UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical
RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INOCULAÇÃO
ARTIFICIAL DE Fusarium verticillioides EM SEMENTES
DE MILHO
LILIANE SILVA DE BARROS
C U I A B Á – MT 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical
RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INOCULAÇÃO
ARTIFICIAL DE Fusarium verticillioides EM SEMENTES
DE MILHO
LILIANE SILVA DE BARROS Engenheira Agrônoma
Orientador: Profº. Dr. SEBASTIÃO CARNEIRO GUIMARÃES Co-orientadora: Profª. Dra. LEIMI KOBAYASTI
Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso, para obtenção do título de Mestre em Agricultura Tropical.
C U I A B Á – MT 2011
B277r Barros, Liliane Silva de
Restrição hídrica na inoculação artificial de Fusarium
verticillioides em sementes de milho / Liliane Silva de Barros. –
2011.
45 f. : il. ; color. ; 30 cm.
Orientador: Prof. Dr. Sebastião Carneiro Guimarães Co-orientadora: Profª. Drª. Leimi Kobayasti.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária, Pós-graduação em Agricultura Tropical, 2011.
Bibliografia: f. 40-45.
1. Milho – Doenças. 2. Milho – Fungos – Transmissão. 3. Sementes de milho – Fungos – Inoculação artificial. I. Título.
“Nenhuma grande vitória é possível sem que tenha sido precedida de pequenas vitórias sobre nós mesmos”
DEDICO
A Antônio de Barros e Elisete F. Silva Pelo amor incondicional, incentivo e compreensão
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo.
À Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Programa de Pós-Graduação em Agricultura Tropical (PPGAT), pela realização do curso de mestrado.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de estudos.
Aos professores Sebastião Carneiro Guimarães e Leimi Kobayasti pela orientação e contribuição para meu desenvolvimento profissional.
Aos funcionários do PPGAT, laboratórios de Fitopatologia e de Sementes pela convivência.
A empresa de sementes MONSANTO, pela concessão das sementes. A Andressa Iraides Adoriam pelo apoio fundamental no laboratório de Fitopatologia.
A minha irmã Angélica M. S. Barros, por compartilhar os momentos difíceis.
Aos amigos que me incentivaram e tornaram minha vida agradável e feliz durante esse período: Franciele Caroline & Daniel, Fábio Kempim, Renata Cabral, Larissa Fatarelli, Everton Oliveira, Lorena Tavares, Kelly Maas, Rafael Henrique e Ronnky Chaell.
RESTRIÇÃO HÍDRICA NA INOCULAÇÃO ARTIFICIAL DE Fusarium
verticillioides EM SEMENTES DE MILHO
RESUMO: A restrição hídrica tem sido utilizada nos meios de cultura com o
objetivo de inibir ou retardar a germinação das sementes. Visando a inoculação de Fusarium verticillioides em sementes de milho, foram avaliados os efeitos da restrição hídrica com os solutos KCl e NaCl nos potenciais de -0,6, -0,8, -1,0, -1,2 MPa, em relação ao crescimento micelial e produção de conídios de F. verticillioides, umidade das sementes inoculadas, porcentagem de sementes contaminadas e infectadas, germinação das sementes inoculadas e transmissão do fungo em milho. Não houve diferença significativa para produção de conídios de F. verticillioides e germinação de sementes inoculadas. Foi obtido nos potenciais de -0,6 a -1,0 MPa utilizando KCl, -0,6 e -0,8 MPa utilizando NaCl os melhores crescimentos miceliais e ainda relacionando os dois potenciais, o soluto KCl obteve maior crescimento nos potenciais de -0,8 a -1,2 MPa. A maior porcentagem de sementes contaminadas ocorreu nos potenciais de 0,6 a -1,2 MPa, independente do soluto utilizado. A maior porcentagem de sementes infectadas ocorreram nos potenciais de -1,0 e -1,2 MPa para o soluto KCl, entre -0,6 e -1,2 MPa para NaCl e -0,6 e -0,8 MPA quando comparado os dois solutos. A maior porcentagem de colmos e raízes infectados ocorreu entre -0,6 e -1,2 MPa independente do potencial utilizado.
WATER RESTRICTION IN ARTIFICIAL INOCULATION FOR
Fusarium verticillioides IN MAIZE SEEDES
ABSTRACT: The water restriction has been used in culture medium in order
to inhibit or delay seed germination of seeds. Aiming the inoculation of
Fusarium verticillioides in maize seeds, were assessed the effects of water
restriction with solutes KCl and NaCl at potentials of -0.6, -0.8, - 1.0, -1.2 MPa, comparing mycelial growth and conidial production of F. verticillioides, moisture of inoculated seeds, percentage of contaminated and infected seeds, germination of inoculated seed and also transmission of the fungus maize. There was no significant difference of conidia production of F.
verticillioides and germination of inoculated seeds. Was obtained at
potentials of -0.6 to -1.0 MPa using KCl, -0.6 and -0.8 MPa using NaCl the best mycelia growth and still relating the two potentials solute KCl obtained higher growth in potential from -0.8 to -1.2 MPa. The highest percentage of contaminated seeds occurred at potentials of -0.6 to -1.2 MPa independent of the solutes used. The highest percentage of infected seeds occurred at potentials of -1.0 and -1.2 for the solute KCl, between -0.6 and -1.2 Pa to NaCl and -0.6 and -0.8 and MPA when the two solutes where compared. The highest percentage of infected stems and roots occurred between 0.6 and -1.2 MPa independent of the potential used.
SUMÁRIO
página
1 INTRODUÇÃO... 09
2 REVISÃO DE LITERATURA... 11
2.1 Importância da cultura e doenças do milho... 11
2.2 Etiologia de Fusarium e sintomatologia da doença... 12
2.3 Relações hídricas... 14
2.4 Germinação de sementes em ambientes com restrição hídrica... 14
2.5 Crescimento de microrganismos em condições de estresse hídrico... 15 2.6 Metodologias de inoculação de fungos em sementes... 16
3 MATERIAL E MÉTODOS... 19
3.1 Obtenção e caracterização das sementes... 19
3.2 Obtenção, multiplicação e manutenção do inóculo... 19
3.3 Preparo do meio de cultura básico ... 20
3.4 Determinação do tempo para início da germinação das sementes de milho nos diferentes tratamentos... 20 3.5 Crescimento micelial e produção de conídios de F. verticillioides em meio de BDA sob restrição hídrica ... 21 3.6 Uso da estrição hídrica no processo de inoculação de F. verticillioides em sementes de milho... 22 3.6.1 Sanidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com F. verticillioides... 22 3.6.2 Germinação das sementes em laboratório... 23
3.6.3 Determinação do grau de umidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com F. verticillioides... 24 3.6.4 Transmissão de F. verticillioides das sementes de milho inoculadas artificialmente... 24 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 26
4.1 Determinação do tempo para início da germinação das sementes de milho nos diferentes tratamentos... 26 4.2 Crescimento micelial e produção de conídios de F. verticillioides em relação à restrição hídrica do substrato agarizado... 29 4.3 Uso da restrição hídrica no processo de inoculação de F. verticillioides em sementes de milho... 32 4.3.1 Sanidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com F. verticillioides... 32 4.3.2 Germinação das sementes ... 33
4.3.3 Determinação do grau de umidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com F. verticillioides... 35 4.3.4 Transmissão de F. verticillioides das sementes de milho inoculadas artificialmente... 36 5 CONCLUSÕES... 39
1 INTRODUÇÃO
O milho é uma cultura de grande importância econômica no Brasil, alcançando uma produção de 4.167 kg/ha na safra de 2011 no estado de Mato Grosso (Conab, 2010), porém aliado ao aumento de produtividade, também tem se observado maior interesse dos pesquisadores no controle de patógenos que são comumente encontrados na cultura, dentre esses, o
Fusarium verticillioides.
Esse patógeno é considerado um dos principais responsáveis pelo apodrecimento das sementes, baixos índices de vigor e germinação, além da aceleração do processo de deterioração durante o armazenamento (Goulart e Fialho, 1999; Machado et al., 2001a). Causa ainda, podridão rosada da espiga do colmo e raízes do milho, e é transmitido por sementes (Kimati et al., 2005).
