Importância das etapas pré-analíticas na dosagem de bicarbonato nos pacientes renais crônicos em hemodiálise

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE BIOMEDICINA

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IMPORTÂNCIA DAS ETAPAS PRÉ-ANALÍTICAS NA DOSAGEM DE BICARBONATO NOS PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ANÁLISES CLÍNICAS

NITERÓI

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IMPORTÂNCIA DAS ETAPAS PRÉ-ANALÍTICAS NA DOSAGEM DE BICARBONATO NOS PACIENTES RENAIS CRÔNICOS EM HEMODIÁLISE

Monografia apresentada à Universidade Federal Fluminense/ Sede Niterói como Trabalho de Conclusão de Curso para a obtenção do grau Bacharel em Biomedicina, habilitação em Análises Clínicas.

Orientadora:

Profª Drª Analúcia Rampazzo Xavier

NITERÓI 2018

Ficha elaborada pela bibliotecária Alanda do Valle Vitorino CRB-7 6148/0 P149 Lopes, Bianca de Freitas Muzy

Importância das etapas pré-analíticas na dosagem de bicarbonato nos pacientes renais crônicos em hemodiálise / Bianca de Freitas Muzy Lopes.- Niterói: [ s.n.], 2018.

46 f.

Orientadora: Analúcia Rampazzo Xavier.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Biomedicina) - Universidade Federal Fluminense, 2018.

1. Insuficiência Renal Crônica. 2. Diálise Renal. 3. Cetose 4. Bicarbonatos. 5. Fase pré-analítica. I. Xavier, Analúcia Rampazzo. II. Universidade Federal Fluminense. Graduação em Biomedicina. III. Título.

AGRADECIMENTOS

Sou grata à Deus, a quem devo tudo o que sou e o que tenho. “Até aqui nos ajudou o Senhor” (I Samuel 7:12b) foi o que experimentei durante esses últimos 5 anos em que, longe da minha família, vivi momentos difíceis e, através disso, pude aprender a depender dEle em cada detalhe, vivendo um dia de cada vez somente pela Sua infinita Graça.

Gostaria de agradecer e honrar a minha família, em especial a meus pais, Iredil e Lucimar, por todo o incentivo e apoio que me deram desde o início, mesmo a 180 km de distância. Por sempre acreditarem no meu potencial e me instruírem com os valores que tenho hoje que me auxiliam nas minhas tomadas de decisão. Agradeço por me ensinarem que devo lutar para alcançar os meus objetivos e assim, me ajudarem a fazê-lo e não me deixarem desistir. Obrigada por serem o meu lar onde me sinto segura e por serem uma base tão firme que me manteve de pé durante esses anos.

Agradeço ao meu amor, Davi, que me fez sentir amada todos os dias, mesmo de longe. Que fez com que os dias difíceis não parecessem tão difíceis assim, que soube colocar um sorriso no meu rosto quando eu mais precisava, soube falar palavras de consolo, e soube compartilhar das minhas alegrias como se fossem as dele.

Obrigada aos meus amigos e familiares tão queridos que fazem parte da minha história e que em momentos de descontração me lembravam o valor da vida apesar das dificuldades. Aos meus avós Amaro e Lucy, que sempre sonharam com o dia da minha formatura e assim me motivaram a dar o meu melhor e conquistar esse objetivo, assim como minha avó Jandyra, que recentemente nos deixou e está ao lado do nosso Pai, obrigada por demonstrarem tanto amor por mim e me ensinarem com o exemplo de vida.

Em especial, agradeço às minhas amigas e companheiras de apartamento, Anne e Carol, que chegaram de surpresa, quase no final da faculdade, mas fizeram toda a diferença na minha vida. Com elas, a rotina cansativa se tornou mais leve e teve um pouco mais de graça. Elas foram a minha família em Niterói, me acolheram com amor, e me fizeram me sentir mais perto de casa. À minha orientadora, Analúcia, muito obrigada por me ensinar tanto e por ser tão presente. Que com todo o carinho não media esforços para me ajudar e sempre se apresentou disponível, mesmo com tantos afazeres. Eu não poderia ter escolhido melhor orientadora, sou grata à Deus pela sua vida.

do seu tempo à mim e certamente contribuíram no desenvolvimento desse projeto; à Camilla que, graças ao seu projeto de mestrado pude desenvolver o meu de monografia; à Nathalia e à Renata da coordenação que sempre estiveram dispostas a me atender com toda paciência. Sou imensamente grata aos farmacêuticos dos laboratórios onde desenvolvi minha pesquisa, Alexander Timote Ferreira e Sônia Aparecida Gonçalves de Jesus Ferreira, que prontamente abriram as portas para mim e foram cruciais para que as análises fossem feitas corretamente. Muito obrigada pelo seu tempo dedicado a mim e pela sua contribuição na minha pesquisa. Agradeço também aos pacientes que se dispuseram a participar dessa pesquisa, contribuindo para uma possível melhora na avaliação laboratorial do seu estado clínico.

Por fim, agradeço a todos que oraram por mim durante esse período da minha vida, que me encorajaram, e aos que direta ou indiretamente estiveram comigo ao longo desse tempo. Muito obrigada!

RESUMO

O rim tem como finalidade, entre outras funções, estabelecer o equilíbrio ácido-básico e eletrolítico no organismo saudável. Nos pacientes com doença renal crônica, esse mecanismo de regulação fica comprometido e é comum observarmos acidose metabólica tanto nos pacientes em tratamento conservador quanto nos com falência funcional renal, em hemodiálise. A relação do aumento na mortalidade de pacientes em diálise com a presença da acidose metabólica é um assunto que vem sendo estudado, porém a real extensão deste problema no Brasil permanece desconhecida. Atualmente existem estes métodos disponíveis para determinação do bicarbonato: a gasometria venosa ou arterial para determinação do pCO2 total, o método de determinação de reserva alcalina, sendo

que este já vem sendo abandonado, e o mais recente, o método enzimático. Ainda não existe um método laboratorial adequado para avaliação de acidemia, uma vez que os exames que são coletados em clínicas satélites e encaminhados posteriormente para o laboratório, são influenciados pela demora no transporte e realização do exame, afetando assim a precisão e acurácia dos resultados, considerando que o CO2 é volátil. Portanto,

consideramos de utilidade estudar as variáveis pré-analíticas pelo novo método enzimático visando melhoria nesta fase para que a avaliação laboratorial de acidose metabólica seja mais precisa entre pacientes hemodialisados. Nesse estudo foram comparados os métodos de gasometria arterial com o enzimático, procurando estabelecer qual o mais conveniente para mensuração do estado ácido-básico nesse grupo específico de pacientes. Ficou evidente a importância da eficácia na realização dos procedimentos pré-analíticos para garantir maior acurácia nas dosagens de bicarbonato tanto em gasometrias quanto em método enzimático. O tempo de espera não influenciou de forma significativa nos resultados obtidos nos métodos comparados, mas o método químico mostrou-se mais seguro pois trata-se de um método de quantificação, e não de cálculos para a obtenção dos valores de bicarbonato, como é feito na gasometria A refrigeração mostrou-se mais eficaz na preservação da amostra em ambos os métodos e a centrifugação das amostras para a dosagem bioquímica do bicarbonato é essencial para a preservação da amostra biológica, no que tange a evitar hemólise e possíveis interferentes.

Palavras-chave: Doença renal crônica, hemodiálise, acidose metabólica, fase pré-analítica, bicarbonato.

