autora, 2017, baseado em (1000 GENOMES PROJECT CONSORTIUM et al., 2015; CASTELLI et al., 2014b; TAN; SHON; OBER, 2005).
Essa região é considerada atípica, uma vez que a maioria dos elementos regulatórios presentes e conservados na região promotora dos genes HLA Ia, não se apresentam conservados e funcionais na promotora do HLA-G. O que pode modificar a afinidade pelos fatores transcricionais e suas subunidades (CASTELLI et al., 2014a).
A variabilidade de nucleotídeos da região promotora pode estar envolvida na regulação da expressão da molécula, pela modificação da afinidade de fatores transcricionais em suas sequências alvo (DONADI et al., 2011; GIMENES et al., 2014).
Os sítios de variações da 5’ URR estão intercalados dentro ou perto de regiões conhecidas como elementos regulatórios (MOREAU; FLAJOLLET; CAROSELLA, 2009). Esses sítios também podem estar em desequilíbrio de ligação (DL) com polimorfismos da 3’UTR, que tem sido avaliados em várias populações (AGRAWAL et al., 2015; MISRA et al., 2013). Influenciando assim, a estabilidade do mRNA e a regulação do splicing alternativo (CASTELLI et al., 2011; HIBY et al., 1999).
A região promotora do HLA-G é constituída por módulos regulatórios que estão localizados a montante do códon do início da tradução (Figura 5). A 1.2Kb do primeiro ATG traduzido é identificada a região controladora de locus (LCR, do inglês Locus Control Region) do HLA-G. Esta região participa da expressão do HLA-G, determinando quando e onde ele deve ser expresso. Através da manutenção da configuração ativa da cromatina, aumentando a expressão gênica. Além disso, podem associar-se a complexos proteicos de ativação ou inibição da transcrição do HLA-G (CASTELLI et al., 2014a; GINEAU et al., 2015).
Figura 5 - Representação esquemática do gene HLA-G, demonstrando a região codificadora (éxons e íntrons), e as regiões reguladoras do gene, compostas pelas regiões 3’ não traduzida (3’UTR, do inglês 3’ untranslated region) e com destaque a região promotora 5’ (5’URR, do inglês 5’ upstream regulatory region) com as posições dos elementos regulatórios conhecidos, descritos em Castelli e colaboradores (2014a).
Fonte: Elaborado por Mari Dalva Staffen, 2017, baseado em (CASTELLI et al., 2014b).
Entre esses complexos proteicos estão três sítios de resposta cAMP (CRE, do inglês cAMP Response Elements), que são reportados para a ligação do fator ativador de transcrição 1 (ATF1, do inglês
Activating Transcription Fator 1) (-771 e -1371) e/ou elemento de
resposta ao cAMP ligado a proteína 1 (CREB1, do inglês cAMP
Response Element Binding Protein 1) (-771, -935 e -1371). Mutações
nos três sítios CRE têm sido associadas com a redução da transativação do HLA-G, assim como, foi observado uma forte inibição quando o sítio CRE no LCR estava mutado (CASTELLI et al., 2014a; GINEAU et al., 2015).
Mencionada como sequência regulatória não responsiva no
HLA-G, está o sítio ativado por Interferon-γ (GAS, do inglês Interferon Gamma-activated Site) Adjacente ao GAS, na posição -746, é descrito o
Elemento Responsivo ao γ (ISRE, do inglês
Interferon-Stimulated Response Element), que modula a expressão do HLA-G pela
ligação do fator regulador de interferon 1 (IRF1, do inglês Interferon
Regulatory Fator 1) (-743) (GINEAU et al., 2015; LEFEBVRE et al.,
2001; SILVA; SLOWIK; BICALHO, 2013).
O elemento responsivo ao choque térmico (HSE, do inglês Heat
Shock Element), na porção distal, próximo a posição -480, é responsivo
as proteínas de choque térmico (HSP, do inglês Heat Shock Proteins), especialmente ao fator de choque térmico 1 (HSF-1, do inglês Heat
Shock Factor -1) (-481). As proteínas HSP induzidas por estresse são
importantes componentes que modulam a resposta imune, respostas mediadas por HSE foram detectadas no HLA-G (CASTELLI et al., 2014a; GINEAU et al., 2015; IBRAHIM et al., 2000; SILVA; SLOWIK; BICALHO, 2013).
Outros elementos regulatórios alternativos na promotora do
HLA-G foram descritos. Entre eles, a ligação de um fator repressor RREB1
(Ras-responsive element binding 1) ao elemento de resposta Ras (RRE, do inglês Ras Response Element), cujo mecanismo está associado ao recrutamento de proteínas repressoras que aumentam a condensação da cromatina, dificultando a ligação dos fatores de transcrição (CASTELLI et al., 2014a).