Em estudos de detecção, epidemias, controle e demonstrações que fazem uso de sementes com o patógeno, mecanismos relacionados à resistência de variedades a esse microrganismo, torna-se necessário o uso de sementes com inóculo, inclusive em graus de contaminação diferenciados. Para isso, tem sido usados métodos de inoculação em plantas adultas; imersão de sementes à colônia de fungos em desenvolvimento e suspensão de conídios, porém, esses métodos têm sido questionados por permitirem baixos índices de transmissibilidade do patógeno, ou mesmo resultar na germinação das sementes devido o período de tempo de exposição das mesmas ao inóculo do fungo (Carvalho, 1999).
Além dos métodos mencionados, o uso da restrição hídrica ou condicionamento fisiológico em meio de cultura de Batata-Dextrose-Ágar (BDA) tem sido utilizado para inoculação de alguns fungos em sementes com a vantagem de permitir maior exposição dessas ao inóculo, desde que o potencial osmótico do meio restrinja a germinação das sementes e não prejudique o crescimento das colônias do patógeno (Machado et al., 2001a).
A técnica da restrição hídrica em meio de cultura já foi comprovada como sendo eficaz para a inoculação de vários fungos fitopatogênicos em diversas culturas. No entanto, o potencial osmótico e as substâncias utilizadas para promover a restrição hídrica, são variáveis entre espécies de fungos e de sementes.
Para tanto, o objetivo desse trabalho, foi avaliar a eficácia da técnica da restrição hídrica com a utilização de soluções de NaCl e KCl em diferentes potenciais osmótico na inoculação artificial de sementes de milho com F. verticillioides e sua transmissão.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Importância da cultura e doenças do milho
O milho é um importante representante da família das gramíneas, utilizadas para produção de alimentos tanto para espécie humana quanto para os animais, sendo fonte de vitaminas, carboidratos e minerais. No Brasil, o Estado do Paraná é o maior produtor, com 26% do total produzido no país, sendo a cadeia produtiva de suínos e aves os maiores consumidores, entre 70 e 80% do milho produzido no Brasil (Embrapa, 2009).
É uma planta de clima tropical sendo cultivada em volumes significativos em todo o mundo, preferencialmente, em condições de temperatura entre 25 e 30 ºC, tolerando temperaturas mais amenas desde que não ocorram geadas e que também não ultrapassem 40 ºC (Embrapa, 2009).
A exploração da cultura pode ser realizada durante o ano todo, utilizando-se irrigação e juntamente com o escalonamento da produção e o desenvolvimento de técnicas agrícolas, tem permitido um fluxo constante do produto para a comercialização (Moraes, 2010). A planta de milho pode ser aproveitada praticamente em sua totalidade. Após a comercialização das espigas, os restos da planta podem ser aproveitados para posterior incorporação ou como cobertura do solo para plantio direto, ou ainda, sendo triturado para compor a silagem para a alimentação animal.
Vários trabalhos de monitoramento têm indicado que algumas doenças de parte aérea: mancha branca, cercosporiose, helmintosporiose, enfezamento pálido e vermelho e as ferrugens estão adquirindo importância dependendo da região de ocorrência e condições de cultivo (Embrapa, 2006).
Existem também outras doenças denominadas de podridões de colmo e raíz: podridão de Stenocarpella, antracnose do colmo, podridão seca do colmo, podridão de Pythium e podridões bacterianas as quais tem ocorrido, com importância variável de ano para ano e de região para região (Embrapa, 2009).
As podridões do colmo podem ocorrer antes da fase de enchimento de grãos em plantas jovens e vigorosas ou após a maturação fisiológica dos grãos em plantas senescentes. Essas podridões se iniciam, geralmente, pelas raízes e pode ser causadas por vários fungos, entre eles, o F.
verticillioides, causador da podridão de Fusarium, doença considerada de
grande importância econômica, pois uma planta infectada pode apresentar os sintomas apenas após a polinização (Embrapa, 2009; Del Pont, 2010).
O fungo Fusarium spp., além de causar podridões, pode estar
associado a “damping-off” (tombamento de pré e pós-emergência),
podridões de raiz e podridão de sementes.
2.2 Etiologia de Fusarium e sintomatologia da doença
No gênero Fusarium são englobadas diversas espécies, desde as saprofíticas até aquelas patogênicas capazes de causar doenças e sérios danos em plantas. Possui ampla distribuição geográfica, com representativa ocorrência em todas as regiões do mundo (Menezes, 2009).
Algumas espécies são particularmente comuns no solo, onde podem persistir sob a forma de estruturas de resistência denominadas clamidósporos, ou como hifas, enquanto outras espécies produzem conídios que são disseminados pelo vento, colonizando, normalmente, ramos, folhas, inflorescências e frutos (Ventura, 1999).
O fungo F. verticillioides pertence ao Reino Fungi, Filo Ascomycota mitospórico/Ascomiceto, Classe Hyphomycetes/Plectomycetes, Ordem
Hyphomycetales/Hypocreales, Família Tuberculareaceae – Nectria
(teleomorfo) (Ventura, 2000; Luz, 2001). Caracteriza-se pela produção de conídios hialinos, septados, em forma de “canoa” e denominados de macroconídios. Estes são produzidos em esporodóquios, que consistem nas estruturas de frutificação do fungo. Algumas espécies produzem conídios em micélio aéreo, chamados de microconídios. Dependendo das condições ambientais, podem ocorrer alternâncias na produção de macro e microconídios (Santin, 2001).
Fusarium verticillioides Sacc. Niremberg (F. moniliforme Sheldon) é
um dos patógenos da cultura do milho e principal produtor de fumonisinas, produzindo micélio com aparência pulverulenta devido à abundante produção de microconídios, geralmente com coloração salmão, podendo apresentar-se laranja, púrpura ou violeta (Del Ponte, 2010).
É bastante comum a planta e os grãos estarem infectados pelo fungo e não apresentarem nenhum sintoma visível, denominada infecção assintomática (Santin, 2001). Causa a podridão rosada da espiga e do colmo, reduz a germinação das sementes e morte de plântulas em pré e pós-emergência (Goulart e Fialho, 1999; Machado et al., 2001a).
Esses sintomas também podem variar de acordo com a interação da planta com os fatores ambientais, como a temperatura do solo e do ar (Menezes, 2009), causando clorose da folha, murcha, descoloração vascular, necrose da haste e retardamento do crescimento. Por ser um patógeno cosmopolita, é responsável por importantes perdas na produção de milho no mundo, sendo altamente transmissível por sementes, além de possuir alta capacidade de multiplicação em restos de cultura (Del Ponte, 2010) e capaz de sobreviver no interior das sementes por longos períodos de tempo (Santin, 2001).
A podridão das sementes e até a morte de plântulas ocorre, principalmente, quando a semeadura é realizada em condições de estresse,
como alta umidade e baixa temperatura, que são mais comuns na região sul do Brasil (Kimati et al., 2005).
2.3 Relações hídricas
As relações hídricas, ou seja, qualquer processo dentro de um sistema em que a água esteja desempenhando atividade, envolve vários processos químicos e físicos (Carvalho, 1999). De acordo com o conceito de potencial hídrico, expresso em unidade de energia ou pressão, o mesmo corresponde à diferença entre potencial químico da água em um sistema, ou parte do sistema, e o potencial químico da água pura, nas mesmas condições de pressão atmosférica e temperatura. Ao potencial químico da água pura, atribui-se o valor de zero. Quando misturado a um soluto na água, o potencial é menor que zero e há nas moléculas de água em solução, menor quantidade de energia livre para mover-se (Cook e Papendick, 1978).
O potencial osmótico representa a diminuição do potencial hídrico, em função da concentração de solutos dissolvidos no interior da célula. A tendência natural da água é de fluir naturalmente por difusão, em gradiente decrescente de potencial hídrico, até que o equilíbrio se estabeleça. Assim, um sistema hídrico em equilíbrio, possui o mesmo potencial hídrico em todas as suas partes (Carvalho, 1999).
