Keila de Assis Vitorino
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FíSICO-QUÍMICA PARCIAL DE
UMA FOSFOLIPASE A
2BÁSICA DO VENENO DE Bothrops moojeni
DO PARAGUAI
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FíSICO-QUÍMICA
PARCIAL DE UMA FOSFOLIPASE A
2BÁSICA DO VENENO DE
Bothrops moojeni DO PARAGUAI
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Biomedicina da Faculdade São Lucas, para obtenção do grau de Bacharelado da Faculdade São Lucas.
Orientador: Dr. Andreimar Martins Soares
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FíSICO-QUÍMICA PARCIAL DE UMA FOSFOLIPASE A2 BÁSICA DO VENENO DE Bothrops moojeni DO
PARAGUAI
Monografia apresentada ao Curso de Graduação em Biomedicina da Faculdade São Lucas, para obtenção do grau de
Bacharelado da Faculdade São Lucas.
Aprovado (a): de Dezembro de 2015
Aos meus pais, Saulo e Ceir, pela confiança, pelo apoio e pelo exemplo que sempre me deram. Vocês são meu alicerce e minha maior riqueza.
Aos meus irmãos, Katieli e Faelbe, pela paciência e por fazer parte da construção do ser humano que sou hoje.
Aos meus colegas e amigos, principalmente a Rafaela, Micheli, Nauanny e Weusley, esses quatro anos foram mais alegres graças a vocês, torço muito pelo vosso sucesso.
A Caio Calixto, obrigada por acreditar em mim mais do que eu mesma e pelo carinho de sempre.
Meu orientador, Dr. Andreimar Soares, agradeço pelo conhecimento passado, apoio e confiança.
Ao Ms. Jorge Alfonso, não tenho palavras para agradecer sua paciência e a dedicação em me ajudar em cada etapa desse trabalho.
significativamente para o avanço das Ciências em Saúde, devido ao seu grande potencial biotecnológico. Essas enzimas estão envolvidas numa grande variedade de processos fisiopatológicos e de intoxicação. As fosfolipases A2 (PLA2) são as proteínas com maior prevalência nos venenos ofídicos e induzem diversos efeitos farmacológicos, como ação miotóxica, inibição da agregação plaquetária e efeito bactericida e antiparasitário. Esse trabalho descreve o isolamento e
caracterização de uma PLA2 básica Lys49 isolada do veneno de Bothrops moojeni, oriunda do
Paraguai, por meio de duas etapas: uma Cromatografia de Troca Catiônica em coluna CM-Sepharose, que demonstrou 14 frações, e posteriormente uma Cromatografia de Fase Reversa em
coluna C-18 da fração 13. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida a PLA2
apresentou alto grau de pureza com massa molecular de aproximadamente 14 kDa. A proteína foi dosada pelo método de Bradford, tendo a concentração de 0,67 mg/mL. A espectrometria de massa
em MALDI apresentou dois picos, sendo que a PLA2 apresentou massa molecular de 13.687,67 Da e
uma isoforma de 14.048,73 Da. É importante isolar e caracterizar biomoléculas de diferentes espécies de serpentes, de diferentes regiões, e posteriormente usá-las como protótipo em ensaios experimentais para verificar seu potencial farmacológico e as diferenças que o habitat pode causar.
Purification and characterization of snake venom of biomolecules have contributed significantly to the advancement of health sciences, because of its great potential biotechnology. These enzymes are
involved in a variety of pathophysiological processes and intoxications. Phospholipases A2 (PLA2) are
proteins with higher prevalence in snake venoms and induce various pharmacological effects, such as myotoxic action, platelet aggregation inhibition and antibacterial and antiparasitic effect. This work
describes the isolation and characterization of a PLA2 basic Lys49 isolated from the venom of
Bothrops moojeni, originating in Paraguay, by means of two chromatographic steps: a cationic
exchange chromatography on CM-Sepharose column, which showed 14 fractions, and a reverse phase chromatography on C-18 column of fraction 13. When subjected to polyacrylamide gel
electrophoresis PLA2 showed a high degree of purity with a molecular mass of approximately 14 kDa.
Protein was measured by the Bradford method, with the concentration of 0.67 mg / ml. The MALDI
mass spectrometry showed two peaks, in which PLA2 appear with molecular mass of 13687.67 Da
and 14048.73 isoform Da. Is important to isolate and characterize biomolecules of different snake species in different regions and subsequently use them as a prototype in experimental tests to verify its pharmacological potential and differences that the habitat can cause.
