DIVERSIDADE DE CIANOBACTÉRIAS EM AMOSTRAS DE
ÁGUA DOCE USADA PARA IRRIGAÇÃO
CYANOBACTERIA DIVERSITY IN FRESHWATER SAMPLES
USED FOR IRRIGATION
Aylan Kener Meneghine 1 Alessandro de Mello Varani 2 Lucia Maria Carareto Alves 3
Resumo
Cianobactérias estão amplamente distribuídas pelo mundo sendo um grupo de bactérias que podem ser benéficas ou perigosas ao ambiente, principalmente pelo fato de participarem do ciclo do nitrogênio ou produzirem metabólitos secundários com efeitos tóxicos a outras espécies. Devido a isso a qualidade de ambientes aquáticos deve ser monitorada em aspectos físicos, químicos e biológicos. O objetivo deste trabalho foi analisar a presença e a diversidade de cianobactérias, através de abordagem metagenômica, em amostras de água doce usada para irrigação de uma área de plantio de hortaliças as quais são utilizadas para a alimentação dos animais pertencentes à Fundação Parque Zoológico de São Paulo. Os resultados foram obtidos através do sequenciamento de DNA total do ambiente aquático e posterior análise pelo MG-RAST e ferramentas estatísticas. Nas amostras estudadas observou-se a preobservou-sença de 72 especies distintas de cianobacterias observou-sendo as mais abundantes
Dolichospermum macrosporum, Dolichospermum crassum e Microcystis aeruginosa, que são
espécies relacionadas a bloom em água e produção de cianotoxinas. Não foi observado indícios de bloom de cianobactérias no local, porém existe uma população desses organismos nas amostras estudadas. Considerando que a água do local é utilizada para a produção de alimentos in natura esse ambiente deve ter seu equilíbrio preservado e monitorado para que as espécies de cianobacterias presentes não exerçam efeitos tóxicos contaminando os alimentos e o ambiente em geral.
Palavras-chave: Dolichospermum. Metagenômica. Microsystis aeruginosa
Abstract
Cyanobacteria are distributed worldwide, and considered beneficial or harmful to the aquatic environment, due participation in the nitrogen cycle and to the production of secondary metabolities with toxic effects to other species. Therefore, the quality of aquatic environments
' Mestre e doutorando em Microbiologia Agropecuária, pela Univ. Estadual Paulista, UNESP campus de
Jaboticabal. Laboratório de Bioquímica de Micro-organismos e de Plantas. Departamento de Tecnologia. Endereço eletrônico: aylankm@yahoo.com.br.
%
Pesquisador III. Univ. Estadual Paulista, UNESP campus de Jaboticabal. Laboratório de Bioquímica de Micro-organismos e de Plantas. Departamento de Tecnologia. Endereço eletrônico: amvarani@gmail.com.
-Professor assistente doutor. Univ. Estadual Paulista, UNESP campus de Jaboticabal. Laboratório de Bioquímica de Micro-organismos e de Plantas. Departamento de Tecnologia. Endereço eletrônico:
should be monitored in physical, chemical and biological aspects. The aim of this study was to analyse the cyanobacteria presence and diversity from samples of freshwater used for irrigation of a vegetable planting area which are used for animal feed that belongs to the farm of the Foundation Zoological Park of Sao Paulo thorough metagenomics approaches. The results were obtained by the total environment DNA sequencing and subsequent analysis by MG-RAST and statistical tools. The taxonomic classification study shows the presence of 72 species of Cyanobacteria. Among the most abundant highlight Dolichospermum
macrosporum, Dolichospermum crassum and Microcystis aeruginosa, which are related with
bloom and production cyanotoxins. However, there was not observed evidence of cyanobacteria bloom into the water, but there are a population of these organisms in the studied samples. Considering the freshwater use in the area food production this study indicated that the cyanobacteria population found in the irrigation water should be monitored to avoid toxic effects to the food produced in the area and the environment itself.
Keywords: Dolichospermum. Metagenomics. Microsystis aeruginosa.
1 Introdução
Comunidades microbianas sustentam o legado ecológico governando os ciclos biogeoquímicos, a produtividade das plantas e a saúde ambiental dos ecossistemas (DESAI et al., 2009). A atividade bioquímica das comunidades microbianas, juntamente com a degradação de compostos prejudiciais ao ambiente, é essencial para minimizar a poluição do meio ambiente. A atividade microbiana é, portanto, a chave para remoção e transformação da matéria orgânica.
