INVIABILIZAÇÃO DO METABOLISMO DE Zymomonas mobilis
POR GLUTARALDEÍDO PARA OBTENÇÃO DE SORBITOL E
ÁCIDO GLICÔNICO
A. B. FOLLE1, S. CARRA1, E. MALVESSI1 e M.M. SILVEIRA1
1 Universidade de Caxias do Sul, Laboratório de Bioprocessos, Caxias do Sul-RS
E-mail para contato: abfolle@ucs.br
RESUMO: A ação catalítica das enzimas periplasmáticas glicose-frutose oxidorredutase e glicono-δ-lactonase (GFOR/GL) é independente da viabilidade das células de Zymomonas mobilis. Para evitar-se que os substratos (frutose / glicose) da reação enzimática sejam metabolizados, é feita a inviabilização celular com o uso de detergente, levando à permeabilização da parede da bactéria e ao acúmulo dos produtos de interesse, sorbitol e ácido glicônico. No processo com células imobilizadas em alginato de cálcio, é feita a reticulação com glutaraldeído, substância conhecida pela sua ação biocida. Neste trabalho, avaliou-se a possibilidade de suprimir a etapa de permeabilização, com a inativação do metabolismo de Z. mobilis com glutaraldeído após exposição das células por 10 e 20 minutos. Todos os tratamentos avaliados mostraram inativação do crescimento microbiano por glutaraldeído. Embora não se tenham observado variações na atividade de GFOR/GL em decorrência do tratamento de inviabilização celular, a produtividade específica e, por consequência, a máxima velocidade de formação de produto para os tratamentos com glutaraldeído foram superiores às observadas com a inviabilização celular feita na forma convencional.
1. INTRODUÇÃO
As enzimas periplasmáticas glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glicono-δ-lactonase (GL), presentes em células da bactéria anaeróbia Gram-negativa produtora de etanol, Zymomonas mobilis, são capazes de converter quase totalmente uma solução equimolar de glicose e frutose em ácido glicônico e sorbitol, respectivamente. Entretanto, durante o processo de bioconversão, o ácido glicônico formado pode ser metabolizado pela via Entner-Doudoroff, reduzindo o rendimento em produto (ZACHARIOU e SCOPES, 1986; HARDMAN e SCOPES, 1988; VIIKARI et al., 1988). Como forma de contornar esta desvantagem, tem sido empregada a permeabilização celular com a finalidade de solubilizar os cofatores essenciais para a conversão a etanol.
Chun e Rogers (1988) propuseram o tratamento com tolueno 10% (v/v) como alternativa para a permeabilização da parede celular de Z. mobilis. Os autores relatam a obtenção de cerca de 95% de conversão de glicose e frutose em ácido glicônico e sorbitol, respectivamente, em 16h de reação, em
batelada com células livres. Para as células imobilizadas em alginato de cálcio obtiveram-se resultados semelhantes, com redução de aproximadamente 5% nos casos de reutilização das células. Segundo Rehr et al. (1991), a permeabilização celular de Z. mobilis com detergentes catiônicos não resultou em efeitos negativos sobre a ação do complexo GFOR/GL. O tratamento com brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) 0,1% (m/v), por 10 minutos, foi suficiente para interromper o metabolismo fermentativo das células, impedindo a formação de etanol e proporcionando altos rendimentos de ácido glicônico e sorbitol (98-99%). A produtividade específica atingida com o uso de células livres e tratadas com CTAB 0,1% foi de 1,8-2,1 g/g/h; entretanto valores inferiores foram obtidos com as células imobilizadas em k-carragena, de 1,4-1,8 g/g/h. Há relatos de outras propostas de permeabilização celular para Z. mobilis, como, por exemplo, a utilização de células secas de Z. mobilis para os ensaios de bioconversão de glicose e frutose a ácido glicônico e sorbitol. Com qualquer dos métodos descritos, as enzimas responsáveis pela conversão de glicose e/ou frutose a etanol têm sua ação impedida, entretanto GFOR/GL mantem-se ativas (ICHIKAWA et al., 1989).
