UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE QUÍMICA
QUÍMICA
ISABELA ABREU TRINDADE DA SILVA
ESPECTROFLUORIMETRIA PARA A DETERMINAÇÃO DE ASPARTAME COMO ADULTERANTE EM ADOÇANTES
NITERÓI 2016
II
ISABELA ABREU TRINDADE DA SILVA
ESPECTROFLUORIMETRIA PARA A DETERMINAÇÃO DE ASPARTAME COMO ADULTERANTE EM ADOÇANTES
Monografia apresentada ao Curso de Graduação de Bacharelado em Química Industrial da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel em Química Industrial.
Orientadora: Profa. Dra. Flávia Ferreira de Carvalho Marques Coorientadora: Ma. Renata Corrêa de Carvalho
III
ISABELA ABREU TRINDADE DA SILVA
ESPECTROFLUORIMETRIA PARA A DETERMINAÇÃO DE ASPARTAME COMO ADULTERANTE EM ADOÇANTES
Monografia apresentada ao Curso de Graduação de Bacharelado em Química Industrial da Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para a obtenção do Grau de Bacharel em Química Industrial.
Aprovada em 19 de dezembro de 2016.
BANCA EXAMINADORA
Niterói 2016
IV
S586 Silva, Isabela Abreu Trindade
Espectrofluorimetria para a determinação de aspartame como adulterante em adoçantes / Isabela Abreu Trindade Silva. – Ni- terói: [s.n.], 2016.
51f.
Trabalho de Conclusão de Curso - (Bacharelado em Quími- ca Industrial) – Universidade Federal Fluminense, 2016. 1. Espectroscopia de fluorescência. 2. Fluorimetria. 3. Edul- corante. 4. Método analítico. I. Título.
V
A vida vai ficando cada vez mais dura perto do topo. (Friedrich Nietzsche)
VI
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por tudo que fez, faz e fará por mim. Por seu cuidado e consolo nos momentos difíceis. Por não ter me deixado desistir e me abençoar todos os dias com vida e saúde. Tudo que alcancei até hoje foi por sua grandiosa graça e misericórdia. Não tenho palavras pra agradecer o seu amor por mim.
Agradeço ao meu muito saudoso e amado pai, Agenor, que sempre me ensinou o caminho correto a seguir, sempre me deu todas as oportunidades de conquistar meus sonhos e sempre me ensinou a ser o melhor que eu possa ser. A pessoa que mais vibrou com todas as minhas conquistas, desde as mais bobas até as mais importantes. Devo muito a ele por ter me dado educação e me ensinado valores que carregarei eternamente comigo, mas principalmente por ter me ensinado o que é o amor. Dedico todas as minhas conquistas a ele e gostaria do fundo do meu coração que estivesse aqui.
Agradeço a minha mãe e aos meus irmãos, Rosangela, Raphael e Bruno por estarem comigo e sempre cuidarem de mim. Por me incentivarem e acreditarem no meu potencial.
Agradeço ao meu marido, Rodrigo, que muitas vezes aguentou meu mau humor nos finais de período da faculdade, me incentivando em todos os momentos. Sou grata por seu amor, carinho, cuidado, paciência e compreensão, por ser meu ombro amigo e ouvir meus desabafos.
Agradeço a minha orientadora, Profa. Dra. Flávia Marques, por ter sido tão atenciosa comigo. Por ter se mostrado uma professora no sentido mais profundo da palavra, não apenas de uma disciplina, mas uma professora de vida.
Agradeço a minha querida coorientadora, Renata Corrêa, por toda paciência em me ensinar e auxiliar no meu projeto, o que tornou tudo muito mais agradável. Por estar sempre pronta para tirar minhas dúvidas, se mostrando interessada e empolgada com nosso projeto. É bom trabalhar com pessoas assim!
Agradeço aos professores da UFF pelo exemplo de profissionais que foram para mim, principalmente aos professores Euler Gigante, Eluzir Chacon, Méri Vieira, João Célio e Odivaldo Cambraia. Gostaria também de agradecer ao Prof. Annibal Duarte Pereira Netto, por ceder espaço em seu laboratório para que eu pudesse realizar meu projeto de monografia.
Por fim, agradeço às amigas Julianna Pinho, Olívia Moreira, Barbara Jardim e Laís Oliveira por todo apoio que sempre me deram e que tornaram os dias na UFF inesquecíveis.
VII
RESUMO
A alimentação tem um papel fundamental na preservação de uma boa saúde. Uma dieta rica em açúcar pode resultar em ganho de peso e alterações das taxas sanguíneas, como glicose e colesterol. O aumento da preocupação com estes riscos foi o motivador para o desenvolvimento de edulcorantes, que são substâncias menos calóricas e que podem substituir o açúcar refinado. No entanto, o uso dos edulcorantes artificiais em adoçantes de mesa desperta a atenção dos consumidores devido à existência de dados controversos no que diz respeito à segurança em sua utilização. Dentre os vários edulcorantes existentes, o aspartame tem sido alvo de diversas pesquisas no campo científico que o responsabilizam por alterações neuroquímicas, além de problemas dermatológicos, respiratórios, neurológicos e até mesmo câncer. Ainda não há, na literatura, relatos de metodologias de análise para determinação de aspartame utilizando a espectrofluorimetria. Por este motivo, este trabalho teve como objetivo desenvolver um método baseado na fluorimetria para a determinação deste edulcorante, especialmente como contaminante em adoçantes de mesa que apresentam outra composição, verificando se os mesmos estão em conformidade com a informação fornecida no rótulo. As condições analíticas otimizadas foram: (i) soluções de amostra e padrão preparadas em água ultrapura e (ii) varredura normal com medições dos sinais fluorescentes em λexc/λem = 210/285 nm. O método analítico foi
validado, demonstrando linearidade na faixa de 0,5 a 5,0 mg L-1, e alta sensibilidade verificada através do limite de detecção de 0,13 mg L-1. Repetitividade com RSD = 3,2% (n = 7) e precisão intermediária com tcalculado (0,191) < tcrítico (2,780) para 95% de confiança, demonstraram a boa
precisão do método. Diferentes marcas de adoçante que não continham aspartame em sua composição foram analisadas, e em nenhuma delas este edulcorante foi detectável. Portanto, o método desenvolvido neste trabalho é bastante simples e de baixo custo, podendo ser uma ótima alternativa para o controle de qualidade destes tipos de adoçantes, garantindo a segurança principalmente dos consumidores que não podem ingerir aspartame, como fenilcetonúricos, gestantes e lactentes.
Palavras chave: alimentação, saúde, edulcorantes, aspartame, contaminante, determinação, espectrofluorimetria.
VIII
ABSTRACT
The feeding has a fundamental role in preserving good health. High consumption of sugar may result in weight gain and changes in blood rates such as glucose and cholesterol. The development of sweeteners came with the risks associated with the consumption of sugars. However, the use of artificial sweeteners in tabletop sweeteners has attracted the attention of consumers because of the existence of controversial data regarding the safety of their use. Aspartame, an artificial sweetener, has been responsible for neurochemical alterations, as well as dermatological, respiratory, neurological and even cancer problems. There are still no reports in the literature of methodologies for the determination of aspartame using spectrofluorimetry. For this reason, the aim of this work was to develop a method based on fluorimetry for the determination of this sweetener, especially as a contaminant in tabletop sweeteners that present another sweetener in their composition. The optimized analytical conditions were: (i) sample solutions and standard solutions prepared in ultrapure water and (ii) normal scanning with fluorescence signal measurements at λexc / λem = 210/285 nm. The analytical method was
validated, showing linearity in the range of 0.5 to 5.0 mg L-1, and high sensitivity verified through the limit of detection of 0.13 mg L-1. Repeatability with RSD = 3.2% (n = 7) and intermediate precision with tcalculate (0,191) <tcritical (2,780) at 95% confidence, demonstrated the
good precision of the method. Different brands of sweeteners that did not contain aspartame in their composition were analyzed, and in none of them was this sweetener detectable. Therefore, the method developed in this work is quite simple and low cost, and can be a great alternative for the quality control of these types of sweeteners, ensuring the safety of consumers who can not ingest aspartame, such as phenylketonuric, pregnant women and infants.
