UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
Daniel Campos Villela
CONTRIBUIÇÃO DOS RECEPTORES 5-HT
1ADA SUBSTÂNCIA
CINZENTA PERIAQUEDUTAL NA RESPOSTA CARDIOVASCULAR
PRODUZIDA PELA ATIVAÇÃO DO HIPOTÁLAMO DORSOMEDIAL
Belo Horizonte
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.DANIEL CAMPOS VILLELA
CONTRIBUIÇÃO DOS RECEPTORES 5-HT
1ADA SUBSTÂNCIA
CINZENTA PERIAQUEDUTAL NA RESPOSTA CARDIOVASCULAR
PRODUZIDA PELA ATIVAÇÃO DO HIPOTÁLAMO DORSOMEDIA
Belo Horizonte
2007
Dissertação apresentada ao programa
de Pós-Graduação em Fisiologia e
Farmacologia
da
Universidade
Federal de Minas Gerais com o
requisito para obtenção do título de
Mestre em Fisiologia.
Orientador: Prof. Dr. Marco Antônio
Peliky Fontes.
Aos meus pais, Marcelo e Etelvina e aos meus avós, Joaquim e Marina.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Marco Antônio Peliky Fontes, orientador que me acolheu como estudante e me guiou verdadeiramente por todo o percurso deste trabalho.
Aos amigos e professores do laboratório de Hipertensão e a todos os outros amigos que fiz no ICB.
Ao amigo Luiz Gonzaga que esta comigo neste afeto pela fisiologia desde os tempos de monitoria.
Ao Zezé, pela sua ajuda e amizade que espero manter para sempre.
A todos os meus familiares e em especial à minha irmã Mariana.
Aos amigos de infância do acamari, Bené, Guilesmel, Meg, Capina, Bigainhas, Jayjay, Chapinha, Naka, Gutão, Torão e aos que fiz aqui em Belo Horizonte, Norberto, Cristiano, Guilherme e Rodrigo.
“Eu quase que nada não sei. Mas
desconfio de muita coisa.”
RESUMO
A ativação dos neurônios do hipotálamo dorsomedial (DMH) através da microinjeção do antagonista GABAA, bicuculina (bic), resulta em alterações cardiovasculares, comportamentais e endócrinas similares às observadas durante o estresse emocional. Recentemente demonstramos que a taquicardia e o aumento da pressão arterial produzido pela ativação do DMH através da microinjeção de bic, dependem da integração com os neurônios da região lateral/dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal (l/dlPAG), que é uma região moduladora das respostas comportamentais de defesa. Demonstramos recentemente também que essa sinapse entre o DMH e a l/dlPAG é mediada pelo receptor de aminoácido excitatório N-metil-D-aspartato (NMDA). Agonistas do receptor serotoninérgico subtipo 1A (5-HT1A) possuem utilidade clínica como agentes ansiolíticos e antihipertensivos. Adicionalmente, a ativação de receptores 5-HT1A no tronco encefálico reduz a resposta de aumento da pressão arterial e simpatoexcitatória produzida pela ativação do DMH. No entanto, as regiões específicas do sistema nervoso central onde a ativação destes receptores produziria essas ações ainda não foram determinadas. Neste estudo, avaliamos se a l/dlPAG pode ser uma das regiões do tronco encefálico onde a ativação dos receptores 5-HT1A pode interferir nas respostas produzidas pela ativação do DMH. Adicionalmente testamos se a ativação dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG poderia modular outros tipos de estresse emocional.
Os resultados do presente estudo mostram que a ativação de receptores 5-HT1A na l/dlPAG pode reduzir a resposta cardiovascular induzida pela (1) ativação dos neurônios do DMH; (2) pela ativação dos receptores NMDA na própria l/dlPAG; e (3) pelo estresse emocional por jato de ar. Em conjunto, os resultados do presente estudo sugerem que a sinapse entre o DMH e a l/dlPAG pode ser modulada por receptores 5-HT1A.
ABSTRACT
Neurons in the region of dorsomedial hypothalamus (DMH) are involved in the organization of the physiological responses to emotional stress. Activation of the 5-hydroxytryptamine 1A (5HT1A) receptors in the brain stem causes a potent and selective suppression of the hypertensive and sympathoexcitatory response evoked by stimulation of the DMH. However, the specific region in the brain stem where activation of 5HT1A receptors could possibly suppress the response evoked by activation of the DMH is still unknown. We have recently shown that the lateral/dorsolateral region of the periaqueductal gray (l/dlPAG) is a synaptic relay in the descending pathways mediating the cardiovascular response evoked from the DMH. We have also shown that this synapse between DMH and l/dlPAG is mediated by excitatory amino acid receptors, possibly N-methyl-D-aspartate (NMDA). In this study, we aimed to investigate whether the l/dlPAG is one of the regions of the brain stem where the 5-HT1A agonists may act and interfere in the response evoked by activation of the DMH neurons and additionally, in two other emotional stress models: 1) Air Jet stress; and 2) microinjection of NMDA into the l/dlPAG. The results of the present study show that the activation of 5HT1A receptors in the l/dlPAG can modulate the cardiovascular response evoked by activation of DMH neurons and by two other types of emotional stress. Altogether, these findings indicate that the synapse between DMH and l/dlPAG may be modulated by 5-HT1A receptors at the l/dlPAG.
LISTA DE ABREVIATURAS
3V Terceiro ventrículo
5-HT1A Receptor da 5-Hidroxitriptamina subtipo 1A AAE Aminoácido excitatório
ACTH Hormônio adrenocorticotrópico
bic Bicuculina methiodide
bpm batimentos por minuto
DMC Porção compacta do DMH
DMD Porção difusa do DMH
DMH Hipotálamo dorsomedial
dPAG Coluna dorsal da PAG
DRN Núcleo dorsal da rafe
f Fórnix
FC Frequência cardíaca
GABA Ácido gama amino butírico
IML Coluna intermediolateral
l/dIPAG Coluna lateral e dorsolateral da PAG 8-OH-DPAT Agonista do receptor 5-HT1A
mmHg milímetros de mercúrio
musc agonista do receptor GABAA, muscimol
NMDA Ácido n-metil d-aspártico
NTS Núcleo do trato solitário
PAG Substância cinzenta periaquedutal
PAM Pressão arterial média
PVN Núcleo paraventricular do hipotálamo
RP Rafe pallidus
RVLM Bulbo rostral ventrolateral
SNC Sistema nervoso central
vlPAG Coluna ventrolateral da PAG
VMH Hipotálamo ventromedial
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...8 2 OBJETIVOS...17 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...17 3 MATERIAIS E MÉTODOS...18 3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS...18 3.2 ANIMAIS...18 3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS...18 3.4 MICROINJEÇÃO DE DROGAS...20
3.5 ANÁLISE DA ATIVIDADE LOCOMOTORA...21
3.6 ESTRESSE POR JATO DE AR...22
3.7 DROGAS...23 3.8 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS...23 4 HISTOLOGIA...31 5 ANÁLISE ESTATÍSTICA...32 5 RESULTADOS...32 6 ANÁLISE HISTOLÓGICA...50 7 DISCUSSÃO...52 8 BIBLIOGRAFIA...62
1. Introdução
Cannon (1929) ampliando o conceito de milieu intérieur (“constância do meio interno”) de Claude Bernard (1878) introduziu o conceito de homeostasia (homoio, similar, parecido; stasis, parada) para descrever os processos fisiológicos que mantém os estados de equilíbrio de um organismo e sugeriu que o sistema nervoso simpático seria o principal responsável pelo controle da homeostase após algum evento estressante (CANNON, 1929). No entanto, foi Hans Selye (1936) que introduziu, como termo médico, a palavra estresse, à comunidade científica. Em sua publicação na revista SCIENCE em 1955, descreveu uma tríade patológica (aumento da adrenal, ulceração gastrointestinal e involução do timo) gerada por qualquer agente estressor. Hans Selye conceituou estresse como um componente inespecífico. Atualmente, é aceito que agentes estressantes específicos podem causar respostas específicas e ativar diferentes circuitos do sistema nervoso central (PACAK & PALKOVITS, 2001).
