Efeitos do treinamento resistido moderado em componentes da parede da aorta torácica de ratos no processo de envelhecimento

UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

Programa de pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento

SHEILA MARTINS DA CRUZ PUELKER

Efeitos do treinamento resistido moderado em

componentes da parede da aorta torácica de ratos no

processo de envelhecimento

São Paulo 2019

UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

Programa de pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento

Efeitos do treinamento resistido moderado em

componentes da parede da aorta torácica de ratos no

processo de envelhecimento

SHEILA MARTINS DA CRUZ PUELKER

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento da Universidade São Judas Tadeu (USJT), como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências do Envelhecimento.

Orientadora: Profa. Dra. Laura Beatriz Mesiano Maifrino

São Paulo 2019

“O inverno nunca falha em se tornar primavera” Daisaku Ikeda

DEDICATÓRIA

Ao meu mestre da vida, Daisaku Ikeda.

Ao meu esposo Rodrigo, pela compreensão, companheirismo e incentivo nessa trajetória. Gratidão!

À minha filha Sarah, razão de tudo, do Amor e da minha felicidade.

Aos meus pais, Rosane e Gilmar, pela minha base, meus alicerces na vida, meus maiores exemplos!

AGRADECIMENTOS

À Professora Laura Beatriz Maifrino, pela orientação, dedicação e pelos ensinamentos. À senhora o meu mais eterno respeito!

Ao Professor Romeu Rodrigues Souza, pela confiança e oportunidade de ingressar nesse estudo.

À amiga Sônia Castro, pela amizade fraterna, lealdade, companheirismo, cumplicidade e apoio incondicional, gratidão!!

Aos docentes e amigos que conquistei ao longo do Programa de Mestrado em Ciências do Envelhecimento na Universidade São Judas Tadeu, em especial às docentes Adriana Saldiba de Lima, Angélica Castilho e Eliane Florêncio Gama, pelos ensinamentos, amizade e orientações.

À todas as pessoas que, direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste sonho.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Divisões da artéria aorta com seus respectivos diâmetros normais em cm, na raiz da aorta (A), aorta ascendente (B), arco da aorta (C) e aorta torácica (D), Fonte: DIAS et al, 2010...17 Figura 2- Fotomicrografia da artéria aorta torácica. Túnica Adventícia (A), Túnica média (M) e fibras elásticas (x), Túnica Intima (I). Verhoeff, 400x, Barra 50 µm. Fonte: LIMA,2014...18 Figura 3-Fotomicrografia da aorta ascendente, mostrando fibras colágenas do tipo I na túnica média (seta vermelha) e na túnica adventícia (seta amarela), e tipo III na túnica adventícia (seta verde) e na túnica média (seta azul). Técnica de Picrosirius Red, com luz polarizada, 200x, barra de 50 µm. Fonte: LIMA,2014...21 Figura 4 -Representação esquemática de corte transversal da aorta torácica mostrando os locais onde foram feitas as medidas da espessura da parede...29 Figura 5 - Corte histológico da parede da aorta torácica utilizado para contagem de lamelas elásticas (setas) e núcleo de célula muscular lisa (cabeça de seta). Verhoff, barra 40µm...29 Figura 6 – Fotomicrografia da túnica média da parede da aorta torácica, mostrando o grid utilizado. As fibras colágenas aparecem como pontos rosas (seta) corados pelo Picrosirius. X1000...30 Figura 7 – Ultramicrografia eletrônica das fibras colágenas (setas) em aumento de x12000 evidenciando a distribuição das fibras colágenas do tipo I (de maior diâmetro - branco) e das fibras colágenas do tipo III (de menor diâmetro- vermelho) nos vários grupos estudados. Barra de 30nm...31 Figura 8- Gráfico da espessura da camada média -íntima da aorta torácica no GT quando comparado ao GC...32 Figura 9- Gráfico da Densidade numérica das lamelas elásticas/campo. Valores representam M±EPM; *p<0,05 vs Grupo GC...33 Figura 10- Gráfico densidade de volume das fibras colágenas (Vv[fc]%) no grupo GT quando na comparação com o grupo GC...33

Figura 11- Gráfico Diâmetro médio das fibrilas colágenas da aorta torácica dos grupos estudados. Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs Grupo GC...34

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

DCVs - Doenças Cardiovasculares GC - Grupo Controle

GT - Grupo Treinado

MET- Microscopia Eletrônica de Transmissão

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IMC - Índice de Massa Muscular

PH – Potencial de Hidrogênio Iônico Pp[nu] - Pontos sobre os núcleos

Pt - Pontos Totais NO - óxido nítrico

LISTA DE SÍMBOLOS

% - Percentagem µm - Micrometro

Vv- densidade de volume EPM – Erro Padrão da Média

LISTA DE TABELA

Tabela 1 – Espessura Parede Aorta (Esp.); Densidade numérica de fibras

elásticas (Dn[fc]); Densidade de volume de fibras colágenas (Vv[fc]%); Diâmetro médio das fibras colágenas (Dm[fc])...32

RESUMO

Efeitos do treinamento resistido moderado em componentes da parede da aorta torácica de ratos em processo de envelhecimento.