Keywords: food, health, sweeteners, aspartame, contaminant, determination, spectrofluorimetry.
IX SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 16 1.1 Alimentação... 16 1.2 Edulcorantes... 17 1.3 Aspartame... 18
1.4 Métodos analíticos para determinação de aspartame... 20
2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS ...22
2.1 Objetivos... 22
2.1.1 Objetivo geral ... 22
2.1.2 Objetivos específicos ... 22
2.2 Justificativas... 22
3. FLUORIMETRIA – BREVE FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA... 24
4. MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO E MÉTODOS... 27
4. 1 Materiais e Reagentes... 27
4.1.1 Amostras...27
4.2 Soluções...27
4.3 Medições por espectrofluorimetria... 28
4.4 Preparo das amostras de adoçante em pó...28
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...30
5.1 Verificação do par excitação/emissão (exc/em) fluorescente para o aspartame ...30
5.2 Estudo do efeito do solvente...31
5.3 Estudo da influência do pH... .32
5.4 Estudo da influência do tratamento fotoquímico...36
5.5 Estudo da estabilidade do aspartame em meio aquoso...37
5.6 Condições finais experimentais otimizadas para a determinação espectrofluorimétrica do aspartame...38
5.7 Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito...39
5.8 Aplicação do método analítico...42
X
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura química do aspartame... 18
Figura 2: Diagrama de orbitais moleculares no estado fundamental e excitado da molécula...24
Figura 3: Diagrama simplificado indicando os processos que ocorrem na fluorescência...25
Figura 4: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1 e (b) água ultrapura (branco)...30
Figura 5: Espectros de excitação e emissão fluorescentes dos solventes (a) metanol, (b) etanol, (c) metanol:água 1:1, (e) água ultrapura e de (d) solução aquosa do aspartame 1,0 mg L-1, todos obtidos em fenda de 20 nm...31
Figura 6: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1 em HCl 0,1 mol L-1 e(b) HCl 0,1 mol L-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20 nm...32
Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1 em NaOH 0,1 mol L-1 e(b) NaOH 0,1 mol L-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20 nm...33
Figura 8: Os principais produtos de degradação do aspartame quando em (a) baixos valores de pH e (b) elevados valores de pH...34
Figura 9: Reação de ciclização intramolecular do aspartame (Fonte: adaptado de referência 38)...34
Figura 10: Influência do pH no sinal fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1...35
Figura 11: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 210 nm e λem = 285 nm,
fenda de 20 nm) da solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1, após diferentes tempos de irradiação UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os espectros da água ultrapura (branco) apresentados em (d)...37
Figura 12: Estudo da estabilidade de uma solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1 ao longo do tempo. Medições realizadas em fenda de 20 nm...38
XII
Figura 13: Curva analítica para soluções aquosas de aspartame obtida através de varredura normal (λexc/λem = 210/285 nm) em fenda de 10 nm...40
Figura 14: Gráfico de resíduos para as determinações fluorimétricas soluções aquosas de aspartame...40
Figura 15: Espectros de excitação e emissão de (a) amostra E (adoçante com aspartame), (b) solução aquosa de aspartame 5,0 mg L-1, (c) amostra A (adoçante sem aspartame), (d) água ultrapura (branco). Os resultados para as amostras B, C e D mostrados na Tabela 7 foram iguais ao resultado da amostra A...44
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais métodos analíticos instrumentais reportados na literatura para determinação de aspartame...21
Tabela 2: Comparação entre os sinais líquidos fluorescentes do aspartame em pH original da solução aquosa (7,62), e em meios fortemente ácido e básico...33
Tabela 3: Comprimentos de onda máximos de excitação (λexc) e emissão (λem) fluorescente do
aspartame 1,0 mg L-1 e os seus respectivos sinais líquidos em diferentes valores de pH (tampão Britton-Robinson) e em solução aquosa... 35
Tabela 4: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1. Medições realizadas em fenda de 20 nm...36
Tabela 5: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação espectrofluorimétrica do aspartame em adoçantes...39
Tabela 6: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por
espectrofluorimetria...42
Tabela 7: Determinação de aspartame em amostras de adoçantes de mesa (sachês de 800 mg)...43
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária BRICS - Brasil, Rússia, Índia, China e África do Sul DPR – Desvio Padrão Relativo
DKP - Dicetopiperazina
FDA – Food and Drug Administration FAO – Food and Agriculture Organization IDA – Ingestão Diária Aceitável
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia JECFA – Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives LAQAFA – Laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
OMS – Organização Mundial de Saúde
SVS/MS - Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde UERJ– Universidade Estadual do Rio de Janeiro
VIGITEL - Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico
u.a. – Unidades arbitrárias
WHO – World Health Organization
XV
16
1. INTRODUÇÃO
1.1 Alimentação
A alimentação tem um papel fundamental na vida de todos os seres vivos. No entanto, tem se tornado cada vez mais industrializada, devido à praticidade e ao pouco tempo que a correria do dia a dia impõe. A organização humanitária britânica, Oxfam, realizou uma pesquisa revelando que o país que tem a alimentação mais saudável no mundo é a Holanda e, em 25º lugar no ranking, ficou o Brasil. 1
A relação direta entre o que as pessoas comem e a influência em sua saúde tem causado preocupação. Já é comprovado cientificamente que obesidade, doenças cardiovasculares, distúrbios metabólicos e diabetes são consequências não só do sedentarismo, mas também da má alimentação. 2
Uma dieta baseada em alimentos ricos em açúcar e gordura é o fator determinante que resulta em peso corporal inadequado. Estudos indicam que, no Brasil, a obesidade e sobrepeso atingem 30% das crianças e adolescentes. 3, 4
Baseados nessa questão atual, pesquisadores do Instituto de Medicina da Universidade Estadual do Rio de Janeiro (UERJ) desenvolveram um guia de alimentação saudável com recomendações e instruções sobre os alimentos que devem ser ingeridos em uma dieta ideal e como cada um desses nutrientes influencia na perda ou ganho de peso. Entre as recomendações para uma boa alimentação destacam-se a redução de açúcar, refrigerantes, sal, leites e derivados com alto teor de gordura. 3
Outro seguimento importante que tem se destacado na busca por uma alimentação balanceada e de baixo teor calórico é o de desenvolvimento muscular corporal, que é cada vez mais almejado nas academias de ginástica. A busca pelo corpo “ideal” tem feito muitas pessoas mudarem sua alimentação e aumentarem os níveis de exercício físico. Porém, não são poucos os casos de internações, bulimia, anorexia e, em casos mais extremos, morte, devido à busca pelo estereótipo imposto pela sociedade. 5
O aumento percentual da obesidade para os brasileiros adultos (índice de massa corporal acima de 25), segundo o BRICS (Brasil, Rússia, Índia, China e África do Sul, países que compartilham de uma situação econômica com índices de desenvolvimento e
17
situações econômicas parecidas), foi de 39% em 2006 para 49% em 2014 (mulheres) e de 47% em 2006 para 57% em 2014 (homens). 6
O estudo feito pela Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico (VIGITEL) demonstra que o número de brasileiros acima do peso vêm crescendo com o passar dos anos; porém, ainda fica abaixo da média quando comparado à África do Sul, Rússia e China, ficando acima apenas da Índia. 6
1.2 Edulcorantes
O aumento na preocupação com os riscos oferecidos pelo consumo excessivo de produtos com sacarose em sua composição, como refrigerantes, salgados e massas, foi o grande motivador do desenvolvimento de substâncias que permitissem a substituição desse açúcar por algo menos calórico e que mantivesse o sabor adocicado dos mesmos.