Gráfico 1 - Relação dos acidentes ofídicos no Brasil causados pela família
Viperidae 10
Gráfico 2 - Relação dos acidentes ofídicos no Paraguai causados pelos
principais gêneros de serpentes encontradas no país 11
Figura 1 - Bothrops moojeni 13 Figura 2 - Especificidade de hidrólise de uma molécula de
1,2-diacilglicerolfosfolipídeo pelas fosfolipases 14
Figura 3 - Representação do sítio de ligação ao cálcio de uma PLA2 Asp49 e a
região homóloga de uma PLA2 Lys49 16
Figura 4 - Cromatografia de Troca Catiônica do veneno bruto de Bothrops moojeni 25 Figura 5 - Eletroforese das frações da cromatografia de troca catiônica do
veneno de Bothrops moojeni 27
Figura 6 - Cromatografia de Fase Reversa da fração F13 oriunda de
cromatografia de troca catiônica 28
Figura 7 - Gel de poliacrilamida SDS-PAGE da PLA2 oriunda de cromatografia
de fase reversa 29
INTRODUÇÃO ... 9
1.1 SERPENTES PEÇONHENTAS ... 10
1.2 ACIDENTES OFÍDICOS... 10
1.3 GÊNERO Bothrops ... 12
1.4 Bothrops moojeni ... 12
1.5 COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES ... 13
1.6 FOSFOLIPASE A2 ... 14
1.7 FOSFOLIPASES A2 DE VENENOS DE SERPENTES ... 15
1.8 FOSFOLIPASE A2 LYS49 ... 17
1.9 RELEVÂNCIA DOS ESTUDOS DE VENENOS DE SERPENTES ... 18
2 OBJETIVOS ... 20
2.1 GERAL ... 20
2.2 ESPECÍFICOS ... 20
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 21
3.1 OBTENÇÃO DO VENENO ... 21
3.2 CROMATOGRAFIA DE TROCA CATIÔNICA ... 21
3.3 DOSAGEM DE PROTEÍNA PELO MÉTODO DE BRADFORD ... 21
3.4 ELETROFORESE SDS-PAGE ... 22
3.5 CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA...22
3.6 ESPECTROMETRIA DE MASSA ... ..23
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 24
INTRODUÇÃO
Estão catalogadas cerca de 2.900 espécies de serpentes no mundo, que são agrupadas em 465 gêneros e 20 famílias. O Brasil possui representantes em 9 famílias, 75 gêneros e 321 espécies (SILVA e SPERANDIN, 2005). Enquanto no Paraguai existem 100 espécies de serpentes, sendo 10 venenosas (VERA, et al., 2006).
Duas famílias são consideradas peçonhentas, Viperidae e Elapidae, sendo a primeira com maior especialização no aparelho venenífero, tendo um sistema de produção e estocagem bastante complexo (CUNHA e MARTINS, 2012).
A família Viperidae é composta pelos gêneros Bothrops, Bothriopsis,
Bothrocophias, Crotalus e Lachesis (BERNARDE, 2009). As serpentes do gênero
Bothrops, também conhecidas como jararacas, estão divididas em mais de 30
1.1 SERPENTES PEÇONHENTAS
As serpentes são répteis vertebrados e carnívoros, que podem ser classificadas em dois grupos: peçonhentas, que conseguem inocular veneno no corpo de sua presa e não peçonhentas (FIOCRUZ, 2009).
As serpentes peçonhentas possuem glândulas de veneno desenvolvidas associadas ao aparelho inoculador, que tem como função matar e digerir suas presas (BERNARDE, 2009).
1.2 ACIDENTES OFÍDICOS
Os acidentes ofídicos possuem grande importância médica, devido sua gravidade e frequência. Acontece em todas as regiões do Brasil cerca de 20.000 casos de acidentes por ano, sendo um problema de saúde pública se não tratado com sorologia precocemente (BRASIL, 2010).
Do ponto de vista epidemiológico de acidentes ofídicos, o gênero Bothrops é o mais importante, correspondendo a 87,5% dos casos de envenenamento no Brasil, como mostra a Figura 1 (BRASIL, 2007). No Paraguai acontecem aproximadamente 400 acidentes com serpentes peçonhentas por ano, sendo 92% causados pelo gênero Bothrops (Figura 2) (VERA et al., 2006).
Gráfico 1: Relação dos acidentes ofídicos no Brasil causados pela família Viperidae.
Gráfico 2: Relação dos acidentes ofídicos no Paraguai causados pelos principais gêneros de
serpentes encontradas no país.
Fonte: Adaptado de VERA et al., 2006.
O veneno dessas serpentes manifesta ações proteolíticas, com edema, bolhas e necrose, ações coagulantes, que podem causar incoagulabilidade sanguínea, e ações hemorrágicas (BRASIL, 2010). As manifestações locais da picada por serpentes do gênero Bothrops são dor e edema de instalação precoce e de rápida progressão, equimoses, sangramentos e bolhas, que podem estar acompanhadas de necrose. Além disso, pode-se observar manifestações sistêmicas, como gengivorragias, epistaxes, hematêmese e hematúria. Hipotensão arterial, choque, oligoanúria ou hemorragias intensas definem o caso como grave (FUNASA, 2011).