O treinamento físico interfere na produção de colágeno e material elástico da parede da aorta ascendente. Pouco se sabe, porém, se esses componentes da parede da aorta torácica sofrem modificações diante do treinamento resistido em ratos idosos. O objetivo do presente trabalho é verificar se o treinamento resistido pode interferir na densidade do colágeno e das fibras elásticas na parede da aorta torácica, durante o processo de envelhecimento. Foram utilizados dois grupos de ratos com 14 meses: Grupo Controle (GC) e Grupo Treinado (GT). Todos os animais realizaram um período de adaptação de uma semana em escada inclinada (80°) com 1,1m de altura, após os ratos do GT realizaram treinamento resistido por 8 semanas, 1 vez por dia, 5 dias por semana com uma carga de 60% da massa corporal. Os animais de ambos os grupos foram sacrificados aos 16 meses de idade. Os seguintes parâmetros foram avaliados: espessura da parede da aorta, densidade de volume do tecido elástico e colágeno e densidade numérica das células musculares lisas. Os resultados foram apresentados como média e erro padrão da média. Para a comparação de pares de médias, foi empregado o teste "t" de Student. Todos os testes foram realizados com nível de significância de 5%. Os resultados do presente trabalho apresentaram diminuição significativa na espessura das túnicas médias e íntimas, na densidade numérica de fibras elásticas, na densidade de volume das fibras colágenas e no diâmetro médio das fibras colágenas no grupo treinado. Portanto, o treinamento resistido moderado, pode ser uma estratégia para minimizar os efeitos deletéricos causados pelo envelhecimento da artéria aorta torácica.

ABSTRACT

Effects of moderate resistance training on thoracic aortic wall components in the aging process.

Physical training has been shown to interfere with the production of collagen and elastic material in the ascending aortic wall. Little is known, however, whether these components of the thoracic aortic wall undergo changes in resistance training in elderly rats. The aim of the present study is to verify if resistance training can interfere with the density of collagen and elastic fibers in the thoracic aortic wall during aging. Two groups of 14-month-old rats were used: Control Group (CG) and Trained Group (GT). All animals performed an adaptation period of 1 week on a 1.1 m high inclined ladder (80 °), after the TG rats performed resistance training for 8 weeks, once a day, 5 days a week. Animals from both groups were sacrificed at 16 months of age. The following parameters were evaluated: aortic wall thickness, volume density of elastic and collagen tissue, and numerical density of smooth muscle cells. Results were presented as mean and standard error of the mean. One-way analysis of variance (ANOVA) was properly applied for data analysis. The significance level adopted in was p <0.05. The results of the present study showed a significant decrease in the thickness of the medium and intimate tunics, the numerical density of elastic fibers, the volume density of collagen fibers and the average diameter of collagen fibers. Therefore, moderate resistance training may be a strategy to minimize the deleterious effects caused by aging of the thoracic aorta.

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO ... 15

2. REVISÃO DE LITERATURA ... 17

2.1 Artéria Aorta – Aspectos Estruturais ... 17

2.2 Matriz Extracelular ... 19 2.3 Fibras Elásticas ... 19 2.4 Colágeno ... 20 2.5 Envelhecimento ... 22 2.6 Exercício Físico ... 23 3. JUSTIFICATIVA ... 24 4. OBJETIVOS ... 25 4.1 Objetivo Geral ... 25 4.2 Objetivo Específico ... 25 5. MATERIAIS E MÉTODOS... 26 5.1 Amostras E Procedimentos ... 26

5.2 Protocolo de Treinamento Resistido Moderado ... 27

5.3 Eutanásia e Preparação do Material para Microscopia de Luz ... 27

5.4 Processamento da Aorta Torácica para Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ... 28

5.5 Análises Morfométricas e Estereológicas ... 28

5.5.1. Espessura das túnicas media e íntima ... 29

5.5.2. Densidade de numérica de lamelas elásticas ... 29

5.5.3. Densidade de volume de fibras colágenas (Vv[fc]%) ... 30

5.5.4. Diâmetros maior e menor das fibras colágenas ... 31

5.6. Análise Estatística ... 31

6. RESULTADOS ... 32

6.2 Densidade Numérica de Fibras Elásticas/Campo ... 33

6.3 Densidade de Volume das Fibras Colágenas (Vv[Fc]%) ... 34

6.4 Diâmetro Médio das Fibras Colágenas ... 35

7. DISCUSSÃO ... 36

8. CONCLUSÕES ... 41

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1. INTRODUÇÃO

De acordo com os dados do crescimento populacional do IBGE (2018), estima-se que o Brasil terá um crescimento médio da população idosa de 5,5% pessoas até o ano de 2030 (um acréscimo de aproximadamente 11 milhões de pessoas com idade superior a 60 anos). Neste contexto a doença cardiovascular (DCV) segue liderando as causas de morbidade e mortalidade nas sociedades modernas, tendo como fatores de risco a alimentação inadequada, baixa atividade física, consumo de álcool e tabagismo e a idade além dos fatores ocupacionais, comportamentais e metabólicos (LLOYD-JONES, 2010; ADAMS BROWN et al., 2010, NOGUEIRA et al., 2009, MARCHON et al., 2015; FOROUZANFAR et al, 2015)

Durante o envelhecimento, as artérias, principalmente as de grande calibre, como a artéria aorta, sofrem fragmentação das fibras elásticas, diminuição das células musculares lisas, assim o colágeno torna-se mais espesso e desorganizado, a substância fundamental amorfa aumenta, resultando na diminuição das propriedades elásticas, enfraquecimento da sua parede e subsequente dilatação. Como consequência a aorta perde elasticidade e progressivamente sua parede torna-se mais espessa e endurecida (MAIFRINO et al., 2012; MORVAN et al, 1990; MARIOTTI et al., 2015; LIMA et al., 2015; SOUZA et al., 2015; MARCHON et al., 2015; MAIFRINO et al.,2019). Estas alterações levam a um aumento da pressão sistólica e, consequente, aumento da parede ventricular (LAKATTA AND LEVY, 2003; O’ROURKE & HASHIMOTO, 2007, BRIANEZZI et al, 2017). Desta forma o controle da degradação e síntese da matriz extracelular de forma equilibrada, favorece a manutenção da integridade do vaso por meio da remodelação vascular (LIMA et al., 2012; MARCHON et al., 2015).