Neste contexto, os edulcorantes são substâncias com poder adoçante elevado e baixo teor calórico utilizados na formulação de produtos destinados a pessoas diabéticas e/ou obesas. 7, 8
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou, em 2014, que o consumo de açúcar fosse reduzido de 10% da dieta diária para apenas 5% tanto para adultos quanto para crianças. O objetivo dessa recomendação é a diminuição na quantidade de açúcar ingerido a partir de produtos industrializados que muitas vezes não são vistos como doce. No ketchup, por exemplo, a quantidade de açúcar é de 4 g em uma colher de chá, enquanto que em uma lata de refrigerante tem cerca de 40 g em geral. 8, 9
A substituição ou diminuição do açúcar deve ser levada em consideração por sua riqueza em calorias e pobreza em nutrientes. O açúcar refinado, mais utilizado à mesa, após as etapas de refinamento fica pobre em vitaminas e sais minerais, permanecendo, em quase totalidade, a sacarose. 9
Os adoçantes de mesa, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), são produtos formulados para conferir sabor doce aos alimentos e bebidas, e são constituídos por edulcorante(s) previsto(s) em Regulamento Técnico para Açúcares e Produtos para Adoçar (Resolução RDC nº 271, de 22 de setembro de 2005)12. Dentre os edulcorantes artificiais destacam-se a sacarina, ciclamato, acesulfame-k, sucralose e o aspartame (substância de interesse neste trabalho).8
O uso dos edulcorantes artificiais em adoçantes de mesa desperta a preocupação dos consumidores devido à existência de dados controversos no que diz respeito à segurança em
18
sua utilização. Antes da autorização do consumo de qualquer um desses aditivos, faz-se necessário um controle rigoroso com avaliação toxicológica em que os efeitos do uso desses edulcorantes devem ser observados por longos períodos para caracterização de acúmulo no organismo e detecção de possível toxicidade. São encontrados relatos na literatura que relacionam seu consumo como causa de problemas graves de saúde como câncer, alergias e hiperatividade. Portanto, todos os aditivos devem ser analisados periodicamente, pois podem sofrer variações nas condições de utilização que alterem seu comportamento, aumentando ou diminuindo sua possível toxicidade. 9, 10, 11
1.3 Aspartame
O aspartame, descoberto acidentalmente em 1965 por um pesquisador dos laboratórios G. D. Searle, nos Estados Unidos, é um tipo de edulcorante sintético que apresenta poder adoçante 200 vezes maior que a sacarose. Seu sabor é o mais próximo ao do açúcar comum, o que é relativamente bom quando comparado com a grande maioria dos edulcorantes sintéticos que podem apresentar gosto agridoce, doce-azedo, doce metálico ou até mais doce que o próprio açúcar. 12, 13
Quimicamente chamado de N-L-alfa-aspartil-L-fenilalanina-L-metil-éster, com fórmula química C14H18N2O5, massa molar 294,301g mol-1 e é sólido branco solúvel em
água, sendo composto pelos aminoácidos ácido aspártico e fenilalanina. A Figura 1 apresenta sua estrutura química. 13
Figura 1: Estrutura química do aspartame.
O consumo de aspartame só foi autorizado no Brasil em 1988, após a realização de diversos estudos toxicológicos e, ainda assim, há questionamentos em relação a sua segurança e toxicidade. Após ingestão, o aspartame é rapidamente hidrolisado no intestino
19
formando o dipeptídeo L-aspartil-L-fenilalanina e metanol. Por sua vez, o dipeptídeo é metabolizado nas células da mucosa intestinal em ácido aspártico e fenilalanina e o metanol é metabolizado em formaldeído e, então, em ácido fórmico. Estudos realizados in vivo demonstram que o formaldeído pode estar relacionado com o aumento da incidência de linfomas e leucemias, porém, segundo alguns autores, seriam necessárias altas doses de aspartame para gerar toxicidade, uma vez que a quantidade de metanol e, consequentemente, de formaldeído liberada pela digestão do aspartame é muito pequena 14, 15, 16. Pesquisadores buscam a confirmação ou não da relação do consumo de aspartame com aparecimento de tumores, câncer, mudanças de humor e perda de memória12, 17,18. Alguns efeitos colaterais associados ao aspartame, já comprovados cientificamente, são indução de reações de hipersensibilidade, manifestadas por urticária, prurido e angioedema, e acidose tubular renal, quando consumido em grande quantidade. 14
A avaliação toxicológica deste agente edulcorante pelo Joint Food and Agriculture Organization (FAO) / World Health Organization (WHO) Expert Committee on Food
Additives (JECFA), um comitê científico internacional de especialistas que avalia a
inocuidade de aditivos alimentares, estabeleceu que a Ingestão Diária Aceitável (IDA) de aspartame seria de 40 mg kg-1 de peso corpóreo, valor que também corresponde à IDA do aspartame no Brasil.15, 19
Segundo o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO), o aspartame é contraindicado para fenilcetonúricos, gestantes e lactentes 12. A contraindicação do consumo de aspartame durante a gestação é motivada pelo acúmulo de ácido aspártico. Segundo o pesquisador Sturtevant20, através de suas pesquisas em ratos, a ingestão considerável de aspartame é responsável pela produção de necrose neuronal hipotalâmica. O autor Stegink, por sua vez, afirma que o ácido aspártico não se acumula nos tecidos fetais e, por isso, não existe comprovação da toxicidade fetal resultante do consumo de aspartame durante a gestação. 21
Um dos mais evidentes e comprovados danos causados pela ingestão de aspartame remete às pessoas com uma doença rara, conhecida mundialmente como fenilcetonúria. Trata-se da mutação no gene responsável pela codificação da enzima fenilalanina-hidroxilaTrata-se, ativada no fígado e com função de metabolizar o aminoácido fenilalanina em tirosina. Quantidades excessivas de fenilalanina no sangue fazem com que este aminoácido tenha capacidade de entrar no Sistema Nervoso Central, causando consequências tóxicas gravíssimas, como retardo mental. Essa doença é diagnosticada no “teste do pezinho” em recém-nascidos, por isso é de suma importância sua realização. O diagnóstico precoce é
20
fundamental para controle e tratamento adequado da doença, sendo necessária a exclusão ou substituição de todos os alimentos que forneçam, de alguma forma, a fenilalanina. Esse controle impede o desenvolvimento de retardo mental, porém, são necessários alimentos que deem o aporte proteico que é perdido pela exclusão desse aminoácido. 22
Segundo a determinação da Portaria da Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde - SVS/MS N.º 29/98, deve constar no rótulo de alimentos com adição de aspartame, em negrito, a informação “contém fenilalanina” para que se torne possível o controle dietético pelos portadores dessa deficiência metabólica. 23
1.4 Métodos analíticos para a determinação de aspartame
O aspartame tem sido alvo de diversas pesquisas no campo científico, principalmente devido ao interesse da indústria em comprovar ou não se este edulcorante é prejudicial à saúde. As técnicas mais utilizadas para sua determinação é a espectrofotometria de absorção molecular no UV-visível, Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (HPLC) e eletroforese capilar (EC), ambas acopladas com detectores espectrofotométricos de absorção no ultravioleta (UV) 10, 24, 25. Alguns métodos espectrofotométricos, métodos cromatográficos e eletroforéticos encontrados na literatura para esta determinação estão resumidos na Tabela 1. Métodos baseados na espectrofluorimetria para a determinação do aspartame não foram amplamente explorados como os anteriores, sendo somente encontrados na literatura métodos cromatográficos utilizando a técnica de Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (HPLC) acoplada com detector de fluorescência.
21
Tabela 1. Principais métodos analíticos instrumentais reportados na literatura para determinação de aspartame.