Silveira et al. (1999) propuseram a utilização de altas concentrações iniciais de substrato (glicose e frutose) com forma de inibir o metabolismo fermentativo de Z. mobilis, sem a necessidade da permeabilização. Neste trabalho, os autores identificaram que a concentração inicial de 650 g/L dos substratos foi suficiente para inibir a conversão de ácido glicônico a etanol, resultando na concentração de aproximadamente 300 g/L de produto, com rendimento de 91% em 8 h de reação. A maior produtividade em formação de produto foi atingida na concentração inicial de 500 g/L, fato que pode estar associado a uma possível inibição da enzima quando na presença de altas concentrações iniciais de substrato.
Para a obtenção de ácido lactobiônico e sorbitol pelo sistema enzimático GFOR/GL de Z. mobilis, Carra (2012) destaca a permeabilização das células com CTAB 0,2% (m/v), seguido do tratamento com glutaraldeído e posterior imobilização em alginato de cálcio. Desta forma, ambos os tratamentos poderiam agir no sentido de promover a inviabilização celular, destacando, ainda, a característica biocida do glutaraldeído (LEUNG, 2001; LAOPAIBOON et al. 2003 apud SIMOES et al., 2011; PEREIRA et al., 2014). Assim, considerando-se a possibilidade de simplificação do processo, torna-se interessante a avaliação do tratamento prévio das células apenas com glutaraldeído
Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento com glutaraldeído em substituição à etapa de permeabilização com CTAB das células de Z. mobilis imobilizadas em alginato de cálcio para a produção de ácido glicônico e sorbitol.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 PRODUÇÃO DE CÉLULAS/ENZIMAS
O microrganismo utilizado foi Zymomonas mobilis ATCC 29191 (NRRL B-4492), adquirida do United States Departamento of Agriculture (USDA).
Os meios líquidos utilizados para conservação/ativação, obtenção do inóculo e para os ensaios em biorreator tiveram na sua composição (g/L): (NH4)2SO4, 2,0; MgSO4.7H2O, 1,0; KH2PO4, 3,5;
FeSO4.7H2O, 0,01; extrato de levedura bruto (Prodex Lac®, Prodesa S.A, Brasil), 7,5 (Malvessi et al.,
2006). Para o preparo do meio de ativação e conservação da cultura foram adicionados 20 g/L de glicose e o pH ajustado para 5,5. Na obtenção dos inóculos, a concentração de glicose utilizada foi de 100 g/L e o pH do meio controlado com a adição de CaCO3 na concentração de 5 g/L. O cultivo no reator foi realizado com 150 g/L de glicose. A esterilização de todos os meios, bem como da solução de glicose, foi realizada em autoclave, a 1 atm, por 20min.
A ativação de culturas foi realizada com a adição de 2 mL da suspensão bacteriana em estoque em tubos contendo 18 mL de meio de ativação e, posteriormente, incubados a 30°C por 12 horas. A preparação do inóculo foi realizada em frascos Duran contendo 405 mL do meio de cultura e 45 mL da cultura previamente ativada. O inóculo foi mantido sob agitação orbital de 200 rpm (Certomat U/H – B. Braun Biotech, RFA), em anaerobiose, a temperatura de 30°C, por 10 horas.
O cultivo para produção de biomassa e enzimas foi realizado em batelada, em fermentador de bancada de 7,0 L de volume total e 5,5 L de volume útil. O meio de cultivo foi inoculado com o volume necessário para obter-se uma suspensão celular de 20 unidades de absorbância a 560 nm. A temperatura foi mantida a 30°C e o pH foi controlado em 5,5 pela adição de NaOH 5 mol/L. No decorrer da primeira hora do cultivo, nitrogênio gasoso foi borbulhado no meio a fim de garantir a anaerobiose. Ao término do cultivo, o meio fermentado foi recolhido e centrifugado (Centrífuga Sigma 4K-15), a 6000 rpm (5836 x g), por 10 minutos. Posteriormente as células foram ressuspensas em água destilada à concentração 25 g/L para o tratamento com CTAB e 50 g/L para o glutaraldeído.