A atividade física é um fator determinante para um processo de envelhecimento ativo e saudável, pois ela pode retardar as alterações morfofuncionais que ocorrem nos tecidos com a idade. Embora o envelhecimento seja uma consequência natural da vida, a prática de exercícios físicos adequados, estabelece o suporte para que nesse período o

16 idoso possa viver em melhores condições de saúde, minimizando a incidência de doenças crônicas entre elas hipertensão arterial, obesidade, depressão, diabetes tipo II, sarcopenia, aterosclerose com suas doenças coronarianas, doença cerebrovascular e doença vascular periférica (MEIRELLES,1999; PEDERSEN et al.,2003, MARIOTTI et al, 2011; LIMA et al., 2012; MARCHON et al., 2015; CAMOES et al,2016;BRAGGION et al.,2016).

Embora vários autores tenham estudado o impacto do treinamento resistido na parede da aorta ascendente de indivíduos jovens, de meia idade e senescentes em humanos e também em animais de laboratório (PEDERSEN et al, 2006; MARIOTTI et al, 2011; CROYMANS et al, 2014; FIGUEROA et al, 2014; LIMA et al., 2015; MARCHON et al., 2015; DE SOUZA et al, 2017; MAIFRINO et al.,2019), não foram encontradas na literatura consultada, informações sobre alterações na parede da aorta torácica de ratos idosos submetidos ao treinamento de resistência.

A hipótese do presente trabalho é que o treinamento resistido moderado pode promover modificações positivas na espessura da parede, nas fibras musculares lisas e nas fibras colágenas e elásticas da aorta torácica de ratos idosos, minimizando as doenças vasculares.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Artéria Aorta – Aspectos Estruturais

A aorta é a principal artéria do corpo humano, sai do ventrículo esquerdo do coração e segue em direção a raiz do pulmão esquerdo, passa através do diafragma até chegar ao abdômen no nível da quarta vértebra lombar se divide nas artérias ilíacas direita e esquerda. Durante a vida, a aorta absorve o impacto de 2 a 3 bilhões de batimentos cardíacos, enquanto distribui aproximadamente 2 milhões de litros de sangue pelo corpo. É dividida em: Figura 1

 Aorta Ascendente: Contendo a valva aórtica e a raiz da aorta

 Arco Aórtico: Origina as artérias subclávias e carótidas direita e esquerda.

 Aorta Descendente: Torácica: inicia na emergência da artéria subclávia esquerda e desce, cruzando o diafragma e Abdominal: continuação da aorta torácica dá origem a ramos viscerais (artérias mesentéricas e renais) e termina bifurcando nas duas artérias ilíacas comuns Direita e Esquerda, que vão em direção aos membros inferiores e pelve.

Figura 1-Divisões da artéria aorta com seus respectivos diâmetros normais em cm, na raiz da aorta (A), aorta ascendente (B), arco da aorta (C) e aorta torácica (D). Fonte: DIAS et al, 2010.

18 A aorta, classificada como artéria elástica, é composta por três túnicas:

 As túnica interna ou íntima, consiste de uma única camada de células endoteliais sobre uma lâmina elástica interna, que separa a íntima da média (Figura 2);

 A túnica média, formada de células musculares lisas em matriz de elastina, colágeno e substância fundamental mucóide dispostas como lamelas circulares, compondo as fibras elásticas da parede da aorta. As lamelas elásticas concêntricas compõem o arcabouço estrutural da camada média e atuam na manutenção do fluxo de sangue durante a diástole. Durante a sístole, o diâmetro das lamelas aumenta, enquanto na diástole, as fibras elásticas sofrem um rebote elástico projetando para diante o sangue no interior da aorta. A maior parte da elasticidade e do estiramento tensil da aorta é derivada da camada média (Figura 2);

 A túnica adventícia, que circula a túnica média externamente, encontra-se a composta de tecido conectivo frouxo com fibroblastos, colágeno, elastina e substância fundamental. O colágeno e a elastina são as principais proteínas estruturais da aorta, sendo o colágeno, responsável pela força tensil do vaso e a elastina, pela sua capacidade elástica. A manutenção do diâmetro externo da aorta é função biomecânica da adventícia. O dano de células musculares lisas da média não altera o diâmetro externo. Figura 2

Figura 2- Fotomicrografia da artéria aorta torácica. Túnica Adventícia (A), Túnica média (M) e fibras elásticas (x), Túnica Intima (I). Verhoeff, 400x, Barra 50 µm. Fonte: Lima,2014.

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2.2 Matriz Extracelular

A matriz extracelular é uma rede complexa composta por quatro grandes classes de macromoléculas: colágenos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos e glicoproteínas adesivas, que proporcionam um arcabouço físico para a sustentação da estrutura tecidual, determinando a hidratação e, consequentemente, o volume do tecido, criando espaços para o transporte de moléculas, a organização dinâmica e a resistência às forças de compressão (GAMBARINI et al, 1993)

Dentre os principais constituintes da matriz extracelular dos vasos sanguíneos temos: componentes fibrilares (colágenos fibrilares, laminina, fibronectina, elastina); componentes não-fibrilares (proteoglicanos e glicoproteínas não colagênicas); microfibrilas (colágenos não-fibrilares e microfibrilas associadas à elastina); enzimas de reciclagem de matriz (metaloproteinases, catepsinas, heparanase).