Técnica utilizada Características Referências
Eletroforese Capilar - UV λ = 220 nm 26 LD = 5,1 mg L-1 LQ = 9,4 mg L-1 Faixa Linear = 6,5 - 21,5 mg L-1 Espectrometria de absorção no UV-Vís
Determinação indireta do aspartame utilizando ninidrina como reagente
derivatizante. λ = 603 nm LD = 0,577 mg L-1 LQ não especificado Faixa Linear = 5,89 - 58,9 mg L-1 27 HPLC – UV λ = 210 nm 28 LD = 0,08 mg L-1 LQ = 0,23 mg L-1 Faixa Linear = 1,5 - 50 mg L-1 HPLC-Fluorescência
Determinação indireta do aspartame utilizando fluorescamina como
reagente de fluorescência λexc/λem = 395/482 LD = 0,04 mg L-1 LQ não especificado Faixa Linear = 1,0 – 4,0 mg L-1 29
Portanto, como não há na literatura registro de desenvolvimento de método espectrofluorimétrico para a determinação de aspartame, a proposta desse trabalho foi desenvolver um novo método analítico baseado na espectrofluorimetria, que seja de fácil realização, simples, rápido e economicamente favorável para sua quantificação em adoçantes de mesa. Comparada a outras técnicas, como HPLC, a espectrofluorimetria apresenta maior rapidez, simplicidade e menor consumo de reagentes.
22
2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS
2.1 Objetivos
2.1.1 Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de um método analítico baseado na espectrofluorimetria que seja simples, rápido, sensível e de baixo custo para determinação do edulcorante artificial aspartame como adulterante em adoçantes de mesa.
2.1.2 Objetivos específicos
- Estudar as características fluorescentes da molécula do aspartame para a otimização das condições experimentais que proporcionem a melhor sensibilidade para o método espectrofluorimétrico;
- Validar a metodologia desenvolvida considerando os seguintes parâmetros: linearidade e faixa linear, limites de detecção e quantificação, precisão e exatidão;
- Realizar estudos de preparo das amostras (adoçantes de mesa);
- Aplicar o método para quantificar aspartame, principalmente em adoçantes de mesa na forma de pó (sachês), que dizem não ter este edulcorante em sua formulação, verificando se os mesmos estão em conformidade com a informação fornecida no rótulo;
2.2 Justificativas
O mercado de consumo dos adoçantes de mesa encontra-se em expansão não só pelo aumento de casos de diabetes, mas também porque a procura por este produto é motivada por interesse das pessoas em manter a boa forma corporal, já que os adoçantes têm uma quantidade de calorias muito menor que o açúcar comum.
No entanto, conforme já mencionado na Seção 1.3, o uso do aspartame é alvo de diversas críticas devido à sua possível toxicidade. Muitos estudos indicam que seu consumo em excesso pode causar reações graves à saúde como problemas dermatológicos, respiratórios, neurológicos e até mesmo câncer. 10
23
Por este motivo, visando preservar a saúde do consumidor, é importante ampliar e simplificar os meios analíticos para quantificação deste edulcorante, principalmente com o intuito de identificar a sua presença ou não como adulterante em adoçantes de mesa nos quais os fabricantes declaram não conter este edulcorante.
24
3. FLUORIMETRIA – BREVE FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A fluorescência é um fenômeno que ocorre devido à emissão da radiação por espécies químicas (luminóforos) após terem absorvido radiação eletromagnética na região do visível e do ultravioleta. Portanto, ao absorver um fóton, a molécula é promovida para um estado de maior energia, denominado estado excitado singleto (S1). Uma molécula que não absorveu nenhum
fóton encontra-se no estado fundamental singleto, denominado S0 (Figura 2). A fluorescência,
portanto, é caracterizada pela transição da molécula do estado excitado ao estado fundamental com liberação de fótons, mantendo o mesmo número quântico de spin. 30, 31
Figura 2: Diagrama de orbitais moleculares no estado fundamental e excitado da molécula.31
O diagrama a seguir (Figura 3) representa, de forma sucinta, as etapas do fenômeno da fluorescência. Pode-se observar a ocorrência da absorção de energia eletromagnética pela molécula ocasionando a transição eletrônica do estado fundamental para o estado excitado de maior energia e, em seguida, o relaxamento da molécula do nível de mais alta energia para um de menor dentro daquele mesmo estado vibracional e, por último, a liberação de fótons que resulta na fluorescência. 31
25
Figura 3: Diagrama simplificado indicando os processos que ocorrem na fluorescência. 31
Quanto maior a população de elétrons deslocalizados em uma molécula, maior seu potencial fluorescente. Esta característica é preponderante em moléculas orgânicas aromáticas. Existem também outros fatores que interferem diretamente na fluorescência, como a estrutura da molécula, temperatura, o solvente utilizado, o pH na solução do analito, a presença de heteroátomos e espécies capazes de desativar a molécula.31, 32
A presença de heteroátomos, por exemplo, afeta a fluorescência principalmente quando estes estão ligados diretamente com o sistema π conjugado, pois há redução da energia devido à transição eletrônica ser do tipo n → π* que representa absorção molar muito menor do que transições do tipo π → π* que acontecem na ausência de heteroátomos resultando na diminuição da fluorescência neste tipo de molécula. Estruturas planares de moléculas são favorecidas pelo aumento na conjugação e interação dos elétrons deslocalizados. 31
O tipo de solvente escolhido deve levar em consideração que suas características podem afetar a fluorescência, pois conforme a sua polaridade, caráter prótico e viscosidade podem acontecer aumento ou diminuição do sinal fluorescente. 31
A espectrofluorimetria constitui uma técnica de obtenção de espectros de emissão molecular partindo da excitação do analito em comprimentos de onda específicos. A aplicação de energia em forma de luz sobre o analito resulta na excitação da amostra em seu comprimento de onda de absorção que é chamado também de excitação e, em um comprimento de onda maior de emissão chamado de comprimento de onda de fluorescência.
26
Os espectros fluorescentes regularmente apresentam imagens de excitação e emissão que podem ser sobrepostas. Isto acontece devido às diferenças de energia entre os estados vibracionais no estado fundamental e no estado excitado serem as mesmas. 31
27
4 MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO E MÉTODOS
4.1 Materiais e reagentes
A água ultrapurificada (18,2 MΩcm) utilizada para o preparo de todas as soluções aquosas foi obtida a partir do sistema de purificação de água Arium Bagtanks, Sartorius, Alemanha. Ácido clorídrico P.A. (Vetec, Brazil), hidróxido de sódio (Merck, Brasil), etanol (Vetec, Brasil) e metanol (J.T.Baker, EUA) foram utilizados na otimização do método espectrofluorimétrico. Ácido bórico (Vetec, Brasil), ácido fosfórico (Vetec, Brasil) e ácido acético (Vetec, Brasil) foram utilizados no preparo do tampão Britton-Robinson e o pH foi ajustado com solução de NaOH 0,1 mol L-1 com auxílio de um pHmetro (DM-22, Digimed, Brasil). Câmara de radiação ultravioleta construída no próprio laboratório - LaQAFA (Laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada) foi usada para o estudo da influência do tratamento fotoquímico no sinal fluorescente do aspartame.34
4.1.1 Amostras
Quatro marcas distintas de adoçantes de mesa comercializados em forma de pó (sachê), cuja composição (segundo o rótulo do fabricante) não apresentava o aspartame como edulcorante, foram analisadas neste trabalho. Estes adoçantes foram adquiridos de diferentes estabelecimentos comerciais (restaurantes, lanchonetes e padarias) da cidade de Niterói, RJ-Brasil.
