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UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

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UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO E MOLECULAR, E

ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO

GENE DA PROTEÍNA CAPSIDIAL DE UM ISOLADO

DE

Apple stem pitting virus

DE PEREIRA

PAULA RADAELLI

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Agronomia da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo, para obtenção do título de Mestre em Agronomia – área de concentração em Fitopatologia.

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UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO

FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO E MOLECULAR, E

ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO

GENE DA PROTEÍNA CAPSIDIAL DE UM ISOLADO

DE

Apple stem pitting virus

DE PEREIRA

PAULA RADAELLI Bióloga

Orientadora: Profª. Drª. Jurema Schons Co-orientador: Dr. Osmar Nickel

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Agronomia da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo, para obtenção do título de Mestre em Agronomia – área de concentração em Fitopatologia.

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“Cada pessoa que passa em nossa vida é única, passa sozinha, mas não vai sozinha, e nem nos deixa só, sempre deixa um pouco de si e leva um pouco de nós. Há as que levaram muito, mas não há as que não deixaram nada...”.

“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim”.

Dedico este trabalho aos meus pais Paulo e Helena e a minha irmã Milena, sem os quais minhas conquistas jamais seriam especiais.

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_________________________________________________________________ R124d Radaelli, Paula

Diagnóstico biológico e molecular, e análise da seqüência de nucleotídeos do gene da proteína capsidial de um isolado de Aplle

stem pitting virus de parreira / Paula Radaelli. – 2005.

49 f. ; 29 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade de Passo Fundo, 2005. Orientação: Dra. Jurema Schons

1. Doença de planta 2. ASPV 3. Árvore frutífera 4. Macieira 5. Pereira I. Título II. Shons, Jurema, orient.

_________________________________________________________________

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AGRADECIMENTOS

Um trabalho só é desenvolvido com a colaboração de muitas pessoas. À todas elas meu sincero agradecimento.

À Drª. Jurema Schons pela orientação, amizade, carinho e incentivo perene à pesquisa.

Ao Dr. Osmar Nickel pela co-orientação, ensinamentos, dedicação e disponibilidade que possibilitou a realização deste trabalho.

À coordenação do Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade de Passo Fundo pela dedicação e disponibilidade.

A Marcos Fernando Vanni, Daiana Rizzon, Fernanda Dalcin e Ivana Prá por todo o auxílio prestado no laboratório e amizade.

Aos funcionários e estagiários da Embrapa Uva e Vinho, em especial aos amigos do laboratório de Biologia Molecular, Phillipe Irala e Danielle Serafim pelo aprendizado e incentivo quando tudo parecia dar errado.

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Aos pesquisadores da Embrapa Uva e Vinho Dr. Thor V. M. Fajardo e Dr. Luis Fernando Revers pelas idéias e assistências prestadas.

Ao Dr. Luis Antônio Suita de Castro (Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS) e ao Dr. Wilhelm Jelkmann (Biologische Bundesanstalt, Institut für Pflanzenschutz im Obstban, Dossenheim, Alemanha) pela doação dos anti-soros utilizados, ao pesquisador Dr. João Bernardi (Embrapa Uva e Vinho, Estação Experimental de Fruticultura Temperada, Vacaria. RS) pela coleta e envio das amostras analisadas e ao Dr. Francisco Aragão (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília. DF), pelo seqüenciamento dos fragmentos clonados.

Aos amigos da pousada dos estagiários da Embrapa Uva e Vinho pelo afeto e apoio.

Aos colegas do mestrado pelo auxílio e colaboração para realização das disciplinas. Em especial as amigas e parceiras Ariane, Cheila, Jucenara, Kalíbia, Tanaka, Vanessa e minha prima Daniele, pelos momentos descontraídos, desabafos e até conversas intelectuais.

A toda minha família pelo incentivo, compreensão e críticas construtivas que muito contribuíram para minha formação.

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À família Gugel Neves pelo carinho com que me acolheram, pela paciência e momentos alegres que passamos juntos.

À Universidade de Passo Fundo pela concessão da bolsa e oportunidade de realizar o curso.

À Embrapa Uva e Vinho pela infra-estrutura e disponibilidade dos recursos e a concessão temporária de uma bolsa, que auxiliaram na elaboração deste trabalho. À FINEP pelo financiamento do projeto e concessão de bolsa.

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DIAGNÓSTICO BIOLÓGICO E MOLECULAR, E ANÁLISE DA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DO GENE DA PROTEÍNA CAPSIDIAL DE UM ISOLADO DE Apple stem pitting virus DE PEREIRA

Paula Radaelli1, Jurema Schons2, Osmar Nickel3

RESUMO - Apple stem pitting virus (ASPV), ocorre na maioria das cultivares comerciais de macieiras, pereiras e marmeleiros, em todas as regiões pomicultoras do mundo, geralmente em combinação com outros vírus. Facilmente transmitido por enxertia, seus danos consistem de redução do vigor das plantas, da qualidade dos frutos e da produção. Com o objetivo de estabelecer técnicas de diagnose para o isolado brasileiro de ASPV, conduziu-se o preconduziu-sente estudo no Laboratório de Virologia da Embrapa Uva e Vinho de Bento Gonçalves, RS. Detectou-se o ASPV por RT-PCR em amostras de cvs. de pêra européia (Pyrus communis L.) Starkrimson e Abate Fetel, e das cvs. de pêra asiáticas (Pyrus pyrifolia var. Culta (Burm)) Kousui e Housui coletadas no outono de 2003 e de 2004, utilizando-se várias combinações de oligonucleotídeos. Foram amplificados fragmentos de DNA de 270, 291 e 1554 pb, este último contendo o gene completo (1131 nt) da

1 Bióloga, mestranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade de Passo Fundo (UPF).

2 Orientadora, Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas, professora da FAMV e ICB/UPF.

3Co-orientador, Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia, pesquisador da Embrapa Uva e Vinho.

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proteína capsidial de ASPV (número de acesso GenBank AY572458). A comparação das seqüências de nucleotídeos com seqüências do banco de dados GenBank, utilizando-se a função BLAST, revelou homologias de 88% e 89% com seqüências de dois isolados alemães de pereira e macieira respectivamente e de 85% a 88% com três isolados poloneses, todos de pereiras. A indicadora herbácea Nicotiana occidentalis (Willd.) cv. 37B inoculada mecanicamente com extrato foliar da cv. Housui, reagiu com lesões locais necróticas nas nervuras e necrose das extremidades apicais e laterais da lâmina foliar. A indicadora lenhosa Pyronia veitchii (Trabut) Guill, enxertada com gemas da cv. Abate Fetel infectada, apresentou manchas cloróticas cujos núcleos tornaram-se necróticos e bandeamento clorótico de nervuras secundárias e terciárias. Confirmou-se a infecção com ASPV por dot-ELISA em Pyronia veitchii e nas cvs. Abate Fetel e Kousui e por Western blot na cv. Starkrimson. Os testes utilizados no presente trabalho permitem diagnosticar o ASPV em matrizes de macieiras e pereiras, evitando assim a disseminação da virose em materiais propagativos.