Em particular, a resposta fisiológica associada ao estresse emocional consiste em um padrão integrado de alterações endócrinas, autonômicas e comportamentais que foram evolutivamente conservadas nos mamíferos (HANS SELYE, 1955; LEDOUX, 1994; DIMICCO et al., 2002). Sem dúvida, essas alterações fisiológicas aumentam as chances de sobrevivência do animal frente à circunstâncias ameaçadoras, sendo então fundamentais para a preservação das espécies. No entanto, o homem urbanizado vivencia situações próprias que o faz experimentar, muitas vezes de forma exagerada ou desbalanceada, as respostas
autonômicas ao estresse. O estresse contribui para o aparecimento de uma grande variedade de doenças em humanos. Entre essas se destacam, a hipertensão arterial (FOLKOW, 1987; HENRY et al., 1986), as arritmias cardíacas, desordens da motilidade intestinal, formações de úlceras gástricas e duodenais (FOSSEY & LYDIARD, 1990), a síndrome do pânico (STROHLE & HOSBOER, 2003), o infarto do miocárdio e até mesmo a morte súbita (GAVEY, 1954; MEERSON, 1994).
Desde os primeiros estudos sobre o estresse, fica evidente a importância da compreensão das vias neurais relacionadas às respostas produzidas pelo estresse emocional (HANS SELYE, 1936).
Por mais de meio século, estudos mostram o envolvimento do hipotálamo como uma estrutura chave na geração da resposta fisiológica ao estresse emocional (KARPLUS & KREIDL, 1927; BARD, 1928). Mesmo assim, até os dias atuais, os mecanismos e circuitos neurais responsáveis pela geração da resposta ao estresse emocional permanecem em grande parte desconhecidos.
Estudos vêm apontando o núcleo dorsomedial do hipotálamo (DMH) como sendo um componente importante das vias centrais mediadoras da respostas cardiovasculares e comportamentais relacionadas ao estresse emocional (DIMICCO et al., 1996; DIMICCO et al., 2002) (Figura 1).
O DMH é anatomicamente localizado adjacente ao terceiro ventrículo e caudal ao núcleo paraventricular do hipotálamo (PAXINOS & WATSON, 1997). A ativação dos neurônios do DMH por meio da microinjeção de aminoácidos excitatórios ou do antagonista de receptores gabaérgicos subtipo A (GABAA), bicuculline-methiodide (bic) resulta em aumento da pressão arterial (PA) e
importante aumento da frequência cardíaca (FC) (BAILEY et. al 2001; FONTES et
al., 2001; DE NOVELLIS et al., 1995) e da atividade simpática (FONTES et al.,
2001; CAO & MORISSON., 2004; HORIUCHI et al., 2004(b) ), além de alterações neuroendócrinas que reproduzem aquelas observadas durante o estresse emocional agudo (BAILEY et al., 2001).
Núcleo Dorsomedial
V M H PVN P H N A H N TÁLAMOFigura 1. Corte sagital do cérebro mostrando o hipotálamo dorsomedial e alguns dos principais núcleos hipotalâmicos que o circundam. VMH, hipotálamo ventromedial; AHN, hipotálamo anterior; PHN, hipotálamo posterior, PVN, núcleo paraventricular do hipotálamo.
Retirado e adaptado de Berne/Levy. Physiology. 5th Edition, 2004
Ativação dos neurônios do DMH também produz alterações comportamentais caracterizadas por aumento da atividade locomotora, aumento seletivo de respostas motivadas pelo medo e aumento na ansiedade experimental (SHEKHAR & DIMMICO, 1987). É interessante destacar que a disfunção crônica de GABA no DMH revelou ser um modelo experimental de transtorno do pânico (SHEKHAR et al., 1996). Ao contrário, a inibição do DMH reduz de forma
importante a resposta pressora e taquicárdica induzida pelo estresse emocional em ratos acordados (STOTZ-POTTER et al., 1996). Sendo assim, todos esses estudos em conjunto apontam o envolvimento do DMH nas respostas fisiológicas relacionadas ao estresse emocional.
Estudos anatômicos mostraram que o DMH não contém neurônios que enviam projeções diretas para os neurônios pré-ganglionares simpáticos localizados na coluna intermediolateral da medula espinhal (TER HORST et al., 1986; THOMPSON et al., 1996). Desta forma, como postulado por Fontes et al. (2001) as alterações fisiológicas relacionadas à ativação dos neurônios do DMH deveriam incluir integrações sinápticas em neurônios de núcleos supramedulares. Neste sentido, esses autores mostraram que as respostas pressora e simpatoexcitatória, mas não a resposta taquicárdica, produzidas pela microinjeção de bicuculina methiodide (bic) no DMH foram abolidas pela inibição dos neurônios da região rostroventrolateral do bulbo (RVLM). Em um estudo subsequente, (SAMUELS et al., 2002; CAO & MORRISON, 2004) foi demonstrado que a taquicardia produzida pela estimulação de neurônios do DMH é atenuada pela inibição de um outro núcleo bulbar, a rafe pallidus (RP). Em conjunto, estes estudos mostraram que as respostas cardiovasculares e simpatoexcitatórias evocadas pela ativação dos neurônios do DMH seriam mediadas pela integração de múltiplos relés sinápticos (FONTES et al., 2001; SAMUELS et al., 2002; CAO & MORRISON, 2004).
Além dos relés sinápticos em nível bulbar descritos acima, estudos anatômicos (TER HORST et al., 1986; THOMPSON et al., 1996 ) mostram a existência de projeções do DMH para uma região mesencefálica que circunda o
aqueduto cerebral, a substância cinzenta periaquedutal (PAG). Os neurônios da PAG possuem papel crucial na integração das respostas autonômicas e somáticas características das reações de defesa (BANDLER & CARRIVE, 1988). De acordo com esses autores, a reação de defesa é comumente referida a uma mudança comportamental e cardiovascular característica do animal sob uma situação de estresse emocional (BANDLER & CARRIVE, 1988).
A substância cinzenta periaquedutal controla um grande número de funções, como a modulação da dor (BASBAUM, 1984; BEHBEHANI et al., 1990; REYNOLDS, 1969), vocalização (JURGENS et al., 1979) e particulamente as respostas autonômicas (LOVICK, 1991) e os diferentes padrões comportamentais de defesa (BANDLER & CARRIVE, 1988; TRICKLEBANK, 1985).
A PAG não é uma estrutura homogenêamente funcional, desta forma, diferentes tipos de padrões comportamentais e cardiovasculares podem ser observados quando diferentes porções da PAG são estimuladas (CARRIVE, 1993). Em particular, a microinjeção de aminoácidos excitatórios (AAE) na porção caudal da coluna lateral e dorsolateral da PAG (l/dlPAG) produz fuga, taquicardia e hipertensão. Em contraste, a microinjeção de AAE realizada na coluna ventrolateral da PAG (vlPAG) diminui a reatividade do gato à estimulos externos (hiporreatividade) e esse comportamento é associado com hipotensão e bradicardia (BANDLER et al., 2000). Desta forma, as respostas produzidas pela ativação da l/dlPAG são semelhantes às observadas após ativação do DMH, o que sugere o envolvimento dos neurônios desta região como um possível relé sináptico nas vias cardiovasculares oriundas do DMH.
