AVALIAÇÃO DO MODELO DE TRANSTORNO DE ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO (TEPT) EM CAMUNDONGOS MACHOS: EFEITOS DO MIDAZOLAM, SERTRALINA E AUSÊNCIA DE EFEITO DA IMIPRAMINA
Fernando de Souza Melo Costa
São Carlos 2008
AVALIAÇÃO DO MODELO DE TRANSTORNO DE ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO (TEPT) EM CAMUNDONGOS MACHOS: EFEITOS DO MIDAZOLAM, SERTRALINA E AUSÊNCIA DE EFEITO DA IMIPRAMINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO MODELO DE TRANSTORNO DE ESTRESSE PÓS-TRAUMÁTICO (TEPT) EM CAMUNDONGOS MACHOS: EFEITOS DO MIDAZOLAM, SERTRALINA E AUSÊNCIA DE EFEITO DA IMIPRAMINA
Orientadora: Profa. Dra. Azair Liane Matos do Canto de Souza.
São Carlos, SP 2008
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de São Carlos, como parte dos requisitos para obtenção do título de mestre em ciências fisiológicas.
Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da Biblioteca Comunitária da UFSCar
C837am Costa, Fernando de Souza Melo. Avaliação do modelo de transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) e camundongos machos : efeitos do midazolam, sertralina e ausência de efeito da imipramina / Fernando de Souza Melo Costa. -- São Carlos : UFSCar, 2008.
84 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São Carlos, 2008.
1. Psicofarmacologia. 2. Ansiedade. 3. Camundongo. 4. Labirinto em cruz elevado. 5. Transtorno do stress pós-traumático. 6. Claro-escuro. I. Título.
Universidade
Federalde São Carlos
Programade Pós-Graduaçãoem CiênciasFisiológicas
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I I I I I I IDefesa de Dissertação de Fernando de Souza Meio Costa
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Prol. Dr. Paulo José de Campos Nogueira..u.~~.íL~~.m...
Dedico este trabalho aos meus pais Antonio e Suely, e Avó Maura pelo apoio e incentivo em todos os momentos da minha vida, alegres ou difíceis. A vocês, minha gratidão por tudo que fizeram e fazem por mim.
À Deus;
À professora Azair, pela orientação, confiança, incentivo e apoio na realização do trabalho; À banca examinadora da Qualificação: Profa. Dra. Cleópatra S. Planeta, Profa. Dra. Rosana Mattioli e Prof. Dr. Paulo José de Campos Nogueira pelas sugestões;
À banca examinadora, pela atenção prestada na leitura deste trabalho; Ao professor Ricardo (Unesp-Araraquara), pelas valiosas sugestões;
Aos técnicos do laboratório, Adriana Corsi e José Gaban, pelo auxílio no dia-a-dia;
Aos amigos do laboratório Ila, Vanessa, Gabriel, Cilene, Letícia, Daniela, Luana, Kelly, Marcos, Polianna, Paula, Luciana, sempre presentes nos momentos bons ou difíceis;
Aos meus pais, pelo apoio incondicional em todas as escolhas da minha vida;
À minha avó Maura, pelo cuidado e dedicação durante todos os mmomentos da minha vida. À Renata, minha namorada, pelo amor, paciência e apoio nos momentos de dificultade; À Selma e Alexandre pela competência profissional na secretaria do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas;
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES, pela bolsa concedida durante a realização deste estudo.
O Transtorno de Estresse Pós-Traumático (TEPT) afeta uma parcela de indivíduos que são expostos a um evento traumático. Este distúrbio induz em longo prazo alterações no eixo HPA, autonômicas e cognitivas. O objetivo deste estudo foi avaliar se o modelo animal de TEPT proposto para ratos poderia ser utilizado em camundongos e investigar o efeito dos fármacos benzodiazepínico, antidepressivo tricíclico e inibidor seletivo da recaptação de serotonina, no modelo de TEPT. Para isso realizamos os seguintes experimentos: Experimento 1- O teste consistiu em submeter camundongos machos, Suíço-albino ao choque inescapável (0,3mA) nas patas no lado escuro (LE) da caixa claro-escuro (CE). No 7º, 14º e 21º dia os camundongos foram reexpostos a situação de lembrança no lado claro (LC) ou LE da caixa por 2 min, sem choque. No 29º dia os animais foram expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE), para o registro dos índices de ansiedade [porcentagem de entradas (%EBA) e de tempo gasto nos braços abertos (%TBA) e atividade locomotora, entrada nos braços fechados (EBF)]. No 34º dia os mesmos animais foram submetidos ao teste CE para o registro da latência de fuga (LF) e do tempo gasto no LC da caixa CE. Experimento 2 – o mesmo procedimento do experimento 1 foi adotado, exceto que os animais foram reexpostos no 7º, 14º e 21º dia a situação de lembrança apenas no LC da caixa por 2 min, sem choque. No 29º dia os animais, 30 min após receberem tratamento com midazolam, foram expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE). No 34º dia os mesmos animais após receberem o mesmo tratamento farmacológico, foram submetidos ao teste CE. Experimento 3, 4 e 5 – o mesmo procedimento do experimento 2 foi adotado, exceto que no 29º dia os animais não foram submetidos ao LCE e no 34º dia, 30 min após receberem tratamento com midazolam, imipramina e sertralina foram submetidos ao teste CE. A ANOVA de duas vias (estímulo x local da SL ou tratamento) seguido do teste de Duncan mostrou que o modelo de TEPT produziu aumento da ansiedade nos camundongos (P < 0,05). As reexposições no LE promoveram extinção do efeito ansiogênico do modelo. O tratamento com midazolam (1,0 e 2,0 mg/kg) produziu efeito ansiolítico no LCE (P < 0,05), e a dose de 0,5 mg/kg reduziu a latência de fuga do ambiente claro (P < 0,05) no teste CE e aumentou a atividade exploratória, sugerindo o envolvimento deste agonista GABA-benzodiazepínico na modulação do TEPT. O LCE não interferiu na avaliação do teste CE. A imipramina não apresentou efeito sobre os camundongos (P > 0,05), ou seja, ausência de efeito deste antidepressivo tricíclico nos sintomas do TEPT. A sertralina (5,0 mg/kg) produziu efeito ansiolítico no teste CE (P < 0,05) e aumento na atividade exploratória, mostrando o envolvimento deste inibidor seletivo da
envolvidas neste distúrbio.
Palavras Chave: Transtorno de estresse pós-traumático, ansiedade, midazolam, imipramina, sertralina, labirinto em cruz elevado, teste claro-escuro.
The post-traumatic stress disorder (PTSD) affects a portion of subjects exposed to a traumatic event. This disorder leads to long-term alterations in the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis, autonomic and cognitive function. The aim of our study was to evaluate whether the animal model of PTSD proposed for rats could be used in mice and, to evaluate the effect of benzodiazepine, tricycle antidepressant and selective serotonin reuptake inhibitor drugs in the PTSD model. For this we realized the following experiments: Experiment 1- The test consisted of exposure the male mice to inescapable electric footshock (0.3 mA) in the black side (BS) of the black-white box (BW). In the 7th, 14th and 21th day, mice were re-exposed to the traumatic reminder on the white side (WS) or BS for 2 min, without footshock. In the 29th day, the animals were submitted to elevated plus-maze (EPM) for record the anxiety indexes [percentage of open arm entries (%OA) and percentage of open arm time (%OT) and as well as general locomotor activity, closed arm entries (CE)]. On day 34 the same animals were submitted to BW test for record the latency to escape (LE) from WS and time spent on WS of the BW box. Experiment 2 – the same procedure of experiment 1 was performed, except that the animals were re-exposed at 7th, 14th e 21th days to reminder situation only in WS of BW box for 2 min, without footshock. On day 29th, the animals were exposed to EPM, 30 min after receiving treatment with midazolam. In 34th day the same animals after receiving treatment with midazolam were submitted to BW box test. Experiment
3, 4 and 5 - the same procedure was adopted from experiment 2, except that in 29th day, the
animals were not submitted to EPM test and on 34th day 30 minutes after treatment with midazolam, imipramine and sertraline were submitted to BW box. Two-way ANOVA (stimulus x place remainder or treatment) followed by Duncan test showed that PTSD model increased anxiety in mice (P<0.05). The re-exposure in BS promoted anxiogenic-like effect extinction of the model. The midazolam treatment (1.0 and 2.0 mg/kg, i.p.) produced anxiolytic-like effect in maze-mice (P < 0.05) and the 0.5 mg/kg decreased latency to escape of WS (P < 0.05) of BW box and increased the exploratory activity, suggesting involvement of this GABA-benzodiazepine agonist on this PTSD modulation. The EPM test does not interfere in the evaluation of the BW test. It is important to note that no other behaviors were significantly altered by imipramine per se (P < 0.05). The sertraline (5.0 mg/kg), selective serotonin reuptake inhibitor, produced anxiolytic-like effect in the BW test (P < 0.05) and increase exploration activity. These results suggest that the employed PTSD model to study neurobiological disturbances associated with this disorder.
