CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ANÁLISE DA CAFEÍNA EM BEBIDAS POR HPLC

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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ANÁLISE DA CAFEÍNA EM BEBIDAS POR HPLC

1 - OBJECTIVO

Pretende-se ilustrar a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (H.P.L.C.) aplicando-a na determinação de cafeína em algumas bebidas.

2 - INTRODUÇÃO

Tem-se verificado um grande incremento nos métodos de cromatografia liquida, tendo-se vulgarizado a utilização de aparelhos para realização de cromatografia líquida de alta eficiência cuja constituição básica pode ser representada esquematicamente como se apresenta na figura 1. A abreviatura H.P.L.C. deriva da designação inglesa High Performance Liquid Chromatography.

Nesta técnica o eluente é alimentado através de uma (ou mais) bomba(s), que assegura(m) a passagem de um caudal controlado do eluente ao longo dos diversos componentes do sistema cromatográfico.

Figura 1 - Representação esquemática de um cromatógrafo líquido para HPLC. Neste caso o

sistema poderá funcionar com um gradiante binário (a baixa pressão) da composição do

eluente.

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Figura 2 - Representação esquemática da válvula de injecção e do processo de introdução de amostras na coluna de HPLC.

(A) Introdução da amostra no loop da válvula, (B) Introdução da amostra na coluna.

Se os solutos tiverem alguma afinidade pela fase estacionária da coluna, ao longo desta vão-se estabelecer sucessivos equilíbrios de distribuição dos solutos entre a fase móvel (o eluente) e a estacionária.

Se as constantes de distribuição para os diversos solutos forem suficientemente diferentes, estes irão deslocar-se ao longo da coluna a velocidades diferentes, saindo da coluna separados uns dos outros.

Em seguida os componentes da amostra passam a um detector, que neste trabalho consiste num espectrofotómetro de UV/Vis com uma célula de fluxo especialmente desenhada para permitir a medida da absorvância da solução que nela passa sem que se dê alargamento significativo da zona de líquido onde está cada um dos solutos.

Um registador ou sistema de aquisição de dados, que está ligado ao detector, permite obter

automaticamente o sinal enviado por este o qual, em primeira aproximação, é proporcional à concentração

do componente na solução que passa nesse instante através da célula do detector. A representação gráfica

do sinal enviado pelo detector em função do tempo que decorreu desde a injecção da amostra na coluna

constitui o que se designa por cromatograma da amostra. Sendo conhecido o caudal de eluente, se

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Figura 3 - Cromatograma como representação gráfica do sinal registado pelo detector (proporcional à concentração dos solutos) em função do tempo.

As colunas de enchimento utilizadas em HPLC são vulgarmente de aço inoxidável e contêm um enchimento com partículas de diâmetro entre 3 e 20 mm. Como regra geral, quanto mais pequenas são as partículas do enchimento, mais eficientes são as colunas. No entanto quanto mais pequenas são as partículas, maior é a perda de pressão do líquido no seu movimento ao longo da coluna e menor é o caudal de eluente para a mesma pressão aplicada pela bomba. Como há limitações instrumentais à utilização de pressões muito elevadas, normalmente quanto menor for o diâmetro das partículas do enchimento, menor é também o comprimento da coluna que se utiliza. As colunas analíticas usuais têm de 3 a 30 cm de comprimento e de 2 a 5 mm de diâmetro interno.

Como consequência do empacotamento das partículas de pequena dimensão no interior da coluna, são necessárias pressões elevadas para forçar o eluente ao longo da coluna, sendo usual utilizarem-se pressões entre 80 e 120 bar. A bomba tem de manter um caudal de eluente constante, sem oscilações de pressão ou caudal e tem de ser construída com material compatível com uma larga gama de solventes. Embora se possam utilizar pressões de 400-500 bar, não é aconselhável o uso em rotina de pressões tão elevadas.

Os solventes utilizados em HPLC têm se ser muito puros e não podem conter resíduos sólidos. Devem

ser desgaseificados antes da sua utilização, pois a formação de bolhas de gás no sistema cromatográfico

pode causar variações de pressão no interior do sistema e/ou perturbações mais ou menos graves no sinal do

detector. A desgaseificação pode fazer-se submetendo o eluente a pressões reduzidas e/ou ultra-sons, ou por

deslocamento dos gases dissolvidos com hélio (este é o sistema indicado na figura 1). No aparelho

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A cafeína é um alcaloide e uma purina. É um produto estimulante e diurético conhecido pela sua existência no café, no chá, em diversas bebidas, nomeadamente da família das colas e em produtos farmacêuticos. O seu doseamento por este método é bastante rápido e de aplicação simples, sendo o HPLC o método normalmente utilizado com esta finalidade. A maior ou menor facilidade na análise depende da complexidade da amostra, pois podem existir outros componentes da amostra com tempos de retenção

próximos do da cafeína.