Palavras-chave: Pyrus communis, Pyrus pyrifolia, Nicotiana occidentalis, Pyronia veitchii, Flexiviridae, ASPV, dot-ELISA, RT-PCR, Western blot.

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BIOLOGICAL AND MOLECULAR DIAGNOSIS, AND NUCLEOTIDE SEQUENCE ANALYSIS OF THE COAT PROTEIN GENE OF AN ISOLATE OF Apple stem pitting virus FROM PEAR

Paula Radaelli1, Jurema Schons2, Osmar Nickel3

SUMMARY - Apple stem pitting virus (ASPV), (family Flexiviridae, genus Foveavirus) occurs in many apple, pear and quince commercial cultivars. It can be found worldwide wherever are grown, frequently in combination with other viruses. Easily transmitted by grafting. The virus damages consist of reduction of plant vigor, of the quality of the fruits and of the production. In order to establish of the diagnostic procedurese for Brazilian isolateds of ASPV, this work was carried out in the Laboratory of Virology of Embrapa Grape and Wine in Bento Gonçalves, RS. ASPV was detected by RT-PCR in samples of the European pear (Pyrus communis L.) cultivars Starkrimson and Abate Fetel, and the Asiatic pear (Pyrus pyrifolia var. Culta (Burm)) cvs. Kousui and Housui collected in the beginning of autumn 2003 and 2004 by RT-PCR using different combinations of primers. Fragments of DNA of 270, 291 and 1554 bp, have been amplified, the latter containing

1 Bióloga, mestranda do Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade de Passo Fundo.

2 Orientadora, Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas, professora da FAMV e ICB/UPF.

3 Co-orientador, Engenheiro Agrônomo, Doutor em Agronomia, pesquisador da Embrapa Uva e Vinho.

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the complete coat protein gene (1131 nt) of ASPV (GenBank access number AY572458). Comparison of the nucleotide sequences of ASPV BR1 with sequences of the data base GenBank, using the function BLAST, showed 88% and 89% homology with sequences of two German isolates and 85% to 88% with three Polish isolates, from pear. The herbacceus indicator Nicotiana occidentalis Willd. cv.37B mechanically inoculated with leaf extracts of ASPV infected cv. Housui presented marginal leaf necrosis and severe vein necrosis. The woody indicator Pyronia veitchii (Trabut) Guill, inoculated with infected cv. Abate Fetel, displayed chlorotic spots which turneds necrotic, and chlorotic vein banding of secondary and tertiary leaf veins. ASPV-infection was confirmed by dot-ELISA in Pyronia veitchii, in the cvs. Abate Fetel and Kousui, and by Western blot in the cv. Starkrimson. The used tests in the present work allow to diagnosis the ASPV in apple and pear mother stok, thus preventing dissemination of ASPV in propagative material.

Key words: Pyrus communis, Pyrus pyrifolia, Nicotiana occidentalis, Pyronia veiitchii, Flexiviridae, ASPV, dot-ELISA, RT-PCR, Western blot.

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1 INTRODUÇÃO

Doenças virais podem provocar danos em todas as partes das plantas frutíferas, causando perdas econômicas por redução da produção ou qualidade dos produtos e da rentabilidade e longevidade do pomar. Alguns vírus ocorrem de forma epidêmica, outros podem estar presentes sem necessariamente, produzir danos, causando apenas pequenas perdas, por vezes sem induzir qualquer sintoma visível, como é o caso dos vírus chamados latentes (Matthews, 1981).

Cerca de 30 doenças de macieira (Malus domestica L.), pereira européia (Pyrus communis L.), pereira asiática (Pyrus pyrifolia var. culta (Burm)) e marmeleiro (Cydonia oblonga Mill.) são causadas por vírus, viróides e agentes assemelhados. Segundo o patógeno, a virulência do isolado viral, a suscetibilidade da cultivar afetada e as condições ambientais, podem manifestar-se em folhas, flores, frutos, na casca e na madeira de troncos e galhos estruturais, ramos e raízes (Nickel, 2004).

Dentre os vírus que infectam macieiras, pereiras e marmeleiros destaca-se o vírus das caneluras do tronco de macieiras, Apple stem pitting virus (ASPV), (Família Flexiviridae, gênero Foveavirus) (Koganezawa & Yanase, 1990; Jelkmann, 1994).

Por ser um vírus latente em macieiras e pereiras, não produzindo sintomas visualmente perceptíveis em cultivares

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comerciais, o ASPV pode passar despercebido e ser propagado

indefinidamente, se o material não for submetido a indexação.

Seus danos consistem em redução de vigor das plantas, da qualidade dos frutos e da produtividade.

Considerando que o ASPV é um vírus importante das frutíferas em função dos danos que causa, e que não há estudos desta virose no Brasil são extremamente restritos no que se refere à variabilidade do patógeno, propôs-se o presente trabalho objetivando:

a) Caracterizar um isolado de ASPV que ocorre no sul do Brasil, possibilitando comparar o grau de parentesco com os isolados já descritos em outros países depositados em bases de dados, contribuindo assim, para ampliar o conhecimento sobre o vírus, sua dispersão geográfica e sua diversidade biológica, visando à utilização dos resultados em programas de produção de cultivares livres de vírus.

b) Estabelecer o diagnóstico do vírus e caracterizar molecularmente a proteína capsidial de um isolado de ASPV obtido de pereiras;

c) Observar e descrever os sintomas do mesmo isolado do ASPV em plantas indicadoras herbáceas e lenhosas.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

O Apple stem pitting virus (ASPV), ocorre na maioria das cultivares comerciais de macieiras, pereiras européias e asiáticas e também de marmeleiros, em todas as regiões pomicultoras do mundo, geralmente em combinação com outros vírus.

O ASPV possui partículas alongadas, filamentosas e flexuosas, de 12 a 15 nm de espessura e 800 nm de comprimento (Koganezawa & Yanase, 1990; Jelkmann, 1997).

O genoma é composto de RNA de fita simples, senso positivo, com 9306 nucleotídeos e 5 fases abertas de leitura (ORFs – open reading frames) (Jelkmann, 1994). As ORFs 1, 2-4 e 5

codificam, respectivamente, metiltransferase/helicase/RNA

polimerase, as proteínas do bloco triplo de genes encontrado tipicamente em Potexvirus e Carlavirus, envolvidas no movimento célula-a-célula das partículas virais, e as subunidades da capa protéica (Figura 1) (Koganezawa & Yanase, 1990; Jelkmann, 1994).