2.3 Fibras Elásticas

As fibras elásticas consistem em polímeros de tropoelastina interligados por microfibrilas. A elastina é produzida principalmente pelas células musculares lisas vasculares durante o período fetal e neonatal e é um nicho importante para a calcificação. O sistema elástico da aorta é essencialmente composto por lamelas e fibras de diferentes espessuras. O principal componente desse sistema é a elastina, uma glicoproteína estrutural. Dentre os componentes da matriz extracelular, as fibras elásticas são essenciais, a sua composição é fragmentada hierarquicamente, e apresenta funções biomecânicas únicas. Diferentes proporções de elastina e microfibrilas promovem características funcionais variáveis, adaptáveis às necessidades locais dos tecidos (KIELTY et al.,2002). Figura 3

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2.4 Colágeno

O colágeno atua como um arcabouço estrutural e com importante papel na resistência a distensões excessivas dos vasos, conferindo rigidez e ao mesmo tempo, limitando a extensibilidade, responsável também pela cicatrização e/ou regeneração em caso de corte ou cirurgia. A ampla variedade de tecidos conjuntivos reflete a variação na composição e na quantidade dos componentes (células, fibras e substância fundamental amorfa), os quais são responsáveis pela diversidade estrutural, funcional e patológica do tecido conjuntivo, possui até o momento cerca de 20 tipos (ALBERTS et al., 2004; KARASIK et al., 2006; BIONDO-SIMÕES et al., 2006; TAMPELINI., 2007). Figura 3

O colágeno, outro elemento da matriz extracelular dos vasos sanguíneos, é o principal tecido de sustentação da maioria dos órgãos. É dito frouxo quando as fibras colágenas são delgadas, desarranjadas e amplamente espaçadas; e denso quando as fibras colágenas estão compactadas e virtualmente confluentes (STEVENS & LOWE, 1995).

Corresponde a um grupo de proteínas constituídas por aminoácido glicina, prolinas e hidroxiprolinas (JENSEN & HOST, 1997). Essas proteínas formam um agregado de suporte para macromoléculas. O colágeno atua como arcabouço estrutural com papel importante na resistência a distensões excessivas dos vasos, conferindo rigidez e, ao mesmo tempo, limitando a extensibilidade dos mesmos (CATTEL et al.,1996). A orientação e organização do colágeno variam conforme o local, de acordo com o estresse tecidual exercido sobre a região (STEVENS & LOWE,1995).

Existem ao menos 28 diferentes tipos de colágenos, com predominância dos tipos I e III. Diversas células são capazes de sintetizar o colágeno (osteoblastos, células endoteliais e musculares lisas), mas a grande maioria deriva dos fibroblastos (JENSEN & HOST,1997). Figura 3

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Colágeno Tipo I: Encontrados em locais que resistem a grandes tensões

como artérias, tendões, derme da pele, nos ossos e até mesmo na córnea, este tipo forma fibras e feixes de colágeno, Figura 3

Colágeno Tipo III: Abundante no tecido conjuntivo frouxo é encontrado na

artéria aorta, coração, pulmões, músculo liso dos intestinos, fígado, útero, dentre outros, constitui as fibras reticulares, Figura 3

Figura 3-Fotomicrografia da aorta ascendente, mostrando fibras colágenas do tipo I nas túnicas média (seta vermelha), adventícia (seta amarela) e tipo III na túnica adventícia (seta verde) e na túnica média (seta azul). Técnica de Picrosirius Red, com luz polarizada, 200x, barra de 50 µm. Fonte: LIMA,2014.

Durante o envelhecimento normal, ocorre fragmentação das fibras elásticas, diminuição das células musculares lisas, desorganização e aumento do colágeno, aumento da substância fundamental amorfa, resultando em diminuição das propriedades elásticas da aorta, enfraquecimento de sua parede e subsequente dilatação. Os diâmetros da aorta aumentam com a idade, e variam de acordo com o sexo. Em mulheres menopausadas a privação dos hormônios ovarianos, leva a alteração na funcionalidade e na estrutura da artéria aorta, além de aumentar o risco de formação de placas ateroscleróticas (LIMA et al., 2015; MARCHON et al., 2015; MAIFRINO et al.,2019).

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2.5 Envelhecimento

A fibra elástica madura começa a surgir sob a forma de agregados de microfibrilas que tomam a disposição e a direção da futura fibra elástica. Com o processo de elastogênese, a elastina começa a se depositar nos interstícios dos feixes de microfibrilase, quando completamente formada, a fibra elástica madura apresenta-se na maior parte com o componente amorfo, a elastina circundada por um envoltório de microfibrilas (ROSS et al., 1977).

A redução da capacidade funcional dos órgãos se deve às alterações antropométricas, metabólicas, neuromotoras (RASO et al., 1997) e cardiovasculares que ocorrem nos tecidos do órgão durante o processo de envelhecimento. As alterações antropométricas compreendem incremento da massa corporal e da adiposidade corporal afetando o índice de massa corporal (IMC), diminuição da densidade óssea e redução da massa livre de gordura. Como alterações metabólicas, observam-se decréscimo da potência aeróbia e redução do consumo máximo de oxigênio. As alterações nas variáveis neuromotoras incluem redução do número de unidades motoras, diminuição da força dos músculos dos membros inferiores e superiores e diminuição do número de fibras musculares, especialmente as do tipo IIb (RASO et. al, 1997; NEGRÃO & BARRETTO, 2005; BRAGGION et al.,2016).

No período do envelhecimento as artérias perdem a elasticidade: suas paredes tornam-se mais rígidas, mais espessas, ocorre uma perda de tecido elástico, acúmulo de tecido conjuntivo e o depósito de cálcio. Estes fatores levam a falta de distensibilidade da parede do vaso, elevação do nível sistólico, aumento ventricular da parede (WENGER et al, 1988).