4.2 Soluções
Para a otimização do método espectrofluorimétrico foi utilizada solução padrão de aspartame 1,0 mg L-1 (0,0034 mol L-1), obtida a partir da diluição de solução estoque 100 mg L-1 em diferentes solventes, como metanol, etanol, HCl 0,1 mol L-1, NaOH 0,1 mol L-1 e tampão Britton-Robinson em diferentes valores de pH.
O tampão Britton-Robinson foi preparado com a mistura de partes iguais das soluções de ácido fosfórico 0,04 mol L-1, ácido acético 0,04 mol L-1 e ácido bórico
28
0,04 mol L-1 com adições de volume adequado de NaOH 0,1 mol L-1 para atingir o pH desejado.
O estudo do efeito da radiação ultravioleta foi realizado com a solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1. Esta solução foi colocada em tubos de quartzo (1,9 cm de diâmetro e 13,7 cm de altura) e posicionada no centro do reator fotoquímico por 15 e 30 minutos.
A partir da solução estoque 100 mg L-1 (0,34 mol L-1), preparada a cada dia de análise, foram feitas diluições e soluções de 0,5; 0,75; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 mg L-1 que foram utilizadas na construção das curvas analíticas.
4.3 Medições por espectrofluorimetria
O estudo da fluorescência do aspartame foi realizado no espectrofluorímetro da marca VARIAN, modelo Cary Eclipse, tendo como fonte de excitação uma lâmpada pulsátil do tipo descarga de xenônio, com 80 Hz e 12 watts. O equipamento apresenta abertura de fenda (banda espectral de passagem) variando de 1,5 a 20 nm e permite velocidade de varredura de 0,01 a 2400 nm min-1. Seu detector, um fotomultiplicador PMT R928, tem resposta sensível que detecta radiação até 900 nm. A aquisição de dados e total controle do equipamento foi feita com o sistema operacional SWEclipse® Bio Pack V 1.1 (XP WIN2000) software.
Para a medidas espectrofluorimétricas, foram utilizadas as bandas espectrais de passagem de 10 e 20 nm, com velocidade de varredura de 1200 nm s-1 e cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm. Os comprimentos de onda de excitação (exc) e
emissão (em) máximos do aspartame em que foram feitas as medidas foram exc/em=
210/285 nm. Os valores dos sinais dos brancos foram medidos em todas as análises para que, posteriormente, fossem feitos os cálculos dos valores líquidos referentes ao sinal fluorescente do analito.
4.4 Preparo das amostras de adoçante em pó
Todo o conteúdo dos sachês das amostras de adoçantes foi pesado (800 mg) e dissolvido em 250 mL de água ultrapura. As soluções foram previamente filtradas, antes
29
das medidas por espectrofluorimetria, com filtros de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) de porosidade 0,45 μm, para eliminar os excipientes dos adoçantes que não são totalmente solúveis em água.
30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método analítico espectrofluorimétrico eficaz, rápido e de baixo custo para determinação de aspartame em adoçantes, tendo em vista que não existem muitas citações na literatura que utilizem esta técnica na determinação em questão.
Foram realizados estudos de otimização, através da avaliação de fatores como solvente, pH do meio e irradiação ultravioleta, com o objetivo de verificar a influência destes parâmetros no sinal fluorescente do aspartame e garantir maior seletividade e sensibilidade ao método.
5.1 Verificação do par excitação/ emissão (exc/em) fluorescente para o aspartame
O primeiro estudo realizado foi a verificação dos comprimentos de onda máximos de excitação (λexc) e de emissão (λem) fluorescente do aspartame através da
varredura de sua solução aquosa a 1,0 mg L-1. O par exc/em encontrado foi 210/285 nm
e os respectivos espectros de excitação e emissão, obtidos com fenda de 20 nm, podem ser vistos na Figura 4.
200 250 300 0 200 400 600 800 1000 Comprimento de onda (nm) In te n sid ad e d o s in al flu o re sc en te ( u .a .) (a) (b) (a) (b)
Figura 4: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1 e (b) água ultrapura (branco).
31
5.2 Estudo do efeito do solvente
A viscosidade, a polaridade e o caráter prótico do solvente afetam diretamente a luminescência do analito, sendo que os solventes mais polares tendem a estabilizar os luminóforos no estado excitado, desfavorecendo perda de energia por processos como relaxação vibracional e favorecendo a fluorescência 35. Sendo assim, metanol, etanol e água:metanol (1:1 v/v) foram utilizados com o objetivo de verificar a influência do solvente no sinal fluorescente do aspartame.
Os resultados obtidos (Figura 5) mostraram que os solventes metanol, etanol e a mistura metanol:água (1:1 v/v) apresentavam alto sinal de fundo (provavelmente por contaminantes provenientes da própria fabricação), tornando inviável o uso para medição do aspartame.
Portanto, a utilização de água como solvente apresentou vantagens, tornando o método mais simples, barato e seguro. Além disso, tendo em vista que a aplicação do método é em amostras de adoçantes, o uso de soluções aquosas dispensaria um tratamento dos rejeitos. Por este motivo, o desenvolvimento do método espectrofluorimétrico prosseguiu com o emprego de água ultrapura como solvente.
In ten sid ad e do sin al flu o re sc en te (u .a .) 200 250 300 0 200 400 600 800 1000 Comprimento de onda (nm) (c) (e) (a) (d) (b) (d) (e)
Figura 5: Espectros de excitação e emissão fluorescentes dos solventes (a) metanol, (b) etanol, (c) metanol:água 1:1, (d) solução aquosa do aspartame 1,0 mg L-1 e de (e) água ultrapura, todos obtidos em fenda de 20 nm.
32
5.3 Estudo da influência do pH
O pH é um parâmetro muito importante na fluorescência devido às diferenças entre as propriedades luminescentes de moléculas com carga ou neutras, sendo que as primeiras apresentam maior chance de fluorescer devido à maior rigidez molecular 35. Sendo assim, foi realizado um estudo das características fluorescentes do aspartame em meio ácido e básico, utilizando soluções deste analito em HCl 0,1 mol L-1 e NaOH 0,1 mol L-1.
As Figuras 6 e 7 mostram os espectros de excitação e emissão fluorescentes do aspartame nos meios ácido e básico, respectivamente. Como pode ser visto, houve um decréscimo no sinal líquido fluorescente do aspartame em ambos os meios, em comparação com o sinal líquido deste analito em meio aquoso (pH original igual a 7,62). Além disso, observou-se também um deslocamento do λexc de 210 nm (em água
ultrapura) para 220 nm (em NaOH 0,1 mol L-1). A Tabela 2 apresenta a comparação entre os sinais líquidos fluorescentes do aspartame nos meios aquoso, ácido e básico, demonstrando que maiores intensidades foram alcançadas em solução aquosa.
(a) (b) 200 250 300 0 200 400 600 800 1000 Comprimento de onda (nm) In ten sid ad e do sin al flu o re sc en te (u .a .) (a) (b)
Figura 6: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1 em HCl 0,1 mol L-1 e(b) HCl 0,1 mol L-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20 nm.
33 (b) (a) 200 250 300 0 200 400 600 800 1000 Comprimento de onda (nm) In ten sid ad e do sin al flu o re sc en te (u .a .) (a) (b)
Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1 em NaOH 0,1 mol L-1 e(b) NaOH 0,1 mol L-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20 nm.
Tabela 2: Comparação entre os sinais líquidos fluorescentes do aspartame em pH original da solução aquosa (7,62), e em meios fortemente ácido e básico.