Figura 1: Labirinto em cruz elevado 23
Figura 2: Caixa claro escuro 24
Figura 3: Efeito do modelo de TEPT sobre a freqüência de entrada nos braços
fechados (BFs) e as porcentagens de entrada e de tempo gasto nos braços abertos (BAs) do LCE em camundongos (n=11-12). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) do número de entrada nos braços fechados e as porcentagens de entrada e do tempo gasto nos BAs do LCE. *P < 0,05 comparado ao LE CCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan). #P < 0,05 comparado
ao grupo LC SCHO (ANOVA duas vias seguido do teste de Duncan). 30
Figura 4: Efeito do modelo de TEPT sobre a latência de fuga do ambiente claro (LF) e
tempo gasto no compartimento escuro (TE) do teste CE em camundongos (n=11-12). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e TC da caixa CE. *P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan). #P < 0,05 comparado ao grupo CCHO LE (ANOVA duas vias seguido do teste de Duncan)
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Figura 5: Efeito do tratamento farmacológico com midazolam sobre a freqüência de
entradas nos braços fechados (BFs) e as porcentagens de entradas e de tempo gasto nos braços abertos (BAs) do LCE em camundongos (n=9-15). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) do número de entrada nos braços fechados e as porcentagens de entradas e do tempo gasto nos BAs do LCE. *P < 0,05 comparado ao respectivo controle salina (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
32
Figura 6: Efeito do tratamento farmacológico com midazolam sobre a latência de fuga
do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=9-15). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e TC da caixa CE. #P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
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Figura 7: Efeito do tratamento farmacológico com midazolam sobre a latência de fuga
do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=6). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e TC da caixa CE. *P < 0,05 comparado ao grupo CCHO salina (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan). # P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
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Figura 8: Efeito do tratamento farmacológico com imipramina sobre a latência de fuga
do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=12). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e TC da caixa CE. #P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
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Figura 9: Efeito do tratamento farmacológico com sertralina sobre a latência de fuga
do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=12). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e TC da caixa CE. *P < 0,05 comparado ao grupo salina CCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan). # P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
LCE – labirinto em cruz elevado n - número de sujeitos
TAG – transtorno de ansiedade generalizada EBA – entradas nos braços abertos
EBF – entradas nos braços fechados TBA – tempo gasto nos braços abertos TBF – tempo gasto nos braços fechados TCe – tempo gasto no centro
TE – total de entradas
%EBA – porcentagem de entradas nos braços abertos %EBF – porcentagem de entradas nos braços fechados %TBA – porcentagem de tempo gasto nos braços abertos %TBF – porcentagem de tempo gasto nos braços fechados %TC – porcentagem de tempo gasto no centro do labirinto BAs – braços Abertos
BFs – braços fechados
DPM – desvio padrão da média EPM – erro padrão da média CE – claro escuro
LC – lado claro LE – lado escuro LF – latência de fuga TC – tempo no claro TEs - tempo no escuro
1. INTRODUÇÃO 1.1 Ansiedade 1.2 Transtorno de Estresse Pós Traumático 1.3 Sistemas Cerebrais de Defesa 1.4 Modelos Animais 2. OBJETIVO 3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Sujeitos 3.2 Equipamentos 3.2.1 Labirinto em cruz elevado (LCE) 3.2.2 Caixa claro escuro
3.3 Drogas 3.4 Procedimento Geral 3.4.1 Experimento 1 3.4.2 Experimento 2 3.4.3 Experimento 3, 4 e 5 3.5 Análise Comportamental 3.6 Análise Estatística 3.7 Ética 4. RESULTADOS 4.1 Experimento 1 4.2 Experimento 2 4.3 Experimento 3 4.4 Experimento 4 4.5 Experimento 5 5. DISCUSSÃO 6. CONCLUSÃO 7. REFERÊNCIAS 8. APÊNCICE 15 15 16 18 19 22 23 23 23 23 24 24 25 25 26 26 27 27 28 29 29 32 34 36 37 39 45 46 62
1. INTRODUÇÃO
1.1 Ansiedade
A ansiedade humana vem sendo relatada há milênios, porém não despertou interesse na medicina e só veio ter importância na cultura ocidental a partir do final do século XIX (Dractu & Lader, 1993). Sigmund Freud, com sua visão psicanalista, influenciou no esclarecimento de alguns dos sintomas da ansiedade e, com o desenvolvimento das neurociências surgiu uma orientação mais biológica para explicar este distúrbio (Pereira, 1997).
Schmitt & Kapczinski (2004), apontaram a ansiedade como um sentimento responsável pela sobrevivência da espécie humana na terra. Pois o medo de ataques de predadores e a antecipação mental dessa possibilidade (característica da ansiedade) levaram o homem a utilizar estratégias eficientes de fuga ou enfrentamento, resultando na preservação da espécie.
A ansiedade torna-se indesejável quando a intensidade das manifestações, durações, relação com o evento desencadeante ocorrem de forma intensa, persistente, desproporcional e passa a ser alvo de intervenção médica (Hetem e Graeff, 2004). Porém, o valor adaptativo da ansiedade moderada também propicia um melhor desempenho em determinadas situações como atividade intelectual (Guimarães, 2001). Entretanto a ansiedade é uma das causas mais comuns que levam os pacientes a procurar assistência médica ou psiquiátrica (Hetem e Graeff, 2004).
A ansiedade geralmente apresenta combinações de manifestações psíquicas e fisiológicas. Justamente por tal motivo, na tentativa de normatizar as variações dos estados patológicos, surgiram os manuais diagnósticos, que incluem o CID (Classificação Internacional de Doenças) e o Manual de Diagnóstico e Estatística das Doenças Mentais (DSM), promovido pela Associação Psiquiátrica Americana e já em sua quarta revisão – DSM-IV-TR (CID-10, 1993; APA, 2000). A tabela 1 resume as principais classificações propostas pelo DSM-IV-TR.
Tabela 1 – Transtornos de Ansiedade segundo classificação do DSM-IV
Agorafobia Ataque de Pânico
Transtorno de Pânico Sem Agorafobia Transtorno de Pânico Com Agorafobia
Agorafobia Sem História de Transtorno de Pânico Fobia Específica
Fobia Social
Transtorno Obsessivo-Compulsivo Transtorno de Estresse Pós-Traumático Transtorno de Estresse Agudo
Transtorno de Ansiedade Generalizada
Transtorno de Ansiedade Devido a uma Condição Médica Geral Transtorno de Ansiedade Induzido por Substância
Transtorno de Ansiedade Sem Outra Especificação. Modificado DSM-IV-RT (APA, 2000)
1.2 Transtorno de Estresse Pós Traumático
Estima-se que a prevalência do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) na população mundial varie de 1 a 14%, podendo alcançar índices de 60 a 80% em populações submetidas a traumas constantes (American Psychiatric Association, 2000; National Center for Posttraumatic Stress Disorder, 2007).
Segundo a classificação do DSM-IV-TR (2000), o transtorno de estresse pós-traumático caracteriza-se pelo desenvolvimento de sintomas como, por exemplo, sentimentos de medo intenso, impotência ou horror. Os sintomas fundamentais deste transtorno incluem revivência persistente do evento traumático, esquiva persistente de estímulos associados com o trauma, embotamento de responsividade geral e sintomas persistentes de excitação aumentada, geralmente ocorrendo após a exposição a estressor traumático extremo. Os sintomas devem estar presentes por mais de um mês, podendo variar em relação à duração em: agudo (presença de sintomas por menos de três meses) ou crônico (presença de sintomas por três meses ou mais).
As alterações neurobiológicas do TEPT ainda não estão claras até o momento, porém sabe-se que os pacientes de TEPT apresentam hiperativação simpático-adrenal, como por exemplo, a avaliação muitos anos depois do inicio do transtorno mostra que a freqüência cardíaca está mais elevada e sua variabilidade diminuída, o que indica uma ativação do sistema simpático e redução do tônus vagal associada à hipofunção do eixo HPA, caracterizada por níveis de cortisol baixo. Estudos têm demonstrado que quanto mais reduzida à função desse último, maior risco do indivíduo apresentar tal transtorno (Resnik et al., 1995; Yehuda et al., 1995; Yehuda et al., 2000). Desse modo, a deficiência de cortisol, verificada no TEPT faria com que os pacientes ficassem sem reação ao evento estressor na fase de defesa (Yehuda et al., 1997). O que poderia explicar a maioria dos sintomas do TEPT, inclusive as alterações cognitivas. Além disso, vários autores já demonstraram redução do volume hipocampal em indivíduos com TEPT (Bremner et al., 1995; Nutt & Malizia, 2004; Smith, 2005; Karl et al., 2006) e diferenças no volume de outras estruturas do sistema nervoso central (SNC) (para revisão, Stam, 2007a).
