ORIGINAL ARTICLE Pub Analysis of Genetic Polymorphisms Related to Virulence and Resistance in a Population of

N

Received: February 2011 www.ufrgs.br/actavet Accepted: May 2011

¹Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais da Universidade Estadual de Santa Cruz. ²Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia - Campus Cruz das Almas, Cruz das Almas, Bahia, Brasil. CORRESPONDÊNCIA:

A

A

A

A

Análise de p

nálise de p

nálise de p

nálise de polimor

nálise de p

olimor

olimor

olimor

olimorfismos em genes r

fismos em genes r

fismos em genes relacionados à vir

fismos em genes r

fismos em genes r

elacionados à vir

elacionados à vir

elacionados à virulência e r

elacionados à vir

ulência e r

ulência e r

ulência e resistência de

ulência e r

esistência de

esistência de

esistência de

esistência de

Streptococcus suis

Streptococcus suis

Streptococcus suis

Streptococcus suis

Streptococcus suis em uma população suína

em uma população suína

em uma população suína

em uma população suína

em uma população suína

Analysis of Genetic Polymorphisms Related to Virulence and Resistance in a Population of Streptococcus suis

Fábio Santos Carvalho¹, Ana Elisa Del’Arco Vinhas Costa² & Amauri Arias Wenceslau¹ Fábio Santos Carvalho¹, Ana Elisa Del’Arco Vinhas Costa² & Amauri Arias Wenceslau¹Fábio Santos Carvalho¹, Ana Elisa Del’Arco Vinhas Costa² & Amauri Arias Wenceslau¹ Fábio Santos Carvalho¹, Ana Elisa Del’Arco Vinhas Costa² & Amauri Arias Wenceslau¹ Fábio Santos Carvalho¹, Ana Elisa Del’Arco Vinhas Costa² & Amauri Arias Wenceslau¹

ABSTRACT

Background: Streptococcus suis is a bacterium that causes several diseases in swines and can infect humans; in addition, it

represents an important risk factor for professionals from this area. In cases of outbreak, despite some animals may remain as asymptomatic disease carriers, mortality can vary between 4 and 14%. Virulence of this bacterium may be associated with different serotypes exist, as well as with cellular proteins present in the capsule, or by mutations in the genomes of different serotypes, or even between samples of the same serotype. The strains of serotype 2 are considered to be the most virulent, although they can have moderate virulence, or even being less virulent. The objective of this work is to analyze genetic variability in S. suis samples.

Materials, Methods & Results: Forty S. suis samples provided by the Laboratório Microvet (Minas Gerais, Brazil) and isolated

between 1995 and 2003 on a farm located in Ponte Nova, MG, have been used. The lyophilized samples were reactivated in BHI, for 24 h, at 37°C; after that, they were cultivated and isolated in Todd Hewitt nutrient medium plus agar-agar and 10% defibrinated sheep blood and kept at 37°C, for 18 h. Serotyping of samples was conducted by Microvet and the data was compiled for comparison with the results. Genomic DNA was extracted from 3x106 _{cells, using DNAzol kit (Invitrogen®),} under the protocol proposed by the manufacturer, followed by PCR individually for each primer pair - dpr and aroA, using 200 µM dNTP, 3.4 mM MgCl2, 2 U of Taq DNA polymerase (Invitrogen®), 1.6x amplification buffer and 0.20 µM of the primers in a final volume of 25 µL. The annealing temperature was 59°C, for aroA gene, and 60°C, for dpr gene. The amplified fragments of genes were digested with 0.2 µL of the restriction enzymes Alu I, AflIII, EcoRI and MPS I, at 37°C, for 2 h. All products were analyzed by separation on 3% agarose gel. Eight in the forty samples analyzed showed polymorphisms in the dpr gene for cleavage site of Alu I enzyme, thus generating samples with two and three DNA fragments. Analysis with the other endonucleases does not show differences; besides, no cleavage has occurred in the fragment. All samples analyzed for the aroA gene were observed to be identical for the cleavage sites of the used enzymes. During the analysis of serotypes, 39 (97.5%) samples were identified as type 2 and one (2.5%) as type 3.