Os sintomas produzidos em indicadoras lenhosas são usados para detecção do ASPV. A síndrome no lenho é caracterizada pela formação coalescente de caneluras no xilema, que em cvs. suscetíveis param na união da enxertia com o porta-enxerto tolerante (Stouffer, 1989).

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Figura 1. Organização genômica do ASPV (Adams et al., 2004). Os danos causados pelo ASPV incluem, desde falhas na "pega" da enxertia no viveiro, até reduções consideráveis de produção e qualidade dos frutos (redução de calibre) (Baumann & Louis, 1980). Além disso, as plantas infectadas por vírus, são geralmente mais suscetíveis a infecções fúngicas, como a podridão do colo, causada por Phytophthora cactorum (Campbell, 1969). Em macieira cv. Lord Lambourne infectada com 5 vírus de macieira, dentre eles o ASPV, observou-se uma redução do vigor e morte das plantas quando comparada com uma macieira sem vírus inoculada com o mesmo fungo Campbell (1969). Em plantas infectadas ocorre uma redução na capacidade de utilização de nutrientes, aumentando o custo de produção e o impacto ambiental da atividade pomicultora (Baumann & Louis, 1980).

13 kDa 247kDa 25kDa 7kDa 44 kDa ORF1 ORF2 ORF3 ORF4 ORF5 5’ 3’

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Considerando que o único método conhecido de transmissão é a enxertia, o ASPV pode ser controlado usando-se propagação de materiais livres de vírus. É possível eliminar o ASPV dos tecidos infectados por termoterapia, na qual as plantas

são submetidas a uma temperatura de 38 °C, durante um período

que de 4 a 5 semanas. Brotações emitidas durante o tratamento, são na sequência enxertadas sobre porta-enxertos sadios ou usadas para extração e cultivo in vitro, permitindo, desse modo, o desenvolvimento de clones livres da doença (Stouffer, 1989; Lemoine, 1990; Jelkmann, 1997).

Diversas doenças estão associadas ao ASPV. Entre elas destacam-se as caneluras produzidas em cultivares suscetíveis de macieiras, como a cv. Virginia Crab, o “amarelecimento das nervuras” o “empedramento dos frutos”e o “mosqueado vermelho da pêra”, a “deformação dos frutos” e as “manchas anelares ferruginosas do marmelo”, a “epinastia e o declínio do Spy 227”, e o “descascamento”e o “nanismo de platycarpa” (Refatti & Osler, 1975; Stouffer, 1989; Cameron, 1989; Jelkmann, 1997; Paunovic & Rancovic, 1998; Schwarz & Jelkmann, 1998; Paunovic et al., 1999).

Entre as indicadoras biológicas do ASPV, destacam-se cultivares de Malus domestica (L.) e outras espécies desse gênero, Pyrus communis (L.) e o híbrido Pyronia veiichii (trabut) Gull.

A enxertia é o único meio pelo qual o ASPV é transmitido para plantas hospedeiras lenhosas. Transmissão experimental por

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inoculação mecânica, foi obtida para Nicotiana occidentalis cv. 37B (Vana der Meer, 1986) e N. occidentalis Wheeler subsp obliqua Wheeler (Koganezawa & Yanase, 1990). Leone et al. (1995) demonstraram a retrotransmissão do vírus de N. occidentalis Wheeler para macieiras e pereiras, e com isto o preenchimento dos requisitos dos postulados de Kock.

O diagnóstico dos vírus de fruteiras pode ser realizado através da enxertia de tecidos de plantas a serem testadas em plantas indicadoras; ou conduzida em laboratório por sorologia, baseada na detecção da proteína capsidial do vírus; e por meio de técnicas moleculares como a PCR ou RT-PCR, baseados na amplificação de um molde de ácido nucléico viral pela enzima polimerase de Thermus acquaticus (Saiki et al., 1988).

A sorologia é uma ferramenta usada com muito sucesso por ser prática e rápida no diagnóstico de agentes infecciosos como vírus, fungos e bactérias. Entretanto, seu uso é limitado, pois, dependendo do estágio de desenvolvimento das plantas e das estações do ano, pode haver interferência negativa destes fatores nos resultados devido flutuações do título viral. Para a utilização desta técnica, deve-se dispor de anti-soros produzidos contra antígenos específicos (Zerbini, et al., 2002), também necessários para o diagnóstico por meio de Western blot (Towbin et al., 1979).

Como outros vírus de macieira e pereiras, ASPV é latente, tornando-se necessária a utilização de plantas indicadoras para realizar a indexação biológica (Tabela 1).

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Tabela 1. Espécies/variedades utilizadas na indexagem biológica do ASPV e os respectivos sintomas que desenvolvem (adaptado de Nickel, 2004)

ESPÉCIES/VARIEDADES SINTOMAS

Malus domestica ‘Spy 227’ MC, (C), E

Pyronia veitchii MAC, BC, C, MC

M. domestica cv. Virginia Crab NUE, C, IBE M. domestica cv. Radiant Crab E, NN

( ) sintoma ocorre com certos isolados, não sendo uma regra geral.

(MC) manchas necróticas e/ou cloróticas, (C) caneluras na madeira, (E) epinastia foliar, (MC) manchas cloróticas, (MAC) manchas anelares cloróticas , (BC) bandeamento clorótico de nervuras, (NUE) necrose na união da enxertia, (IBE) inchamento da base do enxerto, (NN) necrose de nervuras, entre outros.

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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Local de execução e material vegetal

Os experimentos de laboratório foram conduzidos no Laboratório de Virologia da Embrapa Uva e Vinho de Bento Gonçalves, RS, utilizando-se as cultivares de pereiras européias Starkrimson e Abate Fetel, e pereiras asiáticas Kousui e Housui, coletadas na Estação Experimental da Embrapa Uva e Vinho, Vacaria, RS, no outono de 2003 e no outono de 2004.

3.2 Extração de ácidos nucléicos totais

A extração de ácidos nucléicos totais de folhas e cascas de ramos de pereiras cvs. Starkrimson, Abate Fetel, Kousui e Housui, foi realizada por adsorção de ácidos nucléicos totais em partículas de dióxido de silício (Boom et al., 1990). O porta enxerto comercial sadio cv. Pyrodwarf (P. communis: Old Home x Bonne Louise D’Avranches) produzida por cultura de meristemas in vitro foi usada como controle negativo.