ABSTRACT

The purpose of the kidney is, among other things, to establish the acid-base balance in the healthy organism. In patients with chronic kidney disease, this regulatory mechanism is compromised, and it is common to observe metabolic acidosis in patients on conservative treatment and in patients with renal functional failure on hemodialysis. The relation between the increase of mortality in patients on dialysis and the presence of metabolic acidosis is a subject that has been studied, but the real extension of this problem in Brazil remains unknown. There are three methods currently being used for determination of bicarbonate: the analysis of arterial blood gases for determination of total pCO2, the method of alkaline reserve determination, which is already being

abandoned, and the most recent, the enzymatic method. There still isn’t an appropriate laboratorial method for the evaluation of acidemia, since the blood exams there are collected in satellite clinics and later sent to the laboratory are influenced by the delay in transportation and examination, thus affecting the precision and accuracy of the results, considering the volatility of CO2. Therefore, we considered it useful to study the

pre-analytical variables with the objective of improving at this stage so that the laboratory evaluation of metabolic acidosis is more accurate among hemodialysis patients. In this study, the analysis of arterial blood gases and the enzymatic method were compared, pursuing to establish which is the most convenient for measuring acid-base status in this specific group of patients. The importance of efficiency in performing the pre-analytical procedures was evident to guarantee greater accuracy for determination of bicarbonate in both methods. Waiting time did not significantly influence the obtained results by the compared methods, but the chemical method proved to be the most reliable, once it is a quantification method, different then the calculation to determinate bicarbonate values, as done in arterial blood gas analysis. Refrigeration shown to be efficient in the preservation of the samples in both methods. And centrifuge tubes for biochemical analysis has shown to be essential for the preservation of the biological sample in terms of avoiding hemolysis and possible interferents.

Keywords: Chronic kidney disease, hemodialysis, metabolic acidosis, pre-analytical phase, bicarbonate.

LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS

FIGURA 1 – Fluxograma de descrição detalhada do processamento das amostras de acordo com o seu determinado tempo de análise... 19 GRÁFICO 1 – Comparação entre as amostras de sangue total em relação ao tempo de espera para a análise de gasometria (A) refrigeradas (B) Não refrigeradas... 25 GRÁFICO 2 – Comparação entre as amostras em relação ao tempo de espera para a análise pelo método enzimático. (A) centrifugadas refrigeradas (B) centrifugadas não refrigeradas (C) não centrifugadas refrigeradas (D) não centrifugadas não

refrigeradas... 26 GRÁFICO 3 – Comparação entre as amostras centrifugadas e não centrifugadas das dosagens de bicarbonato pelo método enzimático... 27 GRÁFICO 4 – Comparação entre as amostras refrigeradas e não refrigeradas das

dosagens de bicarbonato pelo método enzimático... 28 GRÁFICO 5 – Comparação entre as médias da pCO2 e pH das amostras refrigeradas e

não refrigeradas dosadas pela gasometria evidenciando os pontos em que houve diferença estatística. (A) pCO2 em amostras de gasometria refrigeradas (B) pH em

amostras de gasometria refrigeradas (C) pCO2 em amostras de gasometria não

refrigeradas (D) pH em amostras de gasometria não refrigeradas (E) pCO2 em todas as

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Caracterização das amostras quanto ao sexo, idade, tempo de diálise, doenças de base e comorbidades... 23 TABELA 2 – Média e desvio padrão das amostras de gasometria e do método

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

aNAD+ - Análogo do cofator NAD aNADH – Análogo do cofator NADH ANOVA – Análise de Variância C – Centrifugado

CAAE – Certificado de Apresentação para Apreciação Ética CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

CnR – Centrifugado não refrigerado

CONEP – Comissão Nacional de Ética em Pesquisa CO2 – Dióxido de carbono

CR – Centrifugado Refrigerado DP – Desvio padrão

E0CR – Enzimático até 1 hora refrigerado E0CnR – Enzimático até 1 hora não refrigerado

E4CR – Enzimático de 4 horas centrifugado refrigerado E4CnR – Enzimático de 4 horas centrifugado não refrigerado E4nCR – Enzimático de 4 horas não centrifugado refrigerado E4nCnR – Enzimático de 4 horas não centrifugado não refrigerado E8CR – Enzimático de 8 horas centrifugado refrigerado

E8CnR – Enzimático de 8 horas centrifugado não refrigerado E8nCR – Enzimático de 8 horas não centrifugado refrigerado E8nCnR – Enzimático de 8 horas não centrifugado não refrigerado E24CR – Enzimático de 24 horas centrifugado refrigerado

E24CnR – Enzimático de 24 horas centrifugado não refrigerado E24nCR – Enzimático de 24 horas não centrifugado refrigerado E24nCnR – Enzimático de 24 horas não centrifugado não refrigerado Ed. – Edição

EPIs – Equipamentos de Proteção Individual EUA – Estados Unidos da América

G0R – Gasometria até 1 hora refrigerada G0nR – Gasometria até 1 hora não refrigerada G4R – Gasometria de 4 horas refrigerada G4nR – Gasometria de 4 horas não refrigerada G8R – Gasometria de 8 horas refrigerada G8nR – Gasometria de 8 horas não refrigerada G24R – Gasometria de 24 horas refrigerada G24nR – Gasometria de 24 horas não refrigerada GnR – Gasometria não refrigerada

GR – Gasometria refrigerada H+ - Íon hidrogênio

H2O – Água

HCO-3 – Íon bicarbonato

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana HUAP – Hospital Universitário Antônio Pedro

NADH – Dinucleótido de nicotinamida e adenina reduzido MDH – Malato Desidrogenase

nC – Não centrifugado nm – nanômetro nR – Não refrigerado

pCO2 – Pressão parcial de CO2

PEPCX – Fosfoenolpiruvato carboxilase Pi –Fosfato inorgânico

ppm – Partes por milhão R – Refrigerado

SBPC/ML – Sociedade Brasileira de Patologia Clínica/ Medicina Laboratorial SPSS – Statistical Package for the Social Sciences

SUMÁRIO

5.3. Critérios de Inclusão e Exclusão ... 17

5.4. Coleta de Dados ... 17

5.5. Amostragem e Identificação ... 18

5.6. Procedimentos Pré-Analíticos ... 19

5.6.1 Preparação do Material... 19

5.6.2 Coleta das Amostras ... 20

5.6.3 Transporte das Amostras ... 21

5.7. Procedimentos Analíticos ... 21 5.8 Procedimentos Pós-Analíticos ... 22 5.8.1 Análises Estatísticas ... 22 6. RESULTADOS ... 23 7. DISCUSSÃO ... 30 8. CONCLUSÃO ... 34 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 35 ANEXO 1 ... 38 APÊNDICE 1 ... 43 APÊNDICE 2 ... 45

1. INTRODUÇÃO

A doença renal crônica, enfermidade cada vez mais comum, já é considerada um problema de saúde pública. A análise de um grande estudo americano demonstrou que 13,75% de pessoas nos EUA, que correspondem a 29,9 milhões em números absolutos, apresentam algum grau de perda de função renal (SNYNDER; FOLEY; COKKINS, 2009). No Brasil, segundo o Inquérito Brasileiro de Diálise Crônica de 2016, o número total estimado de pacientes em diálise em 2016 foi de 122.825, o que representa um aumento de 31,5 mil pacientes desde 2011. As estimativas nacionais das taxas de prevalência e de incidência de tratamento dialítico neste mesmo ano chegaram a 596 e 193 pacientes por milhão da população (ppm), respectivamente. E a taxa anual bruta de mortalidade foi 18,2% (SESSO et al.,2017).

A relação do aumento na mortalidade de pacientes em diálise com a presença da acidose metabólica é um assunto que vem sendo estudado, porém a real extensão deste problema no Brasil permanece desconhecida.

