Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2011/2012
Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em MEDICINA
1º Ano
ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO
2ª AULA PRÁTICA
1. Noções de equilíbrio ácido-base
2. Inspecção rápida da eficiência de um tampão de pH
1. IMPORTÂNCIA DO pH NO METABOLISMO CELULAR
O ião de hidrogénio (H+) é, de entre todos os iões inorgânicos, aquele que exerce maior influência na célula por unidade de concentração. Muitas das moléculas que fazem parte das estruturas celulares e dos vários sistemas de enzimas ionizam-se e existem nas células em equilíbrio com os iões livres de hidrogénio. A [H+] é geralmente traduzida em unidades de pH, definido como o negativo do seu logaritmo (ver adiante).
Muitas reacções que ocorrem nas células dependem da carga eléctrica das moléculas dos sistemas envolvidos. Por exemplo, a actividade das enzimas, a permeabilidade da membrana plasmática e o transporte activo de substâncias
concentradas selectivamente na célula são dependentes da concentração de H+, porque
este ião determina a carga eléctrica de moléculas e estruturas celulares.
Geralmente, existe uma concentração óptima de H+ para cada reacção ou actividade funcional da célula. Concentrações inferiores ou superiores a essa concentração são em geral inibidoras, como se indica no caso específico das actividades enzimáticas (Fig. 1).
Actividade enzimática pH óptimo (% do máximo) 100 50 0 4 5 6 7 8 9 pH
Fig. 1 - Relação entre o pH do meio e a actividade enzimática. O pH óptimo da enzima representada na figura é de aproximadamente 6,5. Apesar do pH óptimo de actuação de uma variedade de enzimas ser de aproximadamente 7, existem excepções significativas; por exemplo, a enzima pepsina, uma protease do suco gástrico, tem um pH óptimo de 1,5. O pH do estômago é bastante ácido (pH = 1), podendo a enzima funcionar neste meio. O efeito do pH (pH = - log [H+])na velocidade duma reacção enzimática pode ser devido ao efeito do H+ na enzima, no substrato, ou no complexo formado pela enzima e o substrato. No entanto, variações na concentração de H+ têm um efeito na enzima, uma vez que as enzimas são proteínas e estas, como substâncias anfotéricas (possuem grupos com cargas positivas e outros com cargas negativas) são muito sensíveis a
A variação da concentração de H+ também altera a dissociação de várias substâncias. Assim, uma diminuição da [H+] (aumento do pH) aumenta a dissociação, nomeadamente de proteínas, já que as proteínas com um pK relativamente baixo se dissociam primeiro. Ao pH das células (± 6,5 - 7,0), as proteínas possuem habitualmente uma carga predominantemente negativa e podem, portanto, captar iões H+ produzidos pelo metabolismo celular. Esta reacção entre o ião H+ e as proteínas, ou outras
substâncias capazes de o captarem (p.e. HPO4
2-eHCO3
-) é rápida e evita flutuações na concentração hidrogeniónica (ie do pH) na célula durante a sua actividade.
2. NOÇÕES DE -BASE
Um ácido, segundo a definição de Bronsted, é uma substância dadora de H+,
enquanto uma base é aceitadora de H+. Na descrição que se segue, faremos referência
somente aos ácidos, especialmente ácidos fracos (representados na reacção 1 por HA), que se dissociam parcialmente e existem em equilíbrio, em solução com o H+ e A -produzidos pela dissociação:
KD
HA ⇔⇔⇔⇔ H+ + A- (Reacção 1)
onde HA representa o ácido, A- a quantidade do ácido que se dissociou e KD representa a constante de dissociação, a qual se pode expressar pela equação 1:
[[[[ H+]]]][[[[A-]]]]
KD = (Equação 1)
[[[[HA]]]]
Em relação às bases, as considerações são idênticas às que foram descritas para os ácidos.
