Biossistemas e Biorreações
Prof. Maria Alice Zarur Coelho
Programa de Pós-graduação em Tecnologia de
Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de Química
UFRJ
O conceito da Análise de Fluxo Metabólico (MFA) é útil para estudar
as interações entre os diferentes caminhos metabólicos e quantificar
as distribuições de fluxo em torno do pontos de bifurcação…
… não possibilita medidas quantitativas do controle do fluxo
metabólico!!!
O controle do fluxo metabólico é importante para:
(i) balancear a taxa de síntese e conversão dos metabólitos face a uma
dada condição ambiental não permitindo um aumento ou uma queda
catastrófica nas concentrações intracelulares destes compostos
Mecanismos moleculares que possuem papel importante no
controle do fluxo metabólico (1950’s):
! Inibição por feed-back
! Cooperatividade enzimática
! Modificações enzimáticas por ligação covalente
! Controle da síntese enzimática
Controle metabólico normalmente é descrito de forma qualitativa, i.e.:
“… fosfofrutoquinase é a enzima que controla a maior parte do fluxo glicólitico nos músculos.”
ou
“o primeiro passo de uma caminho metabólico é a taxa cinética limitante.”
Ao invés de assumir a existência de uma única etapa limitante, assume-se que existe uma quantidade definida do controle do fluxo metabólico se encontra espalhada ao longo do
caminho através das enzimas, sendo formalmente conhecido como Teoria do Controle
Metabólico , intimamente relacionada com Análise de Sensibilidade.
Na essência, MCA é aplicação da teoria da perturbação linear de um problema inerentemente não-linear da cinética enzimática das redes metabólicas.
Abordagens possíveis para o estudo do comportamento cinético de sistemas multi-enzimáticos:
Teoria orientada por fluxo – abordagem desenvolvida por E. A. Newsholme, B. Crabtree et al. Alternativa ao MCA, do qual difere quando incorpora o conceito de reguladores
parcialmente externos, cujas concentrações são parcialmente variáveis e parcialmente constantes.
Teoria dos sistemas bioquímicos – abordagem desenvolvida por M. A. Savageau et al.
Teoria geral do controle metabólico que inclui tanto a análise do controle (MCA) como a teoria orientada por fluxo como casos especiais. Ênfase é dada na predição de como os
sistemas irão se comportar quando as condições se modificam, mas do que entender os
termos físicos pelos quais são controlados.
Fundamentos da MCA
! Aplicável apenas a condições de estado estacionário (ou pseudo estado-estacionário) – as concentrações do primeiro substrato e do produto final de cada caminho metabólico podem ser mantidas constante tanto pelo controle das condições ambientais ou como resultado da regulação intracelular.
! Um estado estacionário estável é definido unicamente pelas atividades
das enzimas catalisadoras dos passos individuais do caminho
atividades das enzimas = parâmetros do sistema
propriedades que são determinadas pelos valores destes parâmetros (p.ex. fluxo através do caminho metabólico ou concentração de
intermediários intracelulares) = variáveis do sistema
Um dos objetivos da MCA é relacionar as variáveis do sistema
metabólico com os seus parâmetros
Coeficientes do Controle de Fluxo (FCC)
A sensitividade de uma variável do sistema (fluxo) com respeito aos parâmetros do sistemas (atividades enzimáticas) pode ser determinada.
As sensitividades resumem a extensão do controle do fluxo exercido pela
atividade de uma enzima no caminho metabólico, i.e. como um parâmetro afeta as variáveis do sistema
Tais sensitividades podem ser descritas por um conjunto de coeficientes… …os Coeficientes do Controle de Fluxo
definidos como a mudança relativa no fluxo do estado estacionário resultante de uma alteração infinitesimal na atividade de uma enzima do caminho metabólico
dividido pela mudança relativa da atividade enzimática
( )
( )
E
d
J
d
dE
dJ
J
E
C
ln
ln
=
=
Certa perturbação na atividade de uma enzima aumenta em 5% a taxa da reação isolada. Esta mesma perturbação quando incluído o sistema
metabólico leva a um aumento no fluxo de 2%... É dito que o coeficiente do controle de fluxo desta enzimas é igual a 2/5 ou 0,4.
Se a mesma perturbação causa um decréscimo de 10% na concentração do substrato da enzima, esta enzima tem um coeficiente do controle de
Coeficientes de Elasticidade
A elasticidade é uma propriedade local de uma enzima isolada que expressa como sua taxa varia com a concentração de qualquer metabólito que a afeta: substrato, produto ou qualquer outro metabólito.