A acidose metabólica é caracterizada pela elevação absoluta ou relativa da concentração corporal de íons de hidrogênio acompanhada da redução do bicarbonato sérico. As alterações nos níveis de bicarbonato já são evidenciadas principalmente quando a taxa de filtração glomerular fica abaixo de 30 mL/min (MORANNE et al., 2009). No indivíduo em perfeita homeostase, o controle dos íons de H+ acontece de várias formas através de tampões de H+ intra e extracelulares, controle alveolar através de troca gasosa e alterações na excreção renal de H+ com o objetivo de que seus níveis sejam mantidos em torno de 40 nmol/L (CHEN; ABRAMOWITZ, 2014). O que ocorre na doença renal crônica é a perda da capacidade tubular de gerar amônia suficiente para excretar 1 mmol/kg de peso de íons hidrogênio produzidos diariamente (DE-BRITO ASHURST, 2015) levando a consequente acidose metabólica que se inicia nos indivíduos em estágio 3.

Atualmente estão disponíveis para determinação do bicarbonato: o método de determinação da reserva alcalina, do pCO2 total na gasometria venosa ou arterial e, mais recentemente, o método enzimático.

O método da reserva alcalina se baseia na quantificação do total de dióxido de carbono no sangue, que representa a medida plasmática do HCO3‾ real associado ao CO2

HCO3‾ determinado pela gasometria (PEREZ; GORDON, 2009). É um método

trabalhoso e que demanda tempo e, por isso, vem sendo abandonado e substituído pela estimativa do bicarbonato usando os parâmetros mensurados na gasometria.

A gasometria é um exame que consiste na dosagem de gases sanguíneos e indica o status acidobásico do sangue arterial ou venoso do paciente. Os valores de pH, pCO2 e

pO2 são determinados por eletrodos específicos, e através da equação de

Handersson-Hasselbach, (pH = 6,1 + log HCO3- / pCO2 x 0,03) a concentração do bicarbonato pode

ser calculada. (OLIVEIRA et al, 2014) Esta é uma das investigações mais importantes para avaliação da oxigenação clínica e do estado ácido-base em doentes em estado crítico. E ainda fornece informações sobre a ventilação, que junto com a oxigenação e o estado ácido-base, são os três parâmetros fisiológicos estreitamente ligados que mantêm a homeostasia do pH. (BARTHWAL, 2004) Portanto, ela é considerada um método essencial para avaliação e diagnóstico do doente renal crônico.

Um novo método foi recentemente proposto como alternativa aos tradicionalmente utilizados, neste estudo designado como um método enzimático (Flex® reagent cartdrige, Dimension, SIEMENS®). A base do teste é a utilização de uma enzima, a fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPCX) e um análogo do cofator NADH estável. Essa enzima permite que um dos reagentes do kit, o fosfoenolpiruvato, reaja com o bicarbonato da amostra através da reação:

HCO3- + Fosfoenolpiruvato  Oxaloacetato + Pi .

O oxalacetato gerado é reduzido a malato pela malato desidrogenase (MDH) com oxidação simultânea da forma reduzida de um análogo do cofator NADH (aNADH), como mostra a reação abaixo:

Oxaloacetato + aNADH + H+  Malato + aNAD+.

A diminuição em absorbância do aNADH é medida a 405 ou 700 nm e é proporcional à concentração total do dióxido de carbono na amostra. Como essas reações interrompem o equilíbrio da reação CO2 + H2O  H2CO3  H+ + HCO3-, o CO2

total da amostra é medido.

De acordo com o fabricante deste teste, as amostras devem ser analisadas o mais rápido possível após a coleta e podem ser armazenadas por 8 horas em temperatura

ambiente ou por 2 dias na temperatura de 2-8oC. Além de que, o total da concentração de CO2 pode ser diminuída em até 6mmol/l quando amostras destampadas são expostas ao

ar por 1 hora.

Ainda não existe um método laboratorial adequado para avaliação de acidemia, uma vez que os exames que são coletados em clínicas satélites e encaminhados posteriormente para o laboratório, são influenciados pela demora no transporte e realização do exame, afetando assim a precisão e acurácia dos resultados, considerando que o CO2 é volátil. Portanto, consideramos de utilidade estudar as variáveis pré-analíticas

pelo novo método enzimático visando melhoria nesta fase para que a avaliação laboratorial de acidose metabólica seja mais precisa entre pacientes hemodialisados.

Nesse estudo foram comparados os métodos de gasometria arterial com o enzimático, a fim de estabelecer qual o mais conveniente para mensuração do estado acidobásico nesse grupo específico de pacientes.

2. OBJETIVOS

Avaliar o efeito do tempo de espera, centrifugação e armazenamento e transporte refrigerado sobre o valor do bicarbonato sanguíneo determinado por dois diferentes métodos (gasometria e método enzimático) nos pacientes em hemodiálise.

3. JUSTIFICATIVA

A população em diálise vem aumentando em todo o mundo e a acidose metabólica é um problema que afeta um número significativo desses pacientes. A acidose metabólica está associada à desnutrição, catabolismo proteico acelerado, doença óssea e ao aumento da mortalidade em pacientes em terapia renal substitutiva. A justificativa seria que não existe método laboratorial adequado para avaliação de acidemia, uma vez que o material biológico é coletado e encaminhado posteriormente para o laboratório, e esse tempo de espera e condição de transporte inadequados podem inferir em resultados imprecisos e o exame perderia sua acurácia. Em função disso, a real situação do estado acidobásico na população em diálise no Brasil permanece pouco conhecida.

4. RELEVÂNCIA DO ESTUDO

A identificação do melhor manejo laboratorial das amostras colhidas (sangue) permitiria um melhor diagnóstico da presença e do grau da acidose metabólica nesses pacientes abrindo perspectivas para uma abordagem médica mais precisa.

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1. Tipo de Pesquisa

Trata-se de um estudo transversal realizado em pacientes renais crônicos em hemodiálise provenientes do Serviço de Nefrologia do Hospital Universitário Antônio Pedro em Niterói, Rio de Janeiro.

5.2. Instâncias Envolvidas

1) Serviço / Divisão de Nefrologia da Universidade Federal Fluminense.

2) Serviço / Disciplina de Bioquímica Clínica da Universidade Federal Fluminense. 3) Laboratório Multidisciplinar de Apoio à Pesquisa em Nefrologia e Ciências

Médicas da Universidade Federal Fluminense. 5.3. Critérios de Inclusão e Exclusão

Foram incluídos os pacientes renais crônicos em estágio 3 com falência funcional renal que estão realizando hemodiálise no Hospital Universitário Antônio Pedro, com taxa de filtração glomerular de 30 a 59 mL/minuto.

Foram excluídos pacientes com idade inferior a 20 anos ou com doença pulmonar obstrutiva crônica. Também foram excluídos pacientes com sorologia positiva para hepatites B ou C e HIV devido ao risco biológico.

5.4. Coleta de Dados

A coleta de dados ocorreu entre março e junho de 2018. Após autorização do Serviço de Nefrologia do HUAP/UFF, pôde-se ter acesso à sala de diálise onde os pacientes renais crônicos que se encaixavam nos critérios de inclusão e exclusão foram convidados a participar do estudo. Um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Paciente (Apêndice 1) foi entregue a cada paciente que se submeteu ao estudo, e foi assinado voluntariamente pelo mesmo ou pelo responsável legal. Foram coletados os dados clínicos através do Formulário de Coleta de Dados (Apêndice 2).

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa de Seres Humanos sob número CAAE nº 61204416.4.0000.5243 (Anexo 1).