Os ácidos fortes, tais como o HCl, dissociam-se completamente e, portanto, em água, a concentração de H+ ou Cl- é igual à concentração original do ácido. Assim, 0,1 M de HCl produz 0,1 M de H+ e 0,1 M de Cl-. No caso dos ácidos fracos, tais como o ácido acético, a concentração de H+ produzida pelo ácido em solução aquosa é inferior à concentração original do ácido, porque só uma parte do H+ do ácido se dissocia. A concentração de H+ dissociado pode calcular-se pela equação 2:
[[[[HA]]]]
[[[[H+]]]] = KD (Equação 2)
[[[[A-]]]] ou
[[[[HA]]]]
- log [[[[H+]]]] = - log KD - log (Equação 3)
[[[[A-]]]]
A [H+] é geralmente indicada pelo valor do pH que é definido como o negativo do logaritmo da concentração de [H+].Portanto:
[[[[HA]]]] pH= - log K
D - log (Equação 4)
[[[[A-]]]]
Verifica-se que, quando as concentrações de HA e A- são iguais, o pH é igual a - log KD. O valor de - log KD é uma constante característica de cada ácido e é definida como o pH a que as concentrações de HA e A- são iguais. Esta constante (-log KD) representa-se pelo símbolo pKa.
Portanto:
[[[[A-]]]]
pH = pKa + log (Equação 5)
[[[[HA]]]]
Esta é a equação de Henderson-Hasselbalch, a partir da qual é possível calcular o pH de soluções de ácidos fracos.
3. REGULAÇÃO DA [H+] NO ORGANISMO 3.1. Eficiência de um tampão
Um tampão é geralmente uma mistura dum ácido fraco e do seu sal capaz de libertar ou captar H+, de modo a evitar alterações na concentração de H+. Um termo mais descritivo para este sistema seria “amortecedor”, pois o seu efeito é manter um meio constante no que diz respeito à concentração de H+, em face de produção ou gasto deste ião em qualquer reacção celular.
um meio contendo um sistema tampão para alterar significativamente a concentração de H+? O número de moles necessárias será tanto maior quanto mais eficiente for o sistema tampão.
Pela equação de Henderson-Hasselbalch, pH = pKa + log ([[[[A-]]]]/[[[[HA]]]]), pode verificar-se que a alteração do valor de pH (e portanto da concentração de H+) depende da razão [A-]/[HA], isto é, das concentrações do ácido, [HA], e do sal do ácido, [A-]. Uma análise cuidadosa da equação revela também que o sistema tampão (isto é, mistura do ácido e do seu sal) é mais eficiente na manutenção do pH quando [HA]=[A-] e, portanto, quando pH=pKa. Na prática, utiliza-se um tampão para evitar variações de pH. Este é mais eficiente na gama de valores de pH situados entre uma unidade abaixo e uma unidade acima do valor do pKa do ácido fraco (ou base fraca) que serve de tampão. Fora desta gama, a eficiência do tampão é muito reduzida, como se pode verificar na Fig. 2, que representa a titulação do ácido acético e do ião amónia com NaOH.
CH3COOH ⇔⇔⇔⇔ CH3COO- + H+ NH4+ ⇔⇔⇔⇔ NH3 + H+
1,0
(a) (b) 0,8
0,6
Equivalentes de pKa = 4,76 pKa = 9,3
NaOH 0,4
0,2
0 2 4 6 8 10 12 14 pH
Fig. 2 - Curvas de titulação para dois ácidos fracos: (a) ácido acético, com um pKa = 4,7 e (b) amónia, com um pKa = 9,3. Deve notar-se que a forma da curva é idêntica para todos os monoácidos, sendo a sua posição determinada pelo pKa.
Formatada: Inglês (E.U.A.) Formatada: Inglês (E.U.A.) Formatada: Inglês (E.U.A.)
Analisando a curva de titulação do ácido acético representada na Fig. 2, pode verificar-se que no ínicio da curva a adição de 0,1 equivalentes de NaOH causa uma alteração no pH de aproximadamente uma unidade. Porém, para valores de pH entre 3,76 e 5,75 (ou seja, uma unidade de pH abaixo e uma unidade de pH acima do pKa do ácido) a adição de quantidades maiores de NaOH aumenta mais lentamente o pH. Para valores superiores de pH, uma pequena adição de NaOH causa um aumento relativamente grande no valor de pH. O ácido acético pode, portanto, ser usado como tampão na gama de pH entre 3,76 e 5,76.
Para se tamponar uma solução noutra gama de pH é necessário usar um ácido fraco (ou base fraca) cujo valor do pKa corresponda ao valor de pH pretendido. Para se preparar o tampão, titula-se o ácido até se obter o pH desejado, ie próximo do valor do pKa do tampão, de modo a que as concentrações das formas ionizada e não ionizada do tampão sejam próximas e máxima a eficiência do tampão à concentração usada.
