Introdução
Introdução
A
c r i p t o c o c o s e é u m a d o e n ç a c a u s a d a p o rCryptococcus neoformans, uma
levedura capsulada, encontrada no meio ambiente em detritos de origem vegetal e animal, como excretas de pombos e outras aves. Os propágulos do
microrganismo dispersos no ar são inalados, alcançam os pul-mões, e a levedura apresenta tendência em invadir o sistema nervoso central (1). Atinge o
Diagnóstico Laboratorial da Criptococose
Reginaldo dos Santos Pedroso1, Regina Celia Candido21 – Farmacêutico-Bioquímico, Mestre em Ciências Farmacêuticas, área Análises Clínicas, FCFRP/USP
2 – Professora Associada do Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Artigo
A criptococose é micose oportunista causada por
Cryptococcus neoformans, levedura capsulada, que
aco-mete principalmente indivíduos imunocomprometidos. O diagnóstico é feito através do exame direto, cultura, sorologia, histopatologia e, atualmente, são descritas técnicas moleculares. O exame direto com tinta da Chi-na demonstra leveduras capsuladas, arredondadas ou ovais, com tamanho e espessura de cápsula variáveis. As amostras biológicas são diversas, como líquor, urina, lavado broncoalveolar, raspados de lesões cutâneas e fragmentos de tecidos. O isolamento da levedura em cultura é feito em meios isentos de ciclo-heximida, incubados a 30-32ºC. A identificação definitiva é feita mediante provas morfológicas, produção de urease e fenol-oxidase em meios diferenciais (L-dopa, sementes de girassol ou alpiste), assimilação de fontes de carbono e de nitrogênio. O diagnóstico sorológico se baseia na detecção de antígeno polissacarídico no soro ou líquor, mediante técnica de aglutinação com partículas de látex. A demonstração de C. neoformans em tecido é facilitada pela coloração de mucicarmim ou alcian blue. O diagnóstico através de técnicas moleculares tem apresentado resultados satisfatórios.
Palavras-chave: Cryptococcus neoformans,
criptoco-cose, diagnóstico laboratorial.
Resumo
Summary
Lab diagnosis of Cryptococcosis
Cryptococcosis is a fungal disease caused by the encapsu-lated yeast Cryptococcus neoformans, that is responsible for life-treatening infections, particularly in immunocompro-mised patients. The diagnosis of cryptococcosis is made by direct examination of pathologic specimens, culturing clinical samples, serological and molecular techniques. By using India Ink for the direct microscopic examination of clinical samples, it is possible to detect spherical and ovoid encapsulated yeasts in CSF, urine, bronchoalveolar washes, scrapings of cutaneous lesions and even sections of infected tissues. The primary isolation of C. neoformans must be done with mycological media that do not contain cyclo-heximide and which must be incubated at 30-32ºC. A definite identification is determined by morphology, urease and phenol-oxidase production, and the sugar and nitrogen assimilation profile. The serologycal diagnosis is based on detection of the polysaccharidic antigen in serum or CSF by the agglutination of antibody-coated latex particles. The identification of C. neoformans in tissues is easier when it is possible to stain for the presence of the capsule with mucicarmine or alcyan blue. Diagnosis by molecular techniques has presented good results.
Keywords: Cryptococcus neoformans, cryptococcosis,
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homem e animais, inclusive domésticos, como cães e gatos (2). A incidência da doença aumentou a partir da década de 1980, com a expansão da AIDS e a maior sobrevivência de pacientes no estado imuno-comprometido (3).
Morfologicamente,
Cryptococ-cus neoformans é uma levedura
arredondada, ovalada ou elip-sóide, geralmente envolta por cápsula de mucopolissacarídeo. São conhecidas duas variedades da espécie, C. neoformans var.
neoformans, que compreende
os sorotipos A, D e AD, C.
neoformans var. gattii, com os
sorotipos B e C. A fase sexuada do fungo o coloca entre os basid-iomicetos, gênero Filobasidiella, com a espécie F. neoformans e as variedades neoformans e
bacillispora, respectivamente
correspondendo aos sorotipos A , D e AD, B e C (1).
Ecologia e epidemiologia
O principal reservatório de
C. neoformans var. neoformans
são excretas de aves, principal-mente pombos (Columba livia). A var. gattii teve seu primeiro reservatório descrito em 1991, relacionado a Eucaliptus
camal-dulensis, na Austrália, mas já
foi descrito em outras espécies de vegetais em várias partes do mundo, como oiti, cássia,
fícus, amendoeiras, inclusive no Brasil (4, 5, 6).