5.5. Amostragem e Identificação

Foram coletadas amostras sanguíneas de 13 pacientes renais crônicos em hemodiálise convencional na unidade de diálise da Divisão de Nefrologia do HUAP/UFF. As amostras foram levadas imediatamente para avaliação laboratorial por dois diferentes métodos: pela gasometria e o método enzimático.

Para cada paciente fez-se necessário a coleta de 8 seringas de plástico de 1mL heparinizadas (heparina de lítio) da marca BD®, destinadas à gasometria, e 3 seringas (plásticas) de 20mL de sangue que foram distribuídos em 14 tubos secos com gel separador e ativador de coágulo para coleta à vácuo, também da marca BD®, com 3,5 mL cada, destinados à avaliação laboratorial pelo método enzimático.

Das 8 amostras destinadas a análise pelo método de gasometria, 2 foram analisadas no tempo 0, em até 1h após a coleta, uma tendo sido refrigerada (G0R) e a outra não refrigerada (G0nR). Da mesma forma, outras 2 amostras foram analisadas no tempo de 4h após a coleta, uma refrigerada (G4R) e a outra não refrigerada (G4nR); outras 2 foram analisadas no tempo de 8h após a coleta, uma refrigerada (G8R) e a outra não refrigerada (G8nR); e as últimas 2 foram processadas no tempo final de 24h, sendo uma refrigerada (G24R) e a outra não refrigerada (G24nR). As seringas etiquetadas como refrigeradas (R) foram imediatamente colocadas no isopor com gelo após a coleta e permaneceram até o momento da análise. Todas elas foram corretamente identificadas com uma etiqueta contendo: nome do paciente, hora da coleta e identificação da amostra de acordo com a condição de refrigeração (G0R, G0nR, G4R, G4nR, G8R, G8nR, G24R ou G24nR).

Além das seringas de gasometria, o sangue foi coletado em 3 seringas de 20 mL e imediatamente distribuído para os 14 tubos secos com gel separador e ativador de coágulo para serem levados para avaliação laboratorial pelo método enzimático. Cada tubo foi identificado com uma etiqueta contendo o nome do paciente, hora da coleta e identificação das amostras de acordo com o tempo de espera para a análise (tempo 0, 4h, 8h ou 24h), se são refrigeradas ou não (R ou nR) e ainda, se são centrifugadas ou não (C ou nC). O esquema a seguir descreve as siglas de identificação das amostras de acordo com o tempo em que esperaram para ser processadas (figura 1).

Figura 1. Fluxograma de descrição detalhada do processamento das amostras de acordo com o seu

determinado tempo de espera para análise.

5.6. Procedimentos Pré-Analíticos 5.6.1 Preparação do Material

Os materiais e documentos necessários à coleta foram separados e preparados previamente para garantir a eficiência nos processos de coleta, transporte e análise das amostras. Portanto, foi preciso ter em mãos:

- O termo de consentimento e a ficha de avaliação clínica do paciente;

- Os pedidos médicos para realização dos exames laboratoriais contendo os dados: nome completo do paciente, sexo, número do prontuário, data, tipo da amostra e requisição do exame (dosagem de bicarbonato para os tubos e gasometria arterial ou venosa para as seringas);

- 3 seringas descartáveis de 20mL para cada paciente; - 3 agulhas descartáveis (40x12mm);

- 14 tubos devidamente etiquetados para cada paciente; - Estantes para suporte e transporte dos tubos;

- Cuba rim para transporte das seringas;

- Isopor com gelo reciclável para transporte das amostras refrigeradas.

Todo o procedimento de coleta, manipulação de amostras, transporte e análise laboratorial foi realizado utilizando-se de equipamentos de proteção individual (EPIs), respeitando as normas de biossegurança.

5.6.2 Coleta das Amostras

A coleta das amostras sanguíneas foi realizada pela médica responsável e se deu no início da sessão de diálise, do acesso vascular para hemodiálise (fístula arteriovenosa ou cateter, dependendo do paciente), antes do sangue circular na máquina. A ordem na coleta foi a seguinte: primeiro as 8 seringas de 1mL e, em seguida, as 3 seringas de 20mL, cujo sangue foi imediatamente transferido para os 14 tubos a vácuo.

Para a primeira parte da coleta, deve-se lembrar da importância de, ao retirar a capa protetora das seringas, movimentar o êmbolo pressionando-o para retirar o ar. A coleta foi feita de maneira lenta e cautelosa para não permitir a formação de bolhas. E após conferir a ocorrência de bolhas, nos casos em que ocorreu, elas foram expelidas através da movimentação do êmbolo. Por último, porém de igual importância, as amostras foram homogeneizadas assim que colhidas.

Os mesmos cuidados com a entrada de ar foram tomados durante a coleta com as seringas de 20mL, além do cuidado no manejo da agulha utilizada para a transferência do material biológico da seringa para os tubos à vácuo. A agulha deve ter sido ocluída previamente, e sua capa protetora foi removida somente no momento da transferência, quando já estava acoplada à seringa. O conteúdo das seringas foi ejetado nos tubos, de um em um, sem violar o vácuo. Não foi necessário pressionar o êmbolo da seringa, uma vez que o próprio vácuo do tubo fez com que o sangue fluísse até alcançar volume suficiente determinado pelo fabricante do tubo.

Ao finalizar o processo de coleta, as agulhas e as seringas de 20mL foram descartadas corretamente com os devidos cuidados de biossegurança.

5.6.3 Transporte das Amostras

Uma vez que as amostras já estavam etiquetadas, foram separadas em refrigeradas e não refrigeradas. Os tubos e as seringas destinados à refrigeração foram colocados em uma estante dentro do isopor com gelo. Os tubos não refrigerados foram colocados em uma outra estante fora do isopor, e as seringas em uma cuba rim de inox para que pudessem ser transportados para o laboratório.

O transporte foi feito da sala de diálise onde foi realizada a coleta localizada no 2º andar do Hospital Universitário Antônio Pedro, para o laboratório localizado no 4º andar do mesmo prédio, através do elevador.

5.7. Procedimentos Analíticos

As análises laboratoriais foram realizadas no mesmo dia e no dia seguinte, 24h após a coleta, e o material imediatamente descartado após as análises. Como o material biológico utilizado na pesquisa não foi armazenado não se caracteriza a constituição de um biorrepositório. Em atenção à resolução 441/2011 do CONEP, o sujeito da pesquisa foi informado sobre o descarte de suas amostras biológicas pelos pesquisadores envolvidos na pesquisa. A dosagem de bicarbonato pelo método enzimático foi realizada pelo Sistema Integrado de Bioquímica Dimension RxL Max, SIEMENS®, USA, e os resultados expressos em mEq/L. A gasometria foi realizada no aparelho Stax Profile® pHOx® Ultra®, Nova Biomedical e os resultados liberados em mmol/L. Além do bicarbonato, a gasometria foi utilizada para avaliar os parâmetros de pCO2 (mmHg), CO2

total (mmol/L) e pH.