Às amostras, de 300 mg de tecido vegetal macerado com nitrogênio líquido, adicionou-se 3 mL de tampão de extração (4 M tiocianato de guanidina; 0,2 M NaOAc pH 5,2; 25 mM EDTA pH

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mercaptoetanol para cada amostra e da mistura foram transferidos

500 µL para tubos Eppendorf e adicionados 100 µL de NLS 10%

(N-Lauroyl- Sarcosine sodium salt). Em seguida as amostras

foram incubadas a 70 ºC por 10 minutos com agitação intermitente e mantidas em gelo por 5 minutos. Estas então foram centrifugadas a 12.000 xg por 10 minutos, e a fase aquosa foi transferida para um novo tubo ao qual adicionou-se 150 L de etanol absoluto,300 L de 6M de NaI e 25 L de sílica (Boom et al., 1990). As amostras foram homogenizadas por 10 minutos com agitação intermitente à temperatura ambiente e centrifugadas a 6.000 xg por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado com 500 L de tampão de lavagem (10mM Tris-HCl pH 7,5; 0.5 mM EDTA pH 8.0; 50 mM NaCl; 50 % EtOH). Em seguida as amostras foram centrifugadas a 6.000 xg por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado e o precipitado mantido a temperatura ambiente para secagem. O sedimento foi ressuspendido em 150 µL de água autoclavada e incubado a 70 ºC por 4 minutos. As amostras foram centrifugadas a 12.000 xg por 10 minutos e 120 µL do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo, e armazenados a -20 ºC.

3.3 Síntese de cDNA e amplificação por PCR

A reação de síntese de cDNA constituiu-se, para todas as amostras, de: 1µL de RNA total, 9,6 µL de água, 0,7 µL de inibidor

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de RNAse (40 U/µL) e 0,7 µL de oligonucleotídeo oligo (dT) (10 µM). A mistura foi incubada por 10 minutos a 70 °C e 5 minutos no

gelo. Posteriormente, foram acrescentados 4 µL de tampão 5X da

transcriptase reversa, enzima M-MLV (Moloney murine leukemia virus), 2 µL de DTT (dithiothreitol) (0,1 M), 1 µL de dNTPs (2,5 mM) e 1µL de transcriptase reversa M-MLV (200 U/µL). A mistura foi incubada a 37 °C por 1 hora e depois a 70 °C por 15 minutos.

Para a PCR foram preparados para cada amostra 50 µL da

seguinte mistura de amplificação: 5µL de tampão da enzima 10 X,

1,5 µL de MgCl2 (1,5 mM), 4 µL de dNTPs (2,5 mM cada, dATP,

dTTP, dCTP e dGTP), 1 µL de Taq DNA polimerase (5 U/µL), 1 µL

de cada oligonucleotídeo (10 µM) e 5 µL da reação de cDNA. O

volume foi completado para 50 µL com água esterilizada. A mistura foi desnaturada a 95 ºC por 10 minutos, seguidos de 35 ciclos de amplificação (desnaturação de 1 minuto a 94 ºC, pareamento de 1 minuto a 50 ºC e extensão de 1 minuto a 72 ºC), e uma extensão final de 10 minutos a 72 ºC. Foram utilizados os oligonucleotídeos ASPV1, ASPV2 (Malinowski et al., 1998), ASPV3, ASPV4 e ASPV5 (Jelkmann, 1994). Os fragmentos amplificados foram obtidos a partir de combinações desses oligonucleotídeos (Tabela 2).

A análise dos produtos das amplificações foi realizada em gel de agarose 1,2%, preparado em tampão de corrida 1X TBE (0,09 M Tris HCl + 0,09 M ácido bórico + 2 mM EDTA, pH 8,0). Para o seqüenciamento do gene da proteína capsidial, a banda de

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tamanho esperado de 1554 pb, obtida a partir da combinação dos oligonucleotídeos ASPV3 e ASPV5, foi recortada do gel e o DNA eluído com o kit de purificação GFX (Amersham Biosciences) de acordo com as especificações do fabricante.

Tabela 2. Oligonucleotídeos usados na detecção de Apple stem pitting virus isolado BR1

Nome Seqüência Posição no

genoma Orientação ASPV1 AGCGGTTGCCTATTTTTGCTC

C 3480-3501 senso

ASPV2 GTCAGGTCAAAGATGCTGAA

A 3750-3770 antisenso

ASPV3 GTACATGAGTAACTCGAGCC 7709-7728 senso

ASPV4 CTCTTGAACCAGCTGATGGC 8993-9012 Senso

ASPV5 ATAGCCGCCCCGGTTAGGTT 9243-9262 Antisenso Combinação: ASPV1 e ASPV2, fragmento de 291 pb; combinação: ASPV3 e ASPV5, fragmento de 1554 pb; combinação ASPV4 e ASPV5, Fragmento de 270 pb.

3.4 Clonagem de fragmento de ASPV e transformação de

Escherichia coli

O fragmento de 1554 pb de ASPV foi clonado no vetor pGEM-T Easy (Promega). A reação de ligação estava composta de 5 µL do DNA purificado, 10 µL 2X de tampão da ligase, 1µL do vetor, 1 µL de ligase T4 e 3 µL de água autoclavada, desionizada.

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A mistura de 20 µL da reação de ligação foi incubada em tubo

Eppendorf por 3 horas a 15 ºC e 200 µL de células competentes

de E. coli DH5α foram adicionados. As células foram incubadas em gelo por 30 minutos, submetidas a um choque térmico a 42 ºC por 90 segundos e devolvidas em seguida ao gelo. Foram então

adicionados 800 µL de meio de cultura LB. Após incubação por 1

hora a 37 ºC e centrifugação por 15 segundos, retiraram-se 800 µL do meio líquido, e as células foram ressuspendidas no volume restante de 200 µL e plaqueadas em meio de cultura LB sólido com ampicilina (100 µg/mL), 40 µL de X-Gal (20 mg/mL) e 4 µL de IPTG (200 mg/mL) por placa. As colônias recombinantes, brancas ou transparentes foram transferidas por meio de palitos esterilizados para tubos de ensaio com 3 mL de meio de cultura LB com ampicilina (100 µg/mL) e incubadas com agitação de 120 rpm durante a noite a 37 °C, para possibilitar o crescimento bacteriano.

3.5 Extração e digestão de DNA plasmidial

O DNA plasmidial de clones transformados foi extraído utilizando-se o kit “FlexiPrep” (Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. A confirmação da presença de fragmento de ASPV nos plasmídeos recombinantes foi realizada por clivagem com a enzima de restrição EcoRI a 37 °C por 1 h e visualização dos produtos da digestão em gel de agarose como mencionado no item 3.3.

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O clone recombinante foi seqüenciado e a seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos foi analisada e comparada com as seqüências do banco de dados GenBank, utilizando-se a função BLAST do NCBI.