O tratamento utilizado é a soroterapia com antiveneno específico. Quando o antiveneno é administrado precocemente os efeitos sistêmicos são normalmente revertidos, entretanto os efeitos locais são dificilmente neutralizados, podendo evoluir para necrose com subsequente perda do membro afetado (GUTIÉRREZ et al., 2007). Algumas moléculas presentes em plantas medicinais possuem propriedades inibitórias para esses efeitos locais, como o ácido aristolóquico (papo-de-peru), ácido rosmariníco (erva-baleeira) e ácido cafeico (assa-peixe) (BICUDO, 2015). Da Silva e colaboradores (2007) isolaram saponinas de Pentaclethra
Hypericum brasiliense demonstram atividade inibitória sobre toxinas do veneno de
serpentes (SOARES et al., 2005).
1.3 GÊNERO Bothrops
O nome Bothrops, que vem do grego “bothros”, fosseta e “ops” que significa olho ou face, faz alusão à fosseta loreal, localizada entre a narina e o olho dessas serpentes (CAMPBELL e LAMAR, 2004). O interesse científico pelas serpentes do gênero Bothrops vem aumentando nos estudos de Herpetofauna da América Latina, pois são os maiores causadores de acidentes ofídicos (CAMPBELL e LAMAR, 1989).
Os representantes do gênero mostram uma grande diversidade no tamanho, variando entre 30 a 180 cm. Habitam com maior frequência ambientes terrícolas, mas também podem demonstrar hábitos semi-arborícula (BERNARDE, 2009). Quanto à alimentação, os exemplares juvenis preferencialmente se alimentam de centípedes, lagartos e anfíbios, enquanto os adultos escolhem aves e roedores (CAMPBELL e LAMAR, 2004). Essas serpentes possuem bastante diversidade na composição e atividade do veneno, que pode ter implicação na soroterapia de tratamento, na sua produção e em estudos evolutivos das toxinas e de taxonomia (SANTORO et al., 2009).
1.4 Bothrops moojeni
Figura 1: Bothrops moojeni.
Fonte: BERNARDE, 2009.
A distribuição geográfica abrange Argentina, Paraguai e Brasil, ocorrendo nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Mato Grosso, Goiás, Bahia, Tocantins, Piauí e Maranhão (CAMPBELL e LAMAR, 2004). Essa serpente é responsável por grande parte dos acidentes ofídicos, sendo relatada como a mais frequente em um estudo feito por Rojas e colaboradores (2007).
1.5 COMPOSIÇÃO DOS VENENOS DE SERPENTES
Venenos são secreções produzidas em glândulas especiais que quando em contato com um organismo causa efeitos deletérios e/ou letais. São usados em mecanismos de defesa e ataque, para imobilização, morte das presas e digestão (PIRES, 2006).
Os venenos de serpentes são compostos por misturas complexas de proteínas (70 a 90%), carboidratos (10 a 30%) e pequenas proporções de lipídeos, aminas biogênicas, nucleotídeos, peptídeos e componentes inorgânicos (MOURA-DA-SILVA et al., 1990). Dentre eles, os venenos botrópicos são capazes de alterar drasticamente a homeostasia pela ação de algumas enzimas como fosfolipase A2
PLA2), metaloproteases e serinoproteases. Além dessas toxinas, ainda possuem
Teixeira (2009) descreve três principais atividades fisiopatológicas do veneno botrópico: 1) Atividade Inflamatória Aguda, causada pela ação de proteases, hialuronidases e fosfolipases; 2) Atividade sobre a Coagulação decorrente da ativação de fator X e protrombina; e 3) Atividade Hemorrágica, atribuída as metaloproteases.
Mesmo os acidentes ofídicos podendo ser mortais, os venenos ofídicos possuem grande potencial terapêutico e são usados numa grande variedade de condições patológicas em medicina popular. Com o avanço das pesquisas nesse campo, já foram comprovadas a eficácia de tais tratamentos (KOH et al., 2006).
1.6 FOSFOLIPASE A2
As fosfolipases são enzimas que degradam fosfolipídeos, classificadas em A1,
A2, B, C e D de acordo com a ligação hidrolisada no fosfolipídeo, como mostrado na
figura 2. As PLA2 catalisam a hidrólise da ligação 2 acil éster de 3-sn-fosfolipídeos,
liberando ácidos graxos e lisofosfolipídeos (DENNIS e SIX, 2000).
Figura 2: Especificidade de hidrólise de uma molécula de 1,2-diacilglicerolfosfolipídeo pelas
fosfolipases.