2.2 INVIABILIZAÇÃO CELULAR
Para avaliar a inviabilização celular, inicialmente as células de Z. mobilis foram tratadas de duas formas: i) a suspensão celular concentrada em 25 g/L foi submetida a permeabilização com 0,2% (m/v) de CTAB, a 4°C, por 15 minutos; ii) a suspensão celular concentrada a 50 g/L foi tratada com glutaraldeído 0,5 % (m/v), em temperatura ambiente, por 10 e 20 minutos.
Para a verificação da eficiência dos métodos de inativação celular, foram realizados cultivos em que meios líquidos, contendo 100 g/L de glicose, foram inoculados com suspensões celulares previamente tratados com CTAB ou glutaraldeído, de forma a terem-se concentrações celulares de 0,5 g/L. O pH foi controlado com a adição de 5 g/L de CaCO3. O ensaio foi conduzido em frascos
anaeróbios, sob agitação orbital de 200 rpm (Certomat U/H – B. Braun Biotech, RFA), a 30°C, por 20 horas. Em paralelo, conduziu-se o ensaio com células não tratadas. A influência dos tratamentos sobre o consumo de substrato foi avaliada estatisticamente por análise de variância de um fator (one way Anova).
2.3 IMOBILIZAÇÃO CELULAR
Para o encapsulamento de Z. mobilis em alginato de cálcio, foi utilizada a metodologia descrita por Carra (2012). Primeiramente, alginato de sódio (Degussa Flavors & Fruit Systems) foi dissolvido em água (4% m/v) e mantido sob agitação por 12 horas à temperatura ambiente. Posteriormente, à solução de alginato de sódio, foi adicionado igual volume de suspensão de células
de Z. mobilis, previamente tratada na concentração de 70 g/L. A mistura foi novamente mantida sob agitação, por 2 horas, para homogeneização. A formação das esferas de alginato de cálcio contendo células imobilizadas foi conduzida por meio do gotejamento da mistura de alginato de sódio e de suspensão de células em solução de CaCl2 0,3 mol/L, através de agulhas hipodérmicas, com auxílio
de uma bomba peristáltica. Posteriormente à imobilização, as esferas foram reticuladas com glutaraldeído 0,5% (m/v), sob agitação, à temperatura ambiente, por 10 minutos, e utilizadas para ensaios de bioconversão em batelada (CARRA, 2012).
2.4 ENSAIOS DE BIOCONVERSÃO DE GLICOSE E FRUTOSE
Os ensaios de bioconversão foram realizados em reatores de 200 mL, contendo 100 mL de solução de glicose/frutose (0,7 mol/L). O reator foi mantido em banho termostatizado, à temperatura de 39°C, sob agitação magnética, com pH controlado em 6,4 pela adição automática de solução de NaOH na concentração 7 mol/L. A concentração celular do biocatalisador imobilizado foi de 20 g/L (CARRA, 2012; MALVESSI et al., 2006).
2.5 MÉTODOS ANALÍTICOS
A concentração celular foi determinada indiretamente pela medida da absorbância de suspensões celulares, a 560 nm, e diretamente por gravimetria.
A determinação da concentração de açúcares redutores (AR) foi realizada pelo método do ácido 3,5-di-nitro-salicílico – DNS (MILLER, 1959).
As concentrações de produtos formados, sorbitol e ácido glicônico, foram estimadas indiretamente em função do volume e da concentração da solução de NaOH utilizada para titular o ácido formado na reação e/ou diretamente por cromatografia em fase líquida (CARRA, 2012).