3.6 Indexação biológica

A indexação biológica foi feita em outubro de 2004, enxertando-se gemas de cultivares de pêra infectadas, Abate Fetel e Housui, em indicadoras lenhosas sadias, sendo elas: Spy 227, Virginia crab, Malus platycarpa, Beurrce Hardy, Pyronia veitchii e Radiant crab, enxertadas em Pyrus calleryana (Decne). Foram enxertadas 3 gemas de cada cultivar de pêra infectada em 6 plantas de cada indicadora lenhosa. Após as enxertias, as plantas permaneceram em casa de vegetação para acompanhamento e avaliação.

Folhas das pereiras cvs. Starkrimson, Abate Fetel, Kousui e Housui, infectadas com o ASPV foram maceradas utilizando-se tampão fosfato de potássio 0,01M e nicotina 2,5% pH 7,5 e inoculadas mecanicamente em folhas jovens de N. occidentalis, N. occidentalis obliqua e N. occidentalis 37B, em casa de vegetação.

A RT-PCR de extratos de RNA total das plantas indicadoras foi executada conforme protocolo mencionado no item 3.5 com os oligonucleotídeos ASPV1 e ASPV2.

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3.7 Dot-ELISA

Para o dot-ELISA utilizaram-se como antígeno extratos de cascas de ramos e folhas de pereiras cvs. Abate Fetel e Kousui, e Pyronia veitchii, esta enxertada com gemas da cv. Abate Fetel infectada. Extrato foliar do porta-enxerto comercial sadio cv. Pyrodwarf, foi utilizado como controle negativo.

As amostras foram maceradas em tampão TBS (Tris-base 0,02 M, NaCl 0,05 M, pH 7,5) com sulfito de sódio a 0,2% (p/v), na

proporção 1:5, e aplicados 20 µL sobre membrana de

nitrocelulose. A seguir, a membrana foi mergulhada em solução bloqueadora (TBS, pH 7,5, acrescido de 2% de Triton X-100 e de 2% de leite em pó desnatado (LPD)), onde permaneceu por 1 hora, sob agitação lenta. A membrana foi tratada com 10 µL de anti-soro contra ASPV (fornecido pela Embrapa Clima Temperado), diluído em 1:1000 em TBS com LPD a 2%, incubando-se durante a noite, sob agitação. A membrana foi lavada 3 vezes em TBS com Tween 20 a 0,05%, sob agitação (100

rpm) e incubada, por uma hora, com adição de 10 µL de anti-IgG

comercial (Sigma), diluído 1:1000 em TBS com LPD a 2%. Em seguida, procedeu-se a nova lavagem da membrana, por 4 vezes com TBS + Tween 20. O complexo antígeno-anticorpo foi detectado pela adição do tampão de revelação (0,1 M tris-base +

0,1 M NaCl + 5 mM MgCl2, pH 9,5), ao qual foi adicionado, na hora

da revelação, 0,165 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e 0,33 mg/mL de ‘nitroblue tetrazolium’ (NBT). A reação foi

(26)

interrompida mergulhando-se a membrana em água destilada (Fajardo et al., 2000).

3.8 Western blot

O Western blot foi executado de acordo com Towhin et al. (1979). As amostras constaram de casca de ramo de pereira cultivar Starkrimson, e amostra foliar do porta-enxerto de pereira comercial Pyrodwarf, as quais foram maceradas na proporção 1:10 em tampão de extração: 1. Tris HCl 0.05 M, pH 8.3; 2. Tris HCl 0.5 M, pH 6.8, SDS 10%, 5% glicerol, 2,5% 2-ME, (1:1) e água destilada para completar o volume. As amostras de extratos de proteínas totais (Hussain et al., 1986) foram fervidas, em banho-maria por 3 minutos e em seguida colocadas em gelo para resfriamento e centrifugadas a 10.000 xg durante 20 minutos. As alíquotas foram armazenadas a -20 °C.

O extrato de proteínas contendo a proteína viral foi analisado por meio de SDS-PAGE, utilizando-se o sistema de gel descontínuo vertical, com o gel concentrado em poliacrilamida a 4% e o gel separador a 12% (Laemmli, 1970). Retiraram-se do

freezer 30 µL de cada amostra e adicionaram-se 6 µL de tampão

de carga, este contendo azul de bromofenol (0,25%) e glicerol (30%). As mesmas foram fervidas, em banho-maria, por 3 minutos e aplicadas no gel, juntamente com 5 µL de marcador molecular Magic Mark (Invitrogen). Após a corrida de duas horas a 120 V, com tampão de eletroforese (25 mM Tris + 192 mM glicina + 10%

(27)

de SDS, pH 8,3) o gel foi mergulhado em tampão de transferência (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol) para promover a remoção de sais e detergentes presentes no tampão de eletroforese. As frações antigênicas, separadas por eletroforese, foram transferidas eletroforeticamente, do gel à membrana de nitrocelulose (Amersham), utilizando-se aparato de transferência (BioRad) com tampão de transferência por uma hora a 80 V. Após a transferência, a membrana foi processada e revelada como no teste de dot-ELISA (Item 3.7), com anti-soro cedido pelo Dr. W. Jelkmann (Dossenheim, Alemanha).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com os oligonucleotídeos ASPV4 e ASPV5 foi amplificado um fragmento de 270 pb (Figura 2), a partir de extratos foliares das quatro cultivares de pereira testadas, representando assim, um excelente instrumento para detecção do ASPV.

A partir deste resultado, os oligonucleotídeos ASPV4 e ASPV5 passaram a ser utilizados nas reações do controle positivo do ASPV.

A combinação dos oligonucleotídeos ASPV3 e ASPV5 resultou na amplificação de um fragmento de 1554pb (Figura 3) da cv. Abate Fetel, contendo o gene completo da proteína capsidial, o qual foi clonado e seqüenciado (Figura 5) e depositado no banco de dados Genbank (número de acesso AY572458).

(28)

Figura 2. Análise de produtos da RT-PCR (M) Marcador DNAλ/PstI. (1) cv. Starkrimson; (2) cv. Abate Fetel; (3) cv. Kousui; (4) cv. Housui.

De extratos foliares de N. occidentalis 37B inoculada mecanicamente com o vírus, amplificou-se um fragmento de 291 pb (Figura 4) utilizando-se os oligonucleotídeos ASPV1 e ASPV2, que contém parte do gene da polimerase viral.

2838 1700 1159 805 514 339 264 247 M 1 2 3 4 270 pb

2

(29)

Figura 3. Análise de produtos da RT-PCR (M) Marcador DNAλ/PstI. (1) Controle positivo, cv. Housui; (2) cv. Abate Fetel. M 1 2 270 1554 pb

3

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Figura 4. Análise de produtos da RT-PCR (M) Marcador DNAλ/PstI. (1) Controle positivo, cv. Housui; (2) Controle negativo, Pyrodwarf; (3) N. occidentalis 37B.