Vários produtos já foram utilizados no preparo de soluções para o ajuste do potencial hídrico de substratos, em estudos envolvendo o condicionamento osmótico de sementes de diferentes espécies, entre estes, sais como MgSO4, NaCl, MgCl2, K3PO4, KHPO4, glicerol, manitol e
polietileno glicol. Para o preparo de soluções com esses sais, em exceção, o polietileno glicol, utiliza-se a fórmula de Van’t Hoff citado por Salisbury e Ross (1991).
2.4 Germinação de sementes em ambiente com restrição hídrica
A germinação de sementes é uma sequência ordenada de eventos metabólicos que resulta na retomada do desenvolvimento do eixo embrionário, originando uma plântula (Carvalho e Nakagawa, 2000). Esse
processo é iniciado pela entrada de água na semente por embebição, e a velocidade de reidratação da semente depende da espécie, da permeabilidade do tegumento à água, da disponibilidade da água no solo, da composição química da semente, da temperatura, da pressão hidrostática e da condição fisiológica da semente (Carvalho e Nakagawa, 2000; Villela et al., 2003; Marcos Filho, 2005).
Para sementes, a técnica de condicionamento osmótico consiste em colocá-la em contato com uma solução em um potencial osmótico ajustado para que a semente absorva água até um nível em que todos os processos preparatórios à germinação ocorram, sem, contudo, atingir a fase de elongamento celular (Bradford, 1990). Durante as primeiras fases de embebição não provoca danos irreparáveis ao embrião fazendo com que essas sementes possam ser armazenadas para sua posterior utilização (Carvalho, 1999).
No reinício do crescimento embrionário, a semente de milho atinge teor de água de 30-35%, enquanto o embrião e o endosperma alcançam respectivamente, 50 a 55% e 25 a 30%. Em trabalhos realizado por Farias et al., (2003), a inibição total de germinação de sementes de milho com uso de NaCl ocorreu com potencial de -1,0 MPa e KCl entre -0,8 e -1,0 MPa. E com o uso de PEG 8000 no potencial de -1,0 MPa ainda ocorre germinação de
9% de sementes.
Em sementes de arroz, o uso de KCl, NaCl e manitol nos potenciais de -0,6 a -0,9 MPa é eficiente para inibir ou retardar a germinação das sementes. O mesmo foi verificado para sementes de feijão nos potenciais de -0,4 a -0,7 MPa (Coutinho et al., 2001).
2.5 Crescimento de microrganismos em condições de estresse hídrico
Uma célula microbiana, com potencial hídrico menor que o ambiente que a circunda, absorverá água até que o equilíbrio se estabeleça. O processo inverso resulta em perda de turgor, com posterior dessecação e morte da célula, a não ser que o microrganismo desenvolva estrutura de resistência ou mecanismo de osmorregulação (Cook e Papendick, 1978).
O crescimento de cada microrganismo é influenciado não somente pelo potencial hídrico do substrato, mas também pelo pH, temperatura, habilidade de absorver água do ambiente, entre outros fatores; com isso, fungos que se desenvolvem melhor em ambientes mais úmidos terão seu desenvolvimento prejudicado com a utilização de potenciais hídricos mais baixos e vice-versa (Carvalho, 1999; Farias et al., 2004).
O fungo Colletotrichum lindemuthianum teve seu crescimento micelial até o nível de restrição hídrica de -0,61 MPa, tendendo a declínio em potenciais mais negativos até a restrição de -1,0 MPa (Carvalho et al., 2001).
Bipolaris sorokiniana não teve seu crescimento afetado em níveis de até -0,8
MPa (Farias et al., 2004).
Em estudo realizado por Coutinho et al.,(2001), foi verificado que a restrição hídrica até -0,9 MPa não afetou o crescimento micelial dos fungos
Drechslera oryzae, Gerlachia oryzae, Phoma sorghina, Pyricularia grisea, Colletotrichum lindemuthianum e Rhizoctonia solani. Porém, Machado,
(2002), relatou que Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum teve seu maior crescimento no potencial de -0,6 MPa, e o fungo Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum teve seu máximo crescimento no potencial de -0,82 MPa.
De maneira geral, observa-se que o crescimento dos fungos é estimulado até um nível ótimo, declinando sob potenciais hídricos muito negativos, normalmente acima de -1,0 MPa (Farias et al., 2004).
2.6 Metodologias de inoculação de fungos em sementes
A inoculação de fungos em plantas ou parte de plantas, é um artifício bastante utilizado por pesquisadores, capaz de garantir a identidade do patógeno em estudos envolvendo os vários aspectos da interação patógeno e hospedeiro (Carvalho, 1999). Lembrando que sob a visão da patologia de sementes, uma semente encontra-se infectada quando o inóculo do patógeno está presente no interior dos tecidos da mesma, como por exemplo, no tegumento, endosperma ou embrião. Quando o inóculo está aderido à superfície da semente, esta se encontra contaminada (Machado, 1988).
Vários métodos de inoculação já foram testados, como exemplo, em plantas adultas que é um procedimento demorado e, às vezes, pouco eficiente, pois a transmissão de patógeno da planta para a semente constitui um processo dinâmico, dependente de vários fatores inerentes ao patógeno, ao hospedeiro e ao meio ambiente (Machado, 1994).
O método de imersão das sementes em suspensão de conídios não é considerado muito eficaz devido o curto período de tempo que as sementes ficam em contato com o inóculo, ao desencadeamento de modificações físicas e fisiológicas e o início do processo de embebição das sementes (Garrido et al., 1996). Em trabalho conduzido por Souza et al., (2008), foram observadas menor germinação de sementes quando inoculou-se Fusarium
oxysporum f. sp. vasinfectum em sementes de algodoeiro quando
comparado à técnica de restrição hídrica. Pedroso (2009) obteve mesma eficiência de inoculação de Alternaria spp. em sementes de Apiáceas quando comparadas com a técnica da restrição hídrica.
O método de inoculação a partir do contato das sementes com a colônia fúngica resulta em maior eficiência em relação à imersão das mesmas em suspensão de conídios devido ao maior período de exposição dessas ao fungo e causa menores danos na germinação podendo as mesmas serem secas e armazenadas para estudos posteriores (Tanaka e Menten, 1991). O tempo de contato das sementes com a colônia fúngica depende da cultura utilizada e do fungo em questão (Tanaka et al, 1989; Carvalho, 1999).
Outros métodos de inoculação como, misturar uma formulação em pó de caulim + esporos do fungo ou massa de micélio + esporos às sementes, podem ser utilizados, principalmente, para fungos de armazenamento, tendo como vantagem o fato de que as sementes podem ser inoculadas secas, mantendo sua condição inicial (Carvalho, 1999). O método de perfuração do solo e imersão de raízes em suspensão de conídios (Cavalcanti et al., 2002), também são relatados na literatura.
O método de inoculação através da técnica da restrição hídrica reduz a água disponível no meio de cultura, via adição de solutos, ajustando-os a
potenciais hídricos que não permitem absorção de água suficiente para que ocorra ou retarde a germinação das sementes (Henning, 2004), permitindo tempo maior de contato com o inóculo.
O sucesso ao inocular sementes de duas cultivares de pepino com F.
verticillioides através dessa técnica, foi obtida por Menezes, (2009), assim
como Machado, (2002) e Machado et al., (2001a), ao inocular Colletotrichum
gossypii, C. gossypii var. cephalosporioides, Botryodiplodia theobromae, Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum em sementes de algodão e Diplodia maydis, Cephalosporium acremonium, Fusarium moniliforme em sementes
de milho com uso de manitol. De acordo com Machado et al., (2001b) a inoculação de sementes de soja com Colletotrichum truncatum, Phomopsis
sojae e Sclerotinia sclerotiorum por meio dessa técnica não afeta a
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos na Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária (FAMEV), da Universidade Federal de Mato Grosso – MT, Campus de Cuiabá, nos Laboratórios de Fitopatologia e de Sementes, e também em casa de vegetação.
3.1 Obtenção e caracterização das sementes
Foram utilizadas sementes de milho do híbrido AS1590YG, obtidos na Empresa de sementes Monsanto, Campo Verde – MT, que analisadas de acordo com testes padrões, recomendados e descritos nas Regras para Análise de Sementes (Brasil, 2009), apresentaram 100% de germinação, 12% de Fusarium verticillioides, 12,5% de Penicillium spp., 2,5% de
Aspergillus spp. e grau de umidade de 11%.