Com o objetivo de responder a esta sugestão, DA SILVA et al. (2003) demonstraram que a resposta cardiovascular produzida pela ativação do DMH por meio da microinjeção de bic em ratos acordados depende de conexões sinápticas com a região l/dlPAG, pois a inibição dessa região por meio da microinjeção do agonista do receptor GABAA, muscimol, abole tanto a resposta pressora como a resposta taquicárdica produzida pela ativação do DMH (DA SILVA et al., 2003). Em um estudo mais recente DA SILVA et al. (2006) demonstraram que as conexões sinápticas entre os neurônios do DMH e os da l/dlPAG são mediadas por aminoácidos excitatórios (AAE), possívelmente o N-Metil-D-Aspartato (NMDA) (DA SILVA et al., 2006).
A serotonina (5-Hidroxitriptamina, 5-HT), é uma monoamina amplamente distribuida pelo organismo dos mamíferos, sendo sintetizada a partir do aminoácido essencial L-triptofano principalmente pelas células enterocromafins gastrointestinais e por neurônios serotoninérgicos. Possui sete familias e quatorze subtipos de receptores, até então descobertos (LEOPOLDO, 2004; para revisão BARNES & SHARP, 1999).
Desde sua descoberta no cérebro de mamíferos (TWAROG & PAGE,1953) os efeitos da serotonina às respostas relacionadas ao estresse vêm sendo estudados (HEDGES, 2007). Nos últimos 50 anos, drogas que possuem como alvo direto ou indireto o mecanismo de ação da serotonina, surgiram como uma importante categoria de agentes terapêuticos, fornecendo tratamento para grande quantidade de distúrbios clínicos (PEROUTKA et al., 1989).
Pesquisas em estresse e serotonina mostram que é plausível a hipótese que os componentes dos sistemas serotoninérgicos centrais são sensíveis a
agentes estressores. Essa hipótese se enquadra nas respostas terapêuticas observadas em pacientes com distúrbios de ansiedade e ou depressão, sugerindo então que a 5-HT é um componente importante dos circuitos neurais que provêm adaptação ao estresse (CHAOULOFF et al., 1999).
Entre as drogas ansiolíticas, é importante destacar os inibidores seletivos da recaptação da serotonina, como a fluoxetina e paroxetina. Por seletivamente bloquearem a recaptação de 5-HT, acredita-se que essas drogas funcionem via modulação dos receptores 5-HT1A, conceito que foi reforçado pela ação ansiolítica
da buspirona que é um agonista parcial do receptor 5-HT1A (VAN DER BUUSE &
WEGENER, 2004).
Áreas do sistema nervoso central envolvidas com a regulação cardiovascular recebem grande quantidade de projeções vindas de neurônios serotoninérgicos (DAHLSTROM & FUXE, 1965).
Dos compostos que modulam a ação dos receptores de serotonina, é importante destacar o agonista seletivo do receptor 5-HT1A 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)-tetralin (8-OH-DPAT) como sendo o composto mais estudado sobre uma perspectiva cardiovascular (para revisão PEROUTKA et al.,1989, MCCALL & CLEMENT, 1994). Particulamente com relação ao sistema cardiovascular, a administração de 8-OH-DPAT resulta em redução da pressão arterial e da frequência cardíaca em uma variedade de animais anestesiados ou não, incluindo ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (PEROUTKA et al., 1989, MCCALL & CLEMENT, 1994). Estudos mostram também que o 8-OH-DPAT atua via sistema nervoso central para produzir seu efeito cardiovascular. A administração de 8-OH-DPAT no sistema nervoso central (via cisterna pontina),
produz redução mais acentuada dos parâmetros cardiovasculares quando comparada aos efeitos da administração da mesma dose via intravenosa (WOUTERS et al., 1988; DOODS et al., 1988). É importante destacar a alta afinidade de receptores 5-HT1A à 5-HT e ao 8-OH-DPAT em regiões do tronco encefálico, fato que não ocorre com outros ligantes também específicos ao receptor 5-HT1A, como o MDL 73005 EF , BMY 7378 e a buspirona (ANDRADE & NICOLL, 1987)
Em um estudo recente de HORIUCHI et al. (2005), foi sugerido que os efeitos da ativação dos receptores 5-HT1A no tronco cerebral causa uma potente e seletiva supressão da resposta hipertensiva e simpatoexcitatória evocada pela estimulação do DMH. Desta forma, a resposta produzida pela estimulação do DMH pode ser atenuada pela ativação de receptores 5-HT1A. No entanto, não foi identificado o local específico do tronco cerebral onde os receptores 5-HT1A estão
produzindo sua ação inibitória sobre as respostas evocadas pelo DMH.
A l/dlPAG possui receptores 5HT1A que ao serem ativados levam à inibição
da atividade neuronal dessa mesma região. (PAZOS & PALACIOS, 1985). A microinjeção do agonista dos receptores 5-HT1A, 8-OHDPAT na l/dlPAG pode
inibir as respostas simpatoexcitatórias e de pânico produzidas pela eletroestimulação e estimulação química dessa mesma região (JOHNSON et al., 2004). Adicionalmente, foi demonstrado que a resposta comportamental de defesa produzida pela eletroestimulação do hipotálamo medial foi reduzida de uma forma dose dependente pela microinjeção do agonista seletivo do receptor 5-HT1A,
Em conjunto, estes estudos sugerem que a l/dlPAG possa ser a região do tronco cerebral onde os efeitos da ativação dos receptores 5-HT1A reduzem as
respostas hipertensivas e simpatoexcitatórias evocadas pela estimulação do DMH. Como existe uma via anatômica e funcional entre o hipotálamo dorsomedial e a PAG (TER HORST et al., 1986; THOMPSON et al., 1996), é possível especular sobre os efeitos da ativação dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG sobre a
modulação das respostas produzidas pela ativação do DMH. Desta forma, a ativação desses receptores serotoninérgicos capazes de inibir respostas simpatoexcitatórias e de comportamento de emergência tipo “fuga ou luta”, pode ser relevante na tentativa de explicar a eficácia de drogas serotoninérgicas no tratamento da hipertensão, ansiedade e ataques de pânico.
A investigação do papel dos receptores serotoninérgicos da PAG na resposta cardiovascular e comportamental produzida pela ativação dos neurônios do DMH, torna-se relevante para o melhor entendimento das vias neurais que controlam as respostas fisiológicas e comportamentais relacionadas ao estresse emocional.
Torna-se relevante também, identificar a origem dessas sinapses serotoninérgicas uma vez que estudos mostram a existência de um subgrupo de neurônios serotoninérgicos da vlPAG, ou também denominados as asas laterais do núcleo da rafe dorsal (DRN). Aparentemente, esse subgrupo de neurônios está envolvido na inibição da resposta simpatoexcitatória e tipo pânico (fuga) produzidas pela eletroestimulação da dlPAG (JOHNSON et al., 2004). Este estudo também mostra evidências de uma possível modulação dos neurônios da
dlPAG por esse subgrupo de neurônios serotoninérgicos da vlPAG (JOHNSON et
al., 2004).
2. Objetivos
O objetivo geral do presente estudo é avaliar o papel dos receptores 5-HT1A da região lateral e dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal (PAG) nas respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do hipotálamo dorsomedial.
2.1. Objetivos específicos
1- Avaliar os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela ativação dos neurônios do DMH após a microinjeção do agonista ou do antagonista de receptores 5-HT1A na l/dlPAG.
2- Avaliar os efeitos cardiovasculares produzidos pelo estresse por jato de ar após a microinjeção do agonista ou do antagonista de receptores 5-HT1A na l/dlPAG.
3- Avaliar o possível envolvimento dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG na modulação da resposta cardiovascular e comportamental produzida pela microinjeção do agonista do receptor NMDA, NMDA, na l/dlPAG.