1 TGTAGGTTGTGTTTACTCTGAAGCTTTTATAGAGCTAGTTAAAGGCCTTAAGCCTTATTA 61 CCACCCATTAGGTCAGGGTGTAGTTGCTTAATATTATATAAGTTTGAGGGTGTTCTGTTG 121 TGTGTTTAAAGTTAAAGTTTTAATTGCAATCAGTGTGTTCTTCTATGGCTTCCGACGGAT M A S D G S pb M 1 2 3

4

291 270

(31)

181 CCCAGCCTCCAGCTTCCACTCCACTCACTTCCGTGGAGGAATCTACAGCTGCAGCTTCAG Q P P A S T P L T S V E E S T A A A S A 241 CCCCAATTTCTAGTGCAATTAGCTCGGCCCCCGCAAATGCTCCAGCTGCTAGTGAGCCAG P I S S A I S S A P A N A P A A S E P V 301 TCATCTCCCAGGTTCAATCATTGGCTCCCTTAGTTAGTGGCTTTGACCCAAATCTTCATG I S Q V Q S L A P L V S G F D P N L H G 361 GGCGACTTACTAATGAGCAAATGCGGCAGGCCCAGAGTGGAGCTACAAGTCAGGATCGTG R L T N E Q M R Q A Q S G A T S Q D R V 421 TCAGTATGACCTCTAATCCATTTGAAACTGGTACTGCCTATAGTAGGGGGCCACGTGCAA S M T S N P F E T G T A Y S R G P R A S 481 GCATGGGGCCTTACCTGAACTTTCCTGGAAGTGGAAGTGCTAGTGAGCCTAATTCTCAGA M G P Y L N F P G S G S A S E P N S Q R 541 GGATTTTTCCTTTACAACATGGGGTGAATCCTTCAGCTCATGCTTCCGATCTTGTGCCAA I F P L Q H G V N P S A H A S D L V P N 601 ATCAGCCCACTTCAGGTGGAAATGCTGGAACTCCCTTCACTCTTGGCAATAGAATGCCAA Q P T S G G N A G T P F T L G N R M P R 661 GAAATGTCACGGCCAATACTGGGGGAATGAGGAGACGTCTTGACTCCGTTGGTCTCAAGA N V T A N T G G M R R R L D S V G L K N 721 ATATTGGGTATGAACCCCAGGCTGGAGTTGTGGCAAGCAATCAAAAGATCAGAGCTGTCG I G Y E P Q A G V V A S N Q K I R A V G 781 GCGTTGCACTCGTAGGAATGGGAATCCCTGAGCATCAACTCACAGAGGTGGGAGTTTATC V A L V G M G I P E H Q L T E V G V Y L 841 TGGCTAGGCATTGCGCAGATGTTGGCGCCTCAGACAAGTCTACATTATTGGGAACTTTCC A R H C A D V G A S D K S T L L G T F P 901 CTGGTTCTGACATCACTCTGGAGGAGGTTGGAACTATGATCAAGCAGACTGAGGGGTGTA G S D I T L E E V G T M I K Q T E G C T 961 CTTTGAGGCAATATTGTGCCTTCTATGCAAAGCATGTTTGGAACCTCATGCTGCAGACCC L R Q Y C A F Y A K H V W N L M L Q T Q 1021 AAAGTCCACCAGCCAATTGGGTCGGCAAAGAGTTCAAATTCGAAACAAGGTATGCAGTCT S P P A N W V G K E F K F E T R Y A V F 1081 TTGACTTCTTCTTTGGAGTTGAAAGTACCGCTTCTCTTGAGCCAGCAGACGGCCTGATAA D F F F G V E S T A S L E P A D G L I R 1141 GGCTTCCAACCCAAGCTGAGAGAGTGGCCAATGTTACGAGCAAGGAGATACAGATGTACC L P T Q A E R V A N V T S K E I Q M Y R

(32)

1201 GCATCCGCTCAATGGAGGGTACTCAGGCCGTTAATTTTGGTGTGGTTACAGGGGGAAAAA I R S M E G T Q A V N F G V V T G G K I 1261 TTGGACCCAAGCCAGTTCTATCCATTAGGAAGTAACTAATTAATTAATTTTCCTGCATTT G P K P V L S I R K *

1321 TCAATTTCCAGTACTTATGCTTTTTAGAAAGTTGATCCCAACCTAACCGGG

Figura 5. Fragmento contendo seqüência completa de nucleotídios (superior) e aminoácidos deduzidos (inferior) do gene da proteína capsidial do isolado BR1 do ASPV.

A maior identidade de nucleotídeos do isolado de ASPV (89%) coletado nos Campos de Cima da Serra foi observada com um isolado alemão (D21829) de macieira e a menor foi de 85%

com isolados poloneses (AF345893 e AF345894). A maior

identidade de aminoácidos deduzidos foi de 84% com dois isolados poloneses de pereira (AAK30563 e AAK30566) e a menor identidade foi de 75% com os dois isolados alemães (BAA04852 e BAA04853), respectivamente de macieira e pereira. Foi possível, na análise das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos associar esse clone a outros isolados do mesmo vírus (Tabela 3), confirmando a identificação do isolado nos materiais analisados.

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Tabela 3. Comparação de identidade (%) das seqüências de nucleotídeos (diagonal superior) e de aminoácidos deduzidos (diagonal inferior) do gene da proteína capsidial do isolado de Apple stem pitting virus (ASPV BR1) com as respectivas seqüências de outros isolados

ISOLADO VIRAL ASPV BR1 (1) Alemão PA66

(2) Alemão PSA-H (3) Polonês GNKVII/34 (4) Polonês ST132 (5) Polonês ST113(6) ASPV BR1 (1) 89% 88% 85% 85% 88% Alemão PA66 (2) 75% 99% 80% 88% 91% Alemão PSA-H (3) 75% 89% 80% 88% 90% Polonês GNKVII/34 (4) 84% 76% 83% 81% 82% Polonês ST132 (5) 82% 76% 76% 74% 92% Polonês ST113 (6) 84% 76% 78% 74% 89%

Acesso GenBank (NCBI): (1) AY572458/AAS78637, (2) D21829/BAA04853 (3) D21828/BAA04852, (4) AF345893/AAK30563, (5) AF345894/AAK30565, (6) AF345895/AAK30566. Isolados 1, 3, 4, 5 e 6 de pereira, 2 de macieira.

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nucleotídeos e de 40% de identidade de aminoácidos (Adams et al., 2004). Assim, foi possível confirmar que o isolado ASPV BR1 pertence à mesma espécie do vírus encontrado na Alemanha e na Polônia, com os quais foi comparado.

