Função de Proteínas: Mioglobina e Hemoglobina

Aula de

Bioquímica I

Tema:

Função de Proteínas:

Mioglobina e Hemoglobina

Prof. Dr. Júlio César Borges

Depto. de Química e Física Molecular – DQFM Instituto de Química de São Carlos – IQSC

Universidade de São Paulo – USP E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br

Proteínas

Funções

Transporte e Estoque;

Catálise enzimática;

Sinalização intra e extracelular; etc.

Variedade Funcional  Diferentes Estruturas Tridimensionais

Estrutura 3D  Estrutura Estável em função do tempo

Estabilidade versus flexibilidade

Como as Proteínas Funcionam

Grande maioria → interação com outras moléculas

Interações reversíveis → ligante

***Natureza transitória das interações proteína-ligante***

↓

VIDA

↓

R

S

ÍTIO DE

L

IGAÇÃO

→ Interação específica

→ Acoplada a uma mudança conformacional →

E

I

Introdução



Organismos aeróbicos  Necessitam de suprimento de O

constante

Organismos multicelulares vertebrados - Desenvolvimento de sistema circulatório - Desenvolveram proteínas de transporte de O₂

1 – Mioglobina  músculo - mantém suprimento local de O₂ 2 – Hemoglobina  sangue  hemácias - Transporta O₂ dos pulmões para os tecidos

- Transporta CO₂ e H₃O+ _{dos tecidos para os pulmões}

Mioglobina versus Hemoglobina

- São similares na Estrutura Primária, Secundária e Terciária - Ligam O₂ de maneira muito similar

- Em condições similares aos tecidos, a Hemoglobina está 7% saturada com O₂ enquanto que a Mioglobina apenas 90% saturada

- Hemoglobina liga O₂ de maneira cooperativa e é uma proteína alostérica - Ambas são importantes proteínas-modelo de estudo Bioquímico

Grupo Prostético = Heme

A ligação O

pelas globinas depende do grupo Heme

 Grupo Heme  Protoporfirina + Fe2+ _{=  responsável pela cor vermelha do sangue}

- Protoporfirina  4 anéis pirrólicos (anel tetrapirrólico) - 8 Cadeias Laterais = 4 metilas, 2 vinilas e 2 Ácidos Caboxílicos

- Ferro é coordenado no centro pelos átomos de Nitrogênio dos 4 grupos Pirróis.

Porfirina

_Heme

_Fe

Coordenação Hexagonal

Holomioglobina

Grupo heme está ligado à apoproteína:

1) pelo ocupação do Quinto ponto de coordenação do Fe2+ _{pela His proximal}

2) Interações Hidrofóbicas do anel tetrapirrólico - Sexto ponto de coordenação do Fe2+ _{é ocupado pelo O}

2

Holomioglobina

Holomioglobina



1º Proteína a ter a sua estrutura 3D resolvida

- Estrutura em Hélices Alfa - Possui 153 resíduos de AA

- Total de 8 hélices anfipáticas – nomeadas de A a H  Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F

- Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8) - Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7)

Holomioglobina

 Grupo Heme está ligado entre as hélices E e F

- Hélice alfa F contém a His Proximal (Chamada de His F8) - Hélice alfa E contém a His Distal (Chamada de His E7)



A ligação O

–Fe

_{gera a}

transferência parcial de 1

elétron do Fe

_{para o O}

2



forma o íon superóxido

O

-

A

His E7

estabiliza o O

ligado ao Fe

_{por uma}

ligação de H;



Evita a formação do

íon superóxido;

- O componente protéico

estabiliza a reatividade do

O

Interação Proteína-Ligante

pode ser quantificada

Proteínas são capazes de interagir especificamente com ligantes

A interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica

Questões apresentadas

1) Qual é o máximo número de moles de ligante por proteína?

2) Qual é a constante de equilíbrio deste ligante por cada um dos sítios de ligação? 3) A constante de equilíbrio do L por cada um dos sítios é independente da ocupação dos

demais?

4) A constante de equilíbrio do L é modificada pela presença de um segundo ligante?

P + L

PL

k₁ k₂

Interação Proteína-Ligante

pode ser quantificada

A interação Proteína P com o Ligante L obedece as leis da Termodinâmica

k₁ e k₂ são as constantes de velocidade de associação e dissociação

K_A e K_D são as constantes de equilíbrio no sentido de associação e dissociação

K_A é dado em (mol/L)-1 _(M-1_{) Quanto maior o valor de K}

A maior a afinidade da interação PL

K_D é dado em mol/L (M) Quanto menor o valor de K_D maior a afinidade da interação PL

 Quando a [L] é >>> [P] podemos considerar que a formação do PL não altera a [L]  A fração de Sítios de ligação na P frente ao L pode ser descrita pela seguinte equação

P + L

PL

K

K

L

P

PL

k

k

K

K

1

]