Durante o envelhecimento normal, as artérias, principalmente as de grande calibre, como a artéria aorta, sofrem fragmentação das fibras elásticas, diminuição das células musculares lisas, o colágeno torna-se mais espesso e desorganizado, a substância fundamental amorfa aumenta, resultando na diminuição das propriedades elásticas, enfraquecimento da sua parede e subsequente dilatação.

23 O papel conjunto de lamelas e fibras elásticas, o colágeno e as células musculares lisas conferem as características morfuncionais das artérias e proporcionam a qualidade das funções exercidas por elas. A elasticidade das artérias permite distensibilidade e complacência, o que garante a continuidade do fluxo sanguíneo. A resistência à tensão mecânica sustenta as variações de distensão e extensibilidade a que se submetem, garantindo a sua integridade, e participa na manutenção da resistência periférica total (RODRIGUES JUNIOR, 1987). Trabalhos feitos com animais de experimentação submetidos a diferentes protocolos de exercício físico têm contribuído para o entendimento da relação entre treinamento físico e modificação da massa corporal (FREIBERGER et al., 2011).

2.6 Exercício físico

Estudos evidenciaram que pessoas fisicamente ativas têm menor incidência de doenças crônicas entre elas hipertensão arterial, obesidade, depressão, diabetes tipo II, sarcopenia, aterosclerose com suas doenças coronarianas, doença cérebro-vascular e doença vascular periférica (DE ANGELIS et al., 1997, DE ANGELIS et al., 1999 e PEDERSEN et al, 2006). Com o envelhecimento a parede das artérias fica mais espessa e mais rígida. Este processo acontece como consequência de um espessamento progressivo das túnicas íntima e média e por acúmulo gradual de células musculares lisas e tecidos conjuntivos (FERRARI et.al, 2003). Estas alterações vêm acompanhadas da perda da elastina, e acúmulo de cálcio, resultando em diminuição da complacência arterial e da distensibilidade e o enrijecimento arterial associado a idade (VIRMANI et. al, 1991, TANAKA, 1998; NÓBREGA et al, 1999; MONAHAN, 2001).

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3. JUSTIFICATIVA

Sabendo que a população está vivendo mais e que o processo do envelhecimento está associado a alterações morfológicas e metabólicas, que levam ao aumento das doenças cardiovasculares, e que a aorta torácica por apresentar menor diâmetro comparada à abdominal estaria mais propensa a formação de placas ateromatosas, torna-se de grande importância o conhecimento destas alterações, bem como os benefícios do treinamento físico no acompanhamento deste processo.

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4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo Geral

Avaliar os efeitos do exercício resistido sobre parâmetros da estrutura da aorta torácica de ratos machos no processo de envelhecimento.

4.2 Objetivo Específico

- Técnicas histológicas (TH):

 Espessura das túnicas média-intima da parede da aorta  Densidade numérica das fibras elásticas da túnica média  Densidade de volume das fibras colágenas da túnica média

- Técnica de microscopia eletrônica de transmissão (MET):

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5. MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 Amostras e Procedimentos

Para a realização do estudo foram utilizados 20 ratos Wistar Rattus norvegicusalbinus – Rodentia Mammalia), machos com 14 meses de idade, acondicionados em gaiolas e supridos com ração apropriada e água à vontade durante o estudo. Os animais foram randomicamente divididos em dois grupos: grupo controle (GC, n=10) e grupo treinado (GT, n=10). Os animais foram pesados a cada semana.

No biotério da Universidade São Judas Tadeu, os animais foram acondicionados em caixas, 5 animais, distribuídos de forma aleatória, mantidos até os 16 meses de idade sob condições ambientais controladas de temperatura (23ºC) e iluminação (12 h de claro e 12 h de escuro por dia) e oferta sem restrições de água e alimentação composta exclusivamente de ração tradicionalmente oferecida para animais de laboratório (NUVILAB CR1, NUVITAL Nutrientes LTDA, Curitiba, PR).

O protocolo experimental foi submetido e aprovado pela Comissão de Bioética da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (Protocolo nº 1262/2007). Todos os animais da pesquisa receberam cuidados segundo as Normas Nacionais de Vivisseção Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e em consonância com a Lei Federal n° 11.794 de 8 de Outubro de 2008 em relação à utilização de animais para ensino e pesquisa.

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5.2 Protocolo de Treinamento Resistido Moderado

Para o protocolo de treinamento resistido foram utilizadas uma escada

vertical com 110 cm e inclinação de 80º e pesos de chumbo, atrelados a base da cauda do animal. No período de adaptação na escada, os animais subiram os degraus até o topo da escada, 3 subidas com descanso entre elas de 30 segundos, por uma semana (HORNBERGER & FARRAR,2004).

Após este período, os ratos foram pesados, e realizado o protocolo de esforço máximo, determinado pela carga máxima carregada pelo animal (HORNBERGER, FARRAR, 2004). O treinamento foi realizado com 60%, atividade moderada, 5 dias por semana, 6 subidas por dia, durante 8 semanas.

A fim dos grupos passarem pelo mesmo stresse, o grupo controle foi submetido a um treinamento de 3 escaladas por dia, uma vez por semana, por oito semanas.