3 - PARTE EXPERIMENTAL 3.1 - Aparelhagem

O cromatógrafo tem os seguintes componentes principais:

· Reservatório de eluente(s)

· Bomba e unidade de desgaseificação (Jasco PU-2089 Plus)

· Válvula de injecção (Rheodyne – 7725i)

· Pré-coluna

· Coluna de 125 ´ 4 mm (Merck, Lichrosphere 100 RP-18, partículas de 5 mm)

· Detector de ultravioleta (Jasco UV-2070 Plus)

· Sistema de acquisição de dados através de um computador e software adequado (Borwing Chromatography Software).

3.2 – Reagentes, etc.

Cafeína; metanol para cromatografia; ácido perclórico (solução 1:99); água destilada; filtros para

injecção de amostra de 0.2 mm de malha (ex. ANATOP 10 ou 25).

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NOTA: Boa parte destas soluções já estarão preparadas, mas deverão ser anotados os detalhes associados à preparação de cada uma.

Preparar as seguintes soluções em balões volumétricos, pesando rigorosamente os sólidos:

- solução de cafeína 1 (0.02 g em 1000 mL) - solução de cafeína 2 (0.015 g em 500 mL) - solução de cafeína 3 (0.02 g em 500 mL) - solução de cafeína 4 (0.025 g em 500 mL) - solução de cafeína 5 (0.03 g em 500 mL) - solução de cafeína 6 (0.035 g em 500 mL)

Amostras para a determinação da quantidade de cafeína:

- Coca-cola com cafeína - Coca-cola sem cafeína

- Ice Tea Lipton (pêssego, manga ou outra) - Chá Verde Lipton

- Red Bull

- Chá preto (de embalagem já preparado).

Todas as amostras que contenham gases dissolvidos devem ser desgaseificadas em vácuo à trompa.

Só quando não contiverem gases dissolvidos é que poderão ser introduzidas no injector do cromatógrafo.

Para algumas bebidas é necessário fazer uma diluição prévia da amostra:

Red Bull - pipetar 15,0 mL da bebida para um balão volumétrico de 100 mL e prefazer o volume até ao traço com água destilada.

Chá verde e Coca Cola com cafeína: pipetar 25,0 mL da bebida para um balão volumétrico de 50 mL e prefazer o volume até ao traço com água destilada.

Preparar o eluente a utilizar misturando 400 mL de metanol (grau HPLC) com 600 mL de uma solução aquosa contendo de ácido perclórico (1:99). Filtrar o eluente com a montagem apropriada para esse efeito.

3.4 - Condições experimentais

Caudal de eluente: entre 1.0 e 1.3 mL/min, desde que a pressão seja inferior a 110-120 bar.

Comprimento de onda de detecção: l = 225 nm,

Tempo de aquisição de cada cromatograma: ~10 minutos; na maior parte dos casos a aquisição do cromatograma pode ser interrompida antes dos 10 min. Por exemplo para os padrões de cafeína 1 a 6 deverá bastar 5 minutos.

3.5 - Técnica

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nos tubos da válvula, tendo o cuidado de não introduzir ar quando pressiona o êmbolo da seringa. Não retirar a seringa após a 2ª introdução de solução a analisar,

c) Para introduzir a amostra na coluna rodar a válvula de injecção da posição de load para a posição de inject. Simultaneamente iniciar o registo do cromatograma no sistema de aquisição de dados (com o injector Rheodyne 7725i o accionamento do programa de aquisição do cromatograma inicia-se automaticamente com a passagem para inject). Pode em seguida retirar a seringa da válvula. Para cada solução de padrão ou de amostra será gerado um ficheiro no sistema de aquisição de dados.

d) Com a válvula em posição de load, faça passar cerca de 1 mL de água destilada por duas vezes nos tubos da válvula, para lavar esses tubos antes de introduzir nova solução padrão ou amostra.