4- Avaliar os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela ativação dos neurônios do DMH após inibição bilateral dos neurônios da vlPAG.
3. Materiais e Métodos
3.1. Considerações éticas
Todos os procedimentos metodológicos realizados neste trabalho foram aprovados pelo comitê de ética em experimentaçao animal da Universidade Federal de Minas Gerais. Protocolo:
3.2. Animais
Os experimentos foram realizados usando ratos Wistar (270-330g de peso corporal) provenientes do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais. Os animais foram alojados em gaiolas individuais (47 cm x 31 cm x 16 cm) tendo livre acesso à água e ração.
Os ratos foram anestesiados com tribromoetanol (250 mg/kg i.p., suplementados quando necessário) para implante de cânulas guia (agulha 25G, 16mm) bilateralmente na l/ dlPAG e unilateralmente no DMH. Para realização do procedimento de implante das cânulas guia, os ratos foram posicionados em um aparelho estereotáxico (Stoelting, IL, USA) (figura 2) com a barra incisora fixada a -3.3mm da linha interaural.
As cânulas-guia foram posicionadas usando o bregma como ponto de referência, de acordo com as coordenadas determinadas pelo atlas de Paxinos e Watson (1997): 1) DMH 3.2 mm posterior, 0.6 mm lateral e 8,5mm ventral; 2) l/dlPAG 7.8 mm posterior, 0.7 mm lateral e 4.8 ventral ; 3) vlPAG 7.8 mm posterior, 0.8 mm lateral e 5.6 ventral. As cânulas guia foram fixadas usando acrílico dental autopolimerisável que foi ancorado por dois parafusos fixados na calota craniana do rato.
Ajustes
Canula guia Crânio
Figura 2. Ilustração de um rato posicionado em um aparelho estereotáxico para o procedimento de implante das cânulas guia.
Após, no mínimo, quatro dias de recuperação da cirurgia de implante de cânulas-guia os ratos foram anestesiados novamente com tribromoetanol, e uma pequena incisão foi feita na região inguinal para expor a artéria femoral. Um catéter de polietileno (Clay Adams, 0.011 I.D.), preenchido com salina heparinizada, foi usado para o procedimento de canulação. Aproximadamente 4 cm desse catéter (soldado por aquecimento a um tubo PE-50 de 15 cm) foram inseridos na aorta abdominal, via artéria femoral, para realização de registro da pressão arterial e freqüência cardíaca. A outra extremidade (tubo PE-50 de 15 cm) foi conduzida até a região interescapular através do tecido subcutâneo e
exteriorizada. O catéter foi fixado com linha de sutura e as incisões da região inguinal e interescapular foram suturadas. Os animais se recuperaram por no mínimo 24 h após a cirurgia de implante do catéter e somente após esse período de recuperação, os experimentos foram iniciados. Foi observada a aparência, o comportamento e a perda de peso corporal dos animais como forma de avaliar o estado de saúde desses. Apenas foram utilizados os animais que mantiverem um bom estado de saúde após os procedimentos cirúrgicos e durante o experimento.
3.4. Microinjeção de drogas
O registro de pressão arterial (PA) e freqüência cardíaca (FC) foram monitorados durante todo o experimento com a utilização de um aparelho (Biopac systems, CA, USA modelo MP100 A-CE). Para as microinjeções, foram usadas agulhas (33G, 17mm) sendo o início das microinjeções após 15 minutos de registro da PA e FC. As agulhas foram conectadas a um tubo de polietileno (Norton, 0.010 I.D) preenchido com a droga. Em sua outra extremidade, foi fixada uma seringa (Hamilton) de 5µl, preenchida com água deionizada. Entre os dois líquidos havia uma pequena bolha de ar, assim o experimentador sabia, observando o movimento da bolha, se a droga estava ou não sendo microinjetada. Após o processo de microinjeção, o êmbolo da seringa microinjetora era pressionado e se, imediatamente após a pressão do êmbolo, saisse líquido na ponta da agulha microinjetora, era sinal de que a agulha não estava obstruída e que o procedimento foi bem sucedido. O volume das microinjeções foi de 100 nl e o tempo de cada microinjeção de aproximadamente 20 segundos.
3.5. Análise da atividade Locomotora (Comportamental)
Foram avaliadas a atividade locomotora e exploratória dos animais. A caixa do animal foi dividida igualmente em quatro áreas de 23 cm x 15,5 cm. Uma câmera de vídeo foi fixada acima da caixa para filmar o comportamento do rato após as microinjeções por um período de 10 minutos. Ao término dos experimentos os filmes foram analisados para quantificar o número de vezes (episódios) em que o rato atravessa de um quadrante para o outro (running) (figura 3.1.1) e o número de vezes em que o animal fica apoiado nas patas traseiras (rearing) (figura 3.1.2). A atividade do animal foi expressa em número total de episódios (running + rearing) por um período de 10 minutos.
2
1
Figura 3.1.1 Avaliação da atividade locomotora e exploratória dos animais (running). Podem ser vistos dois movimentos 1 e 2, onde o animal atravessa de um quadrante para outro.
A B C
1
Figura 3.1.2 Avaliação da atividade locomotora e exploratória dos animais (rearing). As três
figuras A, B e C mostram, da esquerda para direita, um movimento de rearing. Em A o animal esta apoiado nas quatro patas, em B ele faz o movimento e fica apoiado nas patas trazeira e em C ele volta para o apoio nas quatro patas.
3.6. Estresse por jato de ar
Imediatamente após a microinjeção das drogas na l/dlPAG, os ratos foram colocados em um cilindro de acrílico para retenção e viabilização do procedimento de jato de ar. Após 10 minutos de registro dos parâmetros cardiovasculares, de pressão arterial e de frequência cardíaca, dentro do cilindro, os ratos foram submetidos a um jato de ar de 1.5 L/min na cabeça. Após 20 minutos de jato de ar os ratos foram então retirados do cilindro.
3.7. Drogas
As drogas usadas foram: o antagonista seletivo do receptor GABAA Bicucculina methiodide (Bic) (Sigma; 10 pmol), o agonista do receptor GABAA muscimol (Sigma; 1nmol); o agonista seletivo do receptor 5-HT1A, 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino) tetralin (8-OH-DPAT) (Sigma; 0.1, 1 e 3 nmol), o antagonista seletivo do receptor 5-HT1A, WAY-100635 (Sigma;0.5 e 3 nmol ); o agonista seletivo do receptor NMDA, NMDA, (Sigma; 6 pmol) e salina (NaCl 0.9 %) que foi usada como veículo. Todas as drogas foram microinjetadas em um volume de 100nl.
3.8. Protocolos experimentais
PROTOCOLO 1: Efeito da ativação de receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH
Com o objetivo de avaliar se a ativação dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG são capazes de modular as respostas produzidas pela ativação dos neurônios do DMH, nesta primeira série de experimentos foram avaliados os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral do antagonista do receptor GABAA, Bic, (10 pmol) no DMH antes e após a microinjeção bilateral de 8-OH-DPAT, (0.1nmol; 1 e 3 nmol) na l/dlPAG em ratos acordados. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.2.
Figura 3.2. Sequência temporal da microinjeção de Bic no DMH antes e após a microinjeção de 8-OH-DPAT na l/dlPAG em ratos acordados.
PROTOCOLO 2: Efeito da inibição dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH
Com o objetivo de avaliar se o bloqueio dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG são capazes de modular as respostas produzidas pela ativação dos neurônios do DMH, nesta série de experimentos foram avaliados os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral de bic (10 pmol) no DMH antes e após a microinjeção bilateral de WAY100635, (0.5 e 3 nmol) na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.3.
