UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Bacharelado em Farmácia-Bioquímica

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Bacharelado em Farmácia-Bioquímica

Análise do potencial de ação nutrigenômica e epigenética do ácido fólico como base para avaliação da política pública de fortificação de alimentos

Erica Mutsumi Hamamura

Trabalho de Conclusão do Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Orientadora: Profa. Dra. Flavia Mori Sarti

São Paulo 2017

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 6

1.1 Defeitos no tubo neural ... 7

1.2 Folato e ácido fólico ... 8

1.3 Metabolismo do ácido fólico ... 10

1.4 Dose e status do consumo de ácido fólico na população ... 12

2. OBJETIVOS ... 14

3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 15

4. RESULTADOS ... 16

4.1 Ácido fólico e epigenética ... 16

4.2 Ácido fólico e nutrigenômica ... 21

5. DISCUSSÃO ... 25

6. CONCLUSÃO ... 27

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LISTA DE ABREVIATURAS

AF Ácido fólico

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária DTN Defeitos no Tubo Neural

DNMT DNA metiltransferase

FDA Food and Drug Administration MTHFR Metiltetrahidrofolato redutase MTHF Metiltetrahidrofolato

SAM S-adenosilmetionina SAH S-adenosilhomocisteína

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RESUMO

HAMAMURA, E.M.. Análise do potencial de ação nutrigenômica e epigenética do ácido fólico como base para avaliação da política pública de fortificação de alimentos. 2016. no. f. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica –

Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, ano.

Palavras-chave: ácido fólico, fortificação, nutrigenômica, epigenética

Introdução. O folato presente nos alimentos de forma natural constitui componente vital em uma dieta saudável; porém, a deficiência do nutriente tornou-se comum pelas mudanças na alimentação decorrentes de alterações do estilo de vida e da urbanização. Considerando evidências da ação na prevenção do desenvolvimento de defeitos no tubo neural (DTN), atualmente, vários países adotam a fortificação mandatória de alguns de alimentos usualmente consumidos pela população com ácido fólico para reduzir incidência de malformações congênitas. Entretanto, ainda há escassez de informações sobre mecanismos de atuação do folato: apesar dos efeitos positivos da intervenção com ácido fólico na redução das taxas de ocorrência de DTN, possíveis efeitos indesejáveis advindos do alto consumo do nutriente em nível populacional devem ser investigados, tendo em vista exposição duradoura ema alimentos fortificados. Considerando papel do folato na síntese de ácidos nucleicos e doação de carbono e possibilidade de subestimação do consumo populacional, há questionamentos quanto à dose e segurança da exposição em nível populacional. Objetivo. Realizar revisão de literatura sobre potencial nutrigenômico e epigenético do ácido fólico, especialmente no que tange a efeitos indesejáveis relacionados ao consumo de alimentos fortificados ou suplementação do nutriente. Materiais e métodos. O trabalho foi baseado em pesquisa bibliográfica nas seguintes bases de dados: PubMed, Scielo e Google Acadêmico, priorizando publicações no período entre 1998 (início da fortificação mandatória nos EUA) e 2017. O levantamento da literatura foi baseado em combinações de termos de busca relacionados a estudos em humanos ou animais, baseados em alimentos fortificados. Resultados. Estudos indicam que consumo elevado de derivados do folato altera níveis de expressão gênica por vias epigenéticas pelo mecanismo de metilação do DNA. Há evidências da influência do nutriente em outras patogenicidades como câncer, resistência à insulina e desenvolvimento neural. Além da relação entre nutriente e regulação gênica, existe também interação gene-nutriente. Conclusão. Programas de políticas públicas de fortificação de alimentos com ácido fólico foram adotados por vários

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países ao longo dos últimos vinte anos, entretanto, ainda há necessidade de avaliação dos diversos impactos em saúde relacionados à fortificação de alimentos, uma vez que há exposição da totalidade das populações dos referidos países ao nutriente em teor elevado nos alimentos consumidos usualmente. Assim, seria interessante adotar controle da concentração de ácido fólico nas farinhas de trigo e milho (alimentos selecionados para fortificação no Brasil), acessibilidade aos suplementos vitamínicos consumidos pela população e estabelecimento de doses mínima e máxima seguras aos diferentes grupos populacionais expostos.

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1. INTRODUÇÃO

Folato é uma vitamina hidrossolúvel presente naturalmente nos alimentos1 que além de ser um componente vital de uma dieta saudável é essencial para inúmeras funções metabólicas. As causas de deficiência de folato podem variar desde fatores como estilo de vida e dieta2 até variações no perfil genético e a presença de polimorfismos.

Como resultado do estudo realizado por Hibbard, B.M.3 em 1964, que estabeleceu pela primeira vez a relação entre deficiência de folato e defeitos no tubo neural (DTN) diversos estudos se seguiram e demostraram que a suplementação com ácido fólico representou uma redução na recorrência desses casos4; 5; 6; 7.

Em 1991, o Medical Research Council (MRC, Reino Unido) publicou um rigoroso estudo randomizado duplo-cego que comparava a administração de 4 mg de ácido fólico (AF) por dia antes da gravidez com o grupo placebo. Ambos os grupos eram compostas por grávidas que já apresentaram um caso prévio de DTN e que iniciaram a intervenção mais de um mês antes da fertilização e continuaram até o terceiro trimestre.