Proceder à injecção dos padrões de cafeína 1 a 6 (nesta ordem). Para a análise das amostras, repita a) a d). As amostras devem ser injectadas na válvula através de um filtro especial (em forma de disco), que lhe será fornecido pelo professor.

Para cada ficheiro de solução de padrão ou de amostra deverá verificar-se se a integração da área dos picos da cafeína está a ser feita correctamente. Se for necessário deve recalcular-se a integração das bandas de forma adequada, procedendo ao reprocessamento do cromatograma com o software Borwing.

Deve verificar se a recta de calibração tem a forma adequada e se as áreas das bandas da cafeína obtidas para as amostras são tais que a determinação da concentração de cafeína pode ser feita por interpolação com os valores disponíveis para os padrões (excepto para a Coca-Cola sem cafeína). Se isso não suceder deverá: ou preparar e injectar novos padrões de cafeína de forma a que a quantificação possa ser feita correctamente, ou proceder á diluição da amostra e injectá-la no cromatógrafo.

4 - Cálculos

1) Trace a recta de calibração para a cafeína: áreas das bandas (A

cafeína

) em função da concentração da cafeína no padrão respectivo.

2) Calcule a(s) concentração(ões) de cafeína na(s) amostra(s) que analisou. Tome atenção para verificar se as áreas das bandas determinadas estão compatíveis com o aspecto dos picos correspondentes.

Determinar os teores de cafeína nas amostras.

3) Determine o número de pratos da coluna (N) e a altura equivalente a um prato (H), tomando um ou mais

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4) Preencher a folha de resultados.

5 – Questionário ( não é para apresentar )

1) Qual a vantagem em utilizar uma coluna de fase reversa do tipo da LiChrosphere 100 RP-18 na análise efectuada? Qual o mecanismo de separação neste tipo de cromatografia?

2) Comente a separação obtida e a ordem de aparecimento dos componentes.

3) Como poderia ser melhorada a separação da cafeína de outros componentes, nos casos em que o factor de resolução é inferior a 1,5? Quais as vantagens e desvantagens que encontra nesse novo procedimento?

6 - BIBLIOGRAFIA

Qualquer livro de Química Analítica relativamente recente dos existentes na biblioteca do DEQB tem capítulos de cromatografia e de HPLC. Por exemplo:

1) S. Lindsay, High Performance Liquid Chromatography, ed. ACOL, John Wiley & Sons, Chichester, 1987.

2) G.W. Ewing, Instrumental Methods of Chemical Analysis, McGraw-Hill Book Co., New York, 5ª ed., 1985, p.375.

3) D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman, Principles of Instrumental Analysis, Saunders Coll. Publ., 5ª ed., Saunders College Publ., Philadelphia, 1998, capítulo de HPLC.

4) D.A. Skoog, D.M. West e F. J. Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, 6ª ed., Saunders Co. Publ., Fort Worth, 1992, capítulo de HPLC.

5) D.C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, W.H. Freeman and Co., New York, 6ª ed., 2003, capítulo de HPLC.

5) H. Willard, L.L. Merrit, Jr., J.A. Dean e F.A. Settle, Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth Publ.

Co., Belmont, 1988, p. 580.

Na biblioteca do DEQB está disponível a revista LC-GC Europe, que tem diversos artigos com

interesse em HPLC de carácter didáctico.

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Dia da semana (da turma) QUARTA Data //

Nomes ______________________ Números

______________________

Grupo nº __________

Características da coluna utilizada

Comprimento cm Diâmetro interno ___ mm

Marca e refª ________ Fase estacionária

Parâmetros de operação

Caudal ________ mL min

^-1

Pressão média _____ bar Temperatura _ ºC Comprimento de onda __ mm

Eficiência da coluna (para um ou mais dos cromatogramas):

Cafeína _ Tempo de retenção _ Largura de banda _____

Número de pratos _____ HETP : _ mm

Cafeína _ Tempo de retenção _ Largura de banda _____

Número de pratos _____ HETP : _ mm

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Resultados para os padrões de cafeína

Padrões Concentrações Áreas Observações

(g/L)

Cafeína 1 _ _

Cafeína 2 _ _

Cafeína 3 _ _

Cafeína 4 _ _

Cafeína 5 _ _

Cafeína 6 _ _

Anexar a curva de calibração e cromatogramas.

Amostras ensaiadas

Amostra Área da Banda Concentração de cafeína Observações na amostra injectada