Além do seu papel no metabolismo de lipídeos estão intensamente ligadas à liberação de AA (ácido araquidônico), percursor de prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos que atuam na regulação do sono, resposta imune, inflamatória e percepção de dor (ARNI e WARD, 1996). Estas enzimas estão envolvidas com uma ampla variedade de processos fisiológicos e patológicos, o que explica o elevado interesse médico-científico.
Segundo Schaloske e Dennis (2006), essa família de proteínas é composta por 15 grupos e seus subgrupos, incluindo cinco tipos distintos: PLA2s secretadas
(sPLA2), PLA2 citosólicas (cPLA2), independentes de Ca2+ (iPLA2), acetil-hidrolases
de fatores de plaquetas (PAF-AH) e lisossomais. As sPLA2 possuem Mr variando
entre 13.000 e 18.000 Da, normalmente contendo de 5 a 8 pontes dissulfeto. São enzimas que em seu sítio ativo apresentam uma histidina e requerem presença do íon Ca2+ para catálise.
1.7 FOSFOLIPASES A2 DE VENENOS DE SERPENTES
As PLA2s de veneno de serpentes (svPLA2) estão classificadas nos grupos I e
II. As PLA2 do grupo I estão presentes nos venenos das serpentes da família
Elapidae, enquanto que as PLA2 do grupo II encontram-se nos venenos dos
Viperídeos (OWNBY et al., 1999). Embora ambos os grupos possuam estruturas altamente conservadas, como idêntica maquinaria catalítica e a presença de sete pontes dissulfeto, é possível identificar características individuais específicas, como a presença de um loop elapídico, formado por dois a três aminoácidos inseridos na região 52-65, no caso das PLA2 do grupo I e uma extensão de cinco a sete
aminoácidos na região C-terminal presente no grupo II (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011). Outra diferença importante consiste na posição de uma das sete pontes dissulfeto, pois nas PLA2 dos Elapídeos observa-se uma ponte dissulfeto nas
posições Cys11-Cys77, por outro lado, nos venenos dos Viperídeos, observa-se uma ponte dissulfeto na região Cys51-Cys133 (BURKE e DENNIS, 2011).
As PLA2 do grupo II são divididas em subgrupos, onde dois se destacam:
PLA2 Asp49, com um resíduo de ácido aspártico na posição 49, o que concede a
posição 49, causando baixa ou nenhuma atividade catalítica sobre substratos artificiais, mas com uma ampla variedade de efeitos farmacológicos nos organismos vivos (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011).
A catálise da reação PLA2-fosfolipídeo envolve o ataque nucleofílico de uma
molécula de água na ligação sn-2 do substrado fosfolipídico. O próton na posição 3 do anel imidazólico do resíduo His48 envolvido com o grupo carboxilato do Asp99, impede que ocorra rotação do anel imidazólico e mantém o nitrogênio na posição 1. Uma molécula de água promove então o ataque nucleofílico ao carbono do grupo éster do substrato e o anel imidazólico da His48 recebe um próton da molécula de água, facilitando a reação. Este próton é doado pelo anel imidazólico para o oxigênio, que forma o grupo álcool do lisofosfolipídeo a ser liberado juntamente com o ácido graxo. O íon Ca2+, coordenado pelo resíduo Asp49, uma molécula de água e os átomos de oxigênio dos resíduos Gly30, Trp31 e Gly32 são responsáveis pela estabilização do intermediário reativo, funcionando como um cofator (MACKESSY, 2010).
A substituição de um resíduo de Asp49 por Lys49 impede a coordenação de Ca+2 no sítio alostérico, que é então ocupado pela cadeia lateral da lisina, inativando o sítio catalítico e impossibilitando a reação enzimática (Figura 3) (ARNI e WARD, 1996).
Figura 3: Representação do sítio de ligação ao cálcio de uma PLA2 Asp49 e a região homóloga
de uma PLA2 Lys49.
Apesar de as PLA2 Lys 49 e Asp 29 serem as mais conhecidas e estudadas,
Polgár e colaboradores (1996) descreveram atividade enzimática significativa em PLA2 com outros aminoácidos na posição 49, com o aspartato substituído por serina
e a tirosina substituída por fenilalanina.
Embora não seja descrita atividade enzimática das isoformas Lys49, as fosfolipases A2 Lys49 apresentam uma grande variedade de efeitos farmacológicos,
como miotoxicidade, atividade anticoagulante e edematogênica (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011).
1.8 FOSFOLIPASE A2 Lys49
As PLA2s Lys49 são proteínas não glicosiladas contendo 121 resíduos de
aminoácidos e massa molecular aproximada de 14 kDa (LOMONTE e GUTIÉRREZ, 2011). Uma característica bem específica do grupo de PLA2s Lys49 é a presença de
um grande número de resíduos básicos, sendo que a lisina compreende 15% dos resíduos totais. A região C terminal é bastante rica em lisina, incluindo duas sequências de ligação a heparina, o que explicaria sua sensibilidade à neutralização pela heparina (OWNBY et al., 1999).