Solvente Sinal líquido fluorescente do aspartame
Água ultrapura 390
HCl 0,1 mol L-1 306
NaOH 0,1 mol L-1 331
O aspartame é relativamente estável no estado sólido e a baixas temperaturas. Porém, a degradação da substância em solução é dependente do pH do meio e da temperatura. Em meios com baixos valores de pH, o dipeptídeo é hidrolisado em seus aminoácidos constituintes (ácido aspártico e fenilalanina); já em altos valores de pH, uma ciclização intramolecular ocorre formando o DKP (dicetopiperazina) como principal produto de degradação. As reações citadas são favorecidas pelo aumento da
34
temperatura e do tempo de exposição do aspartame às condições necessárias para sua degradação. A Figura 8 apresenta os principais produtos de degradação do aspartame e na Figura 9 observa-se a reação de ciclização intramolecular do aspartame com a formação de DKP 36, 37, 38.Portanto, sabendo-se que o aspartame é instável em soluções ácidas e básicas, é possível sugerir que a variação do sinal fluorescente nestes meios pode ser devido à degradação da molécula gerando substâncias que apresentam sinais fluorescentes menores do que o do aspartame em solução aquosa.
Figura 8: Os principais produtos de degradação do aspartame quando em (a) baixos valores de pH e (b) elevados valores de pH. (Fonte: adaptado de referência 38).
Figura 9: Reação de ciclização intramolecular do aspartame (Fonte: adaptado de referência 38).
Um estudo mais detalhado do pH foi realizado utilizando tampão Britton-Robinson na faixa de valores de pH compreendidos entre 2,0 e 12,0. Pequenos deslocamentos do par λexc/λem e diferentes valores de intensidade fluorescente foram
35
observados em comparação com solução aquosa do analito, conforme apresentado na Tabela 3 e na Figura 10. Como a maior intensidade fluorescente foi obtida em solução aquosa, evidenciou-se que o emprego do tampão Britton-Robinson para obtenção de diferentes valores de pH não favoreceu o aumento da sensibilidade do método.
Tabela 3: Comprimentos de onda máximos de excitação (λexc) e emissão (λem)
fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1 e os seus respectivos sinais líquidos em diferentes valores de pH (tampão Britton-Robinson) e em solução aquosa.
pH λexc/λem (nm) Sinal líquido fluorescente (u.a.) 2,0 197/290 149 4,0 210/285 243 6,0 220/297 34
7,62 (pH original da solução aquosa) 210/285 390
8,0 210/285 65 10,0 215/290 133 12,0 215/290 24 0 100 200 300 400 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 pH In te n sid ad e do sin al flu o re sc en te (u .a .)
36
5.4 Estudo da influência do tratamento fotoquímico
De um modo geral, a incidência de radiação UV sobre a solução do analito pode ocasionar uma transformação na molécula de forma a produzir derivado(s) com fluorescência maior do que a molécula inicial (ganho de sensibilidade para o método), além de reduzir o sinal de potenciais interferentes. Por outro lado, o efeito contrário também pode ocorrer, ou seja, a irradiação UV pode produzir derivados com menor eficiência quântica. 35
Sabendo disso, soluções aquosas do aspartame a 1,0 mg L-1 condicionadas em tubos de quartzo foram submetidas a diferentes tempos (15 e 30 min) de irradiação UV em câmara de UV artesanal construída no próprio laboratório. Os resultados obtidos estão na Tabela 4, na qual é possível observar uma queda considerável na intensidade do sinal fluorescente do analito quando exposto à irradiação UV. No entanto, não houve alteração dos comprimentos de onda máximos de excitação e emissão após tratamento fotoquímico.
Tabela 4: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1. Medições realizadas em fenda de 20 nm.
Tempo na câmara de UV (min)
Sinal líquido fluorescente (u.a.)
0 332
15 18
30 0
Portanto, estes estudos demonstraram que o uso da irradiação UV não era vantajoso para o método, pois houve grande perda de sensibilidade, conforme também pode ser visto nos espectros de excitação e emissão mostrados na Figura 11.
37 200 250 300 350 0 200 400 600 800 1000 Comprimento de onda (nm) In ten sid ad e d o s in al flu o re sc en te (u .a .) (c) (c) (a) (a) (b) (b) (d) (d)
Figura 11: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 210 nm e λem = 285 nm,
fenda de 20 nm) da solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1, após diferentes tempos de irradiação UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os espectros da água ultrapura (branco) apresentados em (d).
5.5 Estudo da estabilidade do aspartame em meio aquoso
Como já mencionado na Seção 5.3, o aspartame tem certa estabilidade quando está no estado sólido e a baixas temperaturas, podendo sofrer degradação dependendo do meio, do pH, da temperatura e do tempo em que se encontra em solução.
Um estudo da estabilidade do sinal fluorescente do analito em solução aquosa foi realizado com o intuito de saber por quanto tempo a solução deste analito poderia ser preservada sem que houvesse qualquer alteração do sinal. A Figura 12 apresenta o resultado deste estudo, o qual foi realizado em solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1, com medições feitas em intervalos de 30 em 30 min durante 4 h e 30 min.
38
Figura 12: Estudo da estabilidade de uma solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1 ao longo do tempo. Medições realizadas em fenda de 20 nm.
Com este estudo, concluiu-se que a solução aquosa de aspartame pode ser armazenada em temperatura ambiente e sem a necessidade de estar ao abrigo da luz por até 3h e 30min, sem que a mesma sofra alteração significativa de suas características luminescentes originais. Além disso, nenhum deslocamento das bandas de excitação e emissão fluorescentes foi observado.
5.6 Condições finais experimentais otimizadas para a determinação espectrofluorimétrica do aspartame
Após os estudos de otimização dos parâmetros principais para obtenção do melhor sinal analítico e, consequentemente, melhor sensibilidade, realizados nas Seções de 5.1 a 5.5, a Tabela 5 apresenta as condições finais obtidas.
39
Tabela 5: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação espectrofluorimétrica do aspartame em adoçantes.
Tipo de Varredura Normal
λexc/λem 210/285
pH original (pH = 7,62)
Solvente Água ultrapurificada
Como pode ser visto, o método desenvolvido apresenta condições experimentais que são extremamente simples, sendo esta uma grande vantagem que favorece a sua aplicação.
5.7 Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito
Os parâmetros analíticos de mérito foram obtidos para o aspartame nas condições estabelecidas na Tabela 6, de acordo com o documento DOQ-CGCRE-008 (“Orientação sobre validação de métodos analíticos”) do INMETRO. 39
Para a obtenção dos parâmetros relacionados com a resposta linear, pelo menos três curvas analíticas foram construídas e cada ponto da curva foi o resultado médio de três medições de sinal de fluorescência obtidos no comprimento de onda máximo de emissão (285 nm). As curvas foram realizadas em banda espectral de passagem (fenda) de 20 ou 10 nm, sendo os melhores resultados obtidos em fenda de 10 nm. Este estudo permitiu verificar uma faixa de resposta linear que se estendeu de 0,5 mg L-1 a 5,0 mg L
-1
, caracterizada pelo valor de R2 igual a 0,9977 (Figura 13); e o comportamento homoscedástico foi confirmado através do gráfico de resíduos (Figura 14).
40
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Si
na
l fl
uo
res
cente
(u.
a
.)
Concentração (mg L
-1)
Figura 13: Curva analítica para soluções aquosas de aspartame, obtida através de varredura normal (λexc/λem = 210/285 nm) em fenda de 10 nm.
-8,0 -6,0 -4,0 -2,0 0,0 2,0 4,0 6,0 0,0 2,0 4,0 6,0
R
es
íduo
s
Concentração (mg L
-1)
Figura 14: Gráfico de resíduos para as determinações fluorimétricas de soluções aquosas de aspartame.
41
A detectabilidade do método foi avaliada pelos valores de limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ) usando os seguintes critérios: LD = 3s/a e LQ= 10s/a, em que s é o desvio padrão de 7 medições independentes do branco (água ultrapura) e a é o coeficiente angular da curva analítica. Valores satifatórios de 0,13 e 0,43 mg L-1 foram obtidos para o LD e LQ, respectivamente.