Apesar de compartilhar sintomas com outros transtornos psiquiátricos, alguns estudos têm demonstrado alterações únicas nos pacientes com TEPT, como por exemplo, revivência do evento traumático, o que vai influenciar a resposta individual à medicação. Além disso, um paciente pode necessitar de diferentes fármacos no decorrer do tratamento, dependendo dos sintomas que forem mais proeminentes em determinado momento (Segal, 1979; Kosten et al., 1987; Martinez et al., 2007; Southwick et al., 1991; Southwick et al., 1993).
Assim, alguns autores propõem a seguinte associação entre as dimensões psicopatológicas do TEPT e a resposta aos diferentes fármacos: a) os sintomas de revivescência do trauma normalmente mostram melhor resposta aos antidepressivos tricíclicos como a imipramina; b) a esquiva a estímulos relacionados ao trauma e distanciamento afetivo, aos inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS), como por exemplo, a sertralina; c) a hiperestimulação autonômica, aos betabloqueadores e agonistas alfa-2-adrenérgicos (Friedman, 1988; Davidson, 1992; Katz et al., 1996; Viola et al., 1997; Nutt, 2000; Karl et al., 2006). No entanto os ISRS, como por exemplo, sertralina, são os fármacos que apresentam as melhores respostas no combate ao TEPT, portanto a medicação de primeira escolha (Albucher & Liberzon, 2002).
Neste sentido, estudos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado que no TEPT, ocorrem alterações nos neurotransmissores do SNC, tais como, ácido gamaminobutírico (GABA), serotonina, glutamato, entre outros (Kim & Gorman, 2005).
1.3 Sistemas Cerebrais de Defesa
Bases neurais do comportamento emocional apontam para circuitos neurais específicos que respondem em conformidade com a natureza do estímulo a que o indivíduo é exposto. Os mecanismos associados à resposta incondicionada (inata e não aprendida) estão associados ao chamado sistema cerebral aversivo, representado pelo hipotálamo medial, pela substância cinzenta periaquedutal dorsal e pela amídala. A estimulação elétrica destas estruturas encefálicas produz alterações autonômicas intensas (Brandão et al., 1999).
Além do sistema cerebral aversivo, existe outro sistema neural que organiza a resposta condicionada, o sistema de inibição comportamental, representado pelo sistema septo-hipocampal, em conjunto com núcleo mediano da rafe e a substância cinzenta periaquedutal ventral (Gray & McNaughton, 2000). Já a amídala, está envolvida na participação das respostas incondicionada e condicionada, agindo como interface entre o sistema de inibição comportamental e o sistema cerebral aversivo (Brandão et al., 2003; McNaughton & Corr, 2004). Portanto, sugeriu-se inicialmente que o sistema septo-hipocampal fosse o componente principal do sistema de inibição comportamental, pois sua ativação gera ansiedade (Gray, 1982).
Confirmando os achados da teoria proposta por Gray (Sistema de Inibição Comportamental, de 1982) e acrescentando pontos importantes nesta teoria distinguindo medo e ansiedade,McNaughton & Corr, (2004)relataram que o medo apresenta a função de mover o animal para longe da fonte de perigo, podendo envolver fuga, luta ou congelamento e é insensível a drogas ansiolíticas. Por outro lado, em uma situação conflituosa de aproximação-esquiva, a ansiedade faz com que o animal mova-se em direção a fonte de perigo, aumentando a avaliação de risco e é sensível a ação de drogas ansiolíticas.
Várias evidências têm mostrado que estímulos condicionados potenciais e distais, estímulos incondicionados ameaçadores e proximais estão representados nos dois sistemas neurais responsáveis pela geração e elaboração dos comportamentos emocionais: o sistema de inibição comportamental e o sistema cerebral aversivo,acionados em situações de conflito ou perigo eminente, respectivamente. A ativação de um ou outro destes sistemas resulta na experiência emocional a qual denominamos medo/pânico ou ansiedade (Brandão et al., 2003).
Assim, a avaliação do comportamento de roedores em confronto com predadores pode levar ao surgimento de estratégias comportamentais chamadas de avaliação de risco, exibidas de acordo com o nível de ameaça, se potencial ou real (se real, distal ou proximal). O primeiro
nível está relacionado com a ameaça potencial (novidade), que pode envolver a procura por alimento quanto possíveis ameaças novas, dessa forma, a reação de defesa é a exploração cuidadosa do ambiente. No segundo nível a ameaça está presente, porém distante, nesse momento o predador é identificado, mas estando a uma distância superior àquele limite, verifica-se, então, inibição comportamental que é caracterizada pela imobilidade ou congelamento. E no último nível a ameaça está muito próxima, fazendo com que a presa possa apresentar um comportamento de fuga ou luta (Blanchard et al., 1986, 1997, 2003).
1.4 Modelos Animais
Em consideração a complexidade para conduzir estudos prospectivos de TEPT em humanos, vários modelos animais tem sido desenvolvidos usando diferentes tipos de eventos aversivos (Foa et al., 1992; Yehuda & Antelman, 1993; Stam, 2007). Entretanto, nestes modelos animais, as alterações comportamentais são observadas logo após o evento aversivo (Cohen et al., 2003; Wang et al., 2000) e no TEPT em humanos, os sintomas são observados em longo prazo (American Psychiatric Association, 2000).
Estudos com animais têm demonstrado que estímulos aversivos podem causar aumento da ansiedade em vários modelos de TEPT (Stam, 2007). Por exemplo, nos modelos de exposição ao odor do gato (Zangrossi & File, 1992), derrota social (Heinrichs, 1992 et al; Rodgers & Cole, 1993) e choque inescapável nas patas (Steenbergen & Heinsbroek; 1990; Short & Maier, 1993), os roedores apresentam diminuição das porcentagens de entradas e de tempo gasto nos braços abertos do labirinto em cruz elevado (LCE), mesmo que o evento estressor tenha sido apresentado trinta minutos ou 24 horas antes do teste. Além disso, a administração de choque inescapável na cauda de ratos também produz aumento da ansiedade avaliada no LCE (Grahn et al., 1995).
Também já foi constatado em outros modelos de ansiedade que a administração de choque inescapável em ratos produziu diminuição nos níveis de interação social após 24-72 horas da aplicação do evento estressor, sem alterar a locomoção na arena (Short & Maier, 1993).
Alguns modelos animais com relevância para TEPT esbarram no fato, de que com exceção das experiências traumáticas severas, somente uma minoria de indivíduos desenvolve o TEPT quando expostos a uma situação aversiva, o que torna difícil à semelhança fenomenológica com modelos animais (Stam, 2007a).
No modelo de TEPT em roedores proposto inicialmente por Pynnos et al., (1996) e modificado por Louvart et al., (2005), um estímulo aversivo (estimulação elétrica nas patas de ratos fêmeas), provocou reações comportamentais caracterizadas por alterações autonômicas, congelamento e medo. A reexposição subseqüente de roedores a situações de lembrança do ambiente aversivo contribui para o processo de consolidação das memórias traumáticas (Stam, 2007a; Stam, 2007b).
Alguns estudos tentam entender as adaptações neurais, endócrinas e comportamentais frente a um estímulo aversivo induzido em animais. Estes estudos demonstram que a exposição prévia ao estímulo estressor altera respostas futuras frente ao mesmo estímulo, principalmente desenvolvendo tolerância ou sensibilização. Como por exemplo, o que ocorre no modelo de depressão em roedores onde o tratamento crônico com choque inescapável nas patas pode levar a alterações comportamentais características de depressão (Wilner, 1984). Portanto surgem as distintas respostas adaptativas que podem ser influenciadas pela intensidade, duração e tipo de estímulo aversivo utilizado (Mcewen, 2000; Stam et al., 2000). A adaptação ao estresse induzido repetidamente, isto é, expondo animais diariamente e com variadas durações ao estímulo aversivo (Shibasaki et al., 1995) e as respostas biológicas e comportamentais horas após o primeiro episódio ao estímulo aversivo também tem sido investigadas (Pynnos et al., 1996).