É sugerido que a região C terminal seja responsável por diversos efeitos farmacológicos. Peptídeos sintéticos formados pelas regiões 115 a 129, correspondente a região C-terminal da miotoxina II de B. asper, pode induzir citotoxicidade e a mesma região da miotoxina AppK49 de A. piscivorus foi capaz de induzir mionecrose em ratos (LOMONTE et al., 1994). Foi proposto por Gutiérrez e Lomonte (1995) que resíduos de aminoácidos de cadeia lateral com propriedades básicas e apolares presentes na região hidrofóbica da extremidade C-terminal são relevantes para induzir danos na membrana.
Acredita-se que as PLA2s Lys49 são enzimaticamente inativas devido à
inversão da ligação peptídica Cys29-Gly30 e sua incapacidade estereoquímica em vincular o cofator íon cálcio e assim estabilizar o intermediário tetraédrico, que é observado na reação catalítica promovida por PLA2 Asp49. Alguns estudos tentaram
substituições que podem contribuir para a perda da atividade enzimática das PLA2,
como a substituição do resíduo Tyr28, que estabiliza o loop ligante de cálcio por uma interação com o resíduo de Gly35 (FERNANDES et al., 2010).
A primeira atividade tóxica relatada para PLA2 Lys49 foi a capacidade da
mesma em induzir mionecrose local em roedores, quando injetados por via intramuscular (OWNBY et al., 1999). Além desta, outras atividades foram descritos como: (i) efeitos biológicos relacionados a desestabilização de membranas, tais como destruição de lipossomos, atividade microbicida, citotóxica, antitumoral, mitogênica e de bloqueio neuromuscular; (ii) efeitos relacionados as respostas inflamatórias, desencadeada como resultado de necrose muscular e edema; (iii) e efeitos pela interação com outras moléculas, como lipopolissacarídeo bacteriano, heparina e fator Xa, levando a inibição de sua bioatividade (LOMONTE e RANGEL, 2012).
É bastante comum encontrar isoformas de PLA2s em uma mesma espécie,
sendo dificultosa a separação das mesmas, porque possuem massa molecular, ponto isoelétrico e sequência primária muito semelhantes (GUTIÉRREZ e LOMONTE, 1995). Por exemplo, mais de dez isoformas de PLA2s foram relatadas
para as espécies Naja naja, Daboia (Vipera russellii), Trimeresurus flavoviridis,
Austrelaps superbus e Pseudechis australis (MACKESSY, 2010).
Ketelhut e colaboradores (2003) isolaram da peçonha de B. jararacussu quatro isoformas de PLA2 ácidas. Duas isoformas de PLA2 foram purificadas do
veneno de B. insularis por Cogo e colaboradores (2006). Além disso, foi relatado o isolamento de duas variantes de PLA2 Lys49 do veneno de B. moojeni, comprovando
essa variabilidade também no gênero Bothrops (PERCHUC et al., 2010).
1.9 RELEVÂNCIA DOS ESTUDOS DE VENENOS DE SERPENTES
A purificação de componentes do veneno de serpentes serve a dois objetivos principais: entender a participação desses componentes no processo fisiopatológico do envenenamento e como protótipo de modelos com aplicações biotecnológicos. Por esses motivos, diversas PLA2s têm sido isoladas e caracterizadas (CALDERON,
É bastante discutida a relação entre dieta e a composição do veneno em Toxinologia e Herpetologia, alguns desses estudos apontam também outros fatores relacionados com essa variação, como nicho ecológico, diferentes tipos de presas, sexos dos indivíduos, ontogenia, habitat, distribuição geográfica e fatores sazonais, como temperatura e precipitação (SOUSA et al., 2013; LOMONTE et al., 2014). Considerando tais estudos, pode existir diferenças entre as PLA2s isoladas do
veneno das mesmas espécies, que habitam lugares distintos.
A biodiversidade oferece uma variedade de moléculas que podem possuir potencial aplicável em biotecnologia e ter utilidade na produção de novos fármacos (CALDERON et al., 2009). Um exemplo de grande sucesso na indústria farmacêutica é o Captopril, um anti-hipertensivo baseado no peptídeo potencializador de bradicinina do veneno de B. jararaca (CALDERON et al., 2010). A Eptibatida, encontrada no veneno da cascavel Sistrurus miliarius barbouri e o Tirofiban, isolado a partir da peçonha da víbora Echis carinatus agem no receptor GPIIb/IIIa, evitando agregação plaquetária e formação de trombos (HARVEY, 2014). Novos produtos baseados nas toxinas de serpentes têm sido elaborados, baseados no potencial antitumoral das lectinas e desintreginas e possível inibição de agentes bacterianos e protozoários (KOH et al., 2006).