Os tampões mais comuns, eficientes ao pH fisiológico (possuem pKa entre 6 e 8), são os fosfato (tampão intracelular), bicarbonato (tampão extracelular) e imidazol (estrutura semelhante à do aminoácido histidina).
Para o caso do ácido fosfórico, com três equivalentes de H+ por mole (H3PO4), existem três valores de pKa. Este ácido pode portanto, servir de tampão em três regiões de pH correspondentes aos valores de pKa do ácido (pKa1 = 2,1; pKa2 = 7,2; pKa3 = 12,3). No entanto apenas o pKa2 (7,2) é importante ao nível fisiológico.
Definiu-se o valor de pH ao qual uma molécula apresenta uma carga global nula ou neutra (ie, o número de cargas positivas é igual ao número de cargas negativas) como o ponto isoeléctrico (pI1).
3.2. Importância dos aminoácidos na regulação da concentração de H+
No caso dos aminoácidos, moléculas com carga, os grupos carboxílicos dissociam-se a um pH mais baixo do que os grupos amínicos (Fig. 3).
Como exemplo, apresenta-se a dissociação da glicina (Reacção 2):
pK1 = 2,3 pK2 = 9,6
H2C - COOH ⇔⇔⇔⇔ H2C - COO- + H+ ⇔⇔⇔⇔ H2C - COO- + H+ (Reacção 2) NH+3 NH+3 NH2
Neste caso, em que o aminoácido tem apenas dois grupos acido-base ( a glicina é um aminoácido monoamino, monocarboxílico), o valor de pH correspondente ao pI é determinado pelo cálculo da média dos dois pK’s entre os quais a carga global é nula.
1,0 0,8 pKa2 0,6 pI = 6,0 Equivalentes de NaOH 0,4 pKa1 0,2 0 2 4 6 8 10 12 14 pH
Fig. 3- Curva de titulação da glicina. Nesta curva estão representados os valores de pKa1
= 2,3 e pKa2 = 9,6. O pI é 6,0 (cálculo da média: (pK1 + pK2/2).
No caso de aminoácidos com mais de um grupo carboxílico, a curva (Fig. 4) que representa a titulação do aminoácido com uma base, apresenta uma região tampão para cada grupo carboxílico, além da região tampão correspondente ao grupo amínico.
COOH COO- COO- COO-
pK1 = 2,1 pK2 = 3,9 pK3 = 9,8
HC - NH+3 ⇔⇔⇔⇔ HC - NH+3 + H+ ⇔⇔⇔⇔ HC - NH+3 + H+ ⇔⇔⇔⇔ HC-NH2 +H+ CH2-COOH CH2-COOH CH2-COO- CH2-COO -Carga eléctrica (+1) (0) (-1) (-2) 2,5 tampão pKa3 = 9,8 Equivalentes de NaOH 1,5 tampão pKa2 = 3,9 0,5 tampão pKa1 = 2,1 1,1 2,1 3 3,9 4,9 8,8 9,8 10,8
Fig. 4 - Curva de titulação do ácido aspártico. Estão representadas as três zonas de pH em que o ácido aspártico pode actuar como tampão, e que são correspondentes aos respectivos valores de pKa, pKa1 de 2,1, pKa2 de 3,9 e pKa3 de 9,8. O pI é 3,0 (cálculo da
média: (pKa1 + pKa2/2).
As proteínas possuem vários aminoácidos e, portanto, grupos carboxílicos e amínicos que se ionizam a diferentes valores de pH. Isto explica o facto de as proteínas serem bons tampões de pH, contribuindo para a manutenção da concentração hidrogeniónica nas células.
Formatada: Inglês (E.U.A.) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal) Formatada: Português (Portugal)
Alguns dos grupos das proteínas que se dissociam e os respectivos valores de pK estão representados na Tabela I (pK = valor do pH ao qual ocorre 50% de dissociação de uma substância).
TABELA I- GRUPOS QUÍMICOS DAS PROTEÍNAS E O VALOR DE pK
Grupo das proteínas Reacção de dissociação pK
Carboxílico COOH ⇔⇔⇔⇔ COO- + H+ 3 - 4,7 + Imidazólico HC NH ⇔⇔⇔⇔ HC N + H+ 6,1 HC CH HC CH N N H H Amínico NH3+ ⇔⇔⇔⇔ NH2 + H+ 6,5 - 10,5
3.3. Transporte de CO2 no sangue e efeito acidificante do CO2
O CO2 é continuamente formado por todas as células do organismo como um dos
produtos finais do catabolismo. É libertado das células por difusão e, ao penetrar nos capilares, é transportado pelo sangue sob três formas possíveis:
a) Uma pequena quantidade é transportada na forma dissolvida (7%);
b) Outra pequena percentagem é transportada na forma de
carbamino-hemoglobina (10%);
c) A maior parte (60-90%) é transportada sob a forma de ião bicarbonato.