Em pacientes com AIDS, a criptococose muitas vezes é a primeira indicação da doença. Quase todos os casos de crip-tococose nestes pacientes são devido a C. neoformans var.
neoformans, sorotipo A, mesmo
em áreas onde a variedade gattii é endêmica (3). Aproximada-mente 5-6% dos indivíduos com AIDS desenvolvem infecções por
C. neoformans (7).
Em pacientes imunocompe-tentes, a variedade gattii pre-domina em regiões tropicais, inclusive no Brasil. Nas regiões subtropicais, sul do Brasil, Ar-gentina e sul da Austrália, a variedade neoformans parece ser prevalente (8). No Brasil predomina a variedade
neofor-mans sorotipo A, seguido pela
variedade gattii, sorotipo B, em menor freqüência (9).
Manifestações clínicas
As manifestações clínicas geralmente são relacionadas ao sistema nervoso central, com quadro de meningoencefalite subaguda ou crônica. Os sinto-mas são febre e cefaléia e mais raramente alteração do nível de consciência (3).
A infecção pulmonar pode passar despercebida, ou apre-sentar manifestações discretas
compatíveis com quadro gripal. Em imunocomprometidos pode ocorrer disseminação sistêmica. O acometimento geniturinário, envolvendo pielonefrite é raro, sendo que a cultura de urina específica pode ser importante nesse caso, inclusive em casos de criptococcemia. A próstata também pode ser atingida, sendo uma possível fonte de recidivas em pacientes imuno-comprometidos (10, 11).
Outras manifestações relata-das na literatura são hepatite, sinusite, lesões em diversos órgãos e tecidos, como pele, olhos, esôfago, boca, estômago, intestino, trato genital feminino e ossos (1).
Diagnóstico de laboratório
O diagnóstico laboratorial da criptococose pode ser feito a partir de uma grande variedade de materiais clínicos: líquor, urina, fragmentos de tecido, aspirados de lesões cutâneas, escarro e demais amostras do trato respiratório, entre outras. São realizados exame direto, cultura, histológicos e sorologia. Técnicas moleculares também podem ser utilizadas, porém ainda apresentam aplicação res-trita no diagnóstico clínico (3).
Exame direto
leve-duras arredondadas ou ovais, geralmente apresentando bro-tamento único, envoltas por cápsula polissacarídica, que é evidente quando analisadas em preparações com tinta da China ou nigrosina (12).
As amostras de escarro e outras purulentas podem ser tratadas com KOH a 10% a fim de eliminar a maioria das células do hospedeiro e outros artefatos que poderiam ser confundidos com C. neoformans. O líquor e a urina devem ser centrifuga-dos e o sedimento examinado com tinta da China. Amostras recentes são preferidas, pois
a presença de polimorfonucle-ares em amostras estocadas por 24 horas em refrigeradores pode mimetizar a presença de cápsula, confundindo o analista menos experiente.
Cultura
As amostras clínicas são semeadas em ágar Sabouraud e em outro meio diferencial que pode ser ágar semente de Niger (alpiste), semente de girassol, ágar dopamina, ágar L-dopa ou ágar batata cenoura (13). Nestes meios, a enzima fenol-oxidase produzida pelo micror-ganismo age sobre os substratos
ácido caféico ou compostos di ou polifenólicos, produzindo melanina, através de uma rea-ção de oxidarea-ção, resultando numa coloração amarronzada ou preta das colônias (1). Estes meios não devem conter mais que 0,1% de glicose em suas composições, pois altas concen-trações de glicose inibem ou difi-cultam a formação de pigmentos marrons (13). As amostras de escarro, pus, urina e raspados de pele devem ser inoculadas em meios contendo antimicro-bianos, mas sem ciclo-heximida, pois a maioria dos isolados de
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antifúngico (1, 12).
As colônias de leveduras produtoras de melanina, urease positivas e capsuladas levam à suspeita de C. neoformans, sendo que a identificação de-finitiva é feita a partir do perfil fisiológico do fungo: assimila inositol, não assimila lactose e cresce a 37ºC. Alguns isolados que produzem cápsula e não produzem fenol-oxidase devem ser identificados através de seus perfis fisiológicos para confir-mação (3).
Isolados da variedade
neo-formans crescem bem a 37ºC,
e as colônias tornam-se visíveis em dois a três dias. Na varie-dade gattii muitos isolados têm dificuldade em crescer a 37ºC, e levam de quatro a cinco dias para formar colônias visíveis. Por outro lado, a 30ºC, os isola-dos da variedade gattii formam colônias em dois dias (13).
O aspecto macroscópico das colônias, em ágar Sabouraud, incubado a 25 ou 30ºC, em dois a quatro dias, são brilhantes, tipicamente brancas a cas-tanhas, podendo ser amarelas, rosa-claro ou marrom-claro. Se o organismo for capsula-do, as colônias apresentam-se mucóides e brilhantes, tomando o aspecto de “leite condensado”. No entanto, podem tornar-se secas e opacas com tempo. A
morfologia microscópica revela leveduras arredondadas ou ovais, isoladas ou aos pares, de paredes finas e de tamanhos variados, não ocorrendo pseu-do-hifas e hifas verdadeiras. O brotamento pode ser simples ou duplo, com pontos de ligação estreitos entre as células-mãe e filha. As células são, usual-mente, envoltas por cápsulas, que variam em espessura, es-pecialmente em preparações feitas diretamente a partir de amostras clínicas (12).