A determinação da atividade enzimática foi realizada conforme descrito nos ensaios de bioconversão, com células livres na concentração de 4 g/L e pH controlado em 6,4, pela adição de NaOH 1 mol/L. Uma unidade de GFOR/GL (U) foi definida como a quantidade de enzimas capaz de formar 1 mmol de ácido glicônico por hora, nas condições do teste, sendo a atividade expressa em unidades por grama de células secas (U/g).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Figura 1, são apresentados os resultados do consumo de substrato após de 20 horas de cultivo para as células isentas de tratamento e posterior tratamento com CTAB e com glutaraldeído.
Com as células não tratadas (branco), foi possível observar o completo consumo de substrato em 20 horas de cultivo, o que comprova a viabilidade celular. Para as células tratadas com CTAB por 15 minutos, no mesmo período de cultivo, observou-se limitação no metabolismo, uma vez que o consumo de substrato foi significativamente reduzido, reafirmando, assim, a eficiência deste método de permeabilização celular na inviabilização da bactéria. Resultados similares foram obtidos para o tratamento com glutaraldeído, indicando, da mesma forma, a eficácia deste tratamento.
Comparando-se os resultados do consumo de substrato por microrganismos Comparando-sem tratamento com aqueles observados com os três tratamentos de inviabilização, é possível afirmar, com 95% de confiança, que há diferença significativa no que tange ao consumo de substrato. Confirmando estes resultados, observou-se também o aumento da concentração das células isentas de tratamento, que aumentou de 0,5 para 3,3 g/L. Salienta-se que as limitações no consumo de substrato e no crescimento se deveram ao tratamento a que células foram submetidas, uma vez que as condições de cultivo foram propícias ao pleno desenvolvimento celular.
Figura 1 – Percentual de consumo de substrato por células de Zymomonas mobilis não tratadas e posterior ao tratamento com brometo de cetil trimetil amônio e glutaraldeído, após 20 h de incubação em condições de cultivo. Branco, células não tratadas; CTAB 15, tratadas com brometo de cetil trimetil amônio por 15 minutos; GLUT 10, GLUT 20, tratadas com glutaraldeído por 10 e 20 minutos, respectivamente.
Na sequência, avaliou-se a influência dos tratamentos na atividade de GFOR/GL. Nesta análise, foi acrescido o tratamento com CTAB por 20 minutos (CTAB 20) para avaliar-se o efeito do tempo de contato entre as células e o detergente sobre a atividade enzimática. Como mostrado na Figura 2, a ação catalítica não foi afetada pelo tipo de tratamento. Este comportamento corrobora os resultados de Chun e Rogers (1988) e Rehr et al. (1991), que relatam a manutenção da atividade das enzimas GFOR/GL após a inviabilização do metabolismo fermentativo de Z. mobilis. A atividade na condição CTAB 20 foi superior em 30% às das células submetidas aos outros tratamentos. Este aumento pode estar relacionado ao maior tempo de contato com o agente de permeabilização, que promove a abertura de poros na parede celular, que teria facilitado contato enzima / substrato.
Figura 2 – Atividade das enzimas GFOR/GL presente em células de Zymomonas mobilis tratadas com brometo de cetil trimetil amônio e glutaraldeído.
C on su m o d e s u b st ra to ( % ) A tivi d a d e G FO R /G L ( U/ g )
Os ensaios de bioconversão de glicose e frutose em ácido glicônico e sorbitol, respectivamente, foram realizados com o intuito de avaliar a capacidade catalítica do complexo enzimático imobilizado em alginato de cálcio, após os diferentes tratamentos, por longos períodos de reação. Na Tabela 1, estão apresentados os resultados gerais dos ensaios de bioconversão com as células de Z. mobilis submetidas aos diferentes tratamentos.