Muitas PLA2 revelam atividade antimicrobiana. Páramo e colaboradores
(1998) relataram atividade bactericida de PLA2 Lys49 e Asp49 isoladas do veneno
de B. asper sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas. MjTX-II, encontrada na peçonha de B. moojeni apresentou ação contra E. coli e C. albicans, além de atividade antiparasitária sobre Schistosoma mansoni e Leishmania ssp. (STÁBELI et al., 2006). Rodrigues e colaboradores (2004) relataram efeitos antibacterianos de outra PLA2, oriunda do veneno de B. neuwiedi pauloensis, esta demonstrou ação
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
Realizar o isolamento e a caracterização físico-química preliminar de uma fosfolipase A2 básica do veneno de Bothrops moojeni do Paraguai.
2.2 ESPECÍFICOS
Isolar uma fosfolipase básica do veneno de Bothrops moojeni proveniente do Paraguai;
Determinar concentração de proteínas das frações obtidas a partir do primeiro passo cromatográfico;
Determinar a massa molecular aparente da fosfolipase purificada mediante SDS-PAGE;
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 OBTENÇÃO DO VENENO
Veneno oriundo de serpentes do biotério da Universidad Católica Nuestra Señora de la Asunción-Departamento de Medicina do Paraguai e armezenado a 4ºC no Centro Para el Desarrollo de la Investigación Científica (CEDIC), no mesmo país. Posteriormente foi transportado e mantido refrigerado (-20º C) no Banco de Venenos Amazônicos do Centro de Estudo de Biomoléculas Aplicadas a Saúde (CEBio-FIOCRUZ-RO).
3.2 CROMATOGRAFIA DE TROCA CATIÔNICA
Aproximadamente 35 mg de veneno bruto foi solubilizado em 1 mL de tampão Bicarbonato de Amônia (NH4HCO3 – AMBIC, 0,05M, pH 8,0), sendo
centrifugado a 2000xg durante 5 minutos para retirada do material insolúvel. O veneno foi submetido a uma cromatografia líquida em FPLC, usando coluna CM- Sepharose (1x 30cm), cuja matriz é composta de agarose e o grupo funcional de Carboximetil, previamente equilibrada com solvente A (Bicarbonato de Amônia 0,05 M, pH 8,0) e eluída sob gradiente de 0 a 100% com Solvente B (Bicarbonato de Amônia 0,5 M pH 8,0) em cinco volumes de coluna, sob o fluxo de 1mL/minuto em sistema de cromatografia Akta purifier (GE). A eluição das frações foi monitorada em 280 nm e coletadas individualmente, sendo posteriormente identificadas, liofilizadas e armazenadas a -20º C.
3.3 DOSAGEM DE PROTEÍNA PELO MÉTODO DE BRADFORD
µL de amostra de cada fração ou PBS, para diluir em 995 µL de reagente Bradford e realizar a leitura. Esse procedimento também foi realizado com a proteína isolada.
3.4 ELETROFORESE SDS-PAGE
Conforme descrito por Laemmli (1970), a eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% (m/v) foi realizada em condições redutoras, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS) e em sistema descontínuo de pH. As frações obtidas após cromatografia foram solubilizadas em água deionizada e misturadas na razão 1:1 (v/v) com tampão de amostra (SDS 4%, Azul de Bromofenol 0,2%, Glicerol 20% e Tris 100 mM pH 6,8). A mistura foi aquecida em 75ºC por 15 minutos e aplicadas no gel.
Ao término da separação o gel foi lavado com água deionizada para retirar o excesso de SDS. Em seguida o gel foi fixado em solução aquosa de etanol 40% (v/v) e ácido acético 7% (v/v) por 30 minutos. As bandas de proteínas foram evidenciadas através da imersão e leve agitação em solução contendo Coomassie Brillant Blue G-250® 0,08% (m/v), sulfato de alumínio 8% (m/v), ácido fosfórico 1,6% (m/v) e metanol 20% (v/v) pelo período de uma hora. O excesso de corante foi retirado em solução descorante contendo etanol 20% e ácido acético 3% (v/v) em água. Esta solução foi trocada várias vezes até a obtenção de coloração adequada.
A imagem dos géis foi obtida com o equipamento Image scaner (GEHelthcare
Lifesc.) e a massa molecular relativa (Mr) determinada com o uso do programa IQTL
(GE Helthcare Lifesc.), comparando-se as distâncias relativas de migração das amostras e dos padrões de massa molecular.