Figura 3.3. Sequência temporal da microinjeção de Bic no DMH antes e após a microinjeção de WAY100635 na l/dlPAG.
PROTOCOLO 3: Efeito da interação do agonista e do antagonista dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH.
Com o objetivo de avaliar se os efeitos da microinjeção do 8-OH-DPAT observados no protocolo 1 eram específicos à sua ligação aos receptores 5-HT1A, propos-se administrar o antagonista específico do receptor 5-HT1A antes da microinjeção do 8-OH-DPAT. Neste sentido, avaliou-se os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral de bic (10 pmol) no DMH antes e após a microinjeção bilateral do antagonista do receptor 5-HT1A, WAY100635, (0.5 nmol) seguida da microinjeção do agonista do
receptor 5HT1A, 8-OH-DPAT (3 nmol) na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.4.
Figura 3.4. Sequência temporal da microinjeção de Bic no DMH antes e após a microinjeção de WAY100635 seguida pela microinjeção de 8-OH-DPAT na l/dlPAG.
Em um grupo separado de ratos, foram realizados experimentos controle. Nesta série, avaliou-se a magnitude das respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas por duas microinjeções sucessivas de bic unilateralmente no DMH, após a microinjeção bilateral de veículo salina (NaCl 0.9%) na l/dlPAG, separadas por um intervalo de ~35 min. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.5.
Figura 3.5. Sequência temporal da microinjeção de bic antes e após a microinjeção de salina na l/dlPAG.
PROTOCOLO 4: Efeito da ativação dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em ratos.
Com o objetivo de avaliar se a ativação dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG são capazes de modular as respostas produzidas durante um estresse emocional puro, nesta série de experimentos foram avaliados os efeitos cardiovasculares produzidos pelo estresse por jato de ar (1.5 L/min) antes e após a microinjeção bilateral do agonista do receptor 5-HT1A, 8-OH-DPAT na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.6.
Figura 3.6. Sequência temporal da realização do estresse por jato de ar, antes e após a microinjeção de 8-OH-DPAT na l/dlPAG.
PROTOCOLO 5: Efeito do bloqueio dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em ratos.
Com o objetivo de avaliar se as respostas observadas no protocolo 2 se repetiam durante um estresse emocional puro. Nesta série de experimentos foram avaliados os efeitos cardiovasculares produzidos pelo estresse por jato de ar (1.5 L/min) antes e após a microinjeção bilateral do antagonista do receptor 5-HT1A na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.7.
Figura 3.7. Sequência temporal da realização do estresse por jato de ar, antes e após a microinjeção de WAY100635 na l/dlPAG.
PROTOCOLO 6: Efeito da ativação dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela microinjeção bilateral do agonista dos receptores NMDA na l/dlPAG.
Com a finalidade de avaliar o possível envolvimento dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG na modulação da resposta produzida pela microinjeção do agonista do receptor NMDA, NMDA, na l/dlPAG, foram avaliados os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção de NMDA, (10 pmol / 100nl) antes e após a microinjeção bilateral do agonista do receptor 5-HT1A, 8-OH-DPAT, (3 nmol) na l/dlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.8.
Figura 3.8. Sequência temporal da microinjeção de NMDA na l/dlPAG antes e após a microinjeção de 8-OH-DPAT na mesma região.
PROTOCOLO 7: Efeito da inibição dos neurônios da vlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH
Com o objetivo de investigar se a vlPAG poderia ser uma região cuja inibição dos seus neurônios (posivelmente serotoninérgicos) interferem nas respostas produzidas pela ativação do DMH, foram avaliados os efeitos cardiovasculares e comportamentais produzidos pela microinjeção unilateral de bic (10 pmol) no DMH antes e após a microinjeção bilateral do agonista do receptor GABAA, Muscimol, (1nmol / 100nl) na vlPAG. Este protocolo experimental foi realizado como ilustrado na figura 3.9.
DMH
Muscimol (1nmol/ 100nl) vlPAG Fim do Experimento 5 min ~ 35 min Sal (100nl) vlPAG Bic (10pmol/100nl) DMH Bic (10pmol/100nl) DMH ~ 20 min Controle 5 min ~15minvlPAG
Figura 3.9. Sequência temporal da microinjeção de Bic antes e após a microinjeção de muscimol na vlPAG.
4. Histologia
No final dos experimentos os ratos foram sacrificados com overdose de anestésico. Em seguida, foi microinjetado o corante Alcian Blue (100nl) nos sítios de injeção para confirmação histológica. O cérebro, após ser removido, foi mantido por 24 h em paraformaldeído a 4%. Após esse período, o cérebro foi armazenado em sacarose 30% por, no mínimo, dois dias. Subseqüentemente, o hipotálamo e a PAG foram cortados com a utilização de micrótomo, em fatias coronais de 50 – 100 μm. Os cortes foram colocadas em lâminas e corados com
Vermelho Neutro para a confirmação dos sítios de microinjeção nas regiões do
5. Análise Estatística
Comparações entre as respostas evocadas pela microinjeção de bic no DMH após as diferentes microinjeções de drogas na PAG, em grupos diferentes de ratos, foram determinadas pelos teste-t de student (STEEL et al., 1997). A significância das respostas cardiovasculares e comportamentais evocadas pela microinjeção de bic no DMH após microinjeções de salina ou de diferentes drogas na PAG em um mesmo animal foram determinadas pelo teste-t pareado STEEL et
al., 1997). O valor de significância foi estabelecido quando P< 0,05. Os dados
foram expressos como média ± epm.
6. Resultados
Os resultados aqui apresentados correspondem aos dados obtidos nos protocolos experimentais descritos na seção 3.7 do Materiais e Métodos, páginas 16 – 29.
1- Efeito da ativação de receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH
A tabela 1. mostra que a microinjeção do agonista do receptor 5-HT1A, 8-OH-DPAT, na l/dlPAG não alterou os parâmetros basais, cardiovasculares, em nenhuma das doses testadas.
A tabela 2, mostra que duas microinjeções de salina na l/dlPAG, separadas por um período de aproximadamente 40 minutos, não alteram os parâmetros cardiovasculares basais. Nenhuma diferença foi observada na magnitude das respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas por duas microinjeções de Bic no DMH após a microinjeção de salina na l/dlPAG, em um mesmo rato (Figura 5).
A microinjeção de 8-OH-DPAT (1nmol) na l/dlPAG reduziu em 66% o aumento da FC (173 ± 24 bpm) evocado pela ativação do DMH (figura 4). A dose de 3nmol microinjetada na l/dlPAG reduziu em 64% e 56%, os aumentos de FC e PAM (177 ± 25 bpm e 21 ± 4 mmHg, respectivamente), produzidos pela ativação do DMH (figura 4, 8A e 8B). A microinjeção de 8-OH-DPAT (0.1nmol) na l/dlPAG não alterou os aumentos de PAM, FC e alterações comportamentais evocados pela ativação do DMH (figura 4). Nenhuma das doses testadas alterou o efeito sobre o comportamento (18 ± 7 número de episódios) produzido pela ativação do DMH (figura 4).
Tabela 1. Valores basais de pressão arterial média e frequência cardíaca e alterações cardiovasculares produzidas pela microinjeção de 8-OH-DPAT ou salina na coluna lateral/dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal (l/dlPAG).
Tabela 2 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas por duas microinjeções sucessivas de salina na l/dlPAG, separadas por um período de 40 minutos.