Os resultados apresentaram 6 casos de DTN em 593 mulheres suplementadas com AF comparado com 21 casos em 692 mulheres do grupo placebo. Isso representou uma redução de 72% do risco8. Porém, até hoje os mecanismos pelos quais isso ocorre ainda não foram bem esclarecidos.

Com base nas evidências disponíveis a favor da fortificação até então, o Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos, e também o Centro para Controle e Prevenção de Doenças (CDC), assim como outras entidades recomendaram a todas as mulheres em idade reprodutiva a ingestão de pelo menos 400 mcg de ácido fólico por dia9.

Porém, as iniciativas das campanhas educacionais não foram eficazes como esperado na redução de casos de DTN10, provavelmente porque o fechamento do tubo neural normalmente é concluído nos primeiros estágios do desenvolvimento fetal, ou seja, 28 dia após a fecundação do óvulo8, e, portanto, a suplementação deve ser iniciada com antecedência para garantir uma concentração adequada da vitamina na etapa crítica do desenvolvimento fetal.

Somado ao fato de que metade das gestações nos Estados Unidos não são planejadas, e que um número considerável de mulheres só descobre que estão grávidas no estágio de fechamento do tubo neural10.

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alimentos com ácido fólico por mais de 80 países no mundo, como estratégia para aumentar o consumo de ácido fólico, e assim, reduzir a prevalência de casos de DTN11.

Em 1998 os Estados Unidos e Canadá foram os pioneiros na adoção do enriquecimento de alimentos. Já na América do Sul, o Chile começou o programa dois anos depois, seguido pelo Brasil em 2002, que desde junho de 2004 tornou a fortificação de farinhas de milho e de trigo mandatória pelo Ministério da Saúde. Porém, essa política pública levantou e continua a levantar questionamentos.

O folato é indiscutivelmente um componente vital da dieta humana, e sua deficiência provoca desajustes nos processos metabólicos. Porém, na sociedade moderna depois de mais de 10 anos da fortificação mandatória as pessoas estão mais conscientes, e a disponibilidade e o acesso ao ácido fólico aumentaram.

Nesse contexto a hipertoxicidade ao invés de deficiência vem levantando questionamentos da bancada científica. Isso nos leva ao primeiro questionamento que seria com relação ao consumo extra de ácido fólico pela grande parcela da população que não se inclui no grupo de mulheres em idade reprodutiva12. O segundo, se refere ao fato de que o folato é sem dúvida um micronutriente essencial, mas seu espectro de ação não se limita à prevenção de defeitos no tubo neural12.

Uma vez que também é um cofator importante para a biossíntese de ácidos nucleicos, e tem papel essencial no metabolismo do carbono de modo a garantir assim, a síntese e fornecer grupos metila necessários para metilação do DNA10; 13; 14. Funções estas que se relacionam diretamente com os mecanismos epigenéticos. Portanto, o objetivo dessa revisão é trazer à luz da nutrigenômica e da epigenética as consequências da adoção da fortificação mandatória como política pública e os possíveis efeitos não esperados do consumo elevado e a longo prazo de ácido fólico.

1.1 Defeitos no tubo neural

Com a redução dos principais casos de morbidade e mortalidade em fetos e crianças, como infecções e nascimento prematuro, a atenção em saúde pública se voltou para as malformações congênitas. Defeitos no tubo neural não são casos raros, pois representam o grupo mais comum de malformação do sistema nervoso

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central e são um problema de saúde pública devido a sua mortalidade, morbidade, custos em saúde e sofrimento10.

A neurulação acontece no início da embriogênese, ela inicia o processo na placa neural e culmina no fechamento do tubo neural que é precursor tanto do sistema nervoso central quanto do periférico. Esse processo é de extrema complexidade e altamente regulado. O desenvolvimento e fechamento do tubo é completado até o vigésimo oitavo dia após a fertilização, e falhas na regulação dos genes que regulam as atividades morfogenéticas fazem com que o feto desenvolva DTN8.

Os DTNs apresentam-se de duas formas que variam de acordo com a parte do tubo neural envolvida: cranial ou caudal. O defeito cranial mais importante é a anencefalia, em que o córtex cerebral não se desenvolve. E o defeito caudal principal é a espinha bífida, que inclui meningocele e meningomiocele.

A anencefalia representa um terço dos casos e é letal, nos dois terços restantes encontramos os casos de espinha bífida, que normalmente não são fatais, mas podem implicar em problemas como paraplegia.

- houve redução de cerca de 23,5% na prevalência de DTN e de 39% na preva da especificamente. Porém, houve ligeiro aumento na prevalência dos DTN após -se relativamente estável em 2010, com média de 8,8 casos de DTN por 10.000 nascimentos15.

Isso mostra que a fortificação mandatória das farinhas ocasionou ligeira diminuição dos DTN, porém não foi suficiente para que o Brasil atingisse o chamado ― chão‖ de DTN por 10.000 nascimentos16_{. necessário} prevalência p 15

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1.2 Folato e ácido fólico

Folato. Folato é uma vitamina hidrossolúvel do complexo B que só pode ser obtida pela dieta17. Eles são encontrados em uma variedade de alimentos, em particular os vegetais de folha verde8. Essa vitamina é essencial para diversos processos metabólicos incluindo síntese de DNA e regulação da expressão gênica.

O folato plasmático encontra-se principalmente sob a forma de tetra-hidrofolato (THF), principal forma ativa da vitamina, que é constituída de um

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monoglutamato proveniente da redução partir de substituições nas posições 18

(Figura 1).