O CO2 que se difunde do plasma para os glóbulos vermelhos (GV) reage com a água para formar ácido carbónico (H2CO3); esta reacção é catalizada pela enzima anidrase carbónica (AC). O ácido carbónico dissocia-se rapidamente em iões hidrogénio (H+) e bicarbonato (HCO3
-). A maior parte dos iões H+ formados reagem com a hemoglobina, que é um poderoso tampão de pH. Por outro lado, grande parte dos iões
bicarbonato difundem para o plasma através do trocador aniónico que permite a entrada simultânea de iões Cl- para o interior dos GV (Fig. 5).
A respiração remove o CO2 que é libertado nos pulmões (normalmente à mesma velocidade com que vai sendo formado), ocorrendo a Reacção 4 no sentido inverso.
H2O + CO2 ⇔⇔⇔⇔ H2CO3 ⇔⇔⇔⇔ H+ + HCO3- (Reacção 4)
Fluído intersticial Capilar GV
Célula Hb Hb-CO2 N AC CO2 CO2 CO2 + H2O ⇔ H2CO3 H+ + HCO3 Hb- O2 CO2 Hb -O2 Hb-H Plasma Cl HCO3
-Fig. 5 - Transporte de CO2 no sangue.
A forma desoxigenada da hemoglobina tem maior afinidade para H+ do que a forma oxigenada. Assim, quando o sangue flui através dos tecidos metabolicamente
Formatada: Inglês (E.U.A.)
derivados da reacção de CO2 com água ao nível do sangue são captados pela hemoglobina (Fig. 6), razão pela qual o pH do sangue venoso é ligeiramente inferior ao do sangue arterial.
Tecidos Plasma GV
Hb-O2
O2 O2 Hb- Hb-H
CO2 CO2 + H2O ⇔⇔⇔⇔ H2CO3 ⇔⇔⇔⇔ H+ + HCO3
-Fig. 6 - Efeito tampão da hemoglobina (Hb) quando o sangue flui nos capilares que banham os tecidos.
Quando o sangue venoso passa pelos pulmões, a hemoglobina fica saturada de O2 e a sua capacidade de ligar H+ diminui. Os protões libertados reagem então com o HCO3-, deslocando-se o equilíbrio no sentido de formar CO2, que se difunde para os alvéolos e é expirado (A reacção 5 é a 4, no sentido inverso).
HCO3- + H+ ⇔⇔⇔⇔ H2CO3 ⇔⇔⇔⇔ CO2 + H2O (pulmões; Reacção 5)
O tampão bicarbonato é um tampão fisiológico importante. Um aumento extracelular da [H+] desloca a Reacção 5 para a direita, ao passo que um decréscimo desloca a mesma reacção para a esquerda.
Conceitos importantes associados ao sistema tampão bicarbonato:
a) A concentração de bicarbonato extracelular é normalmente alta (cerca de 25 mM) e regulada pelos rins.
b) Existe uma relação estreita entre a [H+] extracelular e a eliminação de CO2 pelo organismo. Assim, quando a [H+] extracelular aumenta, a Reacção 5 desloca-se no sentido da formação de CO2, mas o restabelecimento da [H+] depende da eliminação de CO2, ie da eliminação pulmonar. Caso contrário, a acumulação de CO2 desloca de novo o equilíbrio para a esquerda, com formação de H+.
Um aumento da [H+] extracelular estimula o centro respiratório, aumentando a ventilação alveolar e, consequentemente, a eliminação de CO2. É este controlo da eliminação de CO2 pela [H+] extracelular que permite que o sistema HCO-3/CO2 funcione como um tampão eficiente.
Quando a [H+] extracelular diminui, a Reacção 5 desloca-se no sentido da formação de HCO3- e H+, restabelecendo a [H+] extracelular normal, porque o decréscimo de [H+] extracelular inibe o centro respiratório, diminuindo a ventilação alveolar e, portanto, a eliminação de CO2. O aumento subsequente da [CO2] extracelular favorece a reacção para a esquerda, permitindo a formação de H+.