Em oposição, a expressão do HLA-G pode ser induzida pela progesterona, mediada pela ativação do receptor de progesterona (PR, do inglês Progesterone Receptor) e subsequente ligação do elemento de resposta à progesterona (PRE, do inglês Progesterone Response
Element), coincidente com o TATA box, entre as posições -52 e -38
Próximo ao nucleotídeo -201, está presente o acentuador A modificado (EnhA, do inglês Enhancer A), relatado como ligante do homodímero p50/p50 (-187/-171), contém as sequências 1 e 2 alteradas, que afetam a ligação de afinidade do NF- (CASTELLI et al., 2014a; GINEAU et al., 2015; GOBIN et al., 1998; SILVA; SLOWIK; BICALHO, 2013).
O Interferon-Stimulated Response Element (ISRE), localizado ao lado do EnhA, está parcialmente deletado no HLA-G, tornando-o não responsivo ao INF-γ (CASTELLI et al., 2014a; GINEAU et al., 2015; GOBIN et al., 1998, 1999; GOBIN; VAN DEN ELSEN, 2000; ROUSSEAU et al., 2004; SILVA; SLOWIK; BICALHO, 2013).
Junto ao ISRE está o módulo SXY, um alvo para o complexo multiproteico regulador do fator X (RFX, do inglês Regulatory Fator X) (-124). O módulo SXY abrange as sequências S, X1 (homólogas aos genes HLA I clássicos) e X2, denominados como sítios α, e a sequência Y conhecido como EnhB ou box CCAAT (CASTELLI et al., 2014a).
A região promotora do HLA-G não medeia a transativação pelos mecanismos clássicos da transcrição verificados nos demais genes HLAclasse I, tornando esta, uma região única (CASTELLI et al., 2014a).
1.10 HLA-G e CCU
A expressão do HLA-G tem sido citada como mecanismo de escape viral (LAJOIEA et al., 2009) e tumoral (HE et al., 2010; JUNG et al., 2009; MAKI et al., 2008; MENIER; ROUAS-FREISS; CAROSELLA, 2009; PAN et al., 2016). Estudos mostram que, o grau da lesão pré-cancerosa cervical está relacionado com o aumento da expressão do gene, sendo sua expressão mais alta encontrada no câncer cervical (DONG et al., 2010; GILLIO-TOS et al., 2012; GIMENES et al., 2014; LI et al., 2012; SILVA, 2013; SILVA; SLOWIK; BICALHO, 2013).
Assim como as células tumorais, os vírus também desenvolveram diversas estratégias para subverter a resposta imune, incluindo o aumento de fatores que modulam positivamente a expressão do HLA-G (DIAS et al., 2015; DONADI et al., 2011). Apenas uma pequena fração de tipos oncogênicos do HPV produzem lesões de alto grau e câncer cervical, sugerindo, assim, uma possível influência da molécula HLA-G no decurso clínico da infecção por HPV (GIMENES et al., 2014). Desta forma, os sítios polimórficos da 5’ URR, em conjunto com o tipo viral,
podem estar associados ao escape imunológico, à suscetibilidade e ao desenvolvimento de lesões do colo do útero.
2 JUSTIFICATIVA
O CCU é uma das principais causas de morbidade e mortalidade para as mulheres em todo o mundo. Seu rastreamento no Brasil é feito pelo exame Papanicolau (citopatológico), no qual se detecta lesões assintomáticas, potencialmente curáveis do trato genital feminino inferior (INCA, 2016). É uma técnica segura, simples e de baixo custo, porém, questionamentos têm sido levantados quanto a sua sensibilidade, devido ao fato dos índices dos resultados falsos-negativos variarem amplamente, de 5 a 70%. O cuidado de preparo da paciente e as variações das técnicas de coleta geram essa variação (GILLIO-TOS et al., 2012; NASCIMENTO; SILVA; MONTEIRO, 2012).
Sabendo ainda que, a interferência de polimorfismos do gene
HLA-G, juntamente com oncoproteínas virais nas respostas do sistema
imune, podem alterar o ciclo celular causando lesões precursoras do câncer, as quais progridem para o CCU.
Há a necessidade de estudos que possibilitem métodos de rastreio, diagnóstico e tratamento, principalmente quando as mulheres se encontram infectadas com o HPV. Sabendo-se que a expressão do
HLA-G inibe células do sistema imunológico, participando assim na
progressão da doença, a melhor compreensão dos polimorfismos da região promotora 5’UR, poderá gerar dados sobre a utilização dos sítio polimórficos nesta região, como marcadores diagnósticos e prognósticos para esta patologia.
