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Secretaria de Estado da Saúde Coordenadoria de Controle de Doenças Instituto Adolfo Lutz BRUNA DE SOUZA DAS NEVES

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Academic year: 2021

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Secretaria de Estado da Saúde Coordenadoria de Controle de Doenças

Instituto Adolfo Lutz

Curso de Especialização

Vigilância Laboratorial em Saúde Pública

BRUNA DE SOUZA DAS NEVES

ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA DA PLANTA VICTORIA

AMAZONICA

SÃO PAULO 2020

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Trabalho de conclusão de curso de especialização apresentado ao Instituto Adolfo Lutz- Unidade do Centro de Formação de Recursos Humanos para o SUS/SP-Doutor Antônio Guilherme de Souza como requisito parcial para obtenção do titulo de Especialista em Vigilância Laboratorial em Saúde Pública

Orientador: Prof. Dr. Pedro Luiz Silva Pinto

Prof. Dr. André Gustavo Tempone Cardoso

ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA DA PLANTA VICTORIA AMAZONICA

SÃO PAULO 2020

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Neves, Bruna de Souza das

Atividade esquistossomicida da planta Victoria amazonica/ Bruna de Souza das Neves – São Paulo, 2020.

38 f. il

Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização-Vigilância Laboratorial em Saúde Pública)-Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, CEFOR/SUS-SP, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, 2020.

Área de concentração: Parasitologia Médica Orientação: Prof. Doutor. Pedro Luiz Silva Pinto

1 Esquistossomose; 2 Schistosoma mansoni; 3 Terapêutica; 4 Produtos Naturais; 5 Victoria amazonica.

SES/CEFOR/IAL-84/2020

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES-SP

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AGRADECIMENTOS

Quero deixar registrada a minha gratidão por todos aqueles que ajudaram direta ou indiretamente na confecção deste trabalho.

Aos meus pais pelos incentivos, e pela oportunidade de estudo que me proporcionaram.

A minha mãe por sempre estar ao meu lado e apoiar as minhas escolhas.

Ao meu pai por nunca deixar faltar nada a nossa família, sendo uma figura importante para realização da minha formação.

Minha irmã por me apoiar na crise que surgiu na reta final deste trabalho.

Aos meus orientadores Pedro Luiz Silva Pinto pela paciência e auxílio com sua vasta experiência e André Gustavo Tempone Cardoso pela ajuda e confiança dada a mim para realizar este trabalho.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Distribuição da esquistossomose segundo percentual de positividade entre 2009 – 2017. ... pág 13

FIGURA 2 - Ciclo biológico da espécie S. mansoni. ... pág 15

FIGURA 3 - V. amazonica coletada no Jardim Botânico Plantarum de Nova Odessa, São Paulo. ... pág 20

FIGURA 4 - Vermes adultos de S. mansoni não tratados. ... pág 23

FIGURA 5 - Efeitos do extrato VAFH no tegumento de vermes adultos de S. mansoni. ... pág 25

FIGURA 6 - Efeitos do extrato VAFD no tegumento de vermes adultos de S. mansoni ... pág 26

FIGURA 7 - Efeitos do extrato VAFA nos ovos e tegumento de vermes de S. mansoni... pág 27

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Compostos naturais esquistossomicidas isolados de plantas. ... pág 19

TABELA 2 - Efeitos in vitro dos extratos VAFH, VAFD e VAFA de V. amazonica contra vermes de S. mansoni quando comparados aos controles negativos e ao fármaco referência (PZQ).. ... pág 24

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LISTA DE SIGLAS

DMSO Dimetilsulfóxido

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay IFI Imunofluorescência Indireta

OXA Oxamniquine

PZQ Praziquantel

RPMI Roswell Park Memorial Institute RPPO Reação de Precipitado Periovular

VAFA Victoria amazonica fração Acetato de etila VAFD Victoria amazonica fração Diclorometano VAFH Victoria amazonica fração Hexano

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LISTA DE SÍMBOLOS cm Centímetro mL Mililitro μg Micrograma µM Micromolar ® Marcas registradas