3.4. Efeito de um excesso de H+ no CO2 do plasma
O efeito directo de um excesso de H+, pela lei de acção da massa, é aumentar a produção de CO2, mas o resultado indirecto é baixar o CO2, estimulando rapidamente a respiração. Uma vez que o último efeito predomina, o efeito final é a redução de CO2 no plasma.
H+ + HCO3- H2CO3 H2O + CO2 resultado final
Este exemplo ilustra o efeito do equilíbrio ácido-base na respiração. Vejamos agora o efeito da respiração no equilíbrio ácido-base:
A) Paragem prolongada da respiração (asfixia): CO2 + H2O ⇔ H2CO3
⇔ H+ + HCO3
acidose: pH extracelular 7,4 ~7,1
Como consequência, o aumento de H+ estimula o centro respiratório e leva à necessidade de respirar profundamente e com grande frequência, partindo do pressuposto de que a função ventilatória foi entretanto restaurada.
B) Hiperventilação: CO2 + H2O ⇔ H2CO3 ⇔ H + + HCO3 alcalose: pH extracelular 7,4 7,7
Em consequência, a diminuição de H+ inibe o centro respiratório, levando à necessidade de respirar menos profundamente e com menor frequência.
Efeito da acidose e da alcalose na respiração (volume de ar ao longo do tempo):
Normal Acidose Normal Alcalose
pH 7,4 pH 7,1 pH 7,4 pH 7,7
Formatada: Português (Portugal)
3.5. Aplicação da equação de Henderson-Hasselbalch ao tampão fisiológico CO2/HCO3
-Tendo em conta a Reacção 4 e a aplicação da Equação 5:
[[[[HCO3-]]]]
pH = pKa + log (Equação 5)
[[[[CO2]]]]
Esta é a equação de Henderson-Hasselbalch, para o par “ácido-base” CO2/HCO3 -, a partir da qual é possível calcular variações no pH fisiológico resultantes das alterações, tanto na pressão de CO2 ([CO2]=pCO2 x 0,0301 mM), como na concentração plasmática do ião HCO3-. O pKa é cerca de 6,1.
APÊNDICE:
I. DISSOCIAÇÃO DA ÁGUA E DEFINIÇÃO DE pH
A água actua como um ácido e como uma base, uma vez que produz H+ e OH-, ie cede e capta protões.
Ke
H2O ⇔⇔⇔⇔ H+ + OH
-onde Ke é a constante do equilíbrio da reacção.
A concentração de H+ produzido pela água é relativamente baixa e é igual à concentração de OH-. O valor de Ke é:
[[[[H+]]]] [[[[OH-]]]] Ke =
[[[[H2O]]]]
Como a concentração da água [H2O] é relativamente alta e constante (é igual ao número de gramas de H2O num litro dividido pelo peso molecular da água, ou seja 1000/ 18 = 55,55 M), o produto Ke [H2O] pode expressar-se pela constante Kw (produto iónico da água). Portanto:
Kw = [[[[H+]]]][[[[OH]]]] = 10-14
Se expressarmos esta equação em termos dos logaritmos dos valores representados:
pKw = pH + pOH = 14
onde pOH tem o valor do - log [OH] por analogia com o valor de pH definido anteriormente.
Uma vez que consideraremos somente ácidos e bases fracos em solução aquosa, o produto das concentrações de [H+] e [OH-] será igual a 10-14 (ou a soma pH + pOH = 14). Portanto, se a concentração de H+ dum ácido fraco em água for de 10-5 M, a concentração de OH- nessa mesma solução será de 10-9 M. Esta relação é válida para valores de pH entre 0 e 14.
A expressão da concentração de H+ em termos de normalidade (N) ou molaridade (M) é pouco conveniente, uma vez que se tem de recorrer ou a potências (ex: 10-6 M) ou a muitas casas decimais (ex: 0,000001 M). Afim de evitar esta dificuldade Sorensen propõs expressar a concentração de H+ como o negativo do seu logaritmo e designou esta função de pH:
pH = - log10[[[[H+]]]]
Na tabela seguinte indica-se a relação entre concentração de H+, de OH- e o pH.