Figura 1. Estrutura dos folatos.

Fonte: BLOM, H. J. et al., 2006.

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Ácido fólico. O termo ácido fólico é uma designação para a fórmula farmacêutica do ácido pteroilglutâmico que a forma sintética estável do folato19. Devido às suas características físicas como estabilidade à luz UV e resistência ao calor é mais apropriado para ser adicionado aos alimentos como farinha de trigo e de milho2 - 20

(Figura 1). E por fim, é importante ressaltar que o folato sintético ou ácido fólico, tem a sua biodisponibilidade variando de 70 a 85% comparado com o folato que fica 50% biodisponível.

Fontes de ácido fólico. O consumo da população dos Estados Unidos, Canadá, Brasil dentre outros, não se restringe somente aos alimentos fortificados com ácido fólico. Ele também engloba alimentos ricos em folato e muito importante de mencionar, os suplementos. O acesso aos comprimidos de ácido fólico é facilitado uma vez que não exigem a apresentação de prescrição médica para sua compra2. E isso levanta certa preocupação com relação à contribuição desse consumo para o excesso de AF.

1.3 Metabolismo do ácido fólico

O ácido fólico é um composto sintético e é metabolizado de maneira distinta dos folatos encontrados nos alimentos. Os folatos da dieta estão na forma de poliglutamatos e são hidrolisados a monoglutamatos para serem transportados pelo corpo por meio da circulação sistêmica. A enzima folilpoli-gama-glutamato carboxipeptidase (FGCP) ancorada na borda em escova do intestino é responsável por essa hidrólise17.

Já o ácido fólico passa por duas etapas de redução no fígado via enzima diidrofolato redutase (DHFR) que tem como produto final a forma bioativa: o tetrahidrofolato (THF). Essa reação habilita que o ácido fólico seja utilizado para processos metabólicos, porém, a maioria dos tecidos, incluindo o fígado possui capacidade limitada para realizar essa reação de redução devido à potência reduzida da DHFR. Esse processo de biotransformação para sua forma biologicamente ativa é saturada em doses equivalente a 200 - 400 mcg de AF.

Uma vez obtido o THF, ocorre a adição de uma unidade de carbono à molécula que seguidos de algumas reações de redução pela metiltetrahidrofolato redutase (MTHFR) produzem o 5- metiltetrahidrofolato (5-MTHF) monoglutamato

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que é transportado pela circulação e corresponde à principal forma de folato na corrente sanguínea. No sangue, carreadores específicos ou receptores transportam o 5-MTHF para dentro das células.

Uma vez no microambiente intracelular, o folato atua tanto como aceptor e como doador de unidades de carbono (Figura 2) que são covalentemente ligadas aos folatos e são doados ao THF que vai originar os aminoácidos, histidina e serina, e glicina e seus derivados dimetilglicina e metilglicina, que são utilizados como blocos de construção do DNA.

Figura 2. Metabolismo intracelular do folato.

Fonte: BLOM, H. J. et al., 2006.

Além disso, o 5-MTHF, está envolvido na remetilação da homocisteína à metionina, que é um precursor da SAM, doador primária de grupo metilas para a maioria das reações de metilação. Depois da transferência do grupo metila, SAM é convertida à S-adenosilhomocisteína (SAH) um potente inibidor das metiltransferases (DNMT) dependente de SAM.

Os grupos metila são doados da S-adenosilmetionina SAM para o DNA por meio da enzima, DNA metiltransferase (DNMT), dando origem à S-adenosilhomocisteína (SAH). Essas enzimas possuem 3 tipos, de um lado a DNMT1 é responsável por manter os padrões de metilação do DNA durante a mitose, de outro, a DNMT2 e DNMT3 tem papel importante na metilação de novo do DNA durante o início do desenvolvimento fetal, que é um período delicado em que

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insultos nutricionais podem desequilibrar a definição correta das marcas epigenéticas.

No ciclo da metilação que ocorre em todas as células com exceção dos eritrócitos, a S-adenosilmetionina (SAM) é o principal grupo doador de carbono que garante a manutenção da metilação de diversos compostos. Isso inclui a metilação do DNA que regula a expressão gênica, das proteínas e dos lipídeos.

Ou seja, o folato é crucial para o funcionamento celular adequado em períodos de crescimento rápido. Mas também o funcionamento adequado de todas as enzimas necessárias para o seu metabolismo como a MTHFR e a DNMT são cruciais para que ele seja biotransformado para a sua forma biologicamente ativa.

1.4 Dose e status do consumo de ácido fólico na população

O Ministério da Saúde do Brasil por meio da RDC 344 aprovou em 2002 o regulamento técnico para fortificação voluntária das farinhas de trigo e das farinhas de milho com ácido fólico.

Dois anos depois, a fortificação se tornou mandatória e a dosagem estabelecida foi de 150 mcg de ácido fólico por 100 g de farinha. Segundo Food and Nutrition Board do Instituto de Medicina o nível máximo de ingestão tolerável para o ácido fólico (UL) é de 1.000 mcg por dia. A UL é o limite superior da ingestão diária de um nutriente abaixo do qual não há risco de efeitos adversos no paciente.

Este é um parâmetro específico para o ácido fólico, ou seja, a ingestão de alimentos que sejam fonte naturais de folato não são contabilizados15. O valor da UL foi baseado na evidência de valores acima dele poderiam exacerbar ou precipitar danos neurológicos por falta de vitamina B12.