3.2 Obtenção, multiplicação e manutenção do inóculo
O fungo F. verticillioides foi isolado a partir de sementes de milho, que foram submetidas a “Blotter test”, incubadas a 25 °C com fotoperíodo de 12 horas, durante sete dias. Após este período, as sementes com a presença do fungo foram utilizadas para isolamento do mesmo em meio de BDA (batata-dextrose-ágar) e incubado durante sete dias, a 25 °C, em fotoperíodo de 12 horas. Em seguida, o isolado foi transferido e mantido em tubos de ensaio contendo meio de BDA + óleo mineral.
3.3 Preparo do meio de cultura básico
O meio de cultura utilizado foi o meio sólido BDA. Para a obtenção dos tratamentos de restrição hídrica do referido meio, foram utilizadas soluções de NaCl e KCl separadamente, utilizando materiais P. A. (pureza analítica). Para efeito de cálculo, foi considerada a temperatura de 25 °C e os potenciais hídricos de -0.60, -0.80, -1.00, -1.20 MPa, obtido por meio da fórmula de Van’t Hoff citado por Salisbury e Ross (1991) (conforme Tabela 1), mais a testemunha água e BDA (-0,35 MPa), sem adição dos restritores.
Ψos = -i RTC
sendo:
Ψos = Potencial osmótico (MPa)
i = Coeficiente isotônico
R = Constante geral dos gases perfeitos (0,0083 MPa x 1 x mol-1 x K-1) T = Temperatura absoluta (ºK)
C = Concentração (mol/L)
Tabela 1. Concentrações de NaCl e KCl no meio de cultura básico para a
obtenção dos respectivos níveis de restrição hídrica para meio de BDA de acordo com Van’t Hoff.
Soluto Restrição hídrica do meio de cultura básico (MPa)
-0,60 -0,80 -1,00 -1,20
NaCl (g/L) 7,6 10,2 12,7 15,3
KCl (g/L) 9,8 13,1 16,4 19,7
3.4 Determinação do tempo para germinação das sementes de milho nos diferentes tratamentos
Inicialmente, as sementes foram desinfestadas superficialmente em solução de hipoclorito de sódio a 2%, com posterior lavagem em água destilada e esterilizada e secagem em câmara de fluxo laminar por 4 horas.
As sementes foram colocadas em placas contendo 40 ml de substrato BDA + tratamento (-0,60, -0,80, -1,0 e -1,2 MPa de KCl e NaCl separadamente) e testemunha (-0,35 MPa). As mesmas foram distribuídas ao acaso em uma câmara de incubação e as avaliações foram feitas
diariamente pela contagem das sementes com início de germinação nos tempos de 24, 48, 72 e 96 horas, para estabelecimento de tempo de contato das sementes mais meio de cultura com restritor hídrico.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com oito repetições, sendo cada repetição uma placa de Petri de 15 cm de diâmetro com 25 sementes. O esquema de análise de variância foi composto por dois ensaios separados: soluto KCl com quatro potenciais mais a testemunha e soluto NaCl com quatro potenciais mais a testemunha. O contraste de médias para comparar tratamentos nos parâmetros avaliados foi realizado pelo teste F e as médias entre os tratamentos foram comparadas por meio de regressão.
3.5 Crescimento micelial e produção de conídios de F. verticillioides em meio de BDA sob restrição hídrica
Foram retirados discos de 0,5 cm de diâmetro das bordas das colônias puras de F. verticillioides e transferidas para o centro de placas de Petri de 9 cm de diâmetro contendo BDA+tratamento. Essas placas foram incubadas a 25 °C em fotoperíodo de 12 horas até que 50% das parcelas de algum dos tratamentos tomasse 3/4 da placa.
A avaliação diária foi realizada por meio da medição dos diâmetros das colônias nos dois sentidos perpendiculares entre si, com auxílio de régua, tomando-se como valor de crescimento a média dos dois eixos. O ensaio constou de 9 tratamentos em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições, sendo cada repetição uma placa de Petri. O esquema da análise de variância foi fatorial 2 x 4 + 1 (dois solutos, quatro potenciais osmóticos mais a testemunha).
Para quantificação do número de conídios nos diferentes meios, foram adicionados 10 mL de água destilada à placa de Petri e misturados com o auxílio de um pincel, para facilitar a liberação dos conídios. Essa suspensão obtida foi filtrada em dupla camada de gase. Três alíquotas de cada placa foram amostradas para determinar a concentração de conídios com auxílio de câmara de Neubauer e microscópio. A quantificação de
conídios foi realizada logo após a medição das colônias. O ensaio constou de nove tratamentos em delineamento inteiramente casualizado utilizando três repetições, sendo cada repetição composta por uma placa de Petri e para cada placa utilizada, três alíquotas. O esquema de análise de variância foi fatorial 2 x 4 + 1 (dois solutos, quatro potenciais osmóticos mais a testemunha). O contraste de médias para comparar tratamentos nos parâmetros avaliados para os dois ensaios foi realizado pelo teste F e as médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste Scott Knott (P≤ 0,05).
3.6 Uso da restrição hídrica no processo de inoculação de F.
verticillioides em sementes de milho
Para inoculação, foram utilizadas placas de Petri contendo 40 ml de substrato BDA + restritor hídrico + patógeno e em contato com as sementes. As placas foram distribuídas ao acaso e mantidos em câmara de incubação a 25 ºC e fotoperíodo de 12 horas, onde permaneceram até o tempo prédeterminado de acordo com o resultado do ensaio anterior (item 3.4) (KCl: 0,35 = 24 h; 0,6 MPa = 25,3 h; 0,8 MPa = 25,5 h; 1,0 MPa = 28,3 h MPa; -1,2 MPa = 29,2 h e para NaCl: -0,35 = 24 h; -0,6 MPa = 26 h; -0,8 MPa = 26 h; -1,0 MPa = 26 h e -1,2 MPa = 27 h). Após os períodos de exposição, as sementes foram colocadas para secar sobre folhas de papel filtro por 24 h, em condições assépticas sobre bancada em sala isolada, em temperatura ambiente em torno de 30º C. Em seguida, as sementes foram armazenadas em sacos de papel Kraft. Foram amostradas sementes ao acaso de cada tratamento para avaliação de umidade e as demais foram mantidas em temperatura de 20°C até a realização dos demais testes.
3.6.1 Determinação do grau de umidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com F. verticillioides
Foram pesadas amostras de sementes de cada repetição, de cada tratamento e levadas a estufa por 24 horas, com temperatura constante de 105 ± 3 °C (Brasil, 2009). O resultado final foi expresso pela média aritmética
em porcentagens da amostra. O teor de umidade das sementes foi calculado através da seguinte fórmula:
% U = PU – PS x 100 PU – T
Onde: PU= peso úmido da semente + peso do recipiente PS= peso seco da semente + peso do recipiente T= tara (recipiente)
O ensaio constou de nove tratamentos em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições (5 g de sementes). O esquema de análise de variância foi fatorial 2 x 4 + 1 (dois solutos, quatro potenciais osmóticos, mais testemunha). O contraste de médias para comparar tratamentos nos parâmetros avaliados foi realizado pelo teste F e as médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste Scott Knott (P≤ 0,05).
3.6.2 Sanidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com
F. verticillioides
As sementes oriundas da etapa de inoculação, após dois dias de armazenamento foram avaliadas quanto a infecção por F. verticillioides, com e sem desinfestação superficial.
Para a avaliação sem desinfestação superficial das sementes, as amostras foram colocadas em placas de Petri contendo três folhas de papel filtro umedecidos com solução de água+restritor hídrico com potencial de -1,0 MPa utilizando NaCl. Após este procedimento, as placas foram mantidas em câmara de incubação por sete dias a 25 °C, com fotoperíodo de 12 horas.
Para o ensaio de sementes desinfestadas superficialmente, as mesmas foram colocadas em solução de hipoclorito de sódio a 2% por um minuto e enxaguadas em água destilada e esterilizada antes da incubação.