Portanto, objetivando o tratamento dos TEPT estratégias farmacológicas têm contribuído para a identificação da correlação neuroquímica central do evento estressor com o distúrbio comportamental através da administração farmacológica em modelos animais (Hamilton et al., 1986).
Neste sentido, um dos modelos animais mais utilizados nas últimas décadas é o LCE, que desde a sua introdução por Handley e Mithani (1984), tornou-se um dos modelos mais usados para detectar atividade ansiolítica de drogas (Hogg, 1996). O teste é baseado na aversão natural de roedores a espaços abertos, foi modificado de Montgomery, (1955), validado em ratos por Pellow et al., (1985) e em camundongos por Stephens et al., (1986); Lister, (1987) e é bidirecionalmente sensível a manipulações projetadas para avaliar a ansiedade (Rodgers & Cole, 1994). Os índices principais de ansiedade no labirinto em cruz elevado compreendem medidas espaço-temporais de esquiva dos braços abertos, enquanto a atividade locomotora é avaliada seja pelo número total de entradas nos braços ou pelo número de entradas nos braços fechados (Lister, 1987; File, 1992 b). Alguns autores têm demonstrado que o material utilizado na confecção do aparato não interfere na avaliação das respostas de ansiedade (Rodgers et al., 1997), entretanto a utilização de braços fechados transparentes no
LCE possibilita uma melhor observação dos efeitos ansiolíticos e não compromete a atividade locomotora geral do animal, na verdade, melhora a exploração do aparato (Wall & Messier, 2000).
Já o modelo claro-escuro (CE) descrito e validado inicialmente por Crawley & Coodwin (1980), é baseado na aversão inata a áreas iluminadas, abertas e no comportamento exploratório espontâneo dos roedores. Uma situação de conflito natural ocorre quando um animal é exposto a um ambiente não familiar ou novos objetos. O conflito ocorre entre a tendência de explorar e a tendência inicial de esquivar-se de ambientes não familiares. A caixa original de teste consiste de dois compartimentos, sendo o compartimento claro tendo dois terços, em relação ao compartimento escuro, totalizando (46 x 27 x 30 cm) com uma pequena passagem entre os compartimentos de 7,0 cm altura, sendo que no compartimento iluminado a parte superior da caixa permanece aberta.
Em 1991, o modelo CE foi modificado por Young & Johnson. Estes autores aumentaram os compartimentos escuro (40 x 23 x 20 cm altura) e claro (40 x 42 x 30 cm altura). Posteriormente, uma nova modificação foi realizada para a implantação de um potenciômetro ligado ao solo do ambiente escuro, permitindo a estimulação elétrica nas patas dos roedores (Pynoos et al., 1996).
O teste CE tem vantagens tais como, fácil uso, início rápido, sem a necessidade de treinamento prévio, privação de comida e água, além da possibilidade da utilização de estímulos naturais ou condicionados. A transição tem sido relatada como um índice de atividade exploratória (Belzung et al., 1987), e a porcentagem de tempo gasto em cada compartimento e latência de fuga do compartimento claro como índice de atividade ansiolítica ou ansiogênica. O tratamento farmacológico com agentes ansiolíticos faz com que os animais permaneçam por mais tempo no lado claro da caixa CE (Hascoet & Bourin, 1998).
Diante da crescente população com TEPT, dificuldade no diagnóstico precoce e fármacos com pouca ou nenhuma eficácia em seres humanos, outros estudos e modelos são necessários para esclarecer principalmente as bases neurais do TEPT.
2. Objetivo
Considerando as evidências acima, este estudo teve por objetivo:
Avaliar se o modelo animal de transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) proposto para ratos, poderia ser utilizado para investigar o efeito dos fármacos benzodiazepínico, antidepressivo tricíclico e inibidor seletivo da recaptação de serotonina, no modelo de TEPT modificado para camundongos.
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1 Sujeitos
Foram utilizados camundongos da cepa Suíço-albino, machos, pesando 28-33 gramas, provenientes do biotério central da Universidade Federal de São Carlos-UFSCar. Os animais foram agrupados em gaiolas coletivas (41 x 34 x 16 cm, 10 por gaiola), mantidos em condições controladas de temperatura (24 ± 1 ºC), umidade (55 ± 5%), luz (ciclo claro/escuro de 12/12 horas, luzes acessas às 7:00 horas) e livre acesso ao alimento e água, exceto durante as breves sessões de teste.
3.2 Equipamentos
3.2.1 Labirinto em cruz elevado (LCE)
Consiste de dois braços abertos (30 x 5 x 0,25 cm) unidos ortogonalmente a dois braços fechados transparentes (30 x 5 x 15 cm), elevados a 38,5 cm do solo por um suporte de madeira (mofificado de Lister, 1987). A iluminação utilizada foi de 77 lux no assoalho da plataforma central. Os testes foram conduzidos durante a fase clara do ciclo de luz (08h30 - 16h00).
3.2.2 Caixa claro escuro (CE)
Feita de alumínio consiste de dois compartimentos, um claro aberto medindo (30 x 30 x 40 cm) e um compartimento escuro fechado (30 x 30 x 40 cm) (Costall et al., 1989). Os compartimentos eram unidos através de uma porta guilhotina (10 x 15 cm de altura), em ambos os compartimentos, o assoalho é formado por 13 barras de alumínio em paralelo, sendo que no compartimento escuro as barras estão ligadas a corrente elétrica, com intensidade de 0,3 mA. Acima do compartimento claro, está acoplada uma lâmpada de 25 W. Os testes foram conduzidos durante a fase clara do ciclo de luz (08h30 - 16h00).
3.3 Drogas
Midazolam (MDZ): (8-Cloro-6-(fluorofenil)-1-metil-4H-imidazo[1,5-a][1,4] maleato de benzodiazepina), PM: 441,8, dissolvido em salina (0,9% NaCl), nas doses de (0, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg, i.p.) Roche, Brasil. Imipramina (IMP): 10,11-Dihidro-N, N-dimetil-5H-dibenzil-5-propanamina hidrocloridríca. PM: 316,87, dissolvida em salina (0,9% NaCl), nas doses de (0, 5,0, 10,0 e 20,0 mg/Kg, i.p.) Sigma, Brasil. Sertralina (SER): (1S,4S)-4-(3,4-Dicloro)-1,2,3,4-tetrahidro-N-metil-1-naftalenamina hidrocloridríca), PM: 342,69, dissolvida em salina (0,9% NaCl), nas doses de (0, 5,0, 10,0 mg/Kg, i.p.) Sigma, Brasil. As doses utilizadas foram baseadas em estudos prévios: midazolam (Nunes-de-Souza et al., 2000), imipramina (Lister, 1987; Cole & Rodgers, 1995) e sertralina (Matar et al., 2006).
3.4 Procedimento Geral
Realizamos cinco experimentos, conforme descrição abaixo.
3.4.1 Experimento 1
Treinamento (T) - realizado na caixa claro-escuro (CE). Os camundongos foram separados aleatoriamente em quatro grupos, sendo dois sem (SCHO) e dois com choque nas patas (CCHO – 0,3mA). No primeiro dia de teste os animais foram confinados no lado escuro (LE) da caixa e após 2 minutos, a porta guilhotina foi aberta permitindo a exploração no lado claro (LC) da caixa. Assim que o animal entrou no LC uma lâmpada de 25W foi acessa e houve o retorno imediato do animal ao LE da caixa. A porta foi novamente fechada e os animais foram expostos (CCHO) ou não ao choque (SCHO) nas patas por 10 segundos.
Situações de Lembrança (SL) - No 7º, 14º e 21º dia os grupos, SCHO e CCHO foram reexpostos ao LC (Louvard et al., 2005) ou LE da caixa CE por 2 minutos, sem choque. Avaliação da Ansiedade - No 29º dia os animais dos grupos SCHO e CCHO, foram expostos ao LCE. A exposição ao LCE consistiu em colocar os camundongos individualmente sobre a plataforma central com a cabeça voltada para um dos braços abertos e foi permitido explorar o labirinto por um período de cinco minutos, para o registro dos índices de ansiedade [porcentagem do número de entradas (%EBA) e de tempo gasto nos braços abertos (%TBA), e o número de entradas nos braços fechados (EBF), como avaliação da atividade locomotora.
No 34º dia os mesmos animais foram submetidos ao teste CE. O teste consistiu em colocar os camundongos individualmente sobre a plataforma do lado claro e foi permitido explorar os dois ambientes da caixa CE por um período de cinco minutos para registro da latência de fuga (LF) e do tempo gasto no LC da caixa CE.
3.4.2 Experimento 2
Treinamento (T) – semelhante ao descrito para o experimento 1.