Figura 6. Região de deleção (seta) observada a partir do alinhamento das seqüências de aminoácidos de ASPV, isolado ASPV BR1 e isolado alemão PA66 (NCBI, 2005).

O alinhamento da seqüência obtida do isolado ASPV BR1 mostrou diferenças substanciais no tamanho do gene da proteína capsidial (Tabela 4) quando comparado com os isolados alemães, não diferindo significativamente dos isolados poloneses. Os dois isolados alemães de ASPV apresentam duas regiões diferentes do

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isolado ASPV BR1 no gene de proteína capsidial, uma com deleção (Figura 6) e outra com inserção (Figura 7) de 113 nucleotídeos. Mesmo assim, o isolado ASPV BR1 apresentou alta homologia (89%) com o isolado alemão. Malinowski (1998) comparando um isolado polonês também verificou essa diferença em relação ao isolado alemão. Não foi possível, entretanto, elucidar nem a causa, nem o efeito dessas diferenças merecendo, portanto, estudos adicionais para um melhor entendimento deste fato.

Figura 7. Região de inserção (seta) observada a partir do alinhamento das seqüências de aminoácidos de ASPV, isolado ASPV BR1 e isolado alemão PSA-H (NCBI, 2005).

Embora, pela análise das seqüências, os valores de homologia sejam suficientemente altos para permitir a determinação, com segurança da identidade do vírus, a

(36)

variabilidade apresentada pode ser explicada, pela variabilidade natural existente entre isolados de uma mesma espécie ou estirpe viral. Nas condições brasileiras ainda é desconhecida a variabilidade do ASPV. Por diferir de outras regiões do mundo onde este vírus está presente, a pressão de seleção no Brasil pode estar produzindo variantes distintas daquelas encontradas em locais com ambientes diferentes, o que justifica a necessidade e acentua a importância do estudo realizado.

Tabela 4. Relação dos isolados de ASPV de pereiras com gene da proteína capsidial caracterizados, disponíveis no banco de dados GenBank

ACESSO ISOLADO TAMANHO PC*

AY572458 Brasileiro ASPV BR1 1.131

D21892 Alemão PA66 1.244

D21828 alemão PSA-H 1.244

AF345895 Polonês ST113 1.124

AF345894 Polonês ST132 1.125

AF345893 polonês GNKVII/34 1.128

* Referente à proteína capsidial, em pares de bases.

No teste de transmissão mecânica somente a indicadora Nicotiana occidentalis 37B inoculada com extrato foliar da cv. Housui, reagiu com necrose de nervuras (NN) (Figura 8A) e das extremidades apicais (NE) e laterais da lâmina foliar (Figura 8B).

(37)

A B

Figura 8. Nicotiana occidentalis 37B inoculada com extrato de ASPV de pereira cv. Housui infectada. (A) necrose de nervuras (B) necrose das extremidades apicais e laterais da lâmina foliar.

Estes resultados encontrados no presente estudo confirmam aqueles obtidos por Van der Meer (1975) e Van Dijk et al. (1987).

Das indicadoras lenhosas, somente Pyronia veitchii enxertada com gemas da cv. Abate Fetel infectada, após 6 meses em casa de vegetação, apresentou manchas cloróticas cujos núcleos tornaram-se necróticos e bandeamento clorótico de nervuras secundárias e terciárias nas folhas (Figura 9).

NE NN

(38)

Figura 9. Reação de Pyronia veitchii inoculada com enxertia de gemas da cv. Abate Fetel infectada com ASPV, com manchas cloróticas nos espaços entre as nervuras secundárias e terciárias; anéis e/ou semi-anéis cloróticos e bandeamento clorótico de nervuras secundárias e terciárias de pouca extensão.

Segundo Jelkmann (1997), sintomas de ASPV em pereiras consistem em clorose nas nervuras, principalmente nas nervuras secundárias e terciárias o que se assemelha com o observado neste trabalho em P. Veitchii.

(39)

Figura 10. Análise por dot-ELISA. (1) Controle negativo, Pyrodwarf (folha); (2) P. veitchii (casca); (3) P. veitchii (folha); (4) Abate Fetel (casca); (5) A. Fetel (folha); (6) Kousui (casca); (7) Kousui (folha).

Neste estudo o ASPV foi detectado por dot-ELISA em todas as cultivares analisadas e nos dois tipos de tecidos amostrados (cascas e folhas). Foi possível visualizar de forma inequívoca a reação sorológica positiva, com evidente contraste entre amostras infectadas, as quais apresentaram uma coloração arroxeada e a

1 2 3 4 5 6 7

(40)

amostra sadia, que apresentou coloração verde (Figura 10). Tanto a casca dos ramos quanto as folhas mostraram-se adequados para o diagnóstico do ASPV, não havendo diferenças entre ambos.

As amostras 2 e 3 apresentaram uma coloração mais forte que as demais. Essa diferença de cor pode ser devida a uma maior concentração de vírus nos respectivos tecidos.

O ASPV também foi detectado por Western blot. Obteve-se uma banda em torno de 55 kDa (Figura 11). Paunovic et al. (1999), observaram uma banda de 48 kDa extraído de folhas de N. occidentalis inoculada com ASPV. Em imunoblots e SDS-PAGE, Jelkmann (1994) observou uma banda de 48 kDa, porém o tamanho previsto segundo cálculo computacional feito com base no tamanho do gene foi de 44 kDa. Essa diferença entre os tamanhos pode ser atribuída à alta hidrofilicidade da proteína capsidial de ASPV. Discrepância similar foi encontrada com a proteína capsídica de Shallot virus X (ShVX), (família Flexiviridae) sugerida por Kanyuka et al. (1992). Estes autores sugeriram que a adsorção de moléculas de água pelas subunidades de proteína da CP, que determina um aumento aparente do tamanho da molécula em conseqüência de uma redução da mobilidade eletroforética. É importante afirmar que ficou demonstrado que a proteína viral do ASPV reagiu com o anti-soro produzido contra um isolado alemão de ASPV.

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Figura 11. Análise por western blot. (M) Marcador molecular Magic Mark (Invitrogen). C- (controle negativo) Pyrodwarf sadio (folha), 1: Starkrimson (casca de ramos). 30 60 80 50 40 100 120 M C- 1 kDa

(42)

5 CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente trabalho permitem concluir que: a) As técnicas de PCR, dot-ELISA e Western blot e o diagnóstico biológico são eficientes para detecção do ASPV;

b) O isolado viral estudado é um isolado de ASPV com alto grau de homologia com outros isolados depositados em bases de dados;

c) Caracterizou-se o gene completo da proteína capsidial de ASPV, isolado pêra BR1;

d) Apesar de somente uma das plantas inoculadas ter sido infectada, foi possível a transmissão mecânica do vírus para Nicotiana occidentalis 37B e por enxertia para a indicadora lenhosa Pyronia veitchii. O diagnóstico biológico mostrou-se igualmente eficiente para a detecção do ASPV.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A implementação de testes diagnósticos biológicos, sorológicos e/ou moleculares, a exemplo dos utilizados neste trabalho, embasa decisões de pesquisa que visem a seleção de matrizes de macieiras e pereiras, e ainda possibilitam a segura indexação de plantas, de maneira a evitar a disseminação da virose em materiais propagativos.