Valores Basais Alterações na PAM e FC PAM FC
(mmHg) (bpm)
PAM FC (mmHg) (bpm) Salina antes do
8-OH-DPAT 0.1nmol n=5
101± 2 361 ± 9 1 ± 1 -7 ± 7
8-OH-DPAT 0.1nmol n=5
109 ± 3 376 ± 17 2 ± 1 -8 ± 5 Salina antes do
8-OH-DPAT 1nmol n=6
104 ± 3 347 ± 12 2 ± 2 4 ± 1
8-OH-DPAT 1nmol n=6
108 ± 4 381 ± 12 -2 ± 1 -13 ± 4
Salina antes do 8-OH-DPAT 3nmol n=5 98 ± 5 340 ± 10 1 ± 1 -10 ± 5 8-OH-DPAT 3nmol n=5 104 ± 6 319 ± 18 -5 ± 3 -34 ± 15
Valores Basais Alterações na PAM e FC PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) Salina l/dlPAG n=3 108 ± 5 368 ± 8 5 ± 1 14 ± 5 Salina l/dlPAG n=3 111 ± 6 384 ± 19 1 ± 1 3 ± 6
0.1nmol n=5 0 10 20 30 A lteraç õ es n a P A M (m m H g ) 1nmol n=6 0 10 20 30 3nmol n=5 0 10 20 30 sal/bic dpat/bic 0.1nmol 0 50 100 150 200 250 Al te ra ç õ e s n a F C (b p m ) 1nmol 0 50 100 150 200 250 3nmol 0 50 100 150 200 250 0.1nmol 0 25 50 A ti v id a d e (n ú m e ro d e e p is ó d io s ) 1nmol 0 25 50
*
*
3nmol 0 25 50*
Figura 4. Alterações na pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e comportamentais produzidas pela microinjeção de Bic (10 pmol / 100 nl) no DMH, após salina, e 40 minutos mais tarde, após a microinjeção de 8-OH-DPAT (0.1, 1 e 3 nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05 comparado com o efeito produzido pela microinjeção de Bic no DMH após a microinjeção de salina na l/dlPAG (teste t pareado).
n=3 0 10 20 30 sal / bic sal / bic A lt e ra çõ e s n a P A M (m m H g ) 0 50 100 150 200 250 A lt er aç õ es n a F C (b p m ) 0 25 50 A ti vi d ad e (n ú m er o d e ep isó d io s)
Figura 5. Alterações na PAM, FC e de comportamento produzidas pela microinjeção de bic ( 10 pmol/100 nl) no DMH, após salina na l/dlPAG e, 40 minutos mais tarde, após salina novamente na l/dlPAG.
2- Efeito do bloqueio dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH
A tabela 3 mostra que a microinjeção isolada do antagonista do receptor 5-HT1A, WAY100635, na l/dlPAG não alterou os parâmetros cardiovasculares basais em nenhuma das doses testadas.
A microinjeção do antagonista do receptor 5-HT1A, WAY100635, ( 0.5 e 3 nmol / 100nl ) na l/dlPAG não interferiu sobre os aumentos de PAM, FC e alterações de comportamento evocados pela ativação do DMH (figura 6).
Tabela 3. Valores basais de PAM e FC e alterações cardiovasculares produzidas pela microinjeção de duas diferentes doses (0.5 nmol/100nl e 3nmol/100nl) do antagonista seletivivo do receptor 5- HT1A, WAY100635, e salina 0.9% (100nl) na l/dlPAG.
Valores Basais Alterações na PAM e FC PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) Salina n=6 104 ± 2 378 ± 12 2 ± 1 7 ± 6 WAY 0.5 nmol l/dlPAG n=6 107 ± 3 386 ± 13 1 ± 2 1 ± 4 Salina n=7 114 ± 3 392 ± 6 1 ± 2 2 ± 1 WAY 3 nmol l/dlPAG n=7 118 ± 3 389 ± 10 2 ± 1 1 ± 5
0.5nmol n= 6 0 10 20 Al ter aç õ es n a P AM (m m Hg ) 3nmol n= 7 0 10 20 sal/bic way/bic 0 50 100 150 Al ter aç õ es n a F C (b p m ) 0 50 100 150 0 50 100 150 Ati vi d ad e (n ú m er o d e ep isó d io s) 0 50 100 150
Figura 6. Alterações na PAM, FC e de comportamento produzidas pela microinjeção de bic (10 pmol / 100 nl) no DMH, após salina, e 40 minutos mais tarde, após a microinjeção do antagonista do receptor 5-HT1A, WAY100635, ( 0.5 - 3 nmol / 100 nl) na l/dlPAG.
3- Efeito da interação do agonista e do antagonista dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH.
A tabela 4, mostra que a microinjeção do antagonista do receptor 5-HT1A WAY100635, seguida pela microinjeção do agonista do receptor 5-HT1A 8-OH-DPAT, na l/dlPAG não alterou os parâmetros basais, cardiovasculares, em nenhuma das doses testadas.
A microinjecão, na l/dlPAG, de WAY100635 (0.5 nmol/100nl), antes da microinjecão de 8-OH-DPAT (3 nmol/100 nl) reverteu o efeito observado pela microinjeção de 8-OH-DPAT na resposta de aumento da PAM e FC produzida pela ativação do DMH (Figura 7 e 8C).
Tabela 4. Valores basais de PAM e FC produzidas pela microinjeção do antagonista do receptor 5-HT1A, WAY100635, seguido pelo agonista seletivo do receptor 5-HT1A, 8-OH-DPAT, e salina
0.9% (100nl) na l/dlPAG.
Valores Basais Alterações na PAM e FC PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) Salina l/dlPAG n=5 117 ± 2 330 ± 10 2 ± 3 4 ± 9 WAY100635 + 8-OH-DPAT l/dlPAG n=5 122 ± 1 339 ± 8 2 ± 3 2 ± 4
n=5 0 10 20 30 sal / bic
way + dpat / bic
Al te ra çõ e s n a P A M (mm Hg ) 0 50 100 150 200 250 Al teraçõ es n a F C (b p m ) 0 25 50 75 100 At ivi d ad e (n ú m ero d e ep isó d io s)
Figura 7. Alterações na PAM, FC e de comportamento produzidas pela microinjeção de bic (10 pmol / 100 nl) no DMH, após salina, e 40 minutos mais tarde, após a microinjeção do WAY100635, ( 0.5nmol / 100 nl) seguido por 8-OH-DPAT (3nmol) na l/dlPAG.
Bic DMH após 8-OH-DPAT na l/dlPAG Bic DMH após sal na l/dlPAG
1min
Bic DMH após Way100635 + 8-OH-DPAT na l/dlPAG 300 Pressão Arterial (mmHg) 160 100 40 160 100 40 600 450 Pressão Arterial média (mmHg) Frequência cardíaca (bpm) 300 160 100 40 160 100 40 600 450 300 160 100 40 160 100 40 600 450 Pressão Arterial (mmHg) Pressão Arterial média (mmHg) Frequência cardíaca (bpm) Pressão Arterial (mmHg) Pressão Arterial média (mmHg) Frequência cardíaca (bpm)
Figura 8. Registros de experimentos mostrando as respostas cardiovasculares produzidas pela microinjeção de Bic no DMH após: (A) microinjeção de salina (100 nl), (B) microinjeção de 8-OH-DPAT (3 nmol / 100 nl) ou (C) microinjeção de WAY100635 (0.5 nmol / 100nl) seguido por 8-OH-DPAT (3 nmol / 100 nl) na l/dlPAG. Em (A) e (B) as microinjeções foram feitas em um mesmo rato. Em (C) o registro mostra um experimento realizado em um rato separado.
A
B
5- Efeito da ativação dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em ratos.
A tabela 5 mostra os valores cardiovasculares basais antes e após a entrada do rato no cilindro de acrílico. Não houve alteração nos parâmetros cardiovasculares basais mensurados após a microinjeção de salina ou 8-OH-DPAT na l/dlPAG seguido pela entrada do rato no cilindro de acrílico. Nenhuma diferença foi observada na magnitude das respostas cardiovasculares produzidas por duas sessões de estresse por jato de ar, após a microinjeção de salina na l/dlPAG, em um mesmo rato (tabela 6).