Para a maioria dos nutrientes, os efeitos adversos são reportados tanto em níveis insuficientes ou em excesso, portanto a avaliação do risco é um desafio. Os artigos publicados até hoje focam predominantemente nos riscos da deficiência, um exemplo disso, é o caso do folato em que estudos mostram a relação entre a deficiência dessa vitamina e ocorrência de defeitos no tubo neural.

No estudo NEST21 desenvolvido na Carolina do Norte (EUA), 51% das mulheres reportaram o consumo de ácido fólico antes da gravidez e 66% disseram ter ingerido durante a gravidez. Além disso, mais de 10% delas relataram suplementação diária com AF excedendo o limite superior tolerável (TUL) antes e durante a gravidez.

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O consumo AF além do TUL foi mais frequente por mulheres Caucasianas e menos frequente em mulheres que relataram pelo menos uma morbidade. Os Estados Unidos foram os primeiros a implementar a fortificação mandatória em 199819. Alguns estudos com a população americana sugerem que consumo médio de folato entre mulheres na idade reprodutiva é 450 mcg/dia e aproximadamente 75% advém do consumo de ácido fólico em alimentos fortificados.

Por causa da disponibilidade do AF ser maior, essas descobertas sugerem que uma certa parcela de grávidas e seus fetos talvez estejam expostos a níveis supra fisiológicos de AF22. Segundo Lucock M.23 o mecanismo de absorção e biotransformação do ácido fólico à sua forma ativa (5-MTHF) é saturada em doses maiores que 400 mcg. A limitação desse processo metabólico resulta na incapacidade do organismo em metabolizar altas doses de AF, levando ao surgimento de AF não metabolizado na circulação sanguínea24.

O estudo de Pfeiffer et al. detectou ácido fólico não metabolizado nas amostras de soro de todos as crianças e adultos do seu estudo depois da fortificação dos grãos. Essas evidências sugerem que seja por causa da fortificação mandatória ou voluntária e/ou o uso de suplementos, a preocupação com o consumo excessivo de AF está aumentando.

Por fim é importante também comentar sobre a fiscalização dos alimentos. No Brasil as autoridades não têm supervisionado rotineiramente a concentração de AF nas farinhas para garantir a quantidade correta da vitamina.

Dois estudos analisaram amostras de farinha e encontraram concentrações inadequadas de AF. Os valores variaram desde 73 até 558 mcg de AF por 100g de farinha sendo que a recomendação é de 150 mcg por 100g25; 26. Portanto, não só o monitoramento dos níveis de folato sanguíneo quanto da concentração de AF nos alimentos fortificados é essencial para ajudar no aconselhamento dietético ajustado de acordo com as diferenças regionais e populacionais.

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2. OBJETIVOS

O objetivo do presente trabalho foi realizar revisão de literatura sobre potencial nutrigenômico e epigenético do ácido fólico, especialmente no que tange a efeitos indesejáveis relacionados ao consumo de alimentos fortificados ou suplementação do nutriente que não estejam relacionados com a redução de casos de defeito no tubo neural.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

O trabalho foi baseado em pesquisas nos seguintes bancos de dados: PubMed, Scielo e Google Acadêmico, priorizando-se estudos com data de publicação entre 1998 (início da fortificação mandatória nos EUA) e 2017.

A definição da data de início da busca foi baseada na busca por investigar evidências quanto aos efeitos potencialmente negativos da política de fortificação mandatória de alimentos de consumo usual das populações em diferentes países, de forma a efetuar um levantamento extensivo de informações sobre efeitos em seres humanos, além dos modelos animais.

A estratégia de busca utilizada foi a estratégia PICO (acrônimo de Patients, Intervention, Comparator and Outcome; ou seja, seleção dos pacientes, tipo de intervenção, intervenção comparativa e desfechos em saúde), conforme objetivo do estudo (Tabela 1).

Tabela 1. Termos para busca utilizando estratégia PICO MeSH Terms - PubMed

Paciente ((Adults) OR Animals)

Intervenção ((Folic Acid) AND Food, Fortified) Controle No intervention

Resultados

(((((Fetal Programming) OR Epigenomics) OR

Nutrigenomics) OR Cacinogenesis) OR Folic Acid/adverse effects)

Scielo e Google Academic

Paciente ((Adults) OR Animals)

Intervenção ((Folic acid) AND fortified food)

Controle Diet

Resultados (((((Fetal programming) OR Epigenomics) OR Nutrigenomics) OR Carcinogenesis) OR Folic Acid/adverse effects)

Fonte: Elaboração própria.

O levantamento da literatura foi baseado em combinações de termos de busca relacionados aos estudos em humanos ou animais, baseados em efeitos adversos de consumo de alimentos fortificados. O critério para seleção dos artigos foi decidido pela autora do trabalho, de acordo com validade dos dados e sua relação com objetivos propostos no trabalho.

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4. RESULTADOS

4.1 Ácido fólico e epigenética

― ‖ influenciam na modulação química da cromatina, ou seja, a forma pela qual o DNA está agrupado junto com as proteínas das histonas no núcleo da célula. Marcadores epigenéticos podem induzir a remodelação da cromatina e mudanças na expressão genética.