Relação entre concentração de H+ expressa em normalidade e o pH:
[[[[H+]]]] [[[[ OH-]]]] log [[[[H+]]]] - log [[[[H+]]]] = pH 1N 100 N 10-14 N - 0 0 0,1 N 10- 1 N 10-13 N - 1 1 0,001 N 10-3 N 10-11 N - 3 3 0,000 01 N 10-5 N 10 -9 N - 5 5 0,000 000 1 N 10-7 N 10-7 N - 7 7 0,000 000 001 N 10-9 N 10-5 N - 9 9 0,000 000 000 01 N 10-11 N 10-3 N - 11 11 0, 000 000 000 000 01 N 10-14 N 10-0 N - 14 14
II. MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DO pH
Existem dois métodos para medir o valor do pH normalmente usados no laboratório:o método dos indicadores (corantes) e o que usa o aparelho de pH (método potenciométrico).
II.a) Indicadores
Indicadores de pH são ácidos (ou bases) fracos que apresentam cores diferentes na forma ionizada e não ionizada. Quando o pH da solução em que se encontram estes indicadores é igual ao pK dos indicadores, as concentrações das moléculas ionizadas e não ionizadas do indicador são iguais e observa-se uma cor de transição.
O uso dos indicadores tem uma aplicação limitada. No entanto, ainda são correntemente usados em titulações de ácidos e bases.
[[[[H+]]]] [[[[In-]]]] HIn ⇔⇔⇔⇔ H+ + In- K = [[[[HIn]]]] [[[[HIn]]]] [[[[H+]]]] = Ka (indicador) [[[[In-]]]] [[[[HIn]]]]
quando [[[[HIn]]]] = [[[[In-]]]] = 1 [[[[H+]]]] = Ka (indicador) ou pH = pKa [[[[In-]]]]
Quando o indicador possui grande capacidade de tingimento, basta usar quantidades pequenas, tão pequenas que não conseguem afectar a acidez ou a basicidade da solução.
A relação entre as duas formas do indicador, HIn e In-, mede neste caso a [H+] que existe na solução antes da adição do indicador. Em equilíbrio, teríamos, no caso da adição de HCl a uma solução com indicador:
[HIn] = a-x
[In-] = x
Valores dos pK e as cores dos indicadores usados em titulações:
Indicador pK Transição de cor Gama de pH em
que pode ser usado
Timol azul 1,7 Vermelho-amarelo 1,2 - 2,8
Laranja de Metilo 3,5 Vermelho-amarelo 3,1 - 4,4
Bromofenol azul 4,0 Amarelo-azul 3,1 - 4,7
Bromocresol verde 4,7 Amarelo-azul 3,8 - 5,4
Vermelho de Metilo 5,0 Vermelho-amarelo 4,2 - 6,3
Clorofenol vermelho 6,0 Amarelo-vermelho 5,1 - 6,7
Bromocresol púrpura 6,2 Amarelo-roxo 5,4 - 7,0
Bromotimol azul 7,0 Amarelo-azul 6,0 - 7,6
Fenol vermelho 7,8 Amarelo-vermelho 7,0 - 8,6
Cresol vermelho 8,3 Amarelo-vermelho 7,4 - 9,0
Timol azul 8,9 Amarelo-azul 8,0 - 9,6
Fenolftaleína 9,7 Descorado-vermelho 8,3 - 10,0
II.b) Medição do pH pelo potenciómetro
Nos laboratórios é mais comum usar-se o aparelho de medir pH (potenciómetro)
em estudos que requerem medições da concentração do ião H+ em solução.
O aparelho de pH (Fig. A.1) possui um elétrodo de vidro que é um tubo que contém
dentro uma solução com uma determinada concentração de H+. Esta solução é separada
das soluções exteriores (em que se deseja medir a concentração de H+) por uma membrana de vidro no fundo do tubo, a qual é permeável somente a H+. Portanto, a tendência de difusão do H+ através desta membrana causa um potencial eléctrico cuja grandeza depende do gradiente de concentração de H+ dentro e fora do eléctrodo. O resto do instrumento consiste simplesmente num mecanismo electrónico que mede o potencial eléctrico quando o circuito é fechado por meio dum eléctrodo de referência. O pH é proporcional a este potencial. O eléctrodo de referência é preparado de modo a evitar potenciais de junção, usando para isso uma solução concentrada de KCl que faz a ligação com a solução cujo pH se deseja medir por intermédio dum pequeno orifício. A quantidade de KCl que se difunde para a solução é insignificante mas basta para fechar o circuito. O KCl é preferido a outros sais porque as mobilidades de K+ e Cl- são aproximadamente iguais, o que evita que se gere um potencial de junção que interfiriria com o potencial criado pelo gradiente de H+ através da membrana do eléctrodo de vidro:
Calibração do aparelho de pH:
1. Seleccionar no respectivo botão do aparelho de pH a temperatura da solução cujo pH se pretende determinar.
2. Colocar o eléctrodo numa solução tampão padrão de pH = 7,0 e ligar o aparelho 3. Ajustar a agulha da escala para a leitura 7,0 com o botão "buffer adjustment".