As amostras etiquetadas como “C” foram imediatamente centrifugadas após a coleta, e as “nC” foram apenas centrifugadas no momento anterior à dosagem, pois o aparelho utilizado requer a utilização de soro. Por esse motivo, as amostras destinadas à primeira dosagem, E0CR e E0CnR foram ambas centrifugadas. E junto com elas, foram colocados na centrífuga os tubos E4CR, E4CnR, E8CR, E8CnR, E24CR e E24CnR, a 3500 rpm (2744g) por 10 minutos. Após esse tempo, as amostras E0R e E0nR foram cadastradas no aparelho para realização da dosagem do bicarbonato pelo método enzimático, enquanto as outras amostras que também foram centrifugadas foram colocadas de volta na estante, ou isopor caso sejam refrigeradas, para serem analisadas no horário correspondente ao descrito na etiqueta. Os tubos só foram abertos no momento em que foram inseridos no aparelho. E, para que o limite de tempo de até 1 hora após a

coleta fosse respeitado, as amostras G0R e G0nR foram encaminhadas para realização da gasometria enquanto os tubos eram processados. Antes de serem processadas pelo aparelho de gasometria, as amostras foram homogeneizadas ao fazer o movimento de “rolar” a seringa entre as mãos. Repetidas vezes. Para a análise, foi utilizado o dispositivo cata coágulo anexado à ponta da seringa para filtrar a amostra e impedir que possíveis coágulos entupissem a agulha do aparelho. Conforme os resultados iam sendo liberados, foram identificados, armazenados e organizados em ordem de horário para serem discutidos depois.

A análise seguinte se deu no tempo igual a 4 horas após à coleta. Portanto, um pouco antes da hora marcada, as amostras E4nCR e E4nCnR foram colocadas na centrífuga. Mesmo rotuladas como “não centrifugadas” elas foram centrifugadas para se adequarem às especificações do aparelho, conforme dito anteriormente. Após centrifugação, elas foram cadastradas para dosagem, juntamente com as amostras E4CR e E4CnR que já haviam sido centrifugadas no momento pós-coleta. E enquanto essas amostras estavam sendo dosadas, as amostras G4R e G4nR foram encaminhadas para gasometria e os procedimentos descritos anteriormente foram repetidos.

Os mesmos procedimentos foram repetidos ao analisar as amostras do tempo de 8h e de 24h.

5.8 Procedimentos Pós-Analíticos

Os resultados, tanto das gasometrias quanto do método enzimático, foram impressos pelos respectivos aparelhos à medida que as análises eram feitas. Eles foram identificados e armazenados, com etiquetas indicando o tipo de amostra o qual se referem, para posterior análise estatística.

5.8.1 Análises Estatísticas

Os resultados foram expressos como média e desvio padrão no caso de distribuição normal e mediana e quartis internos em caso contrário. As variáveis categóricas foram expressas como frequências. Amostras pareadas foram comparadas pelo teste T de Student ou seu equivalente não paramétrico (Teste de Wilcoxon). Comparações entre mais de dois grupos foram feitas empregando-se o teste ANOVA, respeitando a distribuição de normalidade. A estatística do estudo utilizou o aplicativo SPSS, versão 20 para Windows (Chicago, IL, USA) e o software GraphPad Prism versão 5,0.

6. RESULTADOS

Durante o período de 4 meses, 13 pacientes se submeteram ao estudo. Portanto, um total de 104 seringas de gasometria e 182 tubos à vácuo foram analisados. As características da população em que as amostras foram obtidas estão demonstradas na tabela 1.

Tabela 1: Caracterização das amostras quanto à idade, sexo, tempo de diálise, doenças de base e

comorbidades.

Variáveis Frequência

n %

Média + DP

Faixa Etária (anos) 53,92 ± 11,84

30 – 45 3/13 23,1 46 -55 3/13 23,1 56 – 65 6/13 46,2 >66 1/13 7,6 Sexo M 4/13 30,8 F 9/13 69,3 Tempo de Diálise 0 a 1 ano 9/13 69,3 3,86 ± 5,74 1 a 10 anos 1/13 7,6 >10 anos 3/13 23,1

Doenças de Base e Comorbidades

Diabetes 4/13 30,8 -

Hipertensão Arterial Sistêmica 13/13 100 -

Neoplasia 2/13 15,4 -

Litíase 2/13 15,4 -

Doença Arterial Coronariana 3/13 23,1 -

Etilismo 2/13 15,4 -

Tabagismo 3/13 23,1 -

Os valores de bicarbonato dosados pela gasometria e método enzimático foram expressos em mmol/L e mEq/L, respectivamente. E como mencionado anteriormente, as variáveis foram divididas de acordo com o seu estado (CR, CnR, nCR ou nCnR) e tempo de espera (0h, 4h, 8h ou 24h). As médias e desvio padrão de cada variável foram calculadas e estão expressas na tabela 2.

Tabela 2: Média e desvio padrão dos valores de bicarbonato determinado pela gasometria (mmol/L) e

pelo método enzimático (mEq/L).

Amostras Média ± DP 0h 4h 8h 24h GR 20,56 ± 3,26 21,07 ± 2,23 21,38 ± 2,19 22,47 ± 3,81 GnR 20,21 ± 3,01 21,70 ± 2,46 21,58 ± 2,20 22,64 ± 3,91 ECR 22,15 ± 2,72 21,73 ± 4,82 23,57 ± 3,45 22,30 ± 2,89 ECnR 22,33 ± 2,73 22,76 ± 1,84 23,88 ± 4,23 21,50 ± 2,90 EnCR - 21,64 ± 4,66 22,80 ± 3,25 22,16 ± 2,99 EnCnR - 21,62 ± 3,60 22,65 ± 3,31 21,20 ± 2,78

Legenda: GR = amostra de seringa de gasometria refrigerada; GnR = amostra de seringa de gasometria

não refrigerada; ECR = amostra de método enzimático em tubo centrifugado refrigerado; ECnR = amostra de método enzimático em tubo centrifugado não refrigerado; EnCR = amostra de método enzimático em tubo não centrifugado refrigerado; EnCnR = amostra de método enzimático em tubo não centrifugado não refrigerado.

Para as análises estatísticas, as variáveis foram divididas em grupos de acordo com o seu estado de armazenamento (GR e GnR, ECR, ECnR, EnCR e EnCnR) e foram avaliadas para se descobrir a influência do tempo, refrigeração ou centrifugação sobre os resultados obtidos. Primeiramente foram utilizados os testes de normalidade Kolmogorov-Smirnov, D’Agostino e Pearson e de Shapiro-Wilk (p<0,05) para separá-las em variáveis de distribuição normal e de distribuição não normal, para aplicação do teste estatístico apropriado.

Em seguida, como modo de comparação entre amostras de um grupo avaliando se houve diferença estatística com relação ao tempo, foi realizado o teste 1 way ANOVA paramétrico (para os grupos de distribuição normal) ou não paramétrico (para os grupos de distribuição não normal). Portanto, as gasometrias refrigeradas foram comparadas entre si (Gráfico 1A), bem como as não refrigeradas (Gráfico 1B). Foi constatado que não

houve diferença estatística significante entre essas amostras (p>0,05) em nenhum dos tempos estudados.

Gráfico 1: Comparação entre as amostras de sangue total em relação ao tempo de espera para a análise

de gasometria (A) refrigeradas (B) Não refrigeradas.

G_B ic_ 0R G_B ic_ 4R G_B ic_ 8R G_B ic_ 24R 15 20 25 30 Gasometria Bi c a rb o n a to ( m m o l/ L ) G_B ic_ 0nR G_B ic_ 4nR G_B ic_ 8nR G_B ic_ 24nR 15 20 25 30 Gasometria Bi c a rb o n a to ( m m o l/ L ) G_B ic_ 0R G_B ic_ 0nR G_B ic_ 4R G_B ic_ 4nR G_B ic_ 8R G_B ic_ 8nR G_B ic_ 24R G_B ic_ 24nR 0 10 20 30 Gasometria Bi c a rb o n a to ( m m o l/ L )

Legenda: G_Bic_0R = bicarbonato da gasometria tempo 0 refrigerada; G_Bic_4R = bicarbonato da

gasometria tempo de 4h refrigerada; G_Bic_8R = bicarbonato da gasometria tempo de 8h refrigerada; G_Bic_24R = bicarbonato da gasometria tempo de 24h refrigerada; G_Bic_0nR = bicarbonato da gasometria tempo 0 não refrigerada; G_Bic_4nR = bicarbonato da gasometria tempo de 4h não refrigerada; G_Bic_8nR = bicarbonato da gasometria tempo de 8h não refrigerada; G_Bic_24nR = bicarbonato da gasometria tempo de 24h não refrigerada.