Situações de Lembrança (SL) - semelhante ao descrito para o experimento 1, exceto que os animais dos grupos SCHO e CCHO foram reexpostos somente ao LC da caixa CE por 2 minutos, sem choque.
Avaliação da Ansiedade - No 29º dia os grupos SCHO e CCHO, 30 min após receberem tratamento com MDZ (0, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg, i.p.), foram submetidos ao LCE conforme descrito acima (experimento 1).
No 34º dia os mesmos animais após receberem o mesmo tratamento farmacológico descrito acima, foram submetidos ao teste CE por cinco minutos.
3.4.3 Experimento 3, 4 e 5
O procedimento dos experimentos 3, 4 e 5 foram semelhantes ao utilizado no Experimento 2, exceto que no 29º dia os animais não foram submetidos ao LCE, e no 34º dia, 30 min após receberem tratamento com midazolam, imipramina e sertralina foram submetidos ao teste CE. No experimento 3, foi realizado tratamento com MDZ (0, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/Kg,
i.p.). No experimento 4 o tratamento foi com imipramina (0, 5,0, 10,0 e 20,0 mg/Kg, i.p.) e no experimento 5 o tratamento foi com sertralina (0, 5,0, 10,0 mg/Kg, i.p.)
Todas as sessões foram filmadas e gravadas por uma câmera (Panasonic X12) posicionada sobre o labirinto com ângulo de 45º, e a caixa CE com um ângulo de 90º. A câmera estava ligada a um monitor e vídeo cassete, localizados na sala adjacente a sala de teste.
3.5 Análise Comportamental
Os comportamentos foram avaliados pela análise das fitas gravadas, por um observador treinado, utilizando o programa X-Plo-Rat (Becerra-Garcia et al., 2005). Os comportamentos analisados envolveram os parâmetros convencionais do labirinto em cruz elevado (Lister, 1987) e teste claro escuro (Costall, 1989).
Medidas Convencionais no LCE: freqüência de entradas nos braços abertos e fechados (a entrada em um braço é definida pelo cruzamento com todas as quatro patas para dentro do braço) e duração do tempo gasto nestes compartimentos e na plataforma central. Esses dados foram usados para o cálculo da porcentagem de entradas e do tempo de permanência dos animais nos braços abertos (Entradas: [aberto/total] x 100; Tempo: [tempo no compartimento/300] x 100).
Medidas Convencionais no Teste CE: latência de entrada no compartimento escuro (é definida como o tempo que o animal leva para entrar no compartimento escuro com as quatro patas após ser colocado inicialmente no compartimento claro), tempo de permanência no compartimento escuro.
3.6 Análise Estatística
Todos os resultados foram submetidos a uma análise inicial para avaliar a homogeinidade dos grupos (Teste de Levene), quando necessário, os dados foram transformados em LOG, raiz quadrada ou raiz cúbica. Após a homogeneização passaram pela análise de variância (ANOVA de duas vias), seguido do teste de comparações múltiplas de Duncan. Os valores de P ≤ 0,05 foram considerados significativos.
3.7 Ética
Os experimentos realizados neste estudo estiveram de acordo com as recomendações da Sociedade Brasileira de Neurociência e Comportamento (SBNeC) que é, por sua vez, baseada na US National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
4. RESULTADOS
4.1 Experimento 1 – Avaliação do comportamento de camundongos submetidos ao modelo de TEPT com situações de lembrança (SL) no ambiente escuro e claro.
A Figura 3 mostra o efeito do modelo de transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), com situações de lembrança (SL) no lado escuro (LE) e no lado claro (LC) da caixa, sobre o comportamento de camundongos expostos ao LCE. A análise de variância ANOVA de duas vias (Fator 1: estímulo e Fator 2: local da SL) revelou que os grupos que foram reexpostos durante as SL no LE e LC da caixa apresentaram alteração das medidas de ansiedade [porcentagem de entrada nos braços abertos - %EBA: sem alteração significativa para o estímulo (F(1,43)= 1,02; P > 0,05), local de reexposição durante SL (F(1,43)= 1,10; P >
0,05) e alteração significativa para interação estímulo x local de reexposição durante SL (F(1,43)= 5,07; P < 0,05); porcentagem de tempo gasto nos braços abertos - %TBA: alteração
significativa para o estímulo (F(1,43)= 5,21; P < 0,05), sem alteração significativa do local da
SL (F(1,43)= 1,12; P > 0,05) e da interação estímulo x local de reexposição durante SL (F(1,43)=
3,49; P > 0,05)]; e atividade locomotora representada por entradas nos braços fechados - EBF: sem alteração do estímulo (F(1,43)= 3,54; P > 0,05), do local de reexposição durante a SL
(F(1,43)= 0,04; P > 0,05) e da interação estímulo x local de reexposição durante SL (F(1,43)=
0,55; P > 0,05)].
Análises posteriores utilizando comparações múltiplas Teste de Duncan, mostraram que os grupos que receberam choque nas patas durante o treinamento (CCHO) e foram reexpostos durante as SL no LC da caixa, apresentaram diminuição das %EBA (P < 0,05) e de %TBA (P < 0,05), quando comparado ao grupo que não recebeu choque nas patas durante o treinamento (SCHO). A atividade locomotora não foi alterada em nenhum dos grupos (EBF) (P > 0,05). Os animais que foram reexpostos durante as SL no LE, não apresentaram alteração na %EBA (P > 0,05) e de %TBA (P > 0,05), quando comparados ao grupo SCHO.
Figura 3. Efeito do modelo de TEPT sobre a freqüência de entrada nos braços fechados (BFs) e as porcentagens de entrada e de tempo gasto nos braços abertos (BAs) do LCE em camundongos (n=11-12). As colunas representam a média e o erro padrão da média (M+EPM) do número de entrada nos braços fechados e as porcentagens de entrada e do tempo gasto nos BAs do LCE.
*P < 0,05 comparado ao LE CCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
#P < 0,05 comparado ao grupo LC SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
A Figura 4 mostra o efeito do TEPT, com SL no LE e no LC da caixa, sobre o comportamento de camundongos expostos ao teste claro escuro (CE). A ANOVA de duas vias (Fator 1: estímulo e Fator 2: local da SL) revelou que os grupos que foram reexpostos durante as SL no LE e LC da caixa apresentaram alteração das medidas de ansiedade [latência de fuga do ambiente claro - LF: alteração significativa para o estímulo (F(1,43)= 27,65; P <
0,05), local de reexposição durante SL (F(1,43)= 9,04; P < 0,05) e da interação estímulo x local
de reexposição durante SL (F(1,43)= 8,79; P < 0,05); tempo gasto no compartimento claro -
durante SL (F(1,43)= 15,65; P < 0,05) e sem alteração para a interação estímulo x local de
reexposição durante SL (F(1,43)= 2,58; P > 0,05)].
Figura 4. Efeito do modelo de TEPT sobre a latência de fuga do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=11-12). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da latência de fuga e tempo gasto no compartimento claro da caixa CE.
*P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan). #P < 0,05 comparado ao grupo CCHO LE (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
Análises posteriores utilizando comparações múltiplas Teste de Duncan, mostraram que os grupos que receberam choque nas patas durante o treinamento (CCHO) e foram reexpostos durante as SL no LC da caixa, apresentaram aumento das LF (P < 0,05) e do TC (P < 0,05), quando comparado ao grupo que não recebeu choque nas patas durante o treinamento (SCHO). Os animais que foram reexpostos durante as SL no LE não apresentaram alteração na LF (P > 0,05), entretanto ocorreu aumento no TC (P < 0,05),
ambos quando comparados ao grupo que não recebeu choque nas patas durante o treinamento (SCHO).
4.2 Experimento 2 – Efeito do tratamento com midazolam em camundongos submetidos ao modelo de TEPT.
A Figura 5 mostra o efeito das injeções de midazolam, sobre o comportamento de camundongos expostos ao LCE após passarem pelo modelo de TEPT.
Figura 5. Efeito do tratamento com midazolam sobre a freqüência de entradas nos braços fechados (BFs) e as porcentagens de entradas e de tempo gasto nos braços abertos (BAs) do LCE em camundongos (n=9-15). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) do número de entrada nos braços fechados e as porcentagens de entradas e do tempo gasto nos BAs do LCE.