3.5 CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
identificadas, liofilizadas e armazenadas em -20º C. A fração de interesse cromatográfico foi submetida a eletroforese para analisar seu grau de purificação.
3.6 ESPECTROMETRIA DE MASSA
A Espectrometria de Massa foi realizada em equipamento MALDI (ionização e dessorção a laser assistida por matriz) com analisadores TOF (AXIMA TOF2
Shimadzu Biotech), operando em modo linear, utilizando ácido sinapínico como
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A seleção do método cromatográfico empregado deve considerar as características físico-químicas e/ou biológicas e funcionais da proteína em questão. Para isso deve-se observar os resultados e as metodologias descritas (MACKESSY, 2010).
Calgarotto e colaboradores (2008) purificaram uma PLA2 básica Asp49 do
veneno de B. moojeni, utilizando somente um passo cromatográfico em coluna de fase reversa M-Bondapak C18, que foi nomeada como BmTX-I. Enquanto Queiroz e colaboradores (2011) isolaram uma PLA2 homóloga, a qual chamaram BmooMtx,
com a combinação de uma cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-Sephacel e cromatografia de gel filtração em Sephadex G-75.
A BthTX-II, uma PLA2 Asp 49 do veneno de B. jararacussu foi purificada por
dois métodos cromatográficos combinados, cromatografia de gel filtração e troca iônica (SANTOS et al., 2010).
Um método bastante aplicado é o descrito por Soares e colaboradores (1998) e empregado por Soares e colaboradores (2000), utilizando coluna CM-Sepharose, onde isolaram uma PLA2 Lys49 do veneno de B. moojeni, denominada MjTX-I.
Figura 4: Cromatografia de Troca Catiônica do veneno bruto de Bothrops moojeni.
Perfil cromatográfico do veneno de B. moojeni (35 mg) em coluna CM-Sepharose. A coluna foi equilibrada com tampão AMBIC 0,05 M, pH 8,0 e eluída com gradiente de concentração de 0-100% de tampão AMBIC 0,5 M, pH 8,0. Fluxo constante de 1 mL/minuto. A absorbância foi monitorada a 280 nm. As 14 frações cromatográficas foram coletadas, liofilizados e submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida a 12,5% em condições redutoras. A seta indica a fração com a proteína de interesse.
A cromatografia de troca catiônica funciona por interações eletrostáticas entre os íons da fase móvel e da fase estacionária. A fase estacionária é revestida por cátions, resina de CM-Sheparose, com grupamento carboximetil, e a fase móvel representada pelo Tampão AMBIC pH 8,0 sendo possível separar moléculas com pequenas diferenças nas suas propriedades de carga (LOUGH e WAINER, 1995). Considerando o ponto isoelétrico da proteína de interesse e o gradiente crescente do AMBIC, as proteínas ligadas a resina tendem a se desprender da coluna, devido ao aumento da força iônica produzida pelo tampão B e as proteínas básicas, como a PLA2 Lys49 acabam eluindo nas últimas frações.
F2 e F6, sendo que a fração F13 apresentou 9,26 mg/mL de proteína e a F12 2,36 mg/mL (Tabela 1).
Tabela 1 - Dosagem de Proteínas pelo método de Bradford das frações F1 a F14 da
Cromatografia de Troca Catiônica.
Fração Concentração (mg/mL) F1 0 F2 27,02 F3 4,62 F4 0 F5 7,8 F6 28,65 F7 0 F8 6,2 F9 0 F10 0,74 F11 0 F12 2,36 F13 9,26 F14 0
As frações colhidas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, onde se pode observar a massa molecular aparente das proteínas presentas nas diversas frações obtidas a partir do primeiro passo cromatográfico. Nas frações 2 e 3 é possível distinguir bandas pertencentes a proteínas com pI (ponto isoelétrico) ácido, de massa molecular próxima a 14 kDa, provavelmente PLA2s ácidas e
lectinas. Por outro lado, as frações 12 e 13 que são frações com características básicas, apresentaram bandas principais com massa molecar aproximada a 14 kDa. A fração 13 foi escolhida por apresentar maior grau de purificação e concentração de proteínas que a fração 12 (Figura 5 e Tabela 1).
analisar a proteína na forma nativa ou dissociada, nesse primeiro não há alteração na conformação e as proteínas são separadas de acordo com sua carga (GAO et al., 2003). Já o sistema de dissociação, descrito por Laemmli (1970), utiliza SDS como agente desnaturante. Nestas condições o detergente interage com as proteínas, carregando-as negativamente e permitindo que elas migrem pelo gel de poliacrilamida em direção a um eletrodo positivo, dessa forma são separadas de acordo com suas massas molares.
Figura 5: Eletroforese das frações da cromatografia de troca catiônica do veneno de Bothrops
moojeni.