Tabela 1 – Resultados gerais dos ensaios de bioconversão com células de Zymomonas mobilis submetidas a diferentes tratamentos para inviabilização celular e imobilizadas em alginato de cálcio (Substrato inicial: Glicose 700 mmol/L e frutose 700 mmol/L, pH 6,4; temperatura 39°C; 20 g/L de biocatalisador)
CTAB 15 CTAB 20 GLUT 10 GLUT 20
t (h) 10 10 6,2 6,0 Pmax (mmol/L) 530 541 604 602 Sf (mmol/L) 77 35 42 35 ρ (%) 82 83 94 94 p (mmol/L/h) 53 54,1 94,4 100 q (mmol/g/h) 2,6 2,7 4,9 5,0 µp,máx. (mmol/g/h) 4,5 5,0 10,4 10,6
t, tempo de processo, Pmax, concentração máxima de produto (ácido glicônico ou sorbitol); Sf, concentração de glicose residual; ρ, rendimento em produto; p, produtividade; q, produtividade específica; μp,máx, máxima velocidade específica de formação de produto.
Observa-se que com a utilização dos tratamentos apenas com glutaraldeído, visando à inviabilização celular, foram atingidos valores superiores em termos de conversão de substrato em produto em comparação com o procedimento padrão (CTAB 15). A produtividade específica média de 5 mmol/g/h foi obtida nestes tratamentos, em aproximadamente 6 horas de processo, no entanto, a produtividade específica média para os tratamentos CTAB 15 e CTAB 20 foi de 2,7 mmol/g/h para 10 horas de processo. A produtividade específica das células tratadas apenas com glutaraldeído foi similar aos resultados de Malvessi et al. (2001), que obteve 5,2 mmol/g/h para as células de Z. mobilis tratadas com CTAB e imobilizadas em alginato de cálcio.
Na Figura 3, é mostrada a variação da concentração de produtos com o tempo nos diferentes ensaios. Destaque-se que o perfil observado para a formação de produto com células permeabilizadas com 0,2% (m/v) de CTAB por 15 minutos (CTAB 15) condizem com os resultados apresentados por Malvessi et al. (2010), nas mesmas condições de processo. Como pode ser observado na Figura 3, as velocidades de formação de produtos após tratamento apenas com glutaraldeído são superiores àquelas com células permeabilizadas com CTAB. No caso, é possível sugerir que estes resultados tenham decorrido da combinação das formas de tratamento e de imobilização, visto que, como mostrado na Figura 2, as atividades enzimáticas após os diferentes tratamentos de inviabilização celular foram semelhantes. Como consequência, as máximas velocidades de formação de produto (µp,max) para tratamentos GLUT 10 e GLUT 20 foram praticamente o dobro das observadas na
Figura 3 - Concentração de produtos (ácido glicônico ou sorbitol) em função do tempo, em ensaios de bioconversão com células de Zymomonas mobilis submetidas aos diferentes tratamentos para inviabilização celular e imobilizadas em alginato de cálcio (Substrato inicial: Glicose 700 mmol/L e frutose 700 mmol/L, pH 6,4; 20 g/L de biocatalisador). (■) CTAB 15; (∆) CTAB 20; (○) GLUT 10; (▲) GLUT 20.
4. CONCLUSÃO
Os resultados demonstram que o tratamento das células de Z. mobilis com glutaraldeído, independentemente do tempo de exposição, leva à inviabilização do crescimento microbiano e do consumo de substrato sem influenciar na atividade catalítica de GFOR/GL. Nos ensaios de bioconversão, destaca-se o incremento na velocidade específica de formação de produto para as células imobilizadas em alginato de cálcio e tratadas apenas com glutaraldeído, que resulta em maior produtividade específica para o processo de bioconversão.
Com o intuito de buscar a aplicação industrial deste processo, a sua simplificação se torna essencial, uma vez que resulta também na redução de custos operacionais. Desta forma, a supressão da etapa de permeabilização além de ser vantajosa tecnicamente é atrativa economicamente.
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