Uma elasticidade de 0.5 com respeito ao substrato significa que um aumento de 2% na concentração de susbstrato irá aumentar em 1% a taxa da reação catalisada por esta enzima (0.5 x 2%).
! elasticidades para o substrato são positivas (exceto sob condições de inibição pelo substrato);
! elasticidades para o produto são negativas (exceto sob condições de inibição pelo produto);
Sujando as mãos:
Abordagens Experimentais
Métodos para determinação dos FCCs:
! métodos diretos – coeficientes de controle são
determinados diretamente do fluxo e as medidas de
atividade seguem pequenas (mas finitas) mudanças na
atividade;
! métodos indiretos – coeficientes de elasticidade e de
controle são calculados a partir dos teoremas da MCA;
! a partir de medidas nas concentrações dos metabólitos em
estado transiente (i.e. entre uma perturbação e o estado
estacionário), Delgado & Liao (
1992a
,
b
).
Métodos Diretos – Métodos de Perturbação
A forma óbvia de determinar os coeficientes de controle é seguir a definição dos mesmos, i.e.
perturbar um passo metabólico,
deixar o sistema encontrar um novo estado estacionário e;
então medir a alteração na variável de interesse.
Existem várias formas de perturbar a taxa de uma reação...
(i) Mudança na concentração da enzima por meios genéticos – técnicas de
biologia molecular permitem o controle da expressão da enzima a nível genético (ex. Flint et al. (1981) e Niederberger et al. (1992) ou Fell (1992))
(ii) Titulação com enzima purificada – extratos livres de células são usados no procedimento onde se considera que todas as demais enzimas do caminho metabólico (enzimas auxiliares) sao fornecidas em excesso e portanto a respectiva contribuição no controle do fluxo é reduzida
(ex. Torres et al. (1986) ou Fell (1992) )
(iii) Titulação com inibidores específicos – quando o fluxo resultante da titulação da atividade da enzima in vivo é mensurado, estima-se o coeficiente de resposta com relação ao inibidor
Uso de inbidor específico
Cada perturbação deve afetar apenas um passo do caminho metabólico. Para fazer uma fotografia completa do controle de uma dada variável, o mesmo procedimento deve ser repetido em cada passo do sistema.
Problemas associados com estas abordagens:
(i) perturbações devem ser pequenas (1%) – o estado estacionário muda quando as perturbações são finitas existindo erros associados a estas perturbações (quanto maior a perturbação, maior o erro). Porem, perturbações muito pequenas são difíceis de serem mensuradas… usual: 10%.
(ii) inibidores devem ser específicos – não afetar outras reações do sistema (nem sempre se consegue preencher este requisito).
(iii) taxa de reação deve mudar linearmente com a concentração da
enzima, se queremos usar a concentração enzimática como parâmetro a perturbar. Os coeficientes de controle são normalmente definidos como coeficientes de resposta pois as enzimas sofrem influência de efetores externos.
MCA da Biossíntese
de Penicilina
ACVS:
!sofre inibição por feedback do produto LLD-ACV
!efetores da taxa de reação – ATP, AMP, pirofosfato, fosfato, CoA e Mg2+
!ATP estimula a reação
!AMP e pirofosfato inibem a reação
IPNS:
!ferro dependente
!sensível a variações na [OD] – cinética 1a. ordem
Coeficientes de Elasticidade:
ACVS – negativo, i.e. aumento na concentração de LLD-ACV diminui a taxa de síntese deste produto e a magnitude do coeficiente de elasticidade aumenta durante a condução do processo em batelada alimentada devido ao aumento da concentração deste composto. IPNS – positivo, i.e. o efeito do aumento na concentração de LLD-ACV é positivo e
magnitude deste efeito diminui ao longo da batelada devido à saturação de IPNS pelo seu substrato
Coeficientes de Controle de Fluxo:
ACVS – inicialmente é alto (próximo a 1) dada a baixa inibição pelo produto
Conforme a [LLD-ACV] aumenta, o controle do fluxo metabólico troca de
forma gradual da enzima ACVS para a enzima IPNS. Após 70 h de processo, o fluxo é controlado primariamente por IPNS.
Nenhuma das duas enzimas pode ser identificada como responsável pela etapa limitante do processo.
FCCs não são constantes para um
dado caminho metabólico