O ensaio constou de nove tratamentos em delineamento inteiramente casualizado com oito repetições, sendo cada repetição uma placa com 25 sementes. O esquema de análise de variância foi fatorial 2 x 4 + 1 (dois
solutos, quatro potenciais osmóticos mais testemunha). O contraste de médias para comparar tratamentos nos parâmetros avaliados foi realizado pelo teste F e as médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste Scott Knott (P≤ 0,05).
Todas as sementes foram analisadas com auxílio de microscópios estereoscópio e ótico para avaliação de presença do fungo e os resultados foram expressos em porcentagem.
3.6.3 Germinação das sementes
Para avaliação do poder germinativo das sementes inoculadas artificialmente, foram utilizadas sementes em papel germiteste umedecido com água destilada na proporção de 2,5 vezes a massa do papel seco e colocadas em germinador regulado à temperatura de 20 – 30 °C, conforme prescrito pelas Regras para Análise de Sementes (Brasil, 2009). As avaliações de plântulas normais e mortas foram realizadas no quarto dia e expressos em porcentagem.
O ensaio constou de nove tratamentos em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições, sendo cada repetição composta por 50 sementes. O esquema de análise de variância foi fatorial 2 x 4 + 1 (dois solutos, quatro potenciais osmóticos, mais testemunha). O contraste de médias para comparar tratamentos nos parâmetros avaliados foi realizado pelo teste F e as médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste Scott Knott (P≤ 0,05).
3.6.4 Transmissão de F. verticillioides das sementes de milho inoculadas artificialmente
Foi realizado ensaio em casa de vegetação por meio do plantio das sementes inoculadas artificialmente, em vasos de 2,5 L de solo estéril. As plantas foram mantidas por 26 dias após a germinação. A irrigação foi feita diariamente, colocando-se a mesma quantidade de água para todos os tratamentos e após 18 dias, foi realizado adubação de cobertura com nitrogênio conforme Ribeiro et al., (1999), baseado no resultado da análise
do solo utilizado. As plantas foram coletadas na casa de vegetação e colocadas em sacos de papel identificado e levadas ao laboratório onde foram lavadas, feita a separação de colmo e raízes com auxílio de tesoura e desinfestação superficial de todo material com álcool e hipoclorito de sódio a 2%. A confirmação da presença de F. verticilloides foi realizada através da incubação em câmara úmida dos colmos e raízes das plantas de milho, e posterior identificação do patógeno com auxílio de microscópios estereoscópio e ótico.
O ensaio constou de nove tratamentos em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições, sendo cada repetição composta por três vasos com duas plantas cada. O esquema de análise de variância foi fatorial 2 x 4 + 2 (dois solutos, quatro potenciais osmóticos, mais dois adicionais: semente não submetida ao processo de inoculação e semente não submetida ao processo de inoculação e tratada com Fludioxonil+metalaxyl-M na dosagem de 150 mL/100 kg de sementes). O contraste de médias para comparar tratamentos nos parâmetros avaliados foi realizado pelo teste F e as médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste Scott Knott (P≤ 0,05).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1- Determinação do tempo para início da germinação das sementes de milho nos diferentes tratamentos
Os resultados do pré-condicionamento das sementes de milho quando em contato com meio de BDA, indicaram que a adição de KCl e NaCl como restritores hídricos proporcionaram o retardamento na germinação das sementes quando comparado com a testemunha, BDA sem os solutos.
Houve significância (P < 0,05) para meio de BDA+KCl relacionado à germinação das sementes de milho e pode ser observado na Tabela 2 e Figura 1.
Tabela 2. Equações de regressão em diferentes níveis de potencial
osmótico em meio de BDA+KCl, sendo a testemunha BDA sem soluto (-0,35 MPa). G = tempo para início de germinação (horas).
Potencial (MPa) Equação R2 G
-0,35 - 0,0414x2 + 6,2427x – 121,6250 0,9487 24
-0,6 -0,0217x2 + 4,0625x – 87,5000 0,9818 25,3
-0,8 -0,0139x2 + 3,1625x – 71,7500 0,9576 25,5
-1,0 -0,0059x2 + 2,1635x – 51,1250 0,9790 28,3
A
B
E
C
D
NaCl NaCl NaCl NaCl KCl KCl KCl KClFIGURA 1. Germinação de sementes de milho submetidas à incubação em
meio de BDA, sem restrição hídrica (A) e com solutos NaCl e KCl na concentração de -0,6 (B), -0,8 (C), -1,0 (D) e -1,2 MPa (E), após 96 h.
O início de emissão de radícula pelas sementes no tratamento em meio de BDA sem soluto ocorreu a partir de 24 h., enquanto que nos tratamentos BDA+KCl, ocorreu a partir 25,3 h. à -0,6 MPa, seguidos de 25,5 h. à -0,8 MPa, 28,3 h. à -1,0 MPa e 29,2 h. à -1,2 MPa (Figura 1). Portanto, observou-se que quanto mais negativo o potencial utilizado maior o tempo de exposição das sementes em contato com o meio e houve atraso na grminação das sementes.
O tempo máximo de início de germinação das sementes foi de 29,2 h, no potencial de -1,2 MPa. Esse atraso na germinação em maiores concentrações de soluções osmóticas tem sido atribuída à redução de quantidade de água absorvida pelas sementes em meio salino (Braccini et al., 1996). Conforme também observado no trabalho de Menezes (2009),
utilizando sementes de pepino verificou que a germinação iniciou a partir de 48 h de exposição das sementes em meio de BDA + manitol a -0,8MPa.
Para os tratamentos com BDA+NaCl nos potenciais de -0,6, -0,8, -1,0 e -1,2 MPa, os tempos de início de germinação das sementes foram de 26, 26,1; 26,2 e 27 h, respectivamente. A testemunha iniciou a germinação com 24 h e quanto mais próximo do potencial de -1,2 MPa, maior o atraso para início da germinação (Tabela 3 e Figura 1).
Tabela 3. Equações de regressão em diferentes níveis de potencial
osmótico em meio de BDA+NaCl, sendo a testemunha BDA sem soluto (-0,35 MPa). G = tempo para início de germinação (horas).
Potencial (MPa) Equação R2 G
-0,35 -0,0414x2 + 6,2427x – 121,6250 0,9487 24
-0,6 -0,0161x2 + 3,4396x – 77,7500 0,9459 26
-0,8 - 0,0171x2 + 3,5594x – 796250 0,9540 26,1
-1,0 - 0,0152 x2 + 3,3437x – 76,2500 0,9392 26,2
-1,2 -0,0110x2 + 2,8885x – 69,1250 0,9039 27
Com a utilização do soluto NaCl foi possível manter as sementes em contato com substrato em meio agarizado por um período máximo de 27 h Após esse período, as sementes iniciaram a absorção de água em quantidade suficiente para início de emissão da radícula.
Em sementes de soja, por exemplo, a inibição da germinação ocorreu a partir de -0,3 MPa, com a utilização de NaCl e manitol, sendo mais acentuada com a utilização do soluto NaCl (Braccini et al., 1996). Para sementes de feijão, utilizando esse mesmo nível de restrição e substrato BDA+PEG-6000, a emissão da radícula ocorreu no sexto dia de exposição das sementes (Carvalho, 1999). Neste trabalho, o potencial de -0,6 MPa independente se utilizado NaCl ou KCl como soluto, o início de emissão da raiz primária ocorreu no primeiro dia de exposição.
À medida que decresceram os níveis de potencial osmótico, observou-se aumento no tempo de início da germinação, indo de 25,3 a 24 h quando utilizado o potencial -0,6 nos meios BDA+KCl e BDA+NaCl, respectivamente, até 29,2 e 27,0 h, quando utilizado o potencial de -1,2 MPa e os tratamentos BDA+KCl e BDA+NaCl. Isso se deve à menor quantidade
de água absorvida pelas sementes, levando a diminuição do metabolismo, consequentemente, menor disponibilidade de água para digestão de reservas e translocação dos produtos metabolizados (Braccini et al., 1996).