5.3 Eutanásia e Preparação do Material para Microscopia de Luz

Ao término do período de treinamento, aos 16 meses, os animais foram sacrificados por decapitação. Em seguida realizada uma toracotomia, expondo o coração e os vasos da base e cerca de 0,5cm da artéria aorta torácica foi seccionada transversalmente, coletada e fixada em formol tamponado a 4% em tampão fosfato 0,1M pH 7,2, por 48 horas (CARSON et al,1973). Após as amostras foram desidratadas em séries crescentes de álcoois, diafanizadas em xilol, incluído em parafina, secionadas em cortes não seriados de 5 µm. Os fragmentos do tecido foram coletados em lâminas de vidro, corados pela Hematoxilina- Eosina (HE), Verhoeff e Picrosirius Red, a fim de se identificar os núcleos de células musculares lisas, o tecido elástico e o colágeno, respectivamente, para análise em microscopia de luz. Cada lâmina continha, independentemente do tipo de coloração, 3 cortes da aorta torácica (BADDELEY & CRUZ-ORIVE,1986).

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5.4 Processamento da Aorta Torácica para Microscopia Eletrônica

de Transmissão (MET)

Amostras da aorta torácica foram retiradas e imediatamente colocadas em uma solução fixadora de glutaraldeído a 2% em tampão fosfato de sódio a 0,1 M e pH 7,4 e imersos em uma solução aquosa de tetróxido de ósmio a 2% por duas horas. Posteriormente as amostras foram lavadas na mesma solução tampão, seguido de água destilada para então serem mantidas em uranila durante cerca de 12 horas na geladeira. Após esta etapa, as peças foram desidratadas em séries crescentes de alcoóis: 50% (10 minutos), 70% (10 minutos), 90% (10 minutos) e 100% (20 minutos), incluídas em Araldite e deixadas por dois dias. Os blocos foram cortados em secções de 70 a 90 nm de espessura em navalha de diamante. As secções transversais foram colocadas em telas de cobre e coradas com acetato de uranila (Reagen ®) a 3% e citrato de chumbo (Sigma ®).

5.5 Análises Morfométricas e Estereológicas

A análise morfométrica foi realizada através de um sistema digital de processamento e análise de imagens em computador, do Laboratório de Estudos Morfológicos e Imunohistoquímicos da Universidade São Judas Tadeu (LEMI). O sistema consiste em uma microcâmera de vídeo Sony, acoplada ao Microscópio Zeiss, que capta as imagens das lâminas histológicas e as transmite para um computador equipado com software específico para análises quantitativas. Para a análise morfométrica foi utilizado o programa de análise de imagens Software Axio Vision 4.8, Zeiss.

A análise estereológica, tem por função determinar a ocupação relativa das estruturas na área teste e, de acordo com (GUNDERSEN ,1988), permite a observação quantitativa das estruturas tridimensionais, possibilitando quantificar as modificações adaptativas patológicas ou normais das estruturas celulares (PEREIRA et al., 1999). Para a análise das imagens digitalizadas, utilizamos o software Image J, do Instituto Nacional de Saúde, USA.

29

5.5.1. Espessura das túnicas média e íntima

A espessura das túnicas íntima média da parede da aorta torácica foi realizada por meio de 3 medidas, em quatro locais equidistantes localizados a 0º, 90°, 180° e 270°, de 3 cortes não consecutivas, totalizando 12 medidas por lâmina/animal, coradas com Hematoxilina-Eosina (Fig. 4).

Figura 4 -Representação esquemática de corte transversal da aorta torácica mostrando os locais onde foram feitas as medidas da espessura da parede.

5.5.2. Densidade de numérica de lamelas elásticas

Os números de lamelas elásticas foram obtidos pela contagem de lamelas e núcleos em 4 diferentes pontos da parede da aorta em 3 cortes histológicos por animal. O valor final foi a média dos valores obtidos (Fig. 5).

30 Figura 5 - Corte histológico da parede da aorta torácica utilizado para contagem de lamelas elásticas (setas) e núcleo de célula muscular lisa (cabeça de seta). Vehroff, barra 40µm. Fonte: PUELKER, 2018.

5.5.3. Densidade de volume de fibras colágenas (Vv[fc]%)

Para determinar a densidade de volume das fibras colágenas, coradas pelo Picrosirius Red, em ambos os grupos, foi aplicado o sistema teste, com um total de 32 pontos, correspondentes a 100% da imagem, com o auxílio do programa Image J. (versão 1.47 - National Intitutes of Health; COLLINS, 2007), onde foram contabilizados os pontos que caiam sobre a estrutura desejada. Os valores médios foram calculados (Figura 6).

Figura 6 – Fotomicrografia da túnica média da parede da aorta torácica, mostrando o grid utilizado. As fibras colágenas aparecem como vermelho (seta) corados pelo Picrosirius. X1000 Fonte: PUELKER, 2018.

31

5.5.4. Diâmetros maior e menor das fibras colágenas

Os diâmetros máximo e mínimo das fibrilas colágenas foram determinados em 10 ultramicrografias eletrônicas de cada aorta com aumento final de x12.000 obtidas de regiões nas quais as fibrilas colágenas estivessem seccionadas transversalmente. Para medir os diâmetros das fibrilas colágenas foi utilizado o programa de análise de imagem Axio Vision 4.8- Zeiss (Figura 7).

Figura 7 – Ultramicrografia eletrônica das fibras colágenas (setas) em aumento de x12000 evidenciando a distribuição das fibras colágenas do tipo I (de maior diâmetro - branco) e das fibras colágenas do tipo III (de menor diâmetro- vermelho) nos vários grupos estudados. Barra de 30nm. Fonte: PUELKER, 2018.

5.6. Análise Estatística

Os resultados foram apresentados como média e erro padrão da média. Para a comparação de pares de médias, foi empregado o teste "t" de Student. Todos os testes foram realizados com nível de significância de 5%.

32

6. RESULTADOS

Os resultados estão apresentados na tabela 1 e figuras 8, 9, 10 e 11.