Discussion: The dpr gene showed different patterns between the assessed S. suis colonies, what indicates the existence of

polymorphisms in the restriction sites. These data partially corroborate those already reported in the literature, where the percentage of amino acid polymorphisms was 17.9% in the dpr gene. In this study, changes identified in the dpr gene are not conclusive; still, modifications in nucleotide bases of certain genes may be related to expressions of differential proteins, associated with pathogenicity and virulence of pathogens. Even with the use of antibiotics and hygienic-sanitary control measures, records of difficult-to-control outbreaks are constant in the swine populations from which the samples were isolated. The sample of serotype 3 was collected from healthy animal, whereas the serotype 2 samples were collected from sick animals. These factors reinforce the idea that alterations in genomes of bacteria may be establishing new mechanisms to escape, hence favoring the survival of pathogens.

Keywords: bacteria, genetic variability, swines, PCR. Descritores: bactéria, variabilidade genética, suínos, PCR.

INTRODUÇÃO

Streptococcus suis causa doenças como

pneu-monia, artrite, septicemia e meningite, resultando em sérios prejuízos econômicos para a suinocultura. Além disso, este patógeno pode causar grave infec-ção zoonótica e é considerado um risco profissional para trabalhadores de matadouro, frigoríficos e vete-rinários [3,8,22]. A maioria dos casos humanos de infecção por S. suis devem-se à exposição direta aos animais, principalmente no momento do abate e processamento da carne e do couro de animais con-taminados [3,28]. Atualmente há mais de 35 sorotipos de S. suis, sendo o sorotipo 2 o mais frequente, mais virulento, e esta relacionado aos casos em suínos e humanos [3,8,12]. Na China, em 2005, foram relata-dos 215 casos humanos de S. suis, com 18% de mor-te e predomínio do sorotipo 2, isolados principalmen-te, em agricultores e profissionais [26].

Os genes aroA e dpr parecem estarem asso-ciados ao aumento da patogenicidade do S. suis. O gene dpr é responsável por produzir uma proteína peroxidase resistente, defendendo-a de combinações de oxigênio tóxico e tornando-a resistente ao H₂O₂, prevenindo a formação de radicais hidroxi tóxicos na presença de Fe2+ _{[11,28]. Já o gene aroA está}

en-volvido com a síntese dos aminoácidos aromáticos e outros metabolitos essenciais para as bactérias, fun-gos e plantas [17] e tem apresentado rearranjos genômicos e perfil diferentes entre os microrganis-mos da mesma espécie. O gene aroA parece estar relacionado a proteínas de membrana que promove resistência a antibióticos [10,14] que ao longo dos anos tem sido relatadas com maior frequência [1].

Objetivou-se com este trabalho analisar a va-riabilidade genética em amostras de S. suis em uma população suína.

MATERIAIS E MÉTODOS Amostras

Foram utilizadas 40 amostras de S. suis cedi-das pelo Laboratório Microvet2_{, isoladas entre os anos}

de 1995 a 2003 em uma propriedade localizada no município de Ponte Nova na região do Vale do Piranga, na Zona da Mata de Minas Gerais.

Reativação e sorotipagem das amostras de Streptococcus suis

No Laboratório de Monitoramento Ambiental da Universidade Estadual de Santa Cruz, BA, amos-tras liofilizadas foram reativadas em meio BHI (cére-bro-coração¹) por 24 h a 37°C para multiplicação e, posteriormente, foram estriadas em meio Todd Hewitt acrescido de Ágar-ágar e 10% de sangue de carneiro desfibrinado e, foram mantidas por 18 horas a 37ºC para cultivo e isolamento das colônias. Os isolados foram armazenados e congelados em meio BHI e TSB (caseína-peptona¹) adicionados de 50% de glicerol e armazenadas a -20ºC.

A sorotipagem das amostras foi realizado pela Microvete os dados foram copilados para compara-ção com os resultados obtidos.

Extração de DNA e Reação em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA genômico foi extraído a partir de 3 x 106 _{células utilizando o kit DNAzol (Invitrogen®}³_),

conforme protocolo proposto pelo fabricante. A PCR foi realizada individualmente para cada par de primer utilizando 200 µM dNTP, 3,4 mM MgCl2, 2 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen®³_{), e 1,6x tampão}

de amplificação (fornecido pelo fabricante), em um volume final de 25 µL. Foram utilizados 0,20 µM de cada primer para os genes aroA: direto: (5’ TTCCATGTGCTTGAGTCGCTA 3’) e reverso: (5’ ACGTGACCTACCTCCGTTGAC 3’) e dpr: Direto: (5’ CGTCTTTCAGCCCGCGTCCA 3’) e reverso: (5’ GACCAAGTTCTGCCTGCAGC 3’) [11]. As condi-ções termocíclicas consistiram de uma desnaturação inicial a 95°C por 5 min, 35 ciclos de 1 min a 94°C, 2 min a 59ºC para gene aroA e 60°C para gene dpr e extensão final a 72°C por 10 min no termociclador PCRSprint (Bioagency®4_{). Todos os produtos da}

amplificação foram analisados por separação em gel de agarose 2%, seguidos de coloração com Brometo de etídio e fotodocumentados.