Neste trabalho, verificaram-se tempos parecidos entre os solutos utilizados na redução da germinação das sementes. Observou-se uma maior redução no início de germinação das sementes de milho quando na presença do soluto KCl (Figura 1, Tabela 2 e 3), o mesmo encontrado por Farias et al., (2003), quando comparou os solutos KCl, NaCl, manitol, PEG8000 e sacarose em sementes de feijão. Já o processo de germinação é totalmente inibido a partir do potencial de -1,2 MPa, quando utiliza-se NaCl ou KCl como soluto (Machado Neto et al., 2006). Para sementes de algodão, a germinação é iniciada a partir de 53 h de contato da semente com o substrato, quando utilizado solução osmótica de manitol a -1,0 MPa (Souza et al., 2008).
Essa diferença dos valores de início de germinação, quando utilizados NaCl e KCl, pode ser devido a diferença iônica entre os solutos, mesmo com mesmo potencial hídrico utilizado, além das diferenças entre sementes de cada espécie (Machado Neto et al., 2006). O efeito iônico pode facilitar a penetração de solutos nas células em níveis tóxicos e inibir a síntese de enzimas hidrolíticas necessárias à germinação das sementes provocada por sais em altas concentrações (Campos e Assunção, 1990).
4.2- Crescimento micelial e produção de conídios de F. verticillioides em relação à restrição hídrica do substrato agarizado.
Nesse ensaio, verificou-se crescimento micelial e produção de conídios de F. verticillioides em meio de BDA mais os restritores hídricos KCl e NaCl. Houve comportamento diferenciado do crescimento micelial de F.
verticillioides em relação ao potencial osmótico e solutos utilizados enquanto
que para a produção de conídios, não houve diferença significativa entre os tratamentos.
De acordo com a análise, verificou-se que os maiores crescimentos miceliais ocorreram entre os potenciais de -0,6 a -1,0 MPa utilizando soluto
KCl e nos potenciais de -0,6 e -0,8 MPa utilizando o soluto NaCl (Tabela 4, Figuras 2 e 3).
Tabela 4. Crescimento micelial de F. verticillioides (cm) em substrato
agarizado* modificado osmoticamente com os solutos KCl e NaCl
Soluto Potencial osmótico (MPa)
-0,35 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2
KCl 4,09bA 4,28aA 4,31aA 4,23aA 4,14bA
NaCl 4,0bA 4,16aA 4,08aB 4,03bB 3,90cB
CV 4,08%
Médias seguidas de letra minúscula na linha e maiúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.*BDA- batata-dextrose-ágar BDA+NaCl -0,6 MPa BDA BDA+NaCl -1,0 MPa BDA+NaCl -0,8 MPa BDA+NaCl -1,2 MPa
FIGURA 2. Colônias de F. verticillioides em meio de BDA, sem restrição
BDA
BDA+KCl -0,6 MPa BDA+KCl -0,8 MPa
BDA+KCl -1,0 MPa BDA+KCl -1,2 MPa
FIGURA 3. Colônias de F. verticillioides em meio de BDA, sem restrição
hídrica e BDA+KCl nos diferentes potenciais.
Existe para cada microrganismo uma faixa adequada de potencial hídrico para o crescimento e meios de cultura osmoticamente modificados, pois estes diferem na habilidade de absorver água do ambiente (Carvalho,1999; Coutinho et al., 2001).
Os potenciais entre -0,6 e -1,0 MPa estimularam o desenvolvimento da colônia fúngica de F. verticillioides quando utilizado BDA+KCl. No potencial de -1,2 MPa o crescimento micelial foi de 4,14 cm, semelhante a utilização de BDA padrão que obteve 4,09 cm. Já para BDA+NaCl, os maiores crescimentos ocorreram nos potenciais de -0,6 e -0,8 MPa. Segundo Machado (2004), o crescimento micelial de Botryodiplodia
theobromae e Colletotrichum gossypii em meio de BDA+manitol, não foi
prejudicado pelos diferentes potenciais hídricos utilizados (-0,4 a -1,0 MPa). Enquanto F. oxysporum f. sp. vasinfectum foi estimulado, visto que, no meio
sem restrição hídrica, o índice do crescimento micelial foi menor que nos demais potenciais.
O crescimento de F. verticillioides foi favorecido pelo uso do soluto KCl entre os potenciais de -0,8 à -1,2 MPa, já para Bipolaris sorokiniana em trabalho realizado por Farias et al., (2004), o crescimento micelial foi estimulado até -0,8 MPa com a utilização de KCl. Neste ensaio, o meio sem restrição hídrica proporcionou crescimento micelial maior que no potencial de -1,2 MPa utilizando NaCl.
As colônias de F. verticillioides apresentaram coloração salmão em todos os meios utilizados, independente do soluto, não diferindo da coloração da testemunha, sendo que a coloração do micélio pode apresentar-se de cor laranja, púrpura ou violeta (Del Ponte, 2010).
A não diferenciação da coloração do micélio pode ser um indicativo de que os potenciais utilizados não alteram a produção de conídios. O mesmo aconteceu em trabalho realizado por Machado (2002), onde a produção de conídios de Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum não foi diferente estatisticamente quando utilizado o soluto NaCl entre os potenciais de -0,4 a -1,2 MPa, diferente para o fungo Colletotrichum gossypii onde a produção de conídios foi favorecida no potencial osmótico de -0,9 MPa.
4.3 Uso da restrição hídrica no processo de inoculação de F.
verticillioides em sementes de milho
4.3.1 Sanidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com
F. verticillioides
De acordo com os resultados das análises anteriores, foi possível escolher os tempos dentro de cada potencial e soluto a ser utilizado no procedimento de inoculação das sementes de milho com F. verticillioides.
Para sementes contaminadas, houve diferença significativa apenas entre os potenciais utilizados foram obtidos 100% de sementes com F.
verticillioides em qualquer um dos potenciais, diferindo apenas da
Tabela 5. Porcentagem de sementes de milho contaminadas com F.
verticillioides em diferentes níveis de potencial osmótico nos
meios BDA+NaCl e BDA+KCl
Soluto Potencial osmótico (MPa)
-0,35 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2
KCl e NaCl 86,50b 100a 100a 100a 100a
CV 10,94%
Médias seguidas de letra minúscula não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Para F. verticillioides, foi observado que a utilização de BDA+KCl ou BDA+NaCl a -0,6 MPa em 25,3 horas, obteve-se 100% de sementes contaminadas. Em trabalhos sobre inoculação de Cercospora kikuchii em sementes de soja, todos os períodos de contato das sementes com o patógeno a partir de 4 horas, foram suficientes para o mesmo ficar aderido às sementes (Galli et al., 2005).
No ensaio relacionado a sementes com desinfestação superficial, observou-se que a utilização do soluto KCl, nos potenciais de -1,0 e -1,2 MPa, obteve-se 86 e 90,5% de sementes de milho infectadas. Para o soluto NaCl, a porcentagem de sementes infectadas diferiu-se apenas da testemunha. A diferenciação entre solutos ocorreram nos potenciais de -0,8 e -1,0 MPa, ocorrendo maior infecção quando utilizado NaCl (Tabela 6).
Tabela 6. Porcentagem de sementes de milho infectadas com F.
verticillioides em diferentes níveis de potencial osmótico nos
meios BDA+NaCl e BDA+KCl
Soluto Potencial osmótico (MPa)
-0,35 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2
KCl 59,50dA 71,50cB 78,0bB 86,0aA 90,50aA
NaCl 59,59bA 91,50aA 92,0aA 92,50aA 86,50aA
CV 11,51%
Médias seguidas de letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
4.3.2 Germinação das sementes
Não houve diferença significativa na germinação das sementes contaminadas ou infectadas, independente do potencial osmótico e soluto utilizado, pois ocorreu 100% de germinação após a inoculação (Figura 4),
sugerindo que qualquer potencial pode ser utilizado sem causar danos à semente.
Figura 4. Sementes de milho germinadas após processo de inoculação
artificial com F. verticillioides.
Em trabalhos realizado por Reis e Goulart, (1998) e Galli et al., (2005) na inoculação de Cercospora kikuchii em sementes de soja e na inoculação de F. moniliforme com a utilização do soluto manitol (Machado et al, 2001a), também não houveram diferenças na germinação das mesmas após a inoculação. Porém, em sementes de Apiáceas, a utilização de manitol à -0,8 MPa afetou a germinação no processo de inoculação de Alternaria sp. (Pedroso, 2009).