Definições exatas desse campo da ciência variam muito. Porém, todas concordam em um aspecto: a epigenética diz respeito às mudanças na expressão gênica independentes de alterações na sequência de DNA em si27.

Os folatos atuam como doadores de carbono no organismo humano e são essenciais não só em diversas funções metabólicas, mas principalmente no metabolismo do carbono que está intrinsicamente ligado com a regulação da expressão gênica28. A modulação da expressão é regulada por múltiplos mecanismos epigenéticos capazes de silenciar ou ativar a transcrição de genes, por meio da modulação do acesso da maquinaria transcripcional às fitas de DNA29.

Um dos modos, mas não o único, pelo qual isso ocorre é por meio da metilação das fitas de DNA, importante mecanismo para a regulação epigenética30. Esse processo juntamente com a acetilação de histonas controla a tensão de enovelamento do DNA em torno das proteínas das histonas, de modo que, de um lado ocorre o silenciamento dos genes pela metilação, e, de outro, a transcrição por meio da acetilação29. Ou seja, a regulação epigenética é um fator importante na determinação do potencial de uma região genômica em ser ou não transcrita21.

O mecanismo epigenético mais conhecido é a metilação dos dinucleotídeos citosina-guanina (CpG) no DNA dos mamíferos31. Doadores de carbono obtidos pela dieta, como: folato, colina, betaína e metionina, e suplementos com ácido fólico, que contém um grupo metila (CH3), entram no metabolismo do carbono em diferentes etapas, mas no fim, todos são convertidos à S-adenosilmetionina (SAM), doador universal de grupos metila21.

Por fim, SAM vai doar o grupo metila necessário para a metilação do DNA. Logo após a fertilização do óvulo, as marcas de metilação no DNA no genoma paterno e materno são desmetilados e seguidos de metilação de novo antes da implantação. Esse é um período no desenvolvimento fetal em que componentes da

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dieta materna podem afetar o perfil de metilação do embrião21. Em um processo conhecido como programação fetal.

Para estabelecer a ligação entre estímulo ambiental e modulação epigenética do genoma, é necessário um fenótipo sensível e bem estabelecido. Evidências de que a disponibilidade de doadores de carbono durante a gestação é necessária para estabelecer e modular os padrões de metilação tem origem nos experimentos com genes agouti em ratos32. Os ratos agouti tem pelagem amarela, são mais propensos a ganhar peso e desenvolver hiperinsulinemia, além de serem mais susceptíveis ao câncer33.

A cor da pelagem é determinada pela super expressão de um locus específico (Avy) em um único gene, o que mostra que variações nutricionais durante a fase embrionária podem modificar a expressão de genes por meio da metilação28. A super expressão do gene agouti é decorrente da hipometilação dos sítios CpG no locus Avy.

Dessa forma, uma suplementação pré-natal com vitaminas como o folato, que doam carbono, mostrou intensificar a metilação de promotores do gene agouti e reduzir a expressão deste34. O resultado é uma prole majoritariamente composta por ratos com pelagem marrom (Figura 3) e com predisposição baixa para obesidade, diabetes e aparecimento de tumores35.

Figura 3. Camundongos Agouti – efeitos da epigenética na cor da pelagem.

Fonte: Jaenisch, R. et al., 2003.

Ou seja, o padrão de metilação é definido nas primeiras etapas do desenvolvimento fetal e a cor da pelagem é um indicador fenotípico da metilação32.

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Esse resultado demonstra que um estímulo ambiental nos estágios iniciais da vida pode alterar a expressão de genes e alterar o fenótipo do adulto. Apesar do mecanismo da mudança na pelagem na prole não ser conhecida, o resultado final da mudança epigenética dieta-dependente é clara: a alteração na cor é relacionada com a hipermetilação do porção IAP no gene32.

As alterações epigenéticas estão relacionadas com os níveis de folato na circulação sanguínea. Experimentos in vitro demonstraram que a expressão dos genes é alterada em função da concentração de folato extracelular36. O estado de folato materno em camundongos tem impacto na metilação do DNA e na expressão gênica nos hemisférios cerebrais da prole.

Barua et al.37 realizaram um estudo em que alimentaram camundongos no período anterior à gestação e obtiveram como resultado danos cognitivos na geração F1 em relação à aprendizagem reversa. Nesse projeto de estudo, os pesquisadores restringiram a dieta rica em AF a um período anterior ao acasalamento, sugerindo que as alterações comportamentais em F1 podem ser uma consequência dos efeitos do AF em células germinais femininas, como alterações epigenéticas em oócitos induzidos pelo excesso de FA.

Outro resultado obtido foi a regulação negativa de Fxyd2 e positiva de Ptpn14 no grupo AF F1. O primeiro corresponde a um gene regulador da atividade da Na+/K+-ATPase, ou seja, é vital para a neurotransmissão e excitabilidade neuronal. Por conseguinte, a diminuição da expressão da subunidade gama da Na+/K+ -ATPase na prole que recebeu a intervenção com uma dieta rica em FA antes do acasalamento poderia potencialmente contribuir para funções neuronais alteradas e habilidades cognitivas nesses camundongos38.

Huot et al.39 e Cho40 et al. publicaram dois estudos interessantes que exploram a relação entre o consumo de folato da mãe no período pré-natal e obesidade e resistência à insulina na prole. Ambos foram realizados pelo mesmo time, com o mesmo modelo animal e com o mesmo tipo de suplementação, porém um deles tinha como foco a prole feminina e o outro a prole masculina41.