Teste sorológico
O teste sorológico para o diagnóstico da criptococose é sensível, específico, e permite um diagnóstico rápido e seguro. Durante a infecção, antíge-nos capsulares polissacarídicos solúveis são encontrados em fluidos corporais, e podem ser detectados e quantificados com anti-soro específico. O método mais comum empregado para triagem ou titulação do soro é a aglutinação de látex. As partícu-las de látex, recobertas com imunoglobulinas hiperimunes específicas de coelho, são mistu-radas com diluições da amostra do paciente, que pode ser líquor, soro ou urina. Aglutinação posi-tiva em uma diluição de 1:4 é altamente sugestiva de infecção criptocócica. Títulos maiores ou
iguais a 8 geralmente indicam doença ativa. A maioria dos pacientes com AIDS tem altos títulos do antígeno (3).
Aglutinações não específicas podem ocorrer em soros posi-tivos para fator reumatóide. Raramente resultados falsos-positivos ocorrem quando um outro antígeno está presente, apresentando reação cruzada, por exemplo, com o polis-sacarídeo de Trichosporon
beigelii ou de outro
microrgan-ismo. Testes falsos-positivos também podem ser causados pela contaminação da amostra clínica com diminutas quanti-dades de ágar ou agarose, fato que ocorre se a mesma pipeta que foi usada para inocular o meio de cultura for reintro-duzida no frasco contendo a amostra clínica (3, 14).
Alguns testes de Elisa foram desenvolvidos para detectar antígeno ou anticorpo contra
C. neoformans. Em comparação
Conclusão
Histopatologia
A histopatologia da criptoco-cose pode apresentar-se com dois padrões, gelatinoso ou granulomatoso. O padrão gela-tinoso caracteriza-se por pouco ou nenhuma reação inflamatória e grande quantidade de fungos com cápsula volumosa. O pa-drão granulomatoso caracteriza-se pela precaracteriza-sença de granulomas epitelióides, células gigantes, linfócitos e proliferação linfob-lástica. O infiltrado inflamatório é fundamentalmente constituído por macrófagos. A quantidade de parasitas é sensivelmente menor que nas gelatinosas. As colorações úteis para a visual-ização do fungo são H.E. (hema-toxilina e eosina), mucicarmim, PAS (periodic acid-Schiff), alcian blue (15). Mucicarmim cora as células de vermelho e Fontana-Masson cora a melanina fúngica de marrom avermelhado, e são mais específicas para C.
neofor-mans (16).
Técnicas moleculares
Os métodos de identificação moleculares são mais recentes e são úteis em estudos epide-miológicos, para a identificação da variedade, do sorotipo, e variações individuais de cepas (3, 17).
Paschoal et al. (18) otim-izaram a técnica de PCR (reação
em cadeia da polimerase), com o objetivo de aplicação no diag-nóstico em laboratório clínico, sendo que a técnica demon-strou níveis de sensibilidade e especificidade superiores à cultura e ao exame direto pela tinta da China. Estes autores concluíram que o método de PCR, sendo sensível, específico, e reprodutível, representa uma ferramenta promissora para análise de amostras de líquor em pacientes com suspeita clínica de neurocriptococose. Os resul-tados da pesquisa de DNA em lí-quor de paciente com meningite criptocócica têm correlacionado com a melhora clínica durante o tratamento (19).
O uso dessas técnicas para a identificação de C.
neofor-mans também é um avanço
importante, pois permite um resultado mais preciso e mais rápido que o usual. Leal et al. (20) padronizou um método de PCR multiplex que permite a diferenciação entre C.
neofor-mans var. neoforneofor-mans e var. gatti, facilitando sobremaneira
o diagnóstico e tornando-o mais seguro e ágil.
Conclusão
O diagnóstico laboratorial da criptococose pode ser feito com segurança quando
técni-cas e métodos laboratoriais são utilizados adequadamente. As características micromorfológi-cas do organismo, no espécime clínico ou na cultura, quando observadas atentamente, po-dem direcionar a cultura e a identificação do microrganismo. A suspeita clínica e os dados clínicos do paciente permitem também agilizar os procedimen-tos laboratoriais, permitindo a utilização de meios de cultura seletivos e/ou diferenciais, in-cubação em temperatura ade-quada e realização de provas de identificação direcionadas. O conhecimento dos materiais clínicos onde C. neoformans pode ser isolado é importante para a triagem inicial, que vai da realização do exame direto à escolha dos meios de cultura. Considerando a maior sobrevida de indivíduos em condição de imunocomprometimento, diver-sas espécies de microrganismos estão emergindo como agentes de infecção. Um conhecimen-to mais profundo e atualizado sobre esses microrganismos e suas principais características diferenciais é importante para um diagnóstico mais rápido e mais seguro.
Correspondência para:
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Referências Bibliográficas
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