Ecologicamente, cianobactérias são um dos grupos de procariotos fototróficos mais abundantes, tanto em habitats de água doce quanto marinhos (RASTOGI; MADAMWAR; INCHAROENSAKDI, 2015). Entretanto também são fonte de vários outros metabólitos secundários por vias não ribossomais, dentre os quais destaca-se as cianotoxinas (NEWTON et al., 2011; RASTOGI; MADAMWAR; INCHAROENSAKDI, 2015).
Cianobactérias em água doce desempenham um importante papel na fixação de nitrogênio e na ciclagem de nutrientes em lagos, juntamente com outros micro-organismos (NEWTON et al., 2011). Entretanto algumas espécies são frequentemente consideradas um problema, pois além da produção de toxinas, também formam uma grande massa de matéria flutuante nos lagos.
Dentre as cianobactérias que produzem uma grande variedade de cianotoxinas estão as do gênero Microcystis. De um modo geral, as mesmas produzem neurotoxinas e hepatotoxinas (FALTERMANN et al., 2014; LOBNER et al., 2007). Essas cianotoxinas afetam o ambiente aquático, impedindo o crescimento de outros micro-organismos, além de
ser fatais a seres humanos e outros animais, consequentemente o ambiente fica inviabilizado para desde a armazenagem de água para o consumo humano, como para práticas agrícolas.
De acordo com o exposto sobre os possíveis danos que a presença de cianobactérias em ambientes aquáticos pode causar, este trabalho, pioneiro no local de estudo, teve como objetivo analisar a presença e a diversidade de cianobactérias, através de abordagem metagenômica, em amostras de água doce usada para irrigação de uma área de plantio de hortaliças, as quais são utilizadas para a alimentação dos animais pertencentes à Fundação Parque Zoológico de São Paulo.
2 Material e Métodos
As amostras ambientais de água doce foram oriundas do córrego Ribeirão do Lajeado, localizado em Araçoiaba da Serra – SP onde está estabelecida a Divisão de Produção Rural da Fundação Parque Zoológico de São Paulo (FPZSP).
As amostras de água foram coletadas em setembro de 2014, em triplicata e em superfície em um ponto onde há presença de uma moto bomba que capta água para irrigação de uma horta, que produz hortaliças que servem para a alimentação dos animais do FPZSP. As amostras foram misturadas e submetidas à extração do DNA total da comunidade microbiana presente na água, em triplicata. A extração do DNA foi realizada utilizando-se o PowerWater DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories) seguindo as instruções do fabricante. A qualidade do DNA extraído foi então verificada através de eletroforese em gel de agarose 0,8% e Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), e quantificado por fluorescência (Qubit). Em seguida, as réplicas do DNA total extraído foram sequenciadas utilizando plataforma IonProton com chip PI e Ion PI Template OT2 200 v3 (Life Technologies) e Ion PI sequencing 200 v3 (Life Technologies) de acordo com protocolo do fabricante.
Após sequenciamento as sequencias de DNA foram processadas utilizando-se o software PrinSeq (SCHMIEDER; EDWARDS, 2011) e verificadas através do software FastQC (ANDREWS, 2010). As sequencias processadas e com Q 20 foram submetidas para anotação no MG-RAST metagenomics analysis server versão 3.6 (MEYER et al., 2008).
Para realizar análise da diversidade taxonômica de cianobactérias os dados foram comparados através da referência do banco de dados SSU-SILVA (QUAST et al., 2013) presente no MG-RAST, usando e-value máximo de 1e-5, identidade mínima de 95% e um alinhamento mínimo de 15 pb para RNA database para geração de grupos taxonômicos.
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software R (https://cran.r-project.org/), pacote de análises BiodiversityR (KINDT, 2016)
3 Resultados e Discussão
A análise taxonômica indicou a presença de 72 espécies diferentes de Cyanobacteria. De acordo com resultados obtidos por uma análise de rank de abundância (Tabela 1), pode-se visualizar a proporção de cada uma das espécies encontradas. Entretanto, pode-se perceber que as espécies mais abundantes se encontram no rank 3 de abundância, uma vez que somente as mesmas representam 57,9 % dos dados. O que também sugere que as espécies
Dolichospermum macrosporum, Dolichospermum crassum e Microcystis aeruginosa são as
cianobactérias mais abundantes no ambiente em questão.