*P < 0,05 comparado ao respectivo controle salina (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
A ANOVA de duas vias (Fator 1: estímulo e Fator 2: tratamento) revelou que os grupos que foram tratados com midazolam (MDZ) apresentaram alteração das medidas de ansiedade [%EBA: sem alteração significativa para o estímulo (F(1,87)= 0,71; P > 0,05),
alteração significativa no tratamento farmacológico (F(3,87)= 7,46; P < 0,05) e sem alteração
da interação estímulo x tratamento farmacológico (F(3,87)= 0,26; P > 0,05); %TBA: sem
alteração significativa para o estímulo (F(1,87)= 0,007; P > 0,05), alteração significativa no
tratamento farmacológico (F(3,87)= 7,30; P < 0,05) e sem alteração da interação estímulo x
tratamento farmacológico (F(3,87)= 0,52; P > 0,05)] e EBF: sem alteração do estímulo (F(1,87)=
0,04; P > 0,05), alteração significativa no tratamento farmacológico (F(3,87)= 5,96; P < 0,05) e
sem alteração da interação estímulo x tratamento farmacológico (F(3,87)= 1,25; P > 0,05)],
quando comparados ao grupo SCHO.
Análises posteriores utilizando comparações múltiplas Teste de Duncan, mostraram que o tratamento com MDZ nas doses de 1,0 e 2,0 mg/kg, aumentou a %EBA (P < 0,05) para os camundongos dos grupos SCHO e CCHO, e aumentou a %TBA (P < 0,05) somente para os camundongos do grupo SCHO. Enquanto que a dose de 0,5 mg/kg de MDZ não alterou os índices de ansiedade (P > 0,05). Nenhum dos tratamentos com MDZ produziu alteração da atividade locomotora (EBF) nos grupos SCHO e CCHO (P > 0,05), exceto a dose de 0,5 mg/kg de MDZ que aumentou as entradas nos braços fechados nos dois grupos SCHO e CCHO.
A Figura 6 mostra o efeito das injeções de midazolam, sobre o comportamento de camundongos expostos ao teste CE após passarem pelo modelo de TEPT. A ANOVA de duas vias (Fator 1: estímulo e Fator 2: tratamento) revelou que os grupos que foram tratados com MDZ apresentaram alteração das medidas de ansiedade [LF: alteração significativa para o estímulo (F(1,87)= 47,78; P < 0,05), sem alteração significativa no tratamento (F(3,87)= 0,23; P
> 0,05) e alteração da interação estímulo x tratamento (F(3,87= 1,37; P > 0,05); TC: alteração
significativa para o estímulo (F(1,87)= 250,63; P < 0,05) e tratamento farmacológico (F(3,87)=
3,12; P < 0,05), sem alteração da interação estímulo x tratamento farmacológico (F(3,87)= 2,45;
P > 0,05)], quando comparados ao grupo SCHO.
Análises posteriores utilizando comparações múltiplas Teste de Duncan, mostraram que os grupos que receberam choque nas patas durante o treinamento (CCHO) e foram reexpostos durante as SL no LC da caixa, apresentaram aumento das LF (P < 0,05) e do TC (P < 0,05), quando comparado ao grupo que não recebeu choque nas patas durante o treinamento (SCHO), apenas para as doses de 0, 1,0 e 2,0 mg/kg. Apesar da ANOVA ter mostrado diferença em relação ao tratamento farmacológico para TC, o post hoc não confirmou este efeito (P > 0,05).
Figura 6. Efeito do tratamento com midazolam sobre a latência de fuga do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=9-15). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e tempo gasto no compartimento claro da caixa CE.
#P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
4.3 Experimento 3 – Efeito do tratamento com midazolam em camundongos submetidos ao modelo de TEPT modificado.
A Figura 7 mostra o efeito das injeções de midazolam, sobre o comportamento de camundongos expostos ao teste CE após passarem pelo modelo de TEPT. A análise de variância ANOVA de duas vias (Fator 1: estímulo e Fator 2: tratamento) revelou que os grupos que foram tratados com midazolam (MDZ) apresentaram alteração das medidas
Figura 7. Efeito do tratamento com midazolam sobre a latência de fuga do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=6). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e tempo gasto no compartimento escuro da caixa CE.
*P < 0,05 comparado ao grupo CCHO salina (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan). # P < 0,05 comparado ao grupo SCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
convencionais de ansiedade [LF: alteração significativa para o estímulo (F(1,39)= 62,56; P <
0,05), sem alteração significativa no tratamento farmacológico (F(3,39)= 1,41; P > 0,05) e na
interação estímulo x tratamento (F(3,39)= 1,69; P > 0,05); TC: alteração significativa para o
estímulo (F(1,39)= 210,94; P < 0,05), sem alteração significativa no tratamento (F(3,39)= 0,14; P
> 0,05) e na interação estímulo x tratamento farmacológico (F(3,39)= 1,77; P > 0,05)], quando
comparados ao grupo SCHO.
Análises posteriores utilizando comparações múltiplas Teste de Duncan, mostraram que os grupos que receberam choque nas patas durante o treinamento (CCHO) e foram reexpostos durante as SL no LC da caixa, apresentaram aumento das LF (P < 0,05) e do TC
treinamento (SCHO), nas doses de 0, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/kg. Já o tratamento farmacológico com MDZ na dose de 0,5 mg/kg reduziu a LF (P < 0,05) para os camundongos do grupo CCHO, sem alterar o TC (P > 0,05). As doses de 1,0 e 2,0 mg/kg de MDZ não alteraram os índices convencionais de ansiedade do teste CE (P > 0,05), para os camundongos dos grupos SCHO e CCHO.
4.4 Experimento 4 – Avaliação do tratamento com imipramina em camundongos submetidos ao modelo de TEPT modificado.
A Figura 8 mostra o efeito das injeções de imipramina, sobre o comportamento de camundongos expostos ao teste CE após passarem pelo modelo de TEPT.
Figura 8. Efeitos do tratamento com imipramina sobre a latência de fuga do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=12). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e tempo gasto no compartimento escuro da caixa CE.
A análise de variância ANOVA de duas vias (Fator 1: estímulo e Fator 2: tratamento) revelou que os grupos que foram tratados com imipramina apresentaram os seguintes resultados [LF: alteração significativa para o estímulo (F(1,88)= 84,63; P < 0,05), sem
alteração significativa no tratamento farmacológico (F(3,88)= 0,71; P > 0,05) e interação
estímulo x tratamento farmacológico (F(3,88)= 1,06; P > 0,05); TC: alteração significativa para
o estímulo (F(1,88)= 110,86; P < 0,05), sem alteração significativa no tratamento
farmacológico (F(3,88)= 0,26; P > 0,05) e interação estímulo x tratamento farmacológico
(F(3,88)= 0,04; P > 0,05)], quando comparados ao grupo SCHO.
Análises posteriores utilizando comparações múltiplas, Teste de Duncan, mostraram que os grupos que receberam choque nas patas durante o treinamento (CCHO) e foram reexpostos durante as SL no LC da caixa, apresentaram aumento das LF (P < 0,05) e do TC (P < 0,05), quando comparado ao grupo que não recebeu choque nas patas durante o treinamento (SCHO), nas doses de 0, 5,0, 10,0 e 20,0 mg/kg.
4.5 Experimento 5 – Efeito do tratamento com sertralina em camundongos submetidos ao modelo de TEPT modificado.
A Figura 9 mostra o efeito das injeções de sertralina, sobre o comportamento de camundongos expostos ao teste CE após passarem pelo modelo de TEPT. A análise de variância ANOVA de duas vias (Fator 1: estímulo e Fator 2: tratamento) revelou que os grupos que foram tratados com sertralina apresentaram os seguintes resultados [LF: alteração significativa para o estímulo (F(1,66)= 7,19; P < 0,05), sem alteração significativa no
tratamento farmacológico (F(2,66)= 1,32; P > 0,05) e sem alteração da interação estímulo x
tratamento farmacológico (F(2,66)= 2,76 > 0,05); TC: alteração significativa para o estímulo
(F(1,66)= 99,14; P < 0,05), sem alteração significativa no tratamento farmacológico (F(2,66)=
0,26; P > 0,05) e sem alteração da interação estímulo x tratamento farmacológico (F(2,66)=
1,85; P > 0,05)], quando comparados ao grupo SCHO.
Análises posteriores utilizando comparações múltiplas Teste de Duncan, mostraram que os grupos que receberam choque nas patas durante o treinamento (CCHO) e foram reexpostos durante as SL no LC da caixa, apresentaram aumento das LF (P < 0,05) e do TC (P < 0,05), quando comparado ao grupo que não recebeu choque nas patas durante o treinamento (SCHO), nas doses de 0, 5,0 e 10,0 mg/kg. Já o tratamento farmacológico com sertralina na
o TC (P > 0,05) enquanto que a dose de 10,0 mg/kg não alterou os índices convencionais de ansiedade do teste CE (P > 0,05), para os camundongos dos grupos SCHO e CCHO.