][

[

]

[











]

[

]

[

]

[

s

Disponívei

Sítios

de

Total

Ocupados

Sítios

P

PL

PL









Interação Proteína-Ligante

pode ser quantificada

Θ pode ser monitorado e seu valor em função da [L] resulta numa hiperbólica retangular

]

[

]

[

]

[

P

PL

PL







]

][

[

]

[

]

][

[

]

[

L

P

K

PL

L

P

PL

K







K

L

L

K

L

L

L

K

L

K

P

L

P

K

L

P

K

















]

[

]

[

1

]

[

]

[

1

]

[

]

[

]

[

]

][

[

]

][

[



K

K



1

de ligação estão ocupados pelo Ligante

 Para 90% de saturação [L] = 9 x K_D

Interação Mioglobina-O

A interação entre a mioglobina e O₂ segue as leis da termodinâmica mesmo considerando o Oxigênio como gás

- Adequação experimental e matemática é necessária

D

K

O

O

θ





]

[

]

[

Quando pO₂ for equivalente à metade do sinal máximo temos K_D e assim podemos

definir P₅₀ D

K

pO

pO

θ





- Condição na qual metade dos sítios estão ocupados A [O₂] em solução depende

diretamente da pressão de O₂ na atmosfera que pode ser controlada.

50 2 2

P

pO

pO

θ





K

P



Estrutura da Hemoglobina

 A Hemoglobina é um heterotetrâmero

- Duas cadeias Alfa (141 resíduos) e duas cadeias Beta (146 resíduos) - Possui estrutura em hélice alfa

 Hemoglobina A (HbA) = par de dímeros α₁β₁ e α₂β₂ - A interface α₁β₁ e α₂β₂ apresenta ~30 contatos - A interface α₁β₂ e α₂β₁ apresenta ~19 contatos

 Maioria hidrofóbicos e alguns hidrofílicos  Importantes para regulação - Grupos Heme estão bem separados (24-40 Å)

Estrutura da Hemoglobina

 Cadeia Alfa e Beta da HbA apresentam ~25% de identidade com a Mioglobina

 Alta identidade estrutural

- Apesar da baixa identidade sequencial - Identidade estrutural é mais conservada

 Mesma forma de ligar grupo Heme -Possui His Proximal e Distal

Estrutura da Hemoglobina

 A HbA liga O₂ de maneira cooperativa – curva Sigmoidal

- A ligação de O₂ com HbA é >10 x mais fraca do que com a Mioglobina

- A ligação ou saída de O₂ em uma cadeia da HbA aumenta a ligação ou a saída de O₂ nas demais cadeias

 A baixa afinidade da HbA por O₂ está relacionada com a função desta proteína - Captar O₂ nos pulmões (“alta” pO₂) e liberar nos tecidos (“baixa” pO₂)

Cooperatividade

 A Alosteria – “outra forma” – está envolvida na cooperatividade

Sistema de variação de afinidade/atividade frente à modulação.

 Envolve a participação de um Modulador - Modulador  Ativador ou inibidor

- Modulação homotrópica: Ligante e modulador iguais - Modulação heterotrópica: Ligante e modulador diferentes

 Uma curva de ligação sigmoidal é um sinal de ligação cooperativa.

Cooperatividade

 A ligação cooperativa de O₂ na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910)

P + nL

PL

L

P

PL

k

k

K

K

]

][

[

]

[







K

L

θ

n

θ

_

[

]



n

L

n

K

θ

n

θ

log

]

log[

log



















1

]

[

]

[





L

K

L

K

n



2) Dividindo ambos por K_A

3) Substituindo por KD



Curva de Hill 

log [θ/(1-θ)] versus log[L]

onde a inclinação =

n = n

Cooperatividade

 A ligação cooperativa de O₂ na HbA foi analisada por Archibald Hill (1910)



0



log

 

log

log

n

p

n

P

θ

n

θ





















n

não representa o número de sítios

de ligação, mas o grau de interação

entre eles:

o grau de cooperatividade



n

representa a cooperatividade

entre os sítios de ligação

Ligação de O

na Hemoglobina

 Em exercício, o sangue arterial, após uma passagem pelo pulmão, apresenta ~98% de saturação da HbA com O₂

 Após passar pelos tecidos, o sangue venoso apresenta ~32% de saturação de O₂ - Portanto, ~66% dos pontos de ligação contribuíram para o transporte de O₂

 A ação cooperativa da HbA favorece a DESCARGA adequada de O₂

- Nestas condições, a Mioglobina permaneceria com 91% de saturação  7% de transporte  A HbA transporta ~10 x mais O₂ do que a Mioglobina

O₂

A cooperatividade da HbA

 A ligação de O₂ na HbA resulta em mudanças conformacionais na tetrâmero de HbA-O₂ - Um dímero Alfa-Beta sofrem rotação de 15º em relação ao outro