As amostras analisadas pelo método enzimático também foram comparadas entre si para avaliar a influência do tempo sobre os resultados. São elas: as pertencentes aos grupos ECR (Gráfico 2A), ECnR (Gráfico 2B), EnCR (Gráfico 2C) e EnCnR (Gráfico 2D). Em nenhum desses grupos houve diferenças estatisticamente significantes.

Outra análise foi feita, a fim de avaliar a influência da centrifugação. Foram submetidas ao teste não paramétrico as variáveis E0CR, E4CR, E4nCR, E8CR, E8nCR, E24CR e E24nCR. O teste apontou que não existe diferença estatística entre eles, o que significa que, estatisticamente, centrifugar ou não a amostra não interferiu no resultado (Gráfico 3).

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Gráfico 2: Comparação entre as amostras em relação ao tempo de espera para a análise pelo método

enzimático. (A) centrifugadas refrigeradas (B) centrifugadas não refrigeradas (C) não centrifugadas refrigeradas (D) não centrifugadas não refrigeradas.

E_0C R E_4C R E_8C R E_24C R 5 10 15 20 25 30 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L ) E_0C nR E_4C nR E_8C nR E_24C nR 0 10 20 30 40 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L ) E_4n CR E_8n CR E_24n CR 10 20 30 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L ) E_4n CnR E_8n CnR E_24n CnR 10 15 20 25 30 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L ) E_0C R E_4C R E_8C R E_24C R 5 10 15 20 25 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L E_0C nR E_4C nR E_8C nR E_24C nR 0 10 20 30 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L E_4n CR E_8n CR E_24n CR 10 20 30 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L ) E_4n CnR E_8n CnR E_24n CnR 10 15 20 25 30 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L )

Legenda: E_0CR = bicarbonato do método enzimático tempo 0 centrifugada refrigerada; E_4CR =

bicarbonato do método enzimático tempo de 4h centrifugada refrigerada; E_8CR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h centrifugada refrigerada; E_24CR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h centrifugada refrigerada; E_0CnR = bicarbonato do método enzimático tempo 0 centrifugada não refrigerada; E_4CnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 4h centrifugada não refrigerada; E_8CnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h centriguda não refrigerada; E_24CnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h centrifugada não refrigerada; E_4nCR = bicarbonato do método enzimático tempo de 4h não centrifugada e refrigerada; E_8nCR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h não centrifugada e refrigerada; E_24nCR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h não centrifugada e refrigerada; E_4nCnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 4h não centrifugada e não refrigerada; E_8nCnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h não centrifugada e não refrigerada; E_24nCnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h não centrifugada e não refrigerada.

B A

D C

Gráfico 3: Comparação entre as amostras centrifugadas e não centrifugadas das dosagens de bicarbonato

pelo método enzimático.

E_0 CR E_4 CR E_4 nCR E_8 CR E_8 nCR E_2 4CR E_2 4nC R 0 10 20 30 Analisador Bioquímico Bi c a rb o n a to ( m E q /L )

Legenda: E_0CR = bicarbonato do método enzimático tempo 0 centrifugada refrigerada; E_4CR =

bicarbonato do método enzimático tempo de 4h centrifugada refrigerada; E_4nCR = bicarbonato do método enzimático tempo de 4h não centrifugada refrigerada; E_8CR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h centrifugada refrigerada; E_8nCR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h não centrifugada refrigerada; E_24CR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h centrifugada refrigerada; E_24nCR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h não centrifugada refrigerada.

Um último teste incluindo as amostras analisadas pelo método enzimático foi com relação à refrigeração, no qual testou-se a influência de manter as amostras resfriadas ou não. Portanto, foram incluídas as amostras E0CR, E0CnR, E4CR, E4CnR, E8CR, E8CnR, E24CR e E24CnR. Mais uma vez, nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada (Gráfico 4).

Em função de não ter sido observada mudança significativa nos níveis de bicarbonato estimados pela gasometria, foi feita uma análise estatística com os dados de outros dois parâmetros da gasometria: a pCO2 e o pH. Foram testadas as variáveis das

amostras refrigeradas (R) e das não refrigeradas (nR), e depois comparadas entre si. Portanto, foi feita a comparação de pCO2 R com pCO2 nR e pH R com pH nR. Como

mostra o gráfico 5A, o teste da pCO2 em amostras refrigeradas resultou em duas

diferenças estatisticamente significantes (p<0,05), dadas entre as amostras dosadas no tempo 0 e 24h, e entre as do tempo 4h e 24h. O teste da pCO2 em amostras não refrigeradas

(gráfico 5C) revelou diferença (p<0,05) entre as amostras do tempo 0 e 8h, 0 e 24h, 4h e 24h e 8h e 24h. O teste realizado com o pH das amostras refrigeradas resultou em apenas uma diferença significante (p<0,05), entre as amostras do tempo 0 e 24h (gráfico 5B). Enquanto que no pH de amostras não refrigeradas, houve diferença (p<0,05) entre as amostras do tempo 0 e 8h, 0 e 24h e 4h e 24h (gráfico 5D). Quando comparados os refrigerados com não refrigerados, a pCO2 obteve resultados significativos, como mostra

o gráfico 5E. Assim como na comparação do pH nesses grupos, que também obteve diferenças significativas, representadas no gráfico 5F.

Gráfico 4: Comparação entre as amostras refrigeradas e não refrigeradas das dosagens de bicarbonato

pelo método enzimático.

E_0C R E_0C nR E_4C R E_4C nR E_8C R E_8C nR E_24 CR E_24 CnR 0 10 20 30 Analisador Bioquímico B ic a rb o n a to ( m E q /L )

Legenda: E_0CR = bicarbonato do método enzimático tempo 0 centrifugada refrigerada; E_0CnR =

bicarbonato do método enzimático tempo 0 centrifugada não refrigerada E_4CR = bicarbonato do método enzimático tempo de 4h centrifugada refrigerada; E_4CnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 4h centrifugada não refrigerada; E_8CR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h centrifugada refrigerada; E_8CnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 8h centrifugada não refrigerada; E_24CR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h centrifugada refrigerada; E_24CnR = bicarbonato do método enzimático tempo de 24h centrifugada não refrigerada.

Gráfico 5: Comparação entre as médias da pCO2 e pH das amostras refrigeradas e não refrigeradas dosadas pela gasometria evidenciando os pontos em que houve diferença estatística. (A) pCO2 em amostras de gasometria refrigeradas (B) pH em amostras de gasometria refrigeradas (C) pCO2 em amostras de gasometria não refrigeradas (D) pH em amostras de gasometria não refrigeradas (E) pCO2 em todas as amostras (F) pH em todas as amostras.