Figura 9. Efeito do tratamento com sertralina sobre a latência de fuga do ambiente claro (LF) e tempo gasto no compartimento claro (TC) do teste CE em camundongos (n=12). As colunas representam as médias e o erro padrão da média (M+EPM) da LF e tempo gasto no compartimento claro da caixa CE.
*P < 0,05 comparado ao grupo salina CCHO (ANOVA de duas vias seguido do teste de Duncan).
5. DISCUSSÃO
O presente estudo avaliou os efeitos comportamentais de um procedimento aversivo em longo prazo, em camundongos machos. Os resultados obtidos mostraram que o modelo de TEPT proposto para ratos, produz aumento da ansiedade em camundongos, e esta pode ser bloqueada quando os animais são reexpostos durante as situações de lembrança no ambiente que haviam recebido choque inescapável. O tratamento com midazolam produziu efeito ansiolítico, dependente da dose, no labirinto em cruz elevado (LCE) e ausência de efeito no teste claro-escuro (CE). A imipramina não apresentou efeito sobre os camundongos submetidos ao modelo de TEPT, e a sertralina (5,0 mg/kg), produziu efeito ansiolítico no teste CE.
Os nossos resultados, experimento 1, demonstram que um breve e único choque nas patas seguido de situações de lembranças induz alterações comportamentais por mais de um mês após o evento aversivo. Segundo o DSM- IV- TR (2000), na clínica, para o diagnóstico do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) em humanos, os sintomas devem estar presentes por mais de um mês (Stam, 2007b). O modelo animal de TEPT proposto neste experimento indica que o modelo parece ser sensível para o estudo deste distúrbio.
Os resultados apresentados mostram que o modelo de TEPT modificado de Louvart et al. (2005), com reexposição no lado claro (LC) da caixa CE, aumentaram os parâmetros convencionais de ansiedade avaliados no LCE, e no teste CE, sugerindo efeito ansiogênico do modelo sobre os camundongos. Resultados semelhantes foram observados anteriormente em outro estudo, em camundongos machos e ratos fêmeas (Louvart et al., 2005; Matar et al., 2006).
Entretanto os animais que foram reexpostos no lado escuro da caixa, durante as situações de lembrança, apresentaram extinção do aumento dos parâmetros de ansiedade avaliados no LCE e no teste CE, apenas para a medida de latência de fuga do LC, ou seja, ocorreu a perda do efeito ansiogênico do modelo. Os animais com SL no lado escuro da caixa, no teste CE não apresentaram extinção dos parâmetros de ansiedade, avaliados pelo tempo total de permanência no compartimento claro. Porém, a magnitude da resposta foi menor se comparada quando as reexposições ocorreram no lado claro da caixa no teste CE.
Os resultados também mostraram que a atividade locomotora avaliada no LCE no experimento 1 (Lister, 1987; File, 1992), não foi alterada, assim como observado em outros trabalhos (Pynnos et al., 1996). Porém, em outro estudo empregando o modelo de TEPT foi obtida redução da atividade locomotora em ratos fêmeas (Louvart et al., 2005).
Vários trabalhos da literatura têm demonstrado que durante a exposição ao LCE, roedores ingênuos, como por exemplo, ratos (Handley & Mithani, 1984; Pellow et al., 1985; File & Gonzalez, 1996; Rosa et al., 2000) e camundongos (Lister, 1987; Holmes & Rodgers, 1998; Nunes-de-Souza, 2000; Tucker et al., 2004) exibem comportamento caracterizado por evitação dos braços abertos e preferência pelos braços fechados do labirinto, sem alteração da atividade locomotora, caracterizada pelas entradas nos braços fechados.
No teste CE, camundongos geralmente gastam mais tempo no compartimento escuro do que no compartimento claro (Sanchez, 1996; Hascoet & Bourin 1998). Interessantemente em nosso estudo, 34 dias após o choque nas patas, os camundongos evitaram o compartimento escuro, indicando que a lembrança do estímulo aversivo causou resposta de fuga. Alguns autores têm demonstrado que o medo generalizado no contexto comportamental é intensificado quando estímulos condicionados são aumentados (Laxmi et al., 2003). Neste sentido, os nossos resultados corroboram a teoria que o medo apresenta a função de mover o animal para longe da fonte de perigo, podendo envolver fuga, luta ou congelamento e é insensível a drogas ansiolíticas (Gray, 1982; Mcnaughton & Corr, 2004).
Tentando distinguir os comportamentos relacionados com ansiedade e medo, alguns autores sugerem que quando o estímulo ou situação ameaçadora é real, os comportamentos desencadeados (fuga e luta) representariam medo, enquanto os que representam ansiedade (avaliação de risco) seriam desencadeados por estímulos ou situações apenas potencialmente ameaçadoras (Blanchard et al., 1993). Assim, os modelos animais de medo e ansiedade favoreceriam a expressão dos comportamentos defensivos frente a situações artificiais ou naturais de perigo, permitindo a compreensão das suas bases biológicas subjacentes.
No nosso estudo, a situação de lembrança no ambiente escuro (mesmo ambiente do choque) desencadeou o processo de dessensibilização, ou seja, extinção do efeito do choque nas patas, provavelmente ocorrido pelo fato dos animais terem sido reexpostos no LE, sem receber choque nas patas, o que não ocorreu no dia do treinamento. Este processo de extinção das alterações comportamentais que ocorreu nos testes do LCE e CE é semelhante ao que ocorre no “step down”, ou seja, à medida que os animais são reexpostos ao ambiente aversivo, sem receber estimulação elétrica, ocorre diminuição da latência de descida da plataforma, até que ocorra a extinção comportamental por completo (Hiramatsu et al., 1992; Roesler et al., 2000).
No experimento 2, o tratamento com midazolam nas doses de 1,0 e 2,0 mg/kg (i.p.), produziram efeito ansiolítico, em camundongos avaliados no LCE após a presença ou não do estímulo aversivo (choque). Estes efeitos foram seletivos para os índices de ansiedade, não
afetando a atividade locomotora dos camundongos, medida pela freqüência de entradas nos braços fechados do LCE (Lister, 1987; File et al., 1992 a; Rodgers & Johnson, 1995; Rodgers et al., 1997). Já a dose de 0,5 mg/kg não alterou os índices convencionais de ansiedade avaliados no LCE, porém aumentou as entradas nos braços fechados, índice de atividade locomotora, nos dois grupos SCHO e CCHO. Apesar do possível efeito de sedação induzido pela droga nesta concentração, ser oposto ao aumento da atividade locomotora, neste estudo e em outros, doses maiores não produziram alterações das EBF no LCE (Lister, 1987; Nunes-de-Souza, 2000).
Vários estudos com roedores têm demonstrado que durante a exposição ao LCE, estes animais exibem um comportamento exploratório caracterizado por evitação dos braços abertos e preferência pelos braços fechados do labirinto (Lister, 1987; File, 1992; Rodgers & Johnson, 1995; Rodgers et al., 1997). Os benzodiazepínicos (BDZs) e outros compostos ansiolíticos são capazes de modificar este padrão comportamental em roedores, diminuindo os índices convencionais de ansiedade, ou seja, aumentando a porcentagem de entradas e o tempo gasto nos braços abertos do labirinto (Pellow et al., 1985; Lister, 1987; ; Rodgers & Cole, 1994; Holmes & Rodgers, 1999; Nunes-de-Souza et al., 2000).
No nosso estudo, a administração sistêmica de salina, tanto nos animais que não receberam o estímulo aversivo (choque nas patas) como para os que receberam, causou ausência de efeitos, ou seja, ocorreu a perda do efeito ansiogênico produzido pelo modelo. Provavelmente, o procedimento de administração farmacológica (intraperitoneal) no grupo controle pode ter sido aversivo no dia do teste, fazendo com que estes dois grupos distintos apresentassem resultados semelhantes. Na tentativa de minimizar este efeito, realizamos um estudo piloto onde os animais passaram por um período de habituação ao procedimento de administração, sem droga. Porém, permaneceu a ausência do efeito ansiogênico como observado no LCE no experimento 2 (resultados não publicados).
Outros trabalhos têm demonstrado que diferentes variáveis, tais como o tipo de alojamento dos animais, iluminação, temperatura, podem interferir na avaliação da resposta de ansiedade em diferentes modelos (Griebel, 1995; Martinez et al., 2007; Morato et al., 1989; Morato & Brandão, 1996; Salome et al., 2002), entretanto, provavelmente isso não ocorreu no nosso estudo. Também já está descrito na literatura que ocorre uma correlação entre o aumento do cortisol plasmático e o efeito ansiogênico obtido no LCE (Rodgers et al., 1999). Na clínica e no modelo animal descrito por Louvard et al. (2005), o TEPT promove hiporeatividade do eixo HPA e baixos níveis de cortisol plasmático (Yehuda et al., 1995).