Digestão com enzimas de restrição

Os fragmentos amplificados dos genes foram digeridos com 0,2 µL das enzimas de restrição Alu I (5´-AG_{↓CT-3´; 3’-TC↑GA-5’) (Invitrogen®}3_{); AflIII}

(5´-N

G↓AATTC-3´; 3’CTTAA↑G-5’) e MPS I (5’-C↓CGG-3’; 3’-GGC↑C-5’) (Biolabs®5_{) a 37ºC por}

2 h. Todos os produtos da digestão foram analisados por separação em gel de agarose 3%, seguidos de coloração com brometo de etídio e fotodocumentados.

RESULTADOS

Os amplificados dos genes aroA e dpr apre-sentaram, aproximadamente, 370 e 340 pares de ba-ses, respectivamente. Das 40 amostras analisadas, oito (20%) apresentaram polimorfismos no gene dpr para

o sitio de clivagem da enzima Alu I, sendo gerados amostras com dois e com três fragmentos de DNA variando entre 100 e 300 pares de bases (Figura 1). A análise com as demais endonucleases não apre-sentam diferenças e não ocorreu clivagem no frag-mento. Todas as amostras analisadas para o gene aroA apresentaram-se idênticas para os sítios de clivagem das enzimas utilizadas. Na análise dos sotrotipos 39 (97,5%) das amostras foram identificadas como tipo 2 e uma (2,5%) como tipo 3 (Tabela 1).

Figura 1. Resolução em gel de agarose a 3% dos produtos da digestão com a enzima de restrição Alu I para o gene dpr em amplificados de S. suis: marcador de peso molecular 50pb DNA Ladder (1); controle negativo (2); padrão de duas bandas (3, 5, 6, 7 e 9); padrão de três bandas (4 e 8).

DISCUSSÃO

O gene dpr presente no Streptococcus suis está envolvido no mecanismo de oxidação do ferro, armazenando-o, protegendo a célula tornando-a re-sistente ao H₂O₂ [18,27]. Já as proteínas extra-celu-lares presentes na membrana da bactéria, principal-mente do sorotipo 2, geralprincipal-mente estão relacionadas com a virulência e à capacidade de invasão dos patógenos [2,5].

O gene dpr apresentou padrões de bandas diferentes entre as colônias de S. suis avaliadas, o

de restrição. Estes dados corroboram em parte com os encontrados por King et al. [11], onde a porcenta-gem de polimorfismos em aminoácidos foi de 17,9% no gene dpr.

As alterações identificadas no gene dpr neste estudo não são conclusivas, embora modificações em bases nucleotídicas de determinados genes podem estar relacionadas com expressões de proteínas dife-renciadas ligadas a patogenicidade e virulência dtes patógenos. Na população de suínos das quais es-tas amostras foram isoladas, são constantes os

regis-Amostras Sorotipo Gene Polimórfico* Órgãos Ano de isolamento 1 2 dpr Cérebro 1995 2 5 - Cérebro 1996 3 2 - Cérebro 1996 4 2 - Cérebro 1996 5 2 - Cérebro 1996 6 2 - Cérebro 1996 7 2 - Cérebro 1996 8 2 - Cérebro 1996 9 2 - Cérebro 1997 10 2 dpr Cérebro 1997 11 2 - Cérebro 1997 12 2 dpr Cérebro 1997 13 2 - Cérebro 1997 14 2 dpr Cérebro 1997 15 2 - Cérebro 1998 16 2 - Cérebro 1999 17 2 - Cérebro 1999 18 2 - Cérebro 1999 19 2 - Cérebro 1999 20 2 - Cérebro 1999 21 2 - Cérebro 2000 22 3 - Cérebro 2000 23 2 - Cérebro 2000 24 2 - Cérebro 2000 25 2 - Cérebro 2000 26 2 dpr Cérebro 2000 27 2 - Cérebro 2001 28 2 - Cérebro 2001 29 2 - Coração 2001 30 2 - Cérebro 2001 31 2 - Cérebro 2001 32 2 dpr Cérebro 2001 33 2 - Coração 2001 34 2 - Cérebro 2001 35 2 - Cérebro 2001 36 2 - Cérebro 2001 37 2 - Cérebro 2001 38 2 - Cérebro 2001 39 2 dpr Cérebro 2001 40 3 dpr Pulmão 2003