A precisão foi avaliada em termos da repetitividade e precisão intermediária. A repetitividade representa a concordância entre os resultados de medições sucessivas efetuadas sob as mesmas condições de medição, ou seja, mesmo procedimento, analista e instrumento usado sob as mesmas condições, mesmo local e repetições em um curto intervalo de tempo. Neste trabalho, a repetitividade foi avaliada através de 7 medições consecutivas, usando solução aquosa de aspartame na concentração de 3,0 mg L-1 (centro da curva analítica). O resultado obtido produziu um desvio padrão relativo de 3,2%, sendo este valor considerado satisfatório, pois é menor que o valor máximo permitido (5%).39
Já a precisão intermediária refere-se à precisão avaliada sobre a mesma amostra, utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório, mas definindo exatamente quais as condições a variar (uma ou mais), tais como: diferentes analistas; equipamentos e tempos. Neste trabalho optou-se por avaliar a precisão intemediária através de 7 medições independentes de solução aquosa de aspartame 3,0 mg L-1 realizadas pelo mesmo analista em dias diferentes. O teste t-Student (nível de confiança de 95%) foi usado para comparar as médias do sinal líquido fluorescente obtidas em dias diferentes. O valor de tcalculado (0,191) obtido foi menor que o valor de tcrítico (2,780), sendo assim,
pode-se concluir que não existe diferença entre as médias dos sinais fluorescentes obtidos em dias diferentes, e, portanto, o método é preciso no nível de precisão intermediária.
A viabilidade do método foi verificada através de ensaios de recuperação. Amostras de adoçantes de mesa (em pó - sachês) de quatro diferentes marcas (A, B, C e D), em triplicatas autênticas, foram fortificadas com concentração conhecida de aspartame (1,0 mg L-1) e as recuperações foram obtidas através da seguinte equação: Recuperação (%) = [(C1-C2)/C3]*100, em que C1 é a concentração do analito na amostra
fortificada; C2 é a concentração do analito na amostra não fortificada e C3 é a
42
amostras variou de 111 a 120%, o que representa um resultado satisfatório40, confirmando a eficácia e a viabilidade do método desenvolvido para a determinação de aspartame em adoçantes.
Enfim, um resumo dos resultados dos parâmetros analíticos de mérito pode ser visto na Tabela 6.
Tabela 6: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por espectrofluorimetria.
Parâmetros analíticos de mérito Aspartame
Equação da curva analíticaa Y = 37,754*X – 5,7865
Coeficiente de determinação (R2) 0,9977
Faixa linear (mg L-1) 0,5 – 5,0
LD(mg L−1) 0,13
LQ(mg L−1) 0,43
Repetitividade(DPR%, n = 7) 3,2%
Precisão intermediária(teste t-Student; 95%
confiança; n=14, 2 dias) tcalculado (0,191) < tcrítico (2,780)
Recuperação média (n = 3) 111-120%
a
Y = intensidade do sinal fluorescente (u.a.); X = concentração do aspartame em mg L−1
5.8. Aplicação do método analítico
O método analítico espectrofluorimétrico desenvolvido foi aplicado para análise de adoçantes de mesa, comercializados na forma de pó (listados na Tabela 7), os quais, segundo o rótulo dos fabricantes, não continham aspartame em sua composição. Estas determinações tinham como objetivo verificar se estes adoçantes estavam em
43
conformidade com a informação fornecida ao consumidor, ou seja, confirmar se realmente não tinham aspartame (seria um adulterante) na mistura em pó.
As amostras estudadas (A, B, C e D) apresentavam em sua composição os mesmos excipientes, entre eles dióxido de silício (antiumectante) e lactose (diluente). Para comparação, uma amostra de adoçante de mesa (identificada como E) com os mesmos excipientes das demais amostras, mas apresentando o aspartame como edulcorante, também foi analisada. Todos os adoçantes (A, B, C, D e E) foram preparados conforme descrito no item 4.4 e analisados através do método espectrofluorimétrico desenvolvido com as condições apresentadas na Tabela 5, utilizando banda espectral de passagem de 10 nm. Dois sachês de cada marca foram analisados e os sinais fluorescentes das amostras A, B, C e D corresponderam ao sinal fluorescente da água ultrapura (branco). Estes resultados levam à conclusão de que os adoçantes (A, B, C e D) cuja composição era sucralose, realmente não apresentavam o aspartame como um contaminante a um nível detectável pelo método espectrofluorimétrico desenvolvido neste trabalho. Vale ressaltar que o método desenvolvido apresentou boa sensibilidade, com limite de detecção de 0,13 mg L-1 (130 ppb) para o aspartame.
Este método, portanto, pode ser uma alternativa simples aplicada ao controle de qualidade destes tipos de adoçantes, garantindo a segurança principalmente dos consumidores que não podem ingerir aspartame, como fenilcetonúricos, gestantes e lactentes.
Os resultados deste estudo podem ser vistos na Tabela 7 e na Figura 15.
Tabela 7: Determinação de aspartame em amostras de adoçantes de mesa (sachês de 800 mg).
Marcas Tipo de
edulcorante Informação no rótulo
Concentração de aspartame (mg L-1) A Sucralose Não contêm fenilalanina < LD
B Sucralose - < LD
C Sucralose - < LD
44 200 250 300 0 200 400 600 800 1000 Comprimento de onda (nm) In ten sid ad e do sin al flu o re sc en te (u .a .) (a) (a) (b) (b) (c) (d) (c)(d)
Figura 15: Espectros de excitação e emissão de (a) amostra E (adoçante com aspartame), (b) solução aquosa de aspartame 5,0 mg L-1, (c) amostra A (adoçante sem aspartame), (d) água ultrapura (branco). Os resultados para as amostras B, C e D mostrados na Tabela 7 foram iguais ao resultado da amostra A.
45
6 CONCLUSÕES
Com o intuito de quantificar aspartame em amostras de adoçantes de mesa, principalmente naqueles cuja composição não deve conter este (como informado no rótulo), um método baseado na espectrofluorimetria foi desenvolvido e validado com sucesso. Estudos das características fluorescentes deste analito foram realizados e as condições finais mostraram que o método apresentou sensibilidade, precisão e exatidão adequadas. Além disso, o método foi aplicado em diferentes amostras de adoçante à base de sucralose e o aspartame não foi detectado.
Como continuação e trabalho futuro, pretende-se ainda realizar ensaios de recuperação em dois outros níveis de concentração (0,5 e 4,0 mg L-1), além de experimentos para melhorar as taxas de recuperação, aproximando-as mais do valor de 100%.
Uma quantidade maior de adoçantes de mesa de diferentes composições, marcas e tipos (em pó e líquido) também será analisada para verificar a presença ou não de aspartame na formulação. Amostras de bebidas dietéticas (sucos, refrigerantes) também poderão ser estudadas. No entanto, vale acrescentar que, dependendo da amostra, estudos de interferência e seletividade deverão ser realizados, pois a espectrofluorimetria pode não ser uma técnica muito seletiva para algumas amostras, visto que muitas substâncias podem fluorescer na mesma faixa de comprimento de onda.
Enfim, o método desenvolvido neste trabalho pode ser uma boa alternativa para análise de rotina no controle de qualidade de alguns adoçantes de mesa.
46
7 BIBLIOGRAFIA
1. OXFAM. Index: Good enought to eat. 2014.
Disponível em: <https://www.oxfam.org/en/pressroom/pressreleases/2014-01-15/dutch-beat-french-and-swiss-top-oxfams-new-global-food-table>. Acesso em: 19 jun. 2016.
2. MARIATH, A. B., et al; Obesidade e fatores de risco para o desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíveis entre usuários de unidade de alimentação e nutrição. Cadernos de saúde pública, v. 23(4), p.897-905, 2007.
3. SICHIERI, R., COITINHO, D. C., MONTEIRO, J.B., COUTINHO, W. F.; Recomendações de Alimentação e Nutrição Saudável para a População Brasileira. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v. 44(3), p. 227-232, 2000.