Quando os camundongos foram avaliados no teste CE após a exposição ao LCE, o efeito ansiogênico do modelo foi mantido. Os animais que receberam tratamento com MDZ nas doses de 1,0 e 2,0 mg/kg no dia do teste CE, apresentaram aumento da latência de fuga e do tempo gasto no compartimento claro, sem alteração da atividade exploratória. O tratamento com MDZ na dose de 0,5 mg/kg aumentou apenas a atividade exploratória, representada pelo aumento no número de transições entre os dois compartimentos (dados não publicados).
Apesar das inconsistências encontradas na literatura (Yehuda & Harvey, 1997), outros trabalhos têm demonstrado que o sistema gabaérgico também tem sido implicado na fisiopatologia da ansiedade, depressão e insônia, que são distúrbios muitas vezes intrínsecos no TEPT (Vaiva et al., 2004), assim como a modulação do o eixo HPA pelo GABA (Yehuda et al., 2000).
O LCE não interfere nos índices convencionais de ansiedade avaliados no teste CE, conforme demonstrado no experimento 3, ou seja, os animais testados no modelo de TEPT com tratamento farmacológico (MDZ), sem o LCE, apresentaram resultados semelhantes aos obtidos no experimento 2. Assim, apenas a dose de 0,5 mg/kg no experimento 3, reduziu a latência de fuga do ambiente claro e aumentou o número de transições entre os compartimentos. Provavelmente, isso ocorreu porque a exploração do lado escuro da caixa pelos camundongos evocou a lembrança aversiva do choque nas patas, produzindo o retorno imediato ao lado claro.
Outros autores encontraram resultados semelhantes no teste CE, ou seja, a administração de MDZ aumentou a atividade locomotora, caracterizada pelo aumento no número de transições entre os compartimentos, porém ocorreu o aumento do tempo no compartimento claro, em camundongos machos (Imaizumi et al., 1994), o que não foi observado no nosso estudo.
Como acontece na clínica onde os ansiolíticos atuam em apenas alguns dos sintomas do TEPT (Albucher & Liberzon, 2002; Stam, 2007a), neste experimento o MDZ alterou apenas um índice de ansiedade no teste CE, o que de certa forma reforça a hipótese do envolvimento do sistema gabaérgico na modulação do TEPT.
No experimento 4, as doses de 10 e 20 mg/kg aumentaram a atividade exploratória, porém nenhuma das três doses de imipramina foi capaz de alterar os índices convencionais de ansiedade dos animais que passaram pelo modelo de TEPT modificado. O teste CE continuou, produzindo efeito ansiogênico, caracterizado pelo aumento da latência de fuga e do tempo total gasto no ambiente claro. Segundo Costall et al., (1989), a iluminação do
ambiente claro é suficientemente aversiva, para fazer com que os animais retornem ao lado escuro da caixa. Porém, no nosso estudo, o efeito aversivo ao ambiente escuro, provocado pelo modelo de TEPT modificado, foi maior do que o efeito aversivo da iluminação. Desta forma, conforme esperávamos o tratamento com imipramina não foi capaz de inibir o efeito do modelo sobre o comportamento dos animais. Neste sentido, resultados da clínica têm demonstrado que o tratamento com os antidepressivos triciclicos apresenta pouco ou nenhum efeito em humanos com TEPT, exceto para o sintoma de revivência. Por exemplo, um estudo com aplicação crônica de imipramina (300 mg/dia) por 8 semanas, produziu melhora significativa dos sintomas de revivência do trauma (Kosten et al., 1991). Entretanto, a utilização de desipramina, (200 mg/dia), melhorou alguns sintomas depressivos, mas não alterou nenhum dos sintomas que caracterizam o TEPT (Reist et al., 1989).
Outros autores também não encontraram efeito dos antidepressivos tricíclicos, tetracíclicos e inibidores seletivos da enzima monoamino oxidase no teste CE utilizando camundongos, porém nesses estudos não foi aplicado nenhum tipo de estímulo aversivo prévio. Neste sentido, nenhum efeito foi encontrado no teste CE, após a administração dos fármacos, amitriptilina, mianserina, fluoxetina e selegilina (Costall, et al., 1989; Griebel, 1995; Bourin, et al., 1996; De Angelis & Furlan, 2000). Entretanto, em outros trabalhos, a administração de imipramina e paroxetina, produziu efeito ansiolítico em camundongos machos (Bourin et al., 1996; Shimada et al., 1995; Hascoet et al. 2000).
No experimento 5, o tratamento agudo com o inibidor seletivo da recaptação de serotonina, sertralina na dose de 5,0 mg/kg, inibiu o efeito ansiogênico do modelo, representado pela latência de fuga do ambiente claro. Também aumentou a atividade exploratória, caracterizada pelo aumento no número de transições entre os compartimentos. Porém, a dose de 10 mg/kg não interferiu na resposta do modelo de TEPT modificado. Outros autores também encontraram evidências do efeito ansiolítico, ansiogênico e ausência de efeitos de agonistas e antagonistas de serotonina, no teste CE. Por exemplo, foi encontrado efeito ansiolítico utilizando buspirona que é um agonista dos receptores 5-HT1A, efeito
ansiogênico com infusão de ritanserina, antagonista dos receptores 5-HT2 e ausência de efeito
com mCPP, agonista 5-HT2 (Costall et al., 1988; Griebel et al., 1991; Hascoet & Bourin,
1998).
O complexo papel da serotonina no controle dos estados de ansiedade pode estar relacionado ao tipo de medo, ou seja, condicionado ou incondicionado e também pelo local de ação da serotonina em diferentes regiões cerebrais (Deakin & Graeff, 1991; Handley, 1995;
teoria de Deakin e Graeff, (1991), a serotonina pode atuar facilitando ou inibindo o comportamento defensivo, isso dependendo do sítio de ação e dos subtipos de receptores serotoninérgicos que atuam no sistema nervoso central. Assim, os núcleos da rafe disparam seus axônios para várias estruturas cerebrais. Porém, isso não implica necessariamente que a 5-HT exerça ação pró ou antiaversiva em todos os sítios pós-sinápticos. Assim, a serotonina pode apresentar um papel dual no sistema de defesa, atuando como ansiolítica ou ansiogênica, dependendo das características do estímulo aversivo (proximal ou distal, condicionado ou incondicionado).
No nosso trabalho, ambos os estímulos foram apresentados em momentos diferentes. Inicialmente, os animais receberam um estímulo aversivo incondicionado (choque nas patas), e posteriormente foram expostos ao estímulo condicionado (situações de lembrança). Apesar de estímulos diferentes estarem atuando no mesmo modelo, a sertralina, inibidor seletivo da recaptação da serotonina, provavelmente facilitou o aumento da concentração de serotonina na fenda sináptica, exercendo neste caso efeito ansiolítico no teste CE. Este resultado corrobora com diversos estudos clínicos, os quais têm mostrado que os inibidores seletivos de recaptação de serotonina, são recomendados como agentes farmacoterapêuticos de primeira escolha no tratamento agudo e crônico do TEPT (Zohar et al., 2002; Davidson, 2003; Davidson, 2004; Tucker et al., 2004).
6. CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos neste estudo, concluímos que:
• O modelo de TEPT avaliado produz aumento da ansiedade em camundongos, e esta pode ser bloqueada quando os animais são reexpostos durante as situações de lembrança no ambiente que haviam recebido choque.
• O tratamento com midazolam produziu efeito ansiolítico dependente da dose no LCE, e ausência de efeito no teste CE. A dose mais baixa de midazolam reduziu a latência de fuga do ambiente claro e aumentou a atividade exploratória neste teste, sugerindo o envolvimento deste agonista GABA-benzodiazepínico na modulação do TEPT.
• Os comportamentos dos camundongos não foram alterados pelo tratamento com imipramina, fortalecendo resultados da literatura que mostram a ausência de efeito deste antidepressivo tricíclico nos sintomas do TEPT.
• O tratamento com sertralina (dose mais baixa) produziu efeito ansiolítico no teste CE, sugerindo o envolvimento deste inibidor seletivo da recaptação de serotonina na modulação do modelo de TEPT.
Portanto, o modelo proposto neste trabalho pode ser útil para futuros estudos dos distúrbios neurobiológicos do TEPT e ajudar na avaliação de novos agentes terapêuticos que possam amenizar ou inibir estes sintomas.