G_pC O2_ 0R G_pC O2_ 4R G_pC O2_ 8R G_pC O2_ 24R 0 20 40 60 80 * ** Gasometria p C O2 (m m H g ) G_p H_0 R G_p H_4 R G_p H_8 R G_p H_2 4R 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 * Gasometria pH G_pC O2_ 0nR G_pC O2_ 4nR G_pC O2_ 8nR G_pC O2_ 24nR 0 50 100 *** *** *** *** Gasometria p C O2 (m m H g ) G_pH _0nR G_pH _4nR G_pH _8nR G_pH _24nR 6.8 7.0 7.2 7.4 ** *** ** Gasometria pH G_pC O2_ 0R G_pC O2_ 0nR G_pC O2_ 4R G_pC O2_ 4nR G_pC O2_ 8R G_pC O2_ 8nR G_pC O2_ 24R G_pC O2_ 24nR 50 100 *** ** *** *** ** *** *** ** *** *** *** * Gasometria p C O2 (m m H g ) G_p H_0 R G_p H_0 nR G_p H_4 R G_p H_4 nR G_p H_8 R G_p H_8 nR G_p H_2 4R G_p H_2 4nR 7.0 7.5 8.0 * * ** *** ** *** ** *** *** Gasometria pH G_pC O2_ 0R G_pC O2_ 4R G_pC O2_ 8R G_pC O2_ 24R 0 20 40 60 80 * ** Gasometria p C O2 (m m H g ) G_p H_0 R G_p H_4 R G_p H_8 R G_p H_2 4R 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 * Gasometria pH G_pC O2_ 0nR G_pC O2_ 4nR G_pC O2_ 8nR G_pC O2_ 24nR 0 50 100 *** *** *** *** Gasometria p C O2 (m m H g ) G_pH _0nR G_pH _4nR G_pH _8nR G_pH _24nR 6.8 7.0 7.2 7.4 ** *** ** Gasometria pH G_pC O2_ 0R G_pC O2_ 0nR G_pC O2_ 4R G_pC O2_ 4nR G_pC O2_ 8R G_pC O2_ 8nR G_pC O2_ 24R G_pC O2_ 24nR 50 100 *** ** *** *** ** *** *** ** *** *** *** * Gasometria p C O2 (m m H g ) G_p H_0 R G_p H_0 nR G_p H_4 R G_p H_4 nR G_p H_8 R G_p H_8 nR G_p H_2 4R G_p H_2 4nR 7.0 7.5 8.0 * * ** *** ** *** ** *** *** Gasometria pH G_pC O2_ 0R G_pC O2_ 4R G_pC O2_ 8R G_pC O2_ 24R 0 20 40 60 80 * ** Gasometria p C O2 (m m H g ) G_p H_0 R G_p H_4 R G_p H_8 R G_p H_2 4R 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 * Gasometria pH G_pC O2_ 0nR G_pC O2_ 4nR G_pC O2_ 8nR G_pC O2_ 24nR 0 50 100 *** *** *** *** Gasometria p C O2 (m m H g ) G_pH _0nR G_pH _4nR G_pH _8nR G_ pH_2 4nR 6.8 7.0 7.2 7.4 ** *** ** Gasometria pH G_pC O2_ 0R G_pC O2_ 0nR G_pC O2_ 4R G_pC O2_ 4nR G_pC O2_ 8R G_pC O2_ 8nR G_pC O2_ 24R G_pC O2_ 24nR 50 100 *** ** *** *** ** *** *** ** *** *** *** * Gasometria p C O2 (m m H g ) G_p H_0 R G_p H_0 nR G_p H_4 R G_p H_4 nR G_p H_8 R G_p H_8 nR G_p H_2 4R G_p H_2 4nR 7.0 7.5 8.0 * * ** *** ** *** ** *** *** Gasometria pH

Legenda: G_pCO2_0R = pCO2 da gasometria do tempo 0 refrigerada; G_pCO2_4R = pCO2 da gasometria do tempo 4h refrigerada; G_pCO2_8R = pCO2 da gasometria do tempo 8h refrigerada; G_pCO2_24R = pCO2 da gasometria do tempo 24h refrigerada; G_pCO2_0nR = pCO2 da gasometria do tempo 0 não refrigerada; G_pCO2_4nR = pCO2 da gasometria do tempo 4 não refrigerada; G_pCO2_8nR = pCO2 da gasometria do tempo 8 não refrigerada; G_pCO2_24nR = pCO2 da gasometria do tempo 24 não refrigerada; G_pH_0R = pH da gasometria do tempo 0 refrigerada; G_pH_4R = pH da gasometria do tempo 4 refrigerada; G_pH_8R = pH da gasometria do tempo 8 refrigerada; G_pH_24R = pH da gasometria do tempo 24 refrigerada; G_pH_0nR = pH da gasometria do tempo 0 não refrigerada; G_pH_4nR = pH da gasometria do tempo 4 não refrigerada; G_pH_8nR = pH da gasometria do tempo 8 não refrigerada; G_pH_24nR = pH da gasometria do tempo 24 não refrigerada; * = <0,05.

A

C

B

D

7. DISCUSSÃO

A fase pré-analítica é a fase que se inicia na solicitação do exame pelo clínico e se estende até o processamento da amostra pelo laboratório, incluindo o preenchimento da requisição do exame, as instruções de preparo do paciente, o preparo dos materiais e identificação das amostras, procedimentos da coleta, armazenamento, transporte e cadastramento. Muitos estudos vêm demonstrando que a fase pré-analítica concentra a maior frequência de erros associados a ensaios laboratoriais, que podem representar mais de 90% do erro total (LIMA-OLIVEIRA, 2009). Isso demonstra a necessidade de atenção durante esta fase, para garantir resultados eficientes e confiáveis, uma vez que a maioria dos processos não é automatizada, dependendo de atividades manuais (GUIMARÃES et al; 2011).

O número de pacientes participantes é relativamente baixo quando comparado com o período em que se deu o estudo, isso se deve ao fato de que a rotatividade de pacientes no Serviço de Diálise do HUAP é baixa. Uma vez que eles realizam três sessões por semana, logo, 3 dias da semana ficam comprometidos com os mesmos pacientes. E, devido às análises terem sido realizadas em até 24h, foi necessário que os pacientes do turno da manhã fossem priorizados.

Quando se trata de gasometria, as seringas de vidro são as mais recomendadas para coleta e possível estocagem do material, uma vez que, comparadas com as de plástico, elas apresentam vantagem por possuírem uma probabilidade ligeiramente menor de contaminação com o ar externo (RAVEL, 1997). No entanto, a maioria dos hospitais já não utiliza mais as seringas de vidro devido à necessidade de serem heparinizadas manualmente (SMEENK et al, 1997), e de serem esterilizadas para reutilização. Sendo que, quando o processo de esterilização não é feito corretamente, existe o risco de transmissão de doenças como a hepatite B (VIESSER, 2012). Não só o material, mas o tamanho da seringa também pode ser fonte de interferência, uma vez que seringas menores apresentam maior relação entre a superfície de contato e volume, assim como paredes levemente mais finas, ambos colaborando para o aumento da taxa de troca gasosa por difusão. (WU; BARAZANJI; JOHNSON, 1997). A CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recomenda o uso de seringas plásticas preparadas com heparina liofilizadas caso elas sejam mantidas em temperatura ambiente por até 30 minutos. E nos

casos em que se sabe que haverá demora na análise, recomenda-se a coleta na seringa de vidro e conserva em gelo e água (CLSI, 2009).

O aumento da taxa metabólica celular é uma das principais origens de alterações nos valores da gasometria, devido ao acúmulo de ácido lático gerado ao longo do tempo em que o material ficou armazenado nas seringas. Durante a estocagem da amostra o metabolismo celular continua, uma vez que as células ainda estão vivas, fazendo com que haja um consumo de oxigênio e, portanto, diminuição de seus valores (VIESSER, 2012). Plaquetas e leucócitos consomem a maior parte do oxigênio da amostra (LISS; PAYNE, 1993). Portanto, as alterações na pO2 são muito maiores na presença de

leucocitose e/ou trombocitose, e a taxa de metabolismo dessas células se torna a principal influência no resultado, levando à uma queda significativa da pO2 durante o

armazenamento da amostra em temperatura ambiente. (SCHMIDT; MÜLLER-PLATHE, 1992).