4. OLIVEIRA, C. L.; FISBERG. M.; Obesidade na infância e adolescência – uma verdadeira epidemia. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v. 47(2), p. 107-108, 2003.
5. ROSA, Y.; Ditadura da estética: a busca pelo corpo perfeito. Portal PUC-RIO digital. Disponível em: < http://puc-riodigital.com.puc-rio.br/Texto/Ciencia-e-
Tecnologia/Ditadura-da-estetica%3A-a-busca-pelo-corpo-perfeito-4306.html#.V2dDgbiU200>. Acesso em: 19 jun. 2016.
6. FORMIGA, I.; Excesso de peso atinge 52% dos brasileiros, segundo pesquisa
Vitigel. Disponível em: <
http://g1.globo.com/bemestar/noticia/2015/04/excesso-de-peso-atinge-525-dos-brasileiros-segundo-pesquisa-vigitel.html>. Acesso em: 19 jun. 2016.
47
7. CARVALHO, L. C.; Estudos termoanalíticos dos edulcorantes acessulfame-K, aspartame, ciclamato,esteviosídeo e sacarina. 2007. 89 p. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade de São Paulo.
8. MANHANI. T. M., CAMPOS M. V. M., DONATI, F. P.; Sacarose, suas propriedades e os novos edulcorantes. Revista Uniara, v. 17(1), p. 113- 125, 2014.
9. Disponível em: <http://veja.abril.com.br/saude/oms-reduz-a-metade-quantidade-de-acucar-recomendada-ao-consumo/>. Acesso em: 21 jun. 2016.
10. HONORATO, T. C., BATISTA, E., NASCIMENTO, K. O., PIRES, T.; Aditivos alimentares: aplicações e toxicologia. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, v. 8 (5), p. 01-11, 2013.
11. ALBUQUERQUE, M. V., SANTOS, S. A., CERQUEIRA, N. T.V., SILVA, J.A.; Educação Alimentar: Uma Proposta de Redução do Consumo de Aditivos Alimentares. Química Nova na Escola, v. 34 (2), p. 51-57, 2012.
12. INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAÇÃO E QUALIDADE INDUSTRIAL. Adoçantes de mesa e adoçantes dietéticos,
2006. Disponível em:<
http://www.inmetro.gov.br/consumidor/produtos/adocantes.asp>. Acesso em: 29 jun. 2016.
13. FREITAS, A. S., et al; Edulcorante artificial: Aspartame – uma revisão da literatura. Revista Eletrônica Multidisciplinar Pindorama, v. 1, 2010.
14. SOFFRITTI, M., DEGLI. E. D., LAMBERTINI. L.; Aspartame induces lymphomas and leukaemias in rats. European Journal of Oncology, v. 10 (2), p. 107-116, 2005.
48
15. ANVISA (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA). Informe Técnico nº 17, de 19 de janeiro de 2006. Brasília, DF, 2006. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/alimentos/informes/17_190106.htm>. Acesso em 30 jun. 2016.
16. WEIHRAUCH, M. R.; DIEHL, V. Artificial sweeteners - do they bear a carcinogenic risk? Annals of Oncology, v. 15, p.1460-1465, 2004.
17. ROBERTS, H. J.; Aspartame and brain cancer. The Lancet, v. 349, p. 362, 1997.
18. SALINAS, R.D.; Alimentos e nutrição: introdução a bromatologia. Trad. Fátima Murad. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002.
19. JECFA/WHO (JOINT FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS/ WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES). World Health Organization of the United Nations. Evaluation of certain food and additives. Geneva, 1981.
20. STURTEVANT, F. M. Use of aspartame in pregnancy. International Journal of Fertility e Sterility, v. 30 (1), p. 85-87, 1985.
21. STEGINK, L. D. The aspartame story: a model for the clinical testing of a food additive. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 46, p. 204-215, 1987.
22. MONTEIRO, L. T. B., CÂNDIDO. L. M. B. Fenilcetonúria no Brasil: evolução e casos. Revista de Nutrição, v. 19 (3), p. 381-387, 2006.
23. ANVISA (AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA). Informe técnico nº 14, de 8 de abril de 2005. Brasília, DF, 2005. Disponível em: < http://www.anvisa.gov.br/alimentos/informes/14_080405.htm>. Acesso em: 30 jun. 2016.
49
24. JI, C. et al; Simultaneous determination of artificial sweeteners in beverage by ultra performance liquid chromatography. Chinese Journal of Chromatrography (Se Pu), v. 27 (1), p. 111-113, 2009.
25. ZHU, Y., GUO, Y., YE, M., JAMES, F. S.; Separation and simultaneous determination of four artificial sweeteners in food and beverages by íon chromatography. Journal of Chromatography A, v. 1085 (1), p. 143-146, 2005.
26. VISTUBA, J. P., et al; Sub-minute method for simultaneous determination of aspartame, cyclamate, acesulfame-k and saccharin in food and pharmaceutical samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A, v. 1396, p. 148-152, 2015.
27. VIEIRA, I. C., FILHO. O. F.; Determinação espectrofotométrica de aspartame em produtos dietéticos usando ninidrina como reagente. Química Nova, v. 18 (2), 1995.
28. GREMBECKA, M., et al.; Simultaneous determination of aspartame, acesulfame-K, saccharin, citric acid and sodium benzoate in various food products using HPLC-CAD-UV/DAD. European Food Research and Technology, v. 238, p. 357-365, 2014.
29. SANCHEZ,F.G.; GALLARDO, A.A. Liquid chromatographic and spectrofluorimetric determination of aspartame and glutamate in foodstuffs following fluorescamine fluorigenic labeling. Analytica Chimica Acta, v. 270, p.45-53,1992
50
30. HURTUBISE, Robert J. Phosphorimetry. Theory, Instrumentation and Applications. VHC: New York, 1990.
31. MARQUES, F. F.; Desenvolvimento de métodos analíticos espectroluminescentes e eletroforéticos para determinação de alcaloides (beta-carbolinas, camptotecina e derivados) de interesse farmacológico. 237 p. Tese (Doutorado em Química), Programa de Pós-Graduação em Química, Pontíficia Universidade Católica, Rio de Janeiro, 2009.
32. VO-DINH, T. Room Temperature Phosphormetry for Chemical Analysis. Canadá: John Wiley & Sons, 1984.
33. HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 5ª ed, 2001.
34. GOUVÊA, M.M., LIMA, G.S., SILVA, A.A., NETTO, A.D.P., MARQUES, F.F.C. Aplicação da radiação ultravioleta como forma de contribuição para a química verde e construção de um reator fotoquímico alternativo e de baixo custo para pré-tratamento de amostras. Química Nova, v.37, p. 337-343, 2014.
35. SKOOG, D.A., HOLLER, F.J.; NIEMAN, T.A. Princípios de Análise Instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 836 p., 2002.
36. SABAH, S.; SCRIBA, G.K. Determination of aspartame and its degradation and epimerization products by capillary electrophoresis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v.16, p.1089-1096, 1998.
37. HSIEH, T. J.; CHEN, S. A facile HPLC method for optical purity and quantitative measurements of phenylalanine from the hydrolyzed aspartame under different pH and temperature after its derivatization with a fluorescent reagent. Amino Acids, v.33, p. 123-128, 2007.
38. BERSET, J.D.; OCHSENBEIN, N. Stability considerations of aspartame in the direct analysis of artificial sweeteners in water samples using high-performance
51
liquid chromatography–tandem mass spectrometry (HPLC–MS/MS). Chemosphere , v.88, p. 563-569, 2012.
39. BRASIL. Documento de caráter orientativo. Orientação sobre validação de métodos analíticos. Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial, 2011.
40. BRASIL. Resolução no 899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Brasília, 2003.