Tabela 1 – Espessura (Esp.) da parede da Aorta torácica; Densidade numérica

de fibras elásticas por campo (Nn[fe]/c); Densidade de volume de fibras colágenas (Vv[fc]%); Diâmetro médio das fibras colágenas (Dm[fc]).

GC GT

Esp.(µm) 40,33 ± 1,27 34,43 ± 1,34*

Nn[fe]/c 6,96 ± 0,33 4,73 ± 0,21*

Vv[fc]% 32,83± 1,87 26,6 ± 3,1*

Dm[fc] (nm) 16,46± 0,63 9,47± 0,37*

M±EPM *p<0,05 vs Grupo GC; #_{p<0,05 vs Grupo GC;} +_{p<0,05 vs Grupo GC}

6.1 Espessura da camada Média-Íntima da Aorta Torácica (µm)

Verificamos redução significante da espessura da camada média -íntima da aorta torácica no GT quando comparado ao GC (Tabela 1 e Figura 8).

33 Figura 8- Espessura da camada média-íntima da aorta torácica nos grupos estudados. Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs Grupo GC

6.2 Densidade Numérica de Fibras Elásticas/Campo (Nn[fe]/c)

Os resultados mostram redução significante da densidade numérica de fibras elásticas no grupo treinado (GT) quando comparado ao grupo controle (GC) (Tabela1 e Figura 9).

Figura 9- Densidade numérica das fibras elásticas/campo. Valores representam M±EPM; *p<0,05 vs Grupo GC

34

6.3 Densidade de Volume das Fibras Colágenas (Vv[fc]%)

Observamos redução significante na densidade de volume das fibras colágenas (Vv[fc]%) no grupo GT quando na comparação com o grupo GC (Tabela 1 e Figura 10).

Figura 10- Densidade de volume das fibras colágenas (Vv[fc]%) dos grupos estudados. Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs Grupo GC.

35

6.4 Diâmetro Médio das Fibras Colágenas

Observamos que o diâmetro médio das fibrilas colágenas no Grupo GT apresentou-se significantemente menor do que o diâmetro das fibrilas do Grupo GC (Tabela 1 Figura 11).

Figura11- Diâmetro médio das fibrilas colágenas da aorta torácica dos grupos estudados. Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs Grupo GC

36

7. DISCUSSÃO

Durante o envelhecimento, as artérias, principalmente as de grande calibre, como a aorta, sofrem fragmentação das fibras elásticas, redução das células musculares lisas, o colágeno torna-se mais proeminente e desorganizado, a substância fundamental amorfa aumenta resultando na diminuição das propriedades elásticas, enfraquecimento da sua parede e subsequente dilatação. Como consequência a aorta perde elasticidade e progressivamente sua parede torna-se mais espessa e endurecida (MAIFRINO et al, 2009; MARIOTTI et al,2015; LIMA et al., 2015; SOUZA et al, 2015; MARCHON et al.,2015).

As regiões torácica e abdominal da aorta humana apresentam diferenças com redução gradativa do diâmetro e da espessura dos seguimentos proximais (torácica) aos distais (abdominal). Também varia conforme o grau de pressão a que está sujeita: em regiões de maior pressão, a aorta abdominal apresenta característica mais rígida, com maior conteúdo de colágeno, sofrendo alterações do processo de envelhecimento mais precocemente e em regiões de menor pressão, aorta torácica, é mais distensível e com maior conteúdo elástico (SOKOLIS et al., 2007; TSAMIS et al., 2013).

Quanto a avaliação das diferenças entre os gêneros, os homens apresentam aorta com maior diâmetro e aumentam com a idade em ambos os gêneros, no homem entre 50-60 anos e na mulher 60-70 anos (SONESSON, et al, 1994).

Lindesay et al (2018), comparando as artérias torácicas e abdominal em ratas de meia idade hipertensas, verificaram que as ratas com dietas salinas obtiveram aumento no diâmetro da aorta torácica em relação a abdominal, as lamelas elásticas adelgaçaram e apresentaram-se espaçadas, evidenciando que a aorta abdominal é mais propensa a arteriosclerose do que a aorta

37 torácica, esta, menos rígida em relação a aorta abdominal.

O treinamento físico resistido, vem sendo apontado como uma importante ferramenta na diminuição de riscos de doenças cardiovasculares, promovendo importantes respostas metabólicas e hemodinâmicas (ALMEIDA & ARAÚJO, 2003; MONTEIRO & SOBRAL, 2004) capazes de reverter prejuízos ocasionados por diversos fatores de risco, como a idade, menopausa e dislipidemias. Idosos podem se beneficiar da aplicação de treinamento de força: Fiatarone et al (1990) demonstraram que até mesmo indivíduos com idades acima de 90 anos podem conseguir ganho de força durante um período de treinamento de 8 semanas. O aumento de força pode beneficiar até mesmo indivíduos com doenças crônicas (FLECK & KRAEMMER, 1999, MARCHON, 2015)

Por outro lado, a inatividade física causa disfunção endotelial em ratos jovens e saudáveis (SUVORAVA et al.,2004) e em idosos (MARIOTTI et al., 2009, CURY, 2015) a qual é completamente reversível por exercícios físicos moderados em um curto período.

A relevância do presente estudo na aorta torácica de Wistar idosos treinados com exercício resistido de intensidade moderada, foi a confirmação da efetividade do treinamento resistido frente ao envelhecimento onde constatamos que o treinamento promoveu redução (p < 0,05) na espessura da camada média-íntima, na densidade numérica de fibras elásticas/campo e na densidade de volume e diâmetro médio das fibras colágenas.