4. Repetir 2. e 3. para uma solução tampão padrão de pH = 4,0 e certificar-se de que a agulha dá a leitura de 4,0.
5. Medir o pH da solução desejada.
Eléctrodo de Referência (calomelanos)
Eléctrodo de vidro potenciómetro amplificador solução de KCl KCl Hg2Cl2 Hg2 [H+] [H+] desconhecida [H+] = 0,1 N
Fig. A.1- Esquema simplificado dos componentes principais de um aparelho para medir pH. A amostra cujo pH se pretende medir é colocada num recipiente no qual se coloca a extremidade do eléctrodo de vidro contendo H+ 0,1 N e o eléctrodo de referência. Devido à diferença de concentração de H+ dentro e fora do eléctrodo de vidro gera-se um potencial que é amplificado e medido por um potenciómetro. Normalmente o potenciómetro está calibrado em unidades de pH ou em volts (V).
Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em Medicina
1º Ano
Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Ano Lectivo 2011/2012
A) INSPECÇÃO RÁPIDA DA EFICIÊNCIA DE UM TAMPÃO DE pH
Grupos 1 e 3
1. Coloque 96 ml de água da torneira num copo de precipitação.
2. Adicione algumas gotas de azul de bromotimol em quantidade suficiente para que a cor seja bem visível.
3. Ao primeiro copo, adicionar, gota a gota, HCl 1 M até a cor se tornar francamente amarela e anote o volume de ácido. Depois adicione, gota a gota, NaOH 1 M. Observe a mudança de cor para verde e finalmente azul escuro, anotando o volume da base.
4. Ao mesmo copo, adicione cerca de 2 ml de KH2PO4 0,35 M e deixe dissolver completamente. Seguidamente, adicionar 2 ml de K2HPO4 0,3 M e dissolver. Note as mudanças de cor que acompanham as adições.
5. Repetir a adição de HCl 1 M e NaOH 1 M e compare as diferenças de volume (dramáticas) entre a solução não tamponada e depois de tamponada.
6. Interprete as observações.
Grupos 2 e 4
1. Coloque 60 ml de água da torneira num copo de precipitação. Adicione algumas gotas de azul de bromotimol em quantidade suficiente para que a cor seja bem visível. Adicionar 20 ml de KH2PO4 0,35 M e K2HPO4 0,3 M (anote as mudanças de cor que acompanham as adições). Anote os volumes de ácido (HCl 1 M) e base (NaOH 1 M) requeridos para alterar as cores do bromotimol.
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BIOQUÍMICA I 1º Ano
PROTOCOLO DE BANCADA - 2ª AULA PRÁTICA
B) O princípio de Le Chatelier APLICADO AO Efeito acidificante do CO2
Grupos 1 a 4:
1.
Prepare um copo com água da torneira (25 ml) e 3 gotas de azul de bromotimol e adicione NaOH 0,01 M, o suficiente para a solução ultrapassar a neutralidade e estabelecer a cor azul. Retirar 5 ml para um tubo de ensaio para servir de controlo.2.
Fazer borbulhar CO2 (de ar expirado).3.
Notar a mudança gradual da cor.4.
Aquecer a solução até à fervura e registar as transições de cor.5.
Voltar a adicionar CO2 e notar as transições.6.
Comente as observações com base no equilíbrio. CO2 + H2O ⇔ (H2CO3) ⇔ H + + HCO3 ⇔ 2 H+ + CO32-7.
Comente o equilíbrio em relação ao processo respiratório.Nota: o azul de bromotimol é um indicador de pH com um valor de pK~7,0. A forma protonada do indicador (HIn), prevalente a pH<7,0 tem uma coloração amarela, enquanto a forma desprotonada (In-), prevalente a pH>7,0 tem uma coloração azul.