Tabela 1. Características das amostras de Streptococcus suis isoladas de suínos de uma propri-edade localizada no município de Ponte Nova na região do Vale do Piranga, na Zona da Mata de Minas Gerais-Brasil, durante o período de 1995-2003.

*Amostras polimórficas que apresentaram três fragmentos de DNA para o gene dpr quando analisadas com a enzima Alu I.

N

mo com emprego de antibióticos e medidas de con-trole higiênico-sanitário. A amostra do sorotipo 3 foi colhida em animal sadio enquanto que as do sorotipo 2 foram colhidas em animais doentes. Estes fatores reforçam a idéia de que alterações no genoma das bactérias podem estar criando novos mecanismos de escape e, favorecendo a sobrevivência dos patógenos no ambiente, porém Staats et al. [15] constataram que a maioria dos isolados do sorotipo 2 apresentam um único padrão de bandas, enquanto que cepas menos virulentas apresentam heterogeneidade genética.

A virulência das amostras de S. suis aprestam variação e existem heterogeneidade genética en-tre os sorotipos e, até mesmo, enen-tre amostras de um mesmo sorotipo distinguindo através de análise genômica [4]. Segundo Okwumabua et al. [15], a bactéria S. suis é uma espécie geneticamente diversa. Já foram encontrados perfis genéticos distintos para cepas do sorotipo 1 e 2, identificadas durante surtos da doença em populações suínas [13,21]. Outros au-tores utilizaram enzimas de restrição em amplificado do gene aroA e identificaram diferenças entre três sorotipos de Actinobacillus pleuropneumoniae [14]. Acredita-se que o fator EF não esteja diretamente re-lacionado à virulência, porém, desempenhe papel primordial na ativação de elementos importantes para tal [24].

A literatura registra que os fatores de virulên-cias gerados pelas proteínas capsulares MRP e EF podem variar de acordo com a especificidade do hos-pedeiro, podendo favorecer ou não a ação do patógeno em determinado hospedeiro, inclusive no homem [5]. Os mecanismos de virulência ainda são pou-co pou-conhecidos e, alguns sorotipos de S. suis podem

apresentar diferenças importantes de sobrevivência e patogenicidade de acordo com região geográfica onde ocorre o surto. Grande parte dos isolados de S.

suis de suínos doentes na França, Itália e na Espanha

pertencem ao sorotipo 2 [6,23]. No Canadá foi re-gistrado uma redução de 15 a 20% dos animais aco-metidos pelo sorotipo 2 [9]. Já na Europa, principal-mente na Bélgica e na Holanda o sorotipo 9 é o mais comum [19,20] e no Reino Unido os sorotipos 1 e 14 são os mais frequentes [25].

Os dados de sorotipagem identificados nes-te estudo estão acima dos encontrados por Pagnani

et al. [16] e Del’Arco et al. [7], onde o sorotipo 2 foi

responsável pelas causas de infecção em 60% dos casos registrados, principalmente, nas regiões Sul e Sudeste do país, as mais afetadas pelo S. suis.

Os polimorfismos encontrados no gene dpr nas colônias de Streptococcus suis avaliadas podem estar contribuindo para modificações na patogenicidade e resistência das bactérias, sendo ne-cessários novos estudos associando estas alterações a virulência e resistência das cepas.

NOTAS INFORMATIVAS ¹Merck, Darmstadt, Germany.

²Microbiologia Veterinária Especial LTDA, Viçosa, MG, Brasil.

³Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, EUA.

4_{Bioagency, São Paulo, SP, Brasil.} 5_{New England Biolabs Inc, Inglaterra.}

Agradecimentos. Ao Laboratório Microvet e a

Universi-dade Estadual de Santa Cruz, BA.

Declaration of interest. The authors report no conflicts of

interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper.

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