Poucos artigos foram encontrados com modelo experimental idoso que realizasse exercício resistido, desta forma a discussão permeou em artigos que evidenciavam as alterações da aorta no processo de envelhecimento levando em conta a área estudada, sexo, idade e patologias envolvidas neste processo.

Corroboram com nossos resultados (SOUZA et al, 2015) comparando ratos de meia-idade e idosos que realizaram treinamento resistido, mostrando a normalização quantitativa do material elástico, colágeno e fibras musculares lisas, a espessura da parede da aorta diminuiu.

38 Com o envelhecimento a parede das artérias ficam mais espessas e mais rígidas. Este processo acontece como consequência de um espessamento progressivo das túnicas íntima e média e por acúmulo gradual de células musculares lisas e tecidos conjuntivos (FERRARI et. al, 2003).

Baxter et al (1994), observaram uma correlação positiva entre o fator idade e a espessura da aorta, assim como entre a idade e a quantidade de fibras colágenas, uma forte correlação positiva entre idade e conteúdo de colágeno na aorta humana.

Komutrattanamont et al (2019), estudando a aorta humana de idosos verificou aumento do diâmetro da aorta, fragmentação dos componentes elásticos, aumento de fibras colágenas, resultando no remodelamento da parede arterial como resposta fisiológica às alterações sofridas pelo estresse da parede, o envelhecimento vascular muda gradualmente desde a infância, mas as mudanças se tornam mais significativas na meia idade e depois se deterioram com o envelhecimento.

Nossos resultados mostram diminuição na espessura da aorta torácica e nas fibras elásticas de ratos idosos, mostrando que o exercício resistido promove um remodelamento positivo, diferente do que foi observado por Coura et al. (2012), em ratos idosos provavelmente devido ao fato dos autores terem utilizado treinamento aeróbio (natação), observando aumento na espessura da aorta, nas fibras elásticas, no número de lamelas, propondo que a aorta tornou-se mais forte e extensível, com maior quantidade de elastina e com menos alterações degenerativas.

Souza & França (2017), estudando ratos jovens que realizaram treinamento resistido verificaram aumento nos componentes estruturais (colágeno/elastina e célula muscular) na parede da aorta, acreditamos que o fato do estudo ter sido realizado em ratos jovens (3 meses), tenha direcionado para tal resultado.

Resultados diferentes foram encontrados por Souza et al. (2015), ao analisarem a aorta ascendente de ratos idosos com treinamento resistido, onde observaram que o treinamento resultou na melhora estrutural da parede da

39 aorta, com normalização quantitativa do material elástico, colágeno e das fibras musculares lisas. Nossos resultados discordam do referido autor pois a área estudada em nosso estudo foi aorta torácica.

Já para Wenger et al. (1988) a redução da espessura da parede arterial, assim como sua dilatação, está relacionada ao seu processo de degeneração, contrapondo, Hayashi et al. (2005) onde pontua que o aumento da espessura arterial está associado à redução de seu enrijecimento.

Marchon (2015), utilizando artéria aorta ascendente de animais dislipidêmico ovariectomizados exercitados (corrida em esteira) encontraram redução nas fibras colágenas dos animais dislipidêmico ovariectomizados, sugerindo que a discordância dos resultados pode ser explicada pelo fato da diferença entre os segmentos estudados e o treinamento utilizado, pois sabemos que a aorta ascendente apresenta diâmetro maior que a aorta torácica e sofre maior pressão sanguínea.

Paniagua et al, (1983) ressalta que a alteração na quantidade de elastina é o que representa o elemento responsável pela distensibilidade reversível da aorta, sendo capaz de aumentar ou diminuir o seu comprimento e o seu volume em até uma vez e meia e retornar ao seu comprimento ou volume inicial.

Marchon (2010), as alterações na quantidade e qualidade de qualquer um dos constituintes da matriz, tais como: água, íons, proteoglicanas, colágeno e fibras elásticas podem ser a base de doenças que afetam diretamente a aorta. O aumento na rigidez vascular é determinado por um aumento na proporção colágeno-elastina e pela deposição de cálcio e lipídeos (AGUILA et al.,1998).

O indivíduo que desenvolve um enrijecimento arterial, pela idade ou por patologias associadas, provavelmente terá uma diminuição da distensibilidade dos grandes vasos. Sendo assim, o indivíduo fisicamente treinado desenvolve um melhor desempenho nas atividades diárias, tornado tardio os efeitos da idade no enrijecimento dos vasos (TANAKA et al, 2000).

Em estudos realizados em humanos, outros autores também consideram que o grau de eficiência da redução da rigidez arterial em mulheres na

40 menopausa está relacionado com o quão precoce o exercício físico é iniciado (MOREAU et al., 2003; SUGAWARA et al., 2006).

Marchon et al. (2010) as mudanças estruturais da parede das artérias, como as mudanças quantitativas da elastina e do colágeno, refletem as mudanças adaptativas produzidas pelo exercício e pelas alterações a que o organismo é submetido ao longo do seu processo de maturação e desenvolvimento.

Os resultados encontrados neste estudo permitem supor que programas de treinamento de força moderado, mesmo iniciados na fase de envelhecimento, podem ser extremamente eficazes para contribuir para a prevenção de doenças cardiovasculares e, especialmente, de patologias envolvendo a artéria aorta torácica.

41

8. CONCLUSÕES

Durante o processo de envelhecimento verificamos que:

- O exercício resistido moderado promove diminuição na espessura da parede da aorta torácica e mudanças morfológicas significativas nos componentes elásticos e musculares da aorta torácica,

- Assim os resultados encontrados nesse estudo sugerem que o treinamento resistido moderado pode ser utilizado como tratamento não farmacológico nas patologias envolvendo a artéria aorta torácica.

42

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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