Um deles observou que filhotes do sexo feminino de mães que ingeriram uma dieta rica em folato (10 vezes acima do recomendado) apresentaram uma redução de 6% no peso corporal comparado com o grupo controle, independente da dieta da prole (controle ou rica em folato)39.

O outro estudo com os machos apresentou resultados diferentes. A prole masculina que recebeu, diferente da mãe, uma dieta controle teve maior peso

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corporal, enquanto que a prole que recebeu uma dieta rica em folato ficou com menor peso corporal, menor resposta à glicose no teste de tolerância à glicose e melhor resposta no teste de tolerância à insulina40. Esses estudos indicam a complexidade do leque de interações gene-nutriente e vice-versa.

Modelos animais confirmam que a programação fetal em resposta a suplementação materna ocorre e torna viável a hipótese de que processos similares aconteçam em humanos. Atualmente, pesquisas com humanos mostraram que a dieta materna pode influenciar a metilação na prole21.

Os primeiros estudos que iniciaram essa pesquisa foram realizados com holandeses cujas mães estavam grávidas durante a Fome Holandesa (1944-1945) que ocorreu na Segunda Guerra Mundial e durou por aproximadamente 6 meses. Segundo Burger et al.42 no auge da restrição de suprimento de alimentos, os adultos consumiam em média 500 kcal por dia.

Estudos que se seguiram, como o de Friso et al.43, mostraram que essa exposição materna à restrição alimentar antes da gestação foi associada à uma baixa taxa de metilação do gene de fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF-2), assim como outras pesquisas31; 44. Além deste, outro estudo com adultos de 60 anos de idade apresentaram uma redução de 5.2% na metilação do gene IGF-2 em comparação com irmãos do mesmo sexo que não foram expostos à restrição alimentar materna45.

IGF-2 é um gene de origem materna importante para o desenvolvimento e crescimento fetal. A porção IGF-2 é apenas metilada no alelo advindo da mãe, o que torna essa região interessante, pois deve ser vulnerável à variações específicas no perfil nutricional materno, não só no período que antecede a gravidez, mas também durante46.

Tanto o estudo elaborado por Hagaarty et al. em que grávidas foram suplementadas com ácido fólico a partir da décima segunda semana de gestação, como a pesquisa de Steegers-Theunissen et al.31 no qual mulheres tomaram suplementos com 400 mcg de ácido fólico no período anterior à gestação, mostraram que suplementação materna com ácido fólico mesmo dentro da recomendação diária aumentou os níveis de metilação do gene IGF-2 na prole, por programação materna na fase intrauterina21. Esses resultados demonstram a plasticidade da metilação do gene IGF2 por meio da administração de ácido fólico no período periconcepcional31.

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urbanização e o desenvolvimento da tecnologia tornou-a mais diversificada e rica em carboidratos11. O que aumenta a importância de avaliar os efeitos adversos de doses elevadas não só no público alvo (mulheres em idade reprodutiva), mas também nas outras parcelas da população como idosos, homens, crianças e pessoas com morbidades (câncer e obesidade) que de alguma forma podem ser afetadas com esse consumo elevado.

Um estudo realizado em São Paulo em 2017 para avaliar o status de ácido fólico na população depois de 10 anos da implementação da fortificação obrigatória, teve como um dos resultados dessa pesquisa a presença de níveis mais elevados de folato em idosos do que em adultos e adolescentes11.

Uma pesquisa com idosos no Chile constatou que depois da implementação da fortificação ocorreu um aumento de 162% nos casos de câncer de cólon na população com faixa etária entre 45-64 anos e um aumento de 192% naqueles com idade entre 65-79 anos de idade, quando comparado com o período pré-fortificação47.

De maneira complementar, o estudo de Dieuwertje et al.48 realizou uma intervenção por 2 anos em idosos com faixa etária entre 65 a 75 anos e observaram mudanças na metilação de leucócitos. Os autores identificaram também várias posições metiladas de maneira distinta quando comparado com o grupo placebo. Os padrões de metilação mais proeminentes pareceram estar relacionados com carcinogênese. Baseado na comparação entre o grupo placebo e o grupo com intervenção, o gene DIRAS3, também conhecido como ARHI, foi selecionado como o mais interessante.

Esse gene expresso somente pelo alelo materno é membro da superfamília RAS e é considerado como um gene supressor de tumor49. A desregulação da expressão desse gene foi relacionada com diversos tipos de câncer e tem sido associada com invasão e progressão de células neoplásicas50; 51.

Por outro lado, a deficiência também é um risco, uma vez que a deficiência de folato também foi associada com alguns tipos de câncer como, por exemplo, no cólon, no pâncreas dentre outros. Pois, este nutriente é essencial para a síntese de DNA e a carência dele aumenta os níveis de mutação, podendo em última análise aumentar o risco para o desenvolvimento do câncer. Essas mutações podem prejudicar genes supressores de tumor ou proto-oncogenes, levando à formação de células neoplásicas43.

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exposição ao ácido fólico é um fator chave na carcinogênese2. Um estudo indica que a administração de ácido fólico antes do surgimento de células neoplásicas reduz o desenvolvimento tumoral, em contrapartida, a administração durante a formação de células pré-neoplásicas aumenta sua proliferação52.