De acordo com Wu, Barazanji e Johnson (1997), que estudaram o efeito do tempo de espera e da temperatura de armazenamento sobre os parâmetros estimados pela gasometria, o armazenamento das amostras em gelo reduz a taxa metabólica das células sanguíneas para aproximadamente 10% do que a 37oC, e 23% do que a 22-24oC. Porém, eles concluíram que, embora a taxa metabólica dos eritrócitos seja reduzida quando as amostras são refrigeradas, nessa mesma situação, pelo fato de as seringas serem de plástico, os erros em virtude da troca gasosa por difusão são aumentados. E devido a isso, consideraram que o armazenamento em temperatura ambiente pode ser significantemente melhor do que em gelo, mas a análise deve ser feita o mais rápido possível.

Outra variável pré-analítica comum de ocorrer é a presença de bolhas de ar na amostra. Essas bolhas que se misturam com o sangue resultarão em equilíbrio gasoso entre a amostra e o ar e, portanto, podem causar queda significante nos valores de pCO2

e aumento na pO2 (SHAPIRO; HARRISON; WALTON, 1980). E o impacto no resultado

será maior quanto maior for a quantidade de bolhas, pois maior é a superfície de contato. Assim como o impacto também será maior quanto maior for o tempo de contato (VIESSER, 2012). A variabilidade no pH e na pCO2 entre as amostras aumenta com o

tempo de armazenamento e é maior quando feito em temperatura ambiente (MADIEDO; SCIACCA; HAUSE, 1980).

Esse estudo foi conduzido com o intuito de mimetizar o que acontece nas clínicas de diálise quando a amostra de gasometria é colhida e nem sempre é transportada para o laboratório ou armazenada de maneira correta. Assim, foram avaliados os efeitos da refrigeração e o tempo de espera sobre as amostras de gasometria. E como pode-se observar no gráfico 1(A), o fato de as amostras estarem refrigeradas surpreendentemente fez com que o bicarbonato tivesse os resultados preservados por pelo menos 8 horas de espera, e a partir daí começa a mostrar uma tendência a subir, mesmo não apresentando significância estatística. Nas amostras não refrigeradas (gráfico 1B) observa-se que houve maior variação a partir de 4h, ainda que também não tenha demonstrado diferença estatística.

Uma vez que a determinação do bicarbonato pela gasometria não apresentou alterações estatisticamente significativas, foi considerada a importância de comparar os valores da pCO2 e do pH nas mesmas condições. E como esperado, a pCO2 apresentou

um aumento significativo à medida que se prolongava o tempo de espera (gráfico 6E), tanto em amostras refrigeradas quanto em não refrigeradas, sendo mais evidentes nas amostras mantidas em temperatura ambiente. E o pH, por sua vez, apresentou uma queda significativa (gráfico 6F), independente da refrigeração ou não. O que mostra que o equilíbrio entre o aumento da pCO2 e a queda do pH foi o que manteve o bicarbonato sem

alterações quando comparados ao tempo de espera após coleta.

Tratando-se do método enzimático, o kit do fabricante garante que as amostras centrifugadas podem ser estocadas por até 8 horas em temperatura ambiente ou por 2 dias a 2-8o C. Com esse estudo, ficou claro que a dosagem do bicarbonato nas amostras centrifugadas e refrigeradas mantiveram seus níveis de bicarbonato até 24 horas sem alterações estatisticamente significantes (gráfico 3A), conforme o relato do fabricante. O mesmo acontece quando as amostras foram centrifugadas, mas não refrigeradas (gráfico 3B), e quando as amostras não foram centrifugadas, mas foram refrigeradas, mostrando uma tendência a manter a mesma média durante as 24 horas de espera (gráfico 3C). Assim como no caso das amostras não centrifugadas não refrigeradas (gráfico 3D).

Quando somente o efeito da centrifugação foi avaliado (gráfico 4), o resultado saiu como esperado. A centrifugação preservou a amostra, o que pode ser explicado pelo fato de as células sanguíneas estarem isoladas, impossibilitando que o metabolismo dos eritrócitos interferisse na dosagem. Porém, ao avaliar o efeito da refrigeração sobre as

amostras (gráfico 5), observou-se através da distribuição do gráfico que também houve uma preservação nos níveis de bicarbonato.

Outro fator que pode ter influenciado na preservação da dosagem pelo método enzimático foi o modo como o material foi manipulado e colocado em tubo dedicado. Como o sangue foi coletado em seringas e imediatamente transferido para os tubos através de uma agulha sem que precisasse abrir a tampa, o tubo permaneceu intacto e com o vácuo preservado. Isso evitou que o material entrasse em contato com o ar atmosférico e promovesse troca gasosa.

Nesse estudo, foi observado que na análise de 24h após a coleta, os valores de bicarbonato estavam semelhantes aos valores dosados no tempo 0, tanto em amostras refrigeradas quanto em amostras não refrigeradas. Isso evidencia que, mesmo apresentando variações ao longo do tempo (com um pico em 8h) pelo consumo de CO2

na reação de equilíbrio, a espera de 24h foi o suficiente para a reação voltar ao equilíbrio e apresentar valores normais de bicarbonato.

Algumas das amostras que não foram centrifugadas apresentaram hemólise, como era de se esperar. Outras, independente do estado de conservação, apresentaram formação de fibrina, mas nem a hemólise ou a fibrina fizeram com que houvesse alterações significativas na dosagem do bicarbonato.

De acordo com a Associação Mercosul de Normatização (2009), a estabilidade de uma amostra sanguínea é definida pela capacidade dos seus elementos se manterem nos valores iniciais, dentro de limites de variação aceitáveis, por um determinado período de tempo. Ou seja, para serem representativas, as amostras devem ter sua composição e integridade preservadas durante todo o processo pré-analítico (GUIMARÃES, 2011). O uso do tubo dedicado para a dosagem de bicarbonato pelo método enzimático, com a abertura do tubo realizada apenas na hora da dosagem, sendo as amostras centrifugadas e refrigeradas, foi capaz de manter os valores estáveis.

Ao contrário do que a literatura mundial relata sobre a necessidade da rapidez para a realização das dosagens de gasometria (SBPC/ML, 2014), quando levamos em consideração os parâmetros para analisar os distúrbios do equilíbrio acidobásico, fica claro que o tempo influencia nas análises, mas nossos resultados mostram que embora

haja alterações em todos os parâmetros, o bicarbonato parece ainda poder ter os valores utilizados mesmo após longos períodos da coleta do material.

8. CONCLUSÃO

Com base na análise dos resultados apresentados neste estudo, ficou evidente a importância da eficácia na realização dos procedimentos pré-analíticos de coleta, manipulação, transporte e armazenamento das amostras, para garantir maior acurácia nas dosagens de bicarbonato tanto em gasometrias quanto em método enzimático.

O tempo de espera não influenciou de forma significativa nos resultados obtidos tanto para o método enzimático quanto para a dosagem de bicarbonato pela gasometria, mas o método químico mostrou-se mais seguro pois trata-se de quantificação e não de cálculo para a obtenção dos valores de bicarbonato, como é feito na gasometria.

A refrigeração mostrou-se mais eficaz na preservação da amostra, tanto para o método enzimático quanto para a dosagem de bicarbonato pela gasometria.

A centrifugação das amostras para a dosagem bioquímica do bicarbonato é essencial para a preservação da amostra biológica, no que tange a evitar hemólise e possíveis interferentes.

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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