No trabalho realizado por Teixeira e Machado (2003), as sementes de milho quando exposta por mais de 72 h à colônia fúngica de Acremonium
strictum, em meio de BDA+manitol, à -1,2 MPa, observou-se a redução da
Utilizando a técnica de restrição hídrica para a inoculação de sementes de soja com os fungos C. dematium var. truncata, Phomopsis
sojae e Sclerotinia sclerotiorum, Machado et al. (2001a), verificaram que a
inoculação das sementes nos potenciais hídricos em torno de -1,2 MPa, proporcionou os maiores índices de plantas doentes sem afetar negativamente a germinação das sementes. Para fungos como F.
verticillioides, não há a necessidade de prolongamento do tempo de
exposição das sementes ao inóculo, visto que no menor tempo utilizado, de 24 h, obteve-se quase 93% de infecção. Isso sugere que o patógeno tem crescimento rápido e penetra facilmente nos tecidos protetores da semente (Machado et al., 2001a).
A vantagem desse método de inoculação das sementes por contato é proporcionar a obtenção de sementes infectadas de maneira bastante semelhante a que ocorre naturalmente, e em níveis desejados e pré-estabelecidos (Galli et al., 2005).
4.3.3 Determinação do grau de umidade das sementes de milho inoculadas artificialmente com F. verticillioides
Saber o grau de umidade das sementes auxilia no seu posterior armazenamento, evitando que estas percam sua viabilidade e germinação. O grau de umidade atingido pelas sementes inoculadas no final do período de incubação diferiu significativamente em função do soluto e potencial utilizado (P<0,05) (Tabela 7).
Tabela 7. Grau de umidade (%) de sementes de milho infectadas com F.
verticillioides em diferentes níveis de potencial osmótico nos
meios BDA+NaCl e BDA+KCl
Soluto Potencial osmótico (MPa)
-0,35 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2
KCl 12,36dA 21,83bB 21,60bB 23,04aB 17,06cB
NaCl 12,36cA 23,49aA 24,50aA 21,66bA 23,65aA
CV 2,77%
Médias seguidas de letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Com a utilização de BDA+KCl o maior grau de umidade foi de 23,04% de umidade no potencial de -1,0 MPa. Esse potencial proporcionou 86% de sementes contendo F. verticillioides em seu interior, já com a utilização de BDA+NaCl, os maiores índices de umidade ocorreram nos potenciais de -0,6, -0,8 e –1,2 MPa (Tabela 7). A utilização do soluto NaCl promoveu maior umidade final das sementes em todos as concentrações utilizadas.
Neste trabalho a maior porcentagem de sementes contendo F.
verticillioides em seu interior utilizando o soluto NaCl ocorreu no potencial
que obteve maior umidade final indicando que a umidade favoreceu a penetração do patógeno na semente.
O potencial hídrico de um substrato é um fator importante no desenvolvimento de fungos fitopatogênicos em geral. Desta forma, a umidade das sementes é um fator que pode condicionar a ação de um fungo fitopatogênico por ocasião do processo de germinação (Carvalho, 1999).
O grau de umidade atingido após o processo de inoculação das sementes ainda foi menor do que de sementes colhidas do campo que possui, aproximadamente, 32% de teor de água inicial (Garcia et al., 2004). O recomendado para o armazenamento de sementes de milho sem que afete a germinação é de 13% (Baudete et al, 1999). Para se chegar a esse valor sugerido, as sementes devem passar por um processo de secagem de acordo com cada espécie, com o cuidado de preservar a qualidade inicial das sementes (Carvalho, 1994), estando a longevidade da semente diretamente relacionada com o grau de umidade com que esta será armazenada (Neves et al., 2005).
4.3.4 Transmissão de F. verticillioides das sementes de milho inoculadas artificialmente
A transmissão de F. verticillioides das sementes inoculadas obteve resultado significativo apenas entre os potenciais osmóticos (Figura 5 e Tabela 8).
Figura 5. Colmo e raiz de milho infectados com F. verticillioides após
inoculação artificial das sementes
Tabela 8. Colmo e raiz de milho (%) infectados com F. verticillioides após
transmissão via semente inoculada artificialmente nos meios BDA+NaCl e BDA+KCl.
Potencial osmótico (MPa)
*TF -0,35 -0,6 -0,8 -1,0 -1,2
Colmo 04c 45b 68a 75a 81a 91a
Raiz 08c 41b 76a 79a 89a 91a
CV 10,22 %
Médias seguidas de letra minúscula não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.*TF: Sementes tratadas com fungicida e sem inoculação artificial
No potencial de -1,2 MPa em BDA+NaCl foi observado 91% de transmissibilidade de F. verticillioides das sementes para os colmos e raízes das plantas de milho, diferindo apenas dos colmos e raízes provenientes de sementes tratadas com fungicida e sem inoculação artificial e sementes sem inoculação artificial.
O patógeno estava presente nas partes vegetais não apresentando sintoma visual e nenhum dano no desenvolvimento da planta no período estudado. Provavelmente com a evolução da doença, os tecidos dos nós do
colmo poderiam ser colonizados, causando podridão da base do colmo (Sartori et al., 2004).
No trabalho de Rey et al., (2009) estudando Colletotrichum
lindemuthianum e feijoeiro, foram alcançados 80% de transmissão e as
plantas apresentaram sintomas visuais no sistema radicular. Enquanto Teixeira e Machado (2003) observaram 73% de transmissibilidade de
Acremonium strictum e 99% das plantas obtiveram o patógeno no colmo e
raízes, com sintomas visuais a partir de 28 dias de idade. Mesmo no potencial de -1,2 MPa, a germinação das sementes de milho não foi prejudicada. Para sementes de soja inoculadas artificialmente com Colletotrichum truncatum, utilizando manitol com potenciais acima de – 0,4 MPa ocasiona maior número de sementes mortas, sendo maior que 80% nos potenciais de -0,8 e -1,0 MPa (Machado et al, 2001b).
5 CONCLUSÕES
A técnica de restrição hídrica utilizando os solutos NaCl e KCl é eficiente na inoculação artificial de sementes de milho com F. verticillioides
F. verticillioides tem seu crescimento micelial favorecido quando o
meio BDA+KCl é ajustado entre -0,6 e -1,0 MPa e, -0,6 e -0,8 MPa na utilização de BDA+NaCl.
O meio BDA+NaCl e BDA+KCl, ambos no potencial de -1,2 MPa, permitiu 91% de transmissibilidade de F. verticillioides das sementes inoculadas para colmos e raízes de milho.
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAUDET, L.M.L.; VILLELA, F.A.; CAVARIANI, C. Princípios de secagem.
Seed News, Pelotas, n.10, p.20-27,1999.
BRACCINI, A. L.; RUIZ, H. A.; BRACCINI, M. C. L.; REIS, M. S. Germinação e vigor de sementes de soja sob estresse hídrico induzido por soluções de cloreto de sódio, manitol e polietileno glicol. Revista Brasileira de
Sementes, Brasilia, v. 18, n. 1, p. 10 – 16, jan. 1996.
BRADFORD, K. J. A water relations analysisof seed germination rates. Plant
Physiology, Califórnia, v. 94, p. 840-849, jun. 1990.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para Análise
de Sementes, Brasília, SNDA/DNDV/CLAV, 2009. 399p. Disponível em:
http://www.agricultura.gov.br/images/MAPA/arquivos_portal/Regras_Analise %20_Sementes.pdf. Acesso em: nov. 2010.
CAMPOS, I. S.; ASSUNÇÃO, M. V. Efeitos do cloreto de sódio na germinação e vigor de plântulas de arroz. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília. v. 25, n. 6, p. 837 – 843. Jun. 1990.
CARVALHO, J. C. B. Uso da restrição hídrica na inoculação de
Colletotrichum lindemuthianum em sementes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). 1999, 98f. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) – Universidade
Federal de Lavras, Lavras – MG, 1999.
CARVALHO, N.M. A secagem de sementes. 2º ed. Jaboticabal : FUNEP, 1994. 165p.