De acordo com essa teoria elevados níveis de folato aumentam a taxa de replicação tumoral possibilitando maior síntese de DNA. Além disso, também existe a hipótese de que as células neoplásicas aumentam a expressão de receptores de folato o que eleva os níveis intracelulares desse nutriente52. Por isso é de extrema importância estabelecer níveis mínimos e máximos seguros para toda a população e em quais situações eles são cruciais ou prejudiciais.

4.2 Ácido fólico e nutrigenômica

Apesar de ser bem estabelecido por mais de 20 anos que mulheres em idade reprodutiva podem reduzir o risco de uma gravidez com DTNs por meio da suplementação e fortificação com AF, ainda não foi esclarecido porque uma porção significativa de mulheres, que tomam suplementos e estão em países com fortificação mandatória no período da pré-fertilização, dão à luz a bebês com defeito no tubo neural.

Esse questionamento direcionou pesquisas para outras hipóteses e para variações genéticas no metabolismo e transporte do folato8. Com o desenvolvimento das tecnologias de alto rendimento (proteômica, genômica, transcriptômica, metabolômica, ...) que possibilitam a identificação e dosagem de diversas moléculas ao mesmo tempo, campos da ciência como o da nutrigenômica puderam de desenvolver e o estudo dos mecanismos e transporte de nutrientes estão se aprofundando53.

Na genômica por exemplo podemos avaliar diversas variações no DNA incluindo milhares de polimorfismos e isso é crucial uma vez que a maioria dos casos de doenças crônicas não são provocadas por uma única mutação em genes específicos, mas sim por interações complexas entre variantes de muitos genes53.

Um dos principais focos da nutrigenômica é a identificação de polimorfismos em um único nucleotídeo (SNP), que em outras palavras são mudanças na sequência do DNA que representam 90% de todas as variações genéticas no homem. Os polimorfismos que ocorrem em genes envolvidos na manutenção básica da célula são considerados como risco para o desenvolvimento de doenças. Um

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exemplo da interação nutriente-SNP é o polimorfismo comum C677T no gene da enzima metiltetrahidrofolato redutase (MTHFR)53.

Metiltetrahidrofolato redutase. O gene 5,10-metilenotetrahidrofolato codifica a enzima MTHFR que catalisa a reação de síntese do 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF) a partir do 5,10-MTHFR. O composto 5-MTHF é o substrato doador de grupos metila para homocisteína para a síntese de metionina, ajudando na reciclagem de metionina. Além disso, ele também é o precursor da S-adenosilmetionina (SAM), que é o doador universal de carbono para as reações de metilação, incluindo a metilação do DNA.

O gene MTHFR que fica localizado no cromossomo 1p36 possui 2 tipos comuns de polimorfismos envolvendo os alelos C677T e A1298C. Para o primeiro, uma citosina pode ser substituída por uma timina na posição do nucleotídeo 677 em uma ou ambas as cópias, levando a substituição da alanina pela valina (CT; alaninavalina)54. Pessoas com a genótipo 677TT tem cerca de 30% da atividade de MTHFR in vitro do que aqueles com genótipo normal (677CC). Ou seja, isso resulta em uma capacidade reduzida do metabolismo em utilizar folato e ácido fólico para converter homocisteína em metionina e 5,10-metiltetrahidrofolato em 5-MTHF55. Logo, indivíduos com o genótipo MTHFR 677 CC produz a variante com a maior atividade enzimática, que resulta em menores concentrações de 5,MTHF e 10-formil-THF disponíveis a síntese de DNA e elevadas concentrações de 5-MTHF para manter os níveis adequados de metilação54.

Por outro lado, indivíduos heterozigotos, 677CT apresentam 75% da atividade enzimática normal. O outro polimorfismo, 1298, ocorre uma substituição da adenina pela citosina, em uma ou ambas as cópias e provocando a troca do glutamato pela alanina (AC; glutamatoalanina)54. Este polimorfismo afeta também a ação da enzima, assim como a mutação no alelo C677T, porém influencia no acúmulo de homocisteína, redução de metionina e desregulação de outras vias que requerem os intermediários do metabolismo do folato, porém tudo isso ocorre em menor grau que o 677CT55.

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Figura 4. OS 3 genótipos do gene MTHFR e regulação dos níveis de metilação e síntese do DNA.

Fonte: Oberg, E. et al., 201554.

Uma meta-análise desenvolvida por Botto et al.56 sugere que existe flutuações na frequência de pessoas homozigotas para o alelo C677T (TT): 8–18% dos indivíduos com origem europeia, 21–25% em hispânicos, 7% em pessoas negras e 11% em Asiáticos.

Um estudo desenvolvido com a população brasileira57 obteve resultados similares à um estudo anterior feito também no Brasil58, ambos observaram que a frequência para homozigotos (TT) é de 11.3% para a variante 677C>T, sendo que para caucasianos é de 13.2% e para negros 1.6%, ainda menor do que o valor repostado por Botto et al..

E por fim, apesar de não ter sido descoberto se há diferenças na frequência entre homens e mulheres, estudos sugerem que a frequência desse polimorfismo é maior em idosos54. Isso mostra que pessoas de diferentes etnias e até mesmo idade podem responder de forma diferentes à fortificação mandatória com ácido fólico, o que resulta em concentrações de folato variadas entre populações.