(43)

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADAMS, M.J.; ANTONIW, J.F.; BAR-JOSEPH, M.; BRUNT. A.A.; CANDRESSE, T.; FOSTER, G.D.; MARTELLI, G.P.; MILNE, R.G.; FAUQUET, C.M. The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation. Archives of Virology, v. 149, p. 1045-1060, 2004.

BAUMMAN, G.; LOUIS, F. Untersuchungen an virusfreien und virusgetesteten Mc-Klonen. Obstbau, v. 5, p.9-12, 1980.

BOOM, R.; SOL, C.J.A.; SALIMANS, M.M.M.; JANSEN, C.L.; WERTHEIM VAN DILLEN, P.M.E.; VAN DER NOORDAA, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology, v. 28, p. 495-503, 1990.

CAMERON, H.R. Pear vein yellows. In: Friedlund, P.R. (Ed.) Virus and viruslike disease of pome fruits and simulating noninfectious disorders. Washington: Washington State University, Cooperative Extension College of Agriculture and Home Economics, 1989. p. 175-179.

CAMPBELL, A. I. Effect of some apple viruses on susceptibility of 2 clonal rootstocks to color rot caused by Phytophthora cactorum. Journal of Horticultural Science & Biotechnology, v. 44, n. 1, p.69, 1969.

FAJARDO, T.V.M.; KUHN, G.B.; EIRAS, M.; NICKEL, O. Caracterização parcial de um isolado de Grapevine fanleaf virus. Fitopatologia Brasileira, v. 25, p. 505-511, 2000.

JELKMANN, W. Apple stem pitting virus. In: Vesely, D.; Monette, P. (Ed.) Recent research developmente in plant pathology – Filamentous viruses of woody plants. India: Research Signpost, 1997. p. 133-142.

(44)

JELKMANN, W. Nucleotide sequences of Apple stem pitting virus and of the coat protein gene of a similar virus from pear associated with vein yellows disease and their relationship with potex- and carlaviruses. Journal of General Virology, v. 75, p. 1535-1542, 1994.

KANYUKA, K.V.; VISHNICHENKO V. K.; LEVAY K.E.; KONDRIKOV, D.Y.U.; RYABOV, E.V.; ZAVRIEV, S.K. Nucleotide sequence of shallot virus X RNA reveals a 5'-proximal cistron closely related to those of potexviruses and a unique arrangement of the 3'-proximal cistrons. Journal of General Virology, v. 73, p. 2553-2560, 1992.

KOGANEZAWA, H.; YANASE, H. A new type of elongated virus isolated from apple trees containing the Stem pitting agent. Plant Disease, v. 74, p. 610-614, 1990.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophago T4. Nature, v. 277, p. 680-685, 1970.

LEMOINE, J. Les maladies de dégénérescence. L’Arboriculture fruitière, v. 434, p. 38-48, 1990.

LEONE, G.; LINDNER, J.L.; JONGEDIJK, G.; VAN der MEER F.A. Back transmission of a virus associated with apple stem pitting and pear vein yellows, from Nicotiana occidentalis to apple and pear indicators. Acta Horticulturae, v. 386, p. 72-77, 1995.

MALINOWSKI, T.; KOMOROWSKA, B.; GOLIS, T.; ZAWADZKA, B. Detection of apple stem pitting virus and pear vein yellows virus using reverse transcription – polymerase chain reaction. Acta Horticulturae,v. 472, p. 87-95, 1998.

MATTHEWS, R.E.F. Plant Virology. 2. ed. New York: Academic Press, 1981. p. 12-17.

(45)

NCBI – National center for biotechnology information. www.ncbi.nlm.nih.gov (acesso em 23 de Janeiro de 2005)

NICKEL, O. Doenças causadas por vírus. In: NACHTIGALL, G.R. Maçã: Produção. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2004. p. 135-142. (Frutas do Brasil)

PAUNOVIC, S.; RANKOVIC, M. Relationship between quince fruit deformation virus and some pome fruit viruses. Acta Horticulturae, v. 472, p. 125-133, 1998.

PAUNOVIC, S., MAKSIMOVIC, V., RANKOVIC, M.; RADOVIC, S. Characterization of a virus associated with pear stony pit in cv. Württemberg. Journal Phytopathology, v. 147, p. 695-700, 1999. REFFATI, E.; OSLER, R. Possible relationships among pome fruit viruses detected in graft transmission trials. Acta Horticulturae, v. 44, p. 201-208, 1975.

SAIKI, R. K.; GELFAND, D.H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S. J.; HIGUCHI, R.; HORN, G. T.; MULLIS, K. B.; ERLICH, H. A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, v. 239, p. 487-491, 1988.

SCHWARZ, K.; JELKMANN, W. Detection and characterization of european apple stem pitting virus sources from apple and pear by PCR and partial sequence analysis. Acta Horticulturae, v.472, p.75-85, 1998.

STOUFFER, R.F. Apple stem pitting. In: FRIEDLUND, P.R. (Ed.) Virus and viruslike disease of pome fruits and simulating noninfectious disorders. Washington: Washington State University, Cooperative Extension College of Agriculture and Home Economics, 1989. p. 138-144.

TOWBIN, H.; STAEHELIN, T.; GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings National

(46)

Academy of Sciences of the United States of America. v. 76, n. 9, p. 4350-4354, 1979.

VAN der MEER, F.A. Observations on the etiology of some virus diseases of apple and pear. Acta Horticulturae, v. 193, p. 73-74, 1986.

VAN der MEER, F.A. Plant species outside the genus Malus as indicators for latent viruses of apple. Acta Horticulturae, v. 44, p. 213-220, 1975.

VAN DIJK, P.; VAN der MEER, F.A.; PIRON, P.G.M. Accessions of Australian Nicotiana species suitable as indicator hosts in the diagnosis of plant virus diseases. Netherlands Journal Plant Pathology, v. 93, p. 73-85, 1987.

ZERBINI, F. M.; CARVALHO, M. G.; ZAMBOLIM, E. M. Introdução à virologia vegetal. Viçosa: UFV, 2002. 145p.

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