Quando comparada ao efeito obtido no grupo controle, a microinjeção de 8-OH-DPAT ( 3nmol / 100nl ) na l/dlPAG reduziu em 54% a taquicardia induzida pelo jato de ar (controle 122 ± 22 bpm vs. 8-OH-DPAT 56 ± 11 bpm). Da mesma forma 8-OH-DPAT reduziu em 40% o efeito pressor evocado pelo jato de ar (controle 20 ± 5 mmHg, 8-OH-DPAT 12 ± 3 mmHg). (figura 9)
Tabela 5 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas após a microinjeção de salina ou 8-OH-DPAT na l/dlPAG seguido pela entrada do rato no cilindro, separadas por um período de 3 horas.
Valores Basais Fora do cilindro Valores Basais Dentro do cilindro PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) Salina l/dlPAG n=5 103 ± 3 363 ± 13 108 ± 4 382 ± 31 DPAT 3nmol l/dlPAG n=5 104 ± 4 358 ± 18 105 ± 2 346 ± 18
Tabela 6 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas por duas sessões de estresse por jato de ar após duas microinjeções sucessivas de salina na l/dlPAG, separadas por um período de 3 horas. n=4 n=5 0 10 20 30 sal / jato dpat / jato A lt er açõ es n a PA M (m m H g ) 0 50 100 150 A lt er açõ es n a F C ( b p m )
*
*
Figura 9. Alterações na PAM, FC produzidas pelo estresse por jato de ar, após salina na l/dlPAG, 3 horas mais tarde, após a microinjeção de 8-OH-DPAT (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05 comparado com o efeito produzido pelo estresse por jato de ar após a microinjeção de salina na l/dlPAG (teste t pareado).
Valores Basais Alterações na PAM e FC após sal na l/dlPAG Alterações na PAM e FC após sal na l/dlPAG PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) Jato de ar n=4 124 ± 4 371 ± 20 11 ± 6 70 ± 28 11 ± 6 60 ± 16
6- Efeito do bloqueio dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares produzidas pelo estresse por jato de ar em ratos.
A tabela 7 mostra os valores cardiovasculares basais antes e após o rato entrar no cilindro de acrílico.
A microinjeção do antagonista do receptor 5-HT1A, WAY 100635, na l/dlPAG (3nmol / 100nl ) não alterou a taquicardia ou o aumento de pressão arterial evocados pelo estresse por jato de ar (Figura 10).
Tabela 7 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas após a microinjeção de salina ou WAY100635 na l/dlPAG seguido pela entrada do rato no cilindro, separadas por um período de 3 horas. Valores Basais Fora do cilindro Valores Basais Dentro do cilindro PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) Salina l/dlPAG 113 ± 3 370 ± 12 119 ± 2 412 ± 27 WAY 3nmol l/dlPAG 120 ± 4 374 ± 10 122 ± 3 388 ± 13
n=7 0 5 10 sal / jato way / jato A lter aç õ es n a PA M (m m H g ) 0 25 50 75 100 A lter aç õ es n a F C (b p m )
7- Efeito da ativação dos receptores 5-HT1A da l/dlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela microinjeção bilateral do agonista dos receptores NMDA na l/dlPAG.
Quando comparada ao efeito obtido no grupo controle, a microinjeção de 8-OH-DPAT (3nmol) na l/dlPAG reduziu em 94% a taquicardia induzida pela microinjeção de NMDA (controle 90± 20 bpm Vs 6 ± 5 bpm após 8-OH-DPAT). Da mesma forma 8-OH-DPAT reduziu em 73% o efeito pressor evocado pela
Figura 10. Alterações na PAM, FC produzidas pelo estresse por jato de ar, após salina na l/dlPAG, 3 horas mais tarde, após a microinjeção de WAY100635 (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG.
microinjeção de NMDA na l/dlPAG (controle 11 ± 2mmHg) (Figura 11). Nenhuma diferença foi observada na magnitude das respostas cardiovasculares produzidas pela microinjeção de NMDA na l/dlPAG, após a microinjeção de salina na mesma (tabela 8). 0 10 20 sal / nmda dpat / nmda Al te ra ç õ e s n a P A M (m m Hg ) 0 50 100 150 Al te ra ç õ e s n a F C (b p m ) 0 5 10 15 20 At iv id a d e (n ú m e ro d e e p is ó d io s )
*
*
Figura 8 . Alterações na PAM e FC produzidas pela microinjeção de NMDA após salina na l/dlPAG, 24 horas mais tarde, após a microinjeção de 8-OH-DPAT (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05 comparado com o efeito produzido pela administração de NMDA após a microinjeção de salina na l/dlPAG (teste t pareado).
Figura 11. Alterações na PAM e FC produzidas pela microinjeção de NMDA após salina na l/dlPAG, 24 horas mais tarde, após a microinjeção de 8-OH-DPAT (3nmol / 100 nl) na l/dlPAG. * p<0,05
Tabela 8 . Valores basais de PAM e FC e alterações na PAM e FC produzidas pela microinjeção de NMDA na l/dlPAG após duas microinjeções sucessivas de salina na l/dlPAG, separadas por um período de 24 horas. n=4
8- Efeito da inibição dos neurônios da vlPAG sobre as respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas pela ativação dos neurônios do DMH
A tabela 9 mostra que a microinjeção do agonista do receptor GABAA, muscimol (musc), na vlPAG não alterou os parâmetros basais, cardiovasculares, na dose testada (1nmol).
Quando comparada ao efeito obtido no grupo controle, a microinjeção de muscimol (1nmol) na vlPAG aumentou significantemente a resposta comportamental (número de épisódios) produzida pela ativação do DMH (15 ± 5 numero de episódios após salina 0,9% na vlPAG vs. 58 ± 3 número de episódios após mus na vlPAG). No entanto, ao microinjeção de muscimol na vlPAG não alterou as respostas cardiovasculares produzidas pela ativação do DMH (figura 12).
Valores Basais Alterações na PAM e FC após sal na l/dlPAG Alterações na PAM e FC após sal na l/dlPAG PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) NMDA l/dlPAG 97 ± 12 334 ± 23 18 ± 5 114 ± 28 12 ± 3 131 ± 12
Tabela 9. Valores basais de PAM e FC e alterações cardiovasculares produzidas pela microinjeção de muscimol (1nmol/100nl) e salina 0.9% (100nl) na vlPAG. n=6
Valores Basais Alterações na PAM e FC PAM FC (mmHg) (bpm) PAM FC (mmHg) (bpm) Salina vlPAG 109 ± 2 369 ± 2 2 ± 1 -1 ± 16 Musc vlPAG 113 ± 5 381 ± 12 3 ± 2 30 ± 19
n=6 0 10 20 sal / bic musc / bic Al te ra ç õe s na P AM (m mH g ) 0 50 100 150 200 A lte ra ç õ e s n a F C (b p m ) 0 25 50 75 A ti v id a d e (n ú me ro d e e p is ó d io s )
*
Figura 12. Alterações na PAM, FC e atividade locomotora produzidas pela microinjeção de bic no
DMH após microinjeção bilateral de salina ou muscimol (1nmol) na vlPAG. * P < 0.05, comparado com o efeito do Bic no DMH após sal na vlPAG.