Tabela 1 - Rank de abundância das espécies de cianobactéria encontradas no ambiente em estudo.
Espécies Rank Proporção (%)
Dolichospermum macrosporum 1 31,8 Dolichospermum crassum 2 16,9 Microcystis aeruginosa 3 9,2 Microcystis sp. CYN06 4 3,4 Oscillatoria sp. PCC.7112 5 3,4 Arthrospira platensis 6 1,8 Leptolyngbya sp. Sai001 7 1,8 Calothrix sp. PCC7103 8 1,6 Cylindrospermopsis raciborskii 9 1,4 Nostoc commune 10 1,4 Oscillatoria sp. 3272 11 1,4 Cyanothece sp. WH8904 12 1,2 Cylindrospermum sp. A1345 13 1,2 Lyngbya majuscula 14 1,2 Oscillatoria sancta 15 1,2 Stanieria cyanosphaera 16 1,2 Synechococcus sp. MW74D3 17 1,2
Aphanizomenon gracile 18 1,1 Arthrospira fusiformis 19 1,1 Trichormu sdoliolum 20 0,9 Geitlerinema sp. Sai003 21 0,7 Phormidium sp. LMECYA214 22 0,7 Pseudanabaena sp. PCC6802 23 0,7 Stanieria sp. PCC7301 24 0,7 Fischerella sp. CENA161 25 0,5 Limnothrix redekei 26 0,5 Microcoleus chthonoplastes 27 0,5 Oscillatoria spongeliae 28 0,5 Oscillatoriales cyanobacterium JSC1 29 0,5 Synechocystis sp. PCC6803 30 0,5 Trichodesmium erythraeum 31 0,5 Aphanothece sacrum 32 0,4 Arthrospira maxima 33 0,4 Chroococcidiopsis sp PCC7431 34 0,4 Cyanothece sp. PCC7425 35 0,4 Dolichospermum circinale 36 0,4 Snowella litoralis 37 0,4 Spirulina laxissima 38 0,4 Symploca sp. HPC9 39 0,4 Synechococcus sp. HOG 40 0,4 Acaryochloris marina 41 0,2 Anabaena augstumalis 42 0,2 Anabaena bergii 43 0,2 Anabaena cylindrica 44 0,2 Brasilonema octagenarum 45 0,2 Calothrix sp. PCC7507 46 0,2 Chroococcidiopsis sp. MMG6 47 0,2 Chroococcidiopsis sp. PCC6712 48 0,2 Cyanobacterium LS0577 49 0,2
Cyanothece sp. PCC7424 50 0,2 Cyanothece sp. WH 8902 51 0,2 Dolichospermum planctonicum 52 0,2 Gloeobacter violaceus 53 0,2 Leptolyngbya boryana 54 0,2 Leptolyngbya foveolarum 55 0,2 Nodularia spumigena 56 0,2 Nostoc carneum 57 0,2 Nostoc ellipsosporum 58 0,2 Oscillatoria acuminata 59 0,2 Oscillatoria sp. MMG2 60 0,2 Oscillatoria sp. PCC6506 61 0,2 Oscillatoria sp. PCC8926 62 0,2 Planktothrix agardhii 63 0,2 Planktothrix pseudagardhii 64 0,2 Pleurocapsa minor 65 0,2 Prochlorococcu smarinus 66 0,2 Pseudanabaena sp. PCC6903 67 0,2 Synechococcus elongatus 68 0,2 Synechococcus sp. JA33Ab 69 0,2 Synechocystis sp. Sai002 70 0,2 Trichodesmium tenue 71 0,2 Uncultured cyanobacterium 72 0,2
Em um estudo de validação de nomenclatura realizado por (WACKLIN; HOFFMANN; KOMÁREK, 2009), Dolichospermum é um novo gênero proposto designado para separar geneticamente grupos de espécies planctônicas de Anabaena flosaquae Brébisson ex Bornet et Flahault 1888. Ainda segundo os autores, as cianobactérias pertencentes a este gênero pertencem geneticamente a um grupo nostocalean, além do que representam um complexo cluster de membros que não diferem entre si em menos de 92% de similaridade na análise do gene 16S rRNA.