CARVALHO, N. M. de.; NAKAGAWA, J. Sementes: ciência, tecnologia e produção. 4ª ed. Jaboticabal: Funep, 2000. 588p.
CARVALHO, J. C. B.; MACHADO, J. C.; VIEIRA, M. G. G. C. Crescimento micelial de Colletotrichum lindemunthianum em relação a restrição hídrica do substrato agarizado. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 25, n. 4, p. 999-1005, jul. 2001.
CAVALCANTI, L. S.; COELHO, R. S. B; PERES, J. O. Utilização de dois métodos de inoculação na avaliação de resistência de cultivares e linhagens de feijoeiro a Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. Ciência Rural, Santa Maria, v. 32, n.1, p. 1 – 5, fev. 2002.
CONAB. Acompanhamento de safra brasileira: grãos, quarto levantamento, janeiro/2011. Companhia Nacional de Abastecimento, on-line, Brasília, 2009. Disponível em:
http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/10_11_10_11_28_48_b oletim_portugues_-_nov_de_2010..pdf. Acesso em: jan. 2011.
COOK, J. R.; PAPENDICK, R. I. Role of water potential in microbial growth and development of plant disease, with special reference to postharvest pathology. Hort Science, Alexandria, v. 13, n. 5, p. 559 – 564, out. 1978. COUTINHO, W. M.; MACHADO, J. C.; GUIMARÃES, M. G; VIEIRA, C.; GUIMARÃES, R .M.; FERREIRA, D. F. Uso da restrição hídrica na inibição ou retardamento da germinação de sementes de arroz e feijão submetidas ao teste de sanidade em meio ágar-água. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, v. 23, n. 2, p. 127-135, nov. 2001.
DEL PONTE, E. M. (Ed.) Fitopatologia. Net – Herbário Virtual.
Departamento de Fitossanidade. Agronomia, UFRGS. Disponível em:
http://www6.ufrgs.br/agronomia/fitossan/fitopatologia/referencia.php . Acesso em: mai. 2010.
EMBRAPA. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Embrapa milho e sorgo. Cultivo do milho. Sistema de produção nº 01, 2º edição, versão eletrônica, Dezembro de 2006. Disponível em:
http://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Milho/CultivodoM ilho_2ed/ecofisiologia.htm. Acesso em: abr. 2010.
EMBRAPA. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Embrapa milho e sorgo. Cultivo do milho. Sistema de produção n° 02, 5° edição, versão eletrônica, setembro de 2009. Disponível em:
http://www.cnpms.embrapa.br/publicacoes/milho_5_ed/index.htm. Acesso em Jan. 2011.
FARIAS, C. R. J.; DEL PONTE, E. M.; DAL MAGRO, T.; PIEROBOM, C. R. Inibição de germinação de sementes de trigo e milho em teste de sanidade em substrato de papel. Revista Brasileira Agrociência, Pelotas, v. 09, nº 02, p. 141 – 144, abr. 2003.
FARIAS, C. R. J.; DEL PONTE, E. M; CORREA, C. L.; PIEROBOM, C. R. Crescimento radial de Bipolaris sorokiniana em resposta a indução de restrição hídrica por solutos osmóticos em meio agarizado. Revista
Brasileira Agrociência, Pelotas, v. 4, n. 4, p. 457-460, Outubro, 2004.
Disponível em: http://wwwufpel.tche.br/faem/agrociencia/v10n4/artigo09.pdf . acesso em: mar. 2010.
GALLI, J. A.; PANIZZI, R. C.; FESSEL, S. A; SIMONI, F.; ITO, M. F. Efeito de Colletotrichum dematium var. truncata e Cercospora kikuchii na
germinação de sementes de soja. Revista Brasileira de Sementes, Pelotas, v. 27, n. 2, p. 182-187, dez. 2005.
GARCIA, D. C.; BARROS, A. C. S. A.; PESKE, S. T.; MENEZES, N. L. A Secagem de sementes. Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n.2, p. 603-608, mar. 2004.
GARRIDO, L.A.; OLIVEIRA, A.S.; VIDAL, A.S.; MENDES, M.A.S;
FONSECA, J.N.L. Sementes de Glycine max infectadas artificialmente com
Phomopsis phaseoli f. sp. meridionalis e Colletotrichum truncatum.
Fitopatologia brasileira, Brasília, v. 21, p.359. 1996.
GOULART, A. C. P.; FIALHO, W. F. B. Incidência e controle de Fusarium
moniliforme Sheldon em sementes de milho. Revista brasileira de
Sementes, Brasília, v. 21, n. 1, p. 216-222, jan./abril, 1999.
HENNING, A. A. Patologia e tratamento de sementes: noções gerais. Londrina. Embrapa Soja, Documento nº 235, agosto, 2004. 51p.
KIMATI, H.; AMORIM, L.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L.E.A.; REZENDE, J.A.M. (Eds.) Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 2005. v. 2, p. 477-488. LUZ, W. C. Classificação dos seres vivos para o novo milênio. Parte II – Classificação dos fungos. Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 9, p. 1- 60, 2001.
MACHADO, J. da C. Patologia de sementes: fundamentos e aplicações. 1º ed. Brasília: Ministério da Educação, MEC/ESAL, 1988. 107 p.
MACHADO, J. C. Padrões de tolerância de patógenos associados à sementes. In: Luz, W. C. (ed.). Revisão Anual de Patologia de Plantas, Passo Fundo, v. 2, p. 239 – 236. 1994.
MACHADO, J. C.; OLIVEIRA, J. A.; VIEIRA, M. G. G. C. ALVES, E. M. C. Uso da restrição hídrica na inoculação de fungos em sementes de milho.
MACHADO, J. C.; OLIVEIRA, J. A.; VIEIRA, M. G. G. C; ALVES, E. M. C Inoculação artificial de sementes de soja por fungos utilizando solução de manitol. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, v. 23, n. 2, p. 95-101, out. 2001b.
MACHADO, A. Q. Uso da restrição hídrica em testes de sanidade de
sementes de algodoeiro. 2002, 55 f. Dissertação (Mestrado em Agronomia)
-Universidade Federal de Lavras, Lavras – MG, 2002.
MACHADO, J. C. Uso da restrição hídrica na inoculação de fungos em sementes de algodoeiro (Gossypium hirsutum L.). Revista Brasileira de
Sementes, Brasília, v. 26, n. 3, p. 62-67, janeiro, 2004.
MARCOS FILHO, J. Fisiologia de sementes de plantas cultivadas. Piracicaba: Fealq, 2005. 495p.
MACHADO NETO, N. B.; CUSTÓDIO, C. C.; COSTA, P. R.; DONÁ, F. R. Deficiência hídrica induzida por diferentes agentes osmóticos na germinação e vigor de sementes de feijão. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, v. 28, n.1, p. 142-149 , jun. 2006.
MENEZES, V. O. Inoculação de Fusarium moniliforme (Sheld) em
sementes de duas cultivares de pepino através da técnica da restrição hídrica e sua influência sobre a qualidade fisiológica. 2009, 85f.
Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria- RS, 2009.
MORAES, A. R. A. A cultura do milho verde. Instituto Agronômico de
Campinas. Centro Avançado de Pesquisa Tecnológica do Agronegócio de
Grãos e Fibras. Disponível em:
http://www.iac.sp.gov.br/Tecnologias/Milhoverde/Milhoverde.htm#_ftn1. Acesso em: mar. 2010.
NEVES, E.; PESKE, S. P.; VILLELA, F. A.; BAUDET, L.; PERES, W. B. Secagem de sementes de milho em espiga, em função da altura da camada e fluxo de ar. Revista Brasileira de Sementes, Pelotas, v. 27, n. 2, abr. 2005.
PEDROSO, D. C. Associação de Alternaria spp. com sementes de
Apiáceas: métodos de inoculação e influência na qualidade fisiológica.
2009, 118f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria – RS, 2009.
REY, M. S.; LIMA, N. B.; SANTOS, J.; PIEROBOM, C. R. Transmissão semente – plântula de Colletotrichum lindemuthianum em feijão (Phaseolus
vulgaris). Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, v. 76, n.3, p.