 A HbA existe em duas conformações principais: 1) T (Tenso)  Estado deoxigenado

2) R (Relaxado)  Estado Oxigenado

- O Estado R apresenta maior afinidade por O₂ do que o estado T - Na presença de O₂, o estado R é mais estável

A cooperatividade da HbA

 Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α₁β₂ e α₂β₁  A ligação de O₂ altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos

- Mudanças no ambiente do grupo Heme são transmitidas para as outras cadeias do oligômero

A cooperatividade da HbA

 Estado T apresenta um intricada rede de pares iônicos na interface α₁β₂ e α₂β₁  A ligação de O₂ altera a estrutura do grupo Heme que perturba a rede de pares iônicos

A cooperatividade da HbA

 A HbA pura no estado T é muito instável

- Liga avidamente O₂ em baixas [O₂] e libera apenas 8% de O₂ em condições fisiológicas

 A transição T  R adequada depende de um ligante – o 2,3-Bisfosfoglierato – 2,3-BPG

 A [2,3-BPG] nas hemácias é aumentada na altitude. - Adaptação em ~ 24 horas

- Permite menor afinidade entre HbA-O₂

- A HbA liga menos O₂, MAS descarga de O₂ nos tecidos é MAIOR apesar da

A cooperatividade da HbA

A cooperatividade da HbA

O 2,3-BPG:

1) Liga-se no centro do Tetrâmero da HbA; 2) É liberado após transição T  R;

3) Age mantendo HbA no Estado T; 4) É um Efetor Alostérico.

A cooperatividade da HbA

A transição T  R expulsa o BPG do sítio de ligação Estado R Estado T

A Hemoglobina Fetal

- A Hb fetal contem duas cadeia Alfa e duas cadeias Gama

 A cadeia Gama é 72% idêntica à cadeia Beta na seqüência de aminoácidos - A modificação Beta-His143  Gama-Ser143

- Modifica o sítio de interação do 2,3-BPG com a Hb Consequências:

- Redução da afinidade da Hb Fetal por 2,3-BGP - Aumento da afinidade da Hb Fetal por O₂

 Permite que a Hb Fetal receba

eficientemente o O₂ transportado pela HbA maternal

- O feto não “experimenta” pO₂ atmosférica Outros genes

 Existem outras 3 cadeias de hemoglobina expressas em diferentes estágios do

desenvolvimento

Existem ainda: Neuroglobina e citoglobina (+ similares à mioglobina)

A HbA transporta H

_{e CO}

dos tecidos para o pulmão

 A HbA é sensível aos níveis de H+ _{e CO}

2 nos tecidos

- H+ _{e CO}

2 são efetores alostéricos da HbA  aumentam a liberação de O2 para os tecidos

 O estado T é estabilizado pela redução do pH - Resultado: descarga de O₂ nos tecidos

 É chamado de Efeito Bohr (Christian Bohr, pai de Niels Bohr)

 O CO₂ é hidratado pela enzima Anidrase Carbônica nas hemácias

 A afinidade da HbA por O₂ diminui com a redução do pH

A HbA liga H

_{e CO}

 A HbA transporta H+ _{dos tecidos para o pulmão}

 A Hidratação do CO₂ é catalisada

pela Anidrase carbônica

No capilar sanguíneo (tecidos)

O próton liberado pela

hidratação do CO₂ liga-se à cadeia alfa e beta da HbA estabilizando uma ponte salina  estabilização

do estado T

 Permite o transporte de próton para os pulmões

- 80% do transporte

Ponte salina na interface α₂β₁

A HbA liga H

_{e CO}

 A HbA transporta CO₂dos tecidos para o pulmão  O CO₂ liga-se à aminas terminais

- ~15-20% do transporte ligado à HbA

- Restante é transportado na forma de HCO₃- _solúvel

 Forma grupos carbamato  carga negativa  Estabiliza estado T por favorecer interações eletrostáticas na interface cadeia Alfa-Beta da HbA

Descarga de O₂ pela HbA 66%

77% 88%

Mutações na HbA

 Os genes da Hb sofrem mutações que alteram a cadeia protéica - Podem prejudicar a afinidade da Hb pelo O₂

- Originam as Hemoglobinopatias – são as anemias hereditárias - ~ 500 tipos de mutações identificadas na população humana

- Muitas mutações são inócuas

- O Surgimento da anemia depende se o indivíduo é heterozigoto ou homozigoto

 Anemia falciforme

- devido à mutação D6V na cadeia Beta

- Forma a Hemoglobina S

- Forma um contato hidrofóbico com a F85 e V88 entre as cadeias beta

Mutações na HbA

Mutações na HbA

Mutações na HbA

A HbS forma fibras que deformam a estrutura das hemácias

 HbS aumenta resistência à malária  parasita vive dentro das hemácias