Eletroforese a 12,5 % das 14 frações cromatográficas liofilizadas, oriundas da cromatografia de troca catiônica (Figura 4). MM: Padrão de Massa Molecular; linha 1, F1; linha 2, F2; linha 4, F4; linha 5, F5; linha 6, F6; linha 7, F7; linha 8. F8; linha 9, F9; linha 10, F10; linha 11, F11; linha 12, F12; linha 13, F13 e linha 14, F14. Na linha 13, destacada em vermelho, podemos observar uma banda com massa molecular de aproximadamente 14 kDa.
A fração 13 passou por uma segunda etapa, a Cromatografia de Fase Reversa em Coluna C18, caracterizada pela alta capacidade resolutiva. Neste tipo de cromatografia a fase móvel é mais polar do que a fase estacionária, sendo assim o mecanismo para separação acontece por meio da interação hidrofóbica entre os grupamentos da resina e as regiões hidrofóbicas superficiais das proteínas. As moléculas de natureza apolar são retidas por mais tempo e as polares são eluídas nas primeiras frações (LOUGH e WAINER, 1995).
resolução de picos cromatográficos, separando moléculas por pequenas diferenças de hidrofobicidade (MACKESSY, 2010).
Figura 6: Cromatografia de Fase Reversa da fração F13 oriunda de cromatografia de troca
catiônica.
Cromatografia de Fase Reversa da Fração 13, proveniente da cromatografia de troca catiônica (Figura 4). Cromatografia realizada em coluna Discovery (C18 25 x 0,45 cm), previamente equilibrada com TFA 0,1% (Solvente A) e eluída com Acetonitrila 99% + TFA 0,1% (Solvente B) em gradiente 0-100%, sob fluxo constante de 1mL/minuto. A eluição foi monitorada em 280 nm. O pico principal, indicado com uma seta, foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5 % em condições redutoras (Figura 7).
A Cromatografia de Fase Reversa apresentou um pico central no gradiente de 40% de acetronitrila e 30 minutos de corrida (Figura 6). Esse pico foi submetido a eletroforese, que mostrou uma única banda, com massa molecular de aproximadamente 14kDa (Figura 7). A fração foi dosada pelo método de Bradford, obtendo-se 0,67 mg/mL de proteína.
Para confirmar a purificação e a massa molecular dessa PLA2, a mesma foi
Figura 7: Gel de poliacrilamida SDS-PAGE da PLA2 oriunda de cromatografia de fase reversa.
Eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% da fração principal obtida na cromatografia de fase reversa (Figura 6). Na linha 1 pode-se observar uma proteína com alto grau de pureza com
massa molecular aparente de 14 kDa, compatível com PLA2 e na linha 2 vemos o padrão de
massa molecular (MM). A amostra foi submetida a espectrometria de massa em MALDI TOF para determinação de massa molecular exata e confirmação de purificação (Figura 8).
Figura 8: Espectrometria de Massa da PLA2 parcialmente purificada.
Espectro de massa MALDI –TOF da proteína de interesse, demonstrando o valor de m/z de
13.688,68 na forma mono protonada e de 6.827,81 na forma duplamente protonada, obtendo-se assim o valor de massa molecular de 13.687, 67 Da. Observa-se também uma isoforma de 14.048,73 Da. Foi utilizada como matriz ionizante uma solução saturada de ácido sinapinico em acetonitrila que foi homogeneizada com a amostra em uma proporção de 3:1 (matriz/proteína), sendo colocada para cristalizar em placa de MALDI em temperatura ambiente para posterior introdução na câmara a vácuo e análise em modo linear.
Moura e colaboradores (2014) isolaram três fosfolipases A2 básicas com a
cromatografia de fase reversa do veneno de B. mattogrossensis. Considerando que as três fosfolipases identificadas são provenientes da mesma fração da cromatografia de troca catiônica, comprova-se a presença de numerosas isoformas de fosfolipases do veneno de serpentes.
Observando os resultados de Soares e colaboradores (1998 e 2000), podemos classificar essa proteína como uma PLA2 Lys49, pois foi utilizada a mesma
metodologia, com o veneno da mesma espécie de serpente e os resultados foram semelhantes.
5 CONCLUSÃO
Utilizando-se duas etapas de purificação, cromatografia de troca catiônica e cromatografia de fase reversa, foi possível isolar parcialmente uma fosfolipase A2
básica Lys49 do veneno da serpente Bothrops moojeni oriunda do Paraguai. A proteína apresentou massa molecular de 13.687,67 Da e concentração de 0,67 mg/mL quando dosada.
Observou-se no espectrofotômetro de massa outro pico de massa molecular de 14.048,73, que indicam a presença de duas PLA2sbásicasna mesma peçonha,
sugerindo heterozigose na expressão dessas isoenzimas.
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