6. Análise Histológica
A análise histológica mostrou que a os sítios de injeção estavam localizados dentro ou na borda do DMH e dos sitios ojetivados por cada protocolo na PAG . Os sítios de injeção localizados no hipotálamo encontravam-se dentro ou na vizinhança da zona compacta do DMH (aproximadamente -3,3 mm caudal ao bregma) (Paxinos e Watson, 1986). Os sítios de microinjeção na PAG encontravam-se do nível -7,64 a -8,0 mm caudal ao bregma. Os sítios onde a microinjeção de 8-OH-DPAT reduziram a resposta cardiovascular produzida por bic no DMH, e ainda onde a microinjeção de NMDA produziu respostas pressoras, taquicárdicas e de alteração de atividade locomotora estavam localizados dentro da região lateral e dorsolateral da PAG. Os sítios onde a microinjeção de muscimol potenciou a resposta comportamental produzida pela ativação do DMH estavam localizados dentro da região ventrolateral da PAG.
A figura 13.1 ilustra o mapa com a descrição dos sítios de microinjeção, de dois dos protocolos incluídos neste trabalho, onde foi realizado a microinjeção de: (A) 8-OHDPAT na l/dlPAG; (D) Muscimol na vlPAG e (B; C; E; F) bic no DMH. Experimentos em que os sítios de microinjeção encontravam-se fora dos limites do DMH ou das regiões específicas da PAG não foram incluídos na análise. A figura 13.2 representa fotomicrografia de um corte coronal da PAG (A) e um do DMH (B).
vl d dr d dl l dr d dl l dr
Figura 13.1 Diagrama esquemático das secções coronais do cérebro do rato ilustrando os sítios de microinjeção no hipotálamo (B, C, E e F) e na PAG (A e D) em dois protocolos experimentais. DMC, porção compacta do hipotálamo dorsomedial; DMD, porção difusa do hipotálamo dorsomedial; VMH, hipotálamo ventromedial; f, fórnix; 3V, terceiro ventrículo; d PAG dorsal; dl, PAG dorsolateral; l, PAG lateral; vl, PAG ventrolateral; dr, núcleo da rafe dorsal. A distancia ao bregma é indicada. Modificado de Paxinos e Watson, (1986).
A B vl l dl d dr DMC DMD 3V VMH
Fig. 13.2 Fotomicrografia de um corte coronal (50 µm) ao nível da (A) PAG e (B) ao nível do DMH para verificação histológica do sítio de microinjeção. d, PAG dorsal; dl, PAG dorsolateral; l, PAG lateral; vl, PAG ventrolateral; dr, núcleo da rafe dorsal; DMC, porção compacta do hipotálamo dorsomedial; DMD, porção difusa do hipotálamo dorsomedial; VMH, hipotálamo ventromedial; 3V, terceiro ventrículo.
7. Discussão
Os resultados deste estudo indicam que a ativação dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG reduz o aumento da freqüência cardíaca e da pressão arterial observados durante (1) a ativação do hipotálamo dorsomedial (2) o estresse por jato de ar (3) pela microinjeção de NMDA na l/dlPAG. Adicionalmente, a redução observada na resposta cardiovascular após a microinjeção de 8-OH-DPAT na l/dlPAG foi revertida pela subseqüente administração do antagonista seletivo do receptor 5-HT1A WAY100635, mostrando que os efeitos foram mediados especificamente pelo receptor 5-HT1A. A seguir, faremos algumas considerações metodológicas que serão sucedidas pela discussão mais detalhada dos resultados observados no presente estudo.
No presente estudo as microinjeções de 8-OH-DPAT e WAY100635 na l/dlPAG não produziram alterações significantes nos parâmetros cardiovasculares e comportamentais basais. Estudos em animais anestesiados que avaliaram a ação cardiovascular do 8-OH-DPAT (HORIUCHI et al., 2004; BAGO & DEAN, 2001; DI FRANCESCO et al., 1988), demonstram que a administração (intra cistrena pontina, no bulbo rostral ventro lateral e intra peritonial respectivamente) do 8-OH-DPAT causa bradicardia e redução da pressão arterial de forma dose dependente. Ao contrário, no presente estudo e nos poucos estudos realizados em animais acordados, os efeitos de bradicardia e de redução da pressão arterial não foram observados ou foram pouco conclusivos (NALIVAIKO et al., 2006;
KOLBASA et al., 1991; DI FRANCESCO et al., 1988). Possivelmente, a divergência de resultados quanto a esse efeito possa ser devido às diferentes vias de administração do 8-OH-DPAT, que então deve atuar em diferentes sitios do sistema nervoso central ou em vários sitios ao mesmo tempo. Desta forma, a ativação de receptores 5-HT1A em diferents sitios do SNC pode produzir diferente resposta sobre os parametros cardiovasculares basais.
Poderia ser questionado se o aumento na freqüência cardíaca e na pressão arterial produzido pela microinjeção de bic no DMH não ser uma conseqüência indireta do aumento da atividade locomotora, e não uma conseqüência direta da ativação dos neurônios do DMH. No entanto, estudos mostram que a microinjeção de bic no DMH em ratos anestesiados também resultam em aumentos de pressão arterial e frequência cardíaca, assim como um grande aumento na atividade simpática (FONTES et al. 2001; CAO E MORRISON 2004; HORIUCHI et al. 2004). Adicionalmente, no presente estudo observou-se que a administração de 8-OH-DPAT reduziu os parâmetros cardiovasculares produzidos pela ativação do DMH, mesmo enquanto a atividade do rato permanecia elevada.
Poderia também ser questinado se a redução na magnitude da resposta cardiovascular produzida após uma segunda injeção de bic no DMH não seria devido a microinjeção do 8-OH-DPAT na PAG e sim a um efeito taquifilático da bic sobre os neurônio do DMH. Em um grupo separado de animais observamos que a intensidade das respostas cardiovasculares e comportamentais produzidas por duas microinjeções de bic no DMH após veículo na l/dlPAG não diferiu. Esse resultado descarta a possibilidade de que o efeito produzido após uma segunda microinjeção de bic no DMH decorresse de um efeito taquifilático.
Recentemente, Da Silva et al. (2003) demonstraram que a resposta cardiovascular e comportamental produzida pela ativação do hipotálamo dorsomedial é dependente de um relé sináptico na coluna lateral/dorsolateral da substância cinzenta periaquedutal (l/dlPAG), e que essa sinapse é mediada pelo receptor de aminoácido excitatório do subtipo NMDA (DA SILVA et al., 2003; DA SILVA et al., (2006). O presente estudo soma-se aos resultados de Da Silva et al., mostrando que a ativação dos receptores 5-HT1A na l/dlPAG pode modular as respostas cardiovasculares produzidas pela ativação do DMH.
Horiuchi et al. (2005) observaram que os aumentos na PAM, FC e na atividade simpática do nervo renal produzidos pela ativação do DMH foram reduzidos de forma importante após a administração do agonista 5-HT1A, 8-OH-DPAT, sistêmica ou pela microinjeção no tronco encefálico, via intracisterna, em ratos anestesiados. No entanto, as regiões especificas do tronco encefálico onde a ativação dos receptores 5-HT1A poderiam reduzir as respostas produzidas pelo DMH não foram identificadas (HORIUCHI et al., 2005).
Vários subtipos de receptores serotoninérgicos ja foram identificados na PAG ( PAZOS & PALACIOS, 1985; POMPEIANO et al., 1992). Estudos “in vitro” e “in vivo” mostram que a ativação específica dos receptores 5-HT1A na PAG dorsal inibe de forma importante a frequência de disparos dos neurônios da mesma (BEHBEHANI et al., 1993). Adicionalmente, a administração de uma dose semelhante à usada no presente estudo, 3nmol de 8-OH-DPAT na PAG dorsal, reduz a resposta do tipo pânico (fuga) produzida pela microinjeção do ácido D,L-homocisteico na mesma. Esta resposta foi revertida pela administração sistêmica do antagonista 5-HT1A, WAY100635, ( BECKETT & MARSDEN, 1997).