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no gene MTHFR, que reduzem a atividade in vitro dessa enzima, podem afetar a metilação do DNA. O grupo obteve como resultado das análises realizadas nos participantes com o genótipo 677TT que ocorreu redução na metilação. Estudos sugerem que essa hipometilação pode estar relacionada com diversas doenças como malformações congênitas, desordens neurológicas e câncer. Um estudo realizado em 2013 teve como objetivo analisar a suplementação de grávidas com ácido fólico e sua relação com autismo nos filhos. Os autores concluíram a partir da meta-análise de dez publicações que o polimorfismo C677T está correlacionado de maneira significativa com risco para autismo e análises seguintes mostraram que a associação era significante em 5 comparações: frequência alélica, heterozigoto, homozigoto, modelo dominante e recessivo, sendo a associação mais intensa era com homozigoto (TT). Ou seja, crianças com o genótipo TT eram 1.86 vezes mais propensas a ter autismo do que as de genótipo CC60. Por fim, estes estudos demonstram que o perfil genético de cada indivíduo também é uma variante importante a ser considerada na avaliação dos efeitos do consumo do ácido fólico e a variação interindividual do metabolismo do carbono.

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5. DISCUSSÃO

Consumo de níveis adequados de folato é sem dúvida essencial para a regulação de diversos mecanismos que contribuem para a prevenção dos defeitos no tubo neural. Porém, o principal debate continua a ser as questões éticas em relação à fortificação mandatória ser mais benéfica para alguns do que para outros.

Além disso, é importante levar em consideração, quando um programa de fortificação é implementado em âmbito nacional, o quão traduzível é o resultado obtido de um país para outro e para conseguir atuar de maneira efetiva na prevenção de DTNs, mais importante que adotar políticas públicas universais de fortificação, primeiro é necessário entender o mecanismo de desenvolvimento das malformações congênitas e qual é de fato o papel do folato nesse contexto2.

Dessa forma, intervenções mais efetivas e dirigidas para as pessoas em alto risco poderão ser elaboradas de forma segura e assertiva. Outra necessidade é estabelecer a relação dose resposta do ácido fólico na proteção contra DTNs, pois dará suporte aos debates sobre as doses adequadas para a fortificação de alimentos.

A respeito das metodologias adotadas nos estudos, um dos obstáculos para os testes de epigenética que avaliam o perfil de metilação é a coleta de DNA que é realizada com leucócitos presentes na circulação sanguínea, pois muitas vezes é o único tecido de fácil coleta quando se estuda indivíduos saudáveis em uma determinada população34. Porém, é importante ressaltar que a regulação epigenética varia entre tecidos e tipos de célula34.

Além disso, em outros casos o desafio é o método de avaliação para estimar o status do consumo de folato. Muitas vezes é feito por meio do questionário de frequência de consumo retrospectivo, em que é calculado o consumo de determinado nos últimos meses ou por meio de questionário que avalia o consumo nas últimas 24 horas61. Ambos ficam sujeitos à erros de subjetividade e dão espaço à vieses.

E por fim, muitas vezes o consumo é avaliado como folato na dieta, ácido fólico suplementado ou folato total, porém, não é especificado no estudo se o folato na dieta inclui ou não o ácido fólico presente nas farinhas ou se o folato total inclui o de origem natural, o fortificado e/ou o suplementado.

Portanto, é importante ressaltar que políticas públicas em saúde que considerem a fortificação devem elaborar um plano de avaliação da efetividade e segurança da intervenção62. Assim como, estabelecer limiares mínimos e máximos

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seguros do consumo de ácido fólico, assim como metodologias padronizadas para avaliação desse nutriente nos indivíduos.

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6. CONCLUSÃO

A fortificação mandatória com ácido fólico juntamente com o fácil acesso à suplementos vitamínicos contendo o mesmo levanta diversos desafios científicos, éticos e técnicos. O folato é sem dúvida um componente vital da dieta humana, uma vez que sua deficiência causa desarranjo de muitos processos metabólicos.

Porém, na sociedade moderna em que o acesso à informação aumentou, juntamente com a alta disponibilidade ao ácido fólico; a toxicidade ao invés da deficiência se tornou um fato importante que necessita ser mais bem aprofundado. A fortificação voluntária, a disponibilidade de suplementos contendo ácido fólico e a adição mandatória de AF às farinhas pode estar contribuindo para os níveis excessivos de ácido fólico na dieta, o que pode causar efeitos indesejáveis na população.

Os efeitos adversos podem impactar em diversas áreas da saúde pública, com estudos mostrando que consumo de elevados níveis de ácido fólico sob certas circunstâncias pode promover câncer, afetar o desenvolvimento fetal e neurológico, assim como influenciar no desenvolvimento de resistência à insulina.

Nesse contexto, em que vários estudos apontam para diversos efeitos indesejados do consumo excessivo de ácido fólico eu acredito, assim como Finnell et al.8, que múltiplos genes com pequenas contribuições, cada um dos quais podem ser regulados por fatores nutricionais, interagem de forma combinatória para criar um desequilíbrio maior e mais significante no desenvolvimento de um desequilíbrio metabólico do que poderiam ter produzido individualmente.

Assim, é a soma total de todas as interações entre esses elementos, tanto genéticos como ambientais, que levam aos fenótipos anormais observados em lactentes com malformações congênitas. Atualmente, as atividades de pesquisa que incluem o desenvolvimento de novas ferramentas analíticas para explorar plenamente as interações gene-nutrientes e gene-genes vão ser fundamentais para intervenções nutricionais mais assertivas em saúde.

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