(WACKLIN; HOFFMANN; KOMÁREK, 2009) são cianobactérias de água doce, e conhecidas por fixar nitrogênio. A. spiroides podem formar blooms durante períodos de longa retenção e baixa turbulência do ambiente, além de produzirem uma grande quantidade de exopolissacarídeos no meio formando coloides (COLOMBO; VIEIRA; MORAES, 2004). Devido a mudança recente de nomenclatura, e também a dificuldade de se isolar cianobactérias há relativamente pouca informação desses organismos, o que pode dificultar o estudo e entendimento da ecologia de cianobactérias em ecossistemas de água doce.
Entretanto, a espécie Microcystis aeruginosa, é uma das cianobactérias mais estudadas. M. aeruginosa é uma das bactérias que mais formam bloom em água pelo mundo todo, além de produzir perigosas toxinas que causam problemas em humanos e animais, e algumas vezes pode até a morte (CHEN et al., 2015; FALTERMANN et al., 2014). Em um trabalho realizado por Lorenzi (2004) na represa do Guarapiranga-SP, os autores, através de PCR, detectaram a o gene mcyA em diferentes cianobactérias incluindo algumas do gênero
Microsystis. Segundo os autores a abordagem molecular utilizada para identificar
cianobactérias e/ou florações tóxicas pode ser mais vantajosa que as técnicas convencionais utilizadas atualmente. Devido ao exposto, o controle de cianobactérias em ambientes aquáticos torna-se importante, uma vez que o estado trófico do ambiente pode influenciar a proliferação dessa bactéria além de ocorrer deterioração do ambiente. Além disso, há em literatura relatos da capacidade de adaptação a diversos compostos pela M. aerugionsa, por exemplo, à cobre e glifosato (GARCÍA-VILLADA et al., 2004; LÓPEZ-RODAS et al., 2007).
No ambiente estudado neste trabalho, de acordo com análises físico-químicas (dados não publicados) desenvolvidas pelo grupo, a quantidade de nutrientes nitrogenados e fosfatados na época de análise estavam em baixas concentrações (< 1 mg L-1 N e < 0,1 mg L-1
de P), valores comparados com o preconizado pela CONAMA 357/2005 (Conselho Nacional do Meio Ambiente) para águas doces de classe 2 em ambiente lótico. Visualmente não foi possível observar nenhum indício de matéria flutuante na água, o que, juntamente com o fato da baixa concentração de nutrientes, indica que no local não há bloom de cianobactérias. Pode-se sugerir que devido a limitação de nutrientes, as cianobactérias presentes estão agindo apenas de forma benéfica para ajudar com a manutenção para o equilíbrio do ambiente no que diz respeito a ciclagem de nutrientes. A manutenção do equilíbrio de nutrientes desse o ambiente não fornece condições favoráveis para que as cianobactérias lá presentes ajam de forma prejudicial, produzindo cianotoxinas e deteriorando a água do local. Entretanto,
considerando a utilização da água analisada na produção de alimentos que serão consumidos
in natura pelo conjunto de animais do parque Zoológico de São Paulo, a monitoração do
ambiente e o controle da proliferação dessas espécies bacterianas devem ser realizados para se evitar possíveis contaminações desses produtos.
4 Conclusão
A análise da diversidade de cianobactérias demonstrou a presença de várias espécies. Entretanto, apesar dos resultados in silico, visualmente não foi observado indícios de bloom no local, apesar da abundância de espécies relacionadas com esta característica. Estes resultados sugerem que há necessidade de um monitoramento da população de cianobactérias no local, uma vez que se as mesmas começarem a formar bloom o ambiente não estará mais apto à utilização. Com o aparecimento de bloom de cianobactérias esses organismos podem começar a produzir cianotoxinas e por consequência impedir a utilização da água para as práticas agrícolas realizadas neste ambiente.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Fundação Parque Zoológico de São Paulo, por ter permitido o acesso ao local e coleta de material biológico para execução dos experimentos. À FAPESP e CNPq pelo auxílio financeiro concedido e também à CAPES pela bolsa concedida.
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