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RESUMO

A esquistossomose é uma doença parasitária que afeta 240 milhões de pessoas ao redor do mundo e mais de 700 milhões vivem em áreas endêmicas, sendo um problema de saúde pública. Atualmente, o praziquantel (PZQ) é o principal fármaco disponível para esta doença, porém está em uso clínico há mais de 30 anos com relatos de resistência. Neste contexto, a busca por novas terapias é de extrema importância. Metabólitos secundários presentes em plantas são extremamente utilizados como protótipos farmacêuticos. Considerando que o Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades do mundo, muitos candidatos a fármacos antiparasitários vêm sendo estudados. A planta Victoria amazonica pertence a família Nymphaeaceae, é amplamente encontrada na região amazônica. Apesar de nenhum estudo etnofarmacológico ter sido publicado até o momento, pouquíssimos trabalhos descrevem alguns constituintes químicos da planta. No presente trabalho, o potencial esquistossomicida da V. amazonica foi avaliado em modelo in vitro utilizando vermes adultos de Schistosoma mansoni. O extrato total metanólico da planta foi particionado em diferentes solventes, obtendo-se uma fração em hexano (VAFH), acetato de etila (VAFA) e diclorometano (VAFD). Após incubação das frações com o parasito a 300 μg/mL por até 96 horas, observou-se a morte dos vermes após 48 h em todas as frações. Estudos em microscopia óptica demonstraram que as frações induziram descamações e bolhas no tegumento dos vermes (macho e fêmea), porém, apenas a fração VAFA induziu a formação de ovos com morfologia alterada. Houve redução na motilidade nas primeiras 24 horas e ausência a partir de 48 horas nas três frações analisadas. Estes dados demonstram que metabólitos presentes em frações orgânicas da planta V. amazonica apresentam atividade antiparasitária, e que futuros isolamento(s) do(s) composto(s) ativo(s) poderão proporcionar a identificação de novos protótipos de fármacos para a esquistossomose.

Palavras chave: Esquistossomose, Schistosoma mansoni, Terapêutica, Produtos Naturais, Victoria amazonica.

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ABSTRACT

Schistosomiasis is a parasitic disease that affects 240 million people worldwide and more than 700 million live in endemic areas and is a public health problem. Praziquantel (PZQ) is currently the main drug available for this disease, but it has been in clinical use for over 30 years with reports of resistance. In this context, the search for new chemotherapies is priority. Secondary metabolites present in plants are widely used as pharmaceutical prototypes. Considering that Brazil has one of the largest biodiversities in the world, many candidates for antiparasitic drugs have been studied. The Victoria amazonica plant belongs to the family Nymphaeaceae, being widely found in the Amazon region. Although no ethnopharmacological study has been published so far, very few studies describe some chemical constituents of the plant. In the present work, the schistosomicidal potential of V. amazonica was evaluated in an in vitro model using adult Schistosoma mansoni worms. The total methanolic extract of the plant was partitioned in different solvents, obtaining a fraction in hexane (VAFH), ethyl acetate (VAFA) and dichloromethane (VAFD). After incubation of fractions with the parasite at 300 μg / mL for up to 96 hours, worm death was observed after 48 h in all fractions. Optical microscopy studies showed that the fractions induced desquamations and blisters in the worm coat (male and female), but only the VAFA fraction induced the formation of eggs with altered morphology. There was a reduction in motility in the first 24 hours and absence from 48 hours in the three fractions analyzed. These data demonstrate that organic fractions metabolites of the V. amazonica plant have antiparasitic activity, and that future isolation (s) of the active compound (s) may provide the identification of new prototypes of schistosomiasis drugs.

Keywords: Schistosomiasis, Schistosoma mansoni, Therapy, Natural Products, Victoria amazonica.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... pág 10

2. OBJETIVOS ... pág 12

3. REFERENCIAL TEÓRICO ... pág 13

4. MATERIAIS E MÉTODOS ... pág 21

4.1. Obtenção da planta Victoria amazonica e do extrato metanólico .... pág 21

4.2. Fracionamento do extrato bruto da Victoria amazonica utilizando

processo de partição líquido-líquido ... pág 21

4.3. Manutenção experimental do parasito ... pág 21

4.4. Estudos in vitro com S. mansoni ... pág 22

5. RESULTADOS ... pág 23

5.1. Atividade esquistossomicida in vitro da fração VAFH ... pág 25

5.2. Atividade esquistossomicida in vitro da fração VAFD ... pág 26

5.3. Atividade esquistossomicida in vitro da fração VAFA ... pág 27

6. DISCUSSÃO ... pág 28

7. CONCLUSÕES ... pág 32

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1. INTRODUÇÃO

A esquistossomose é uma doença parasitária de ampla distribuição mundial sendo prevalente em áreas tropicais e subtropicais. A enfermidade é causada pelo verme da classe Trematoda gênero Schistosoma, e tem como principais agentes etiológicos Schistosoma mansoni, S. japonicum e S. haematobium, todas de interesse médico (WHO, 2019).

No Brasil a disseminação ocorre pela espécie Schistosoma mansoni, seu ciclo de vida depende de espécies suscetíveis de caramujos de água doce pertencente ao gênero Biomphalaria (ARAÚJO, 2010).

A parasitose apresenta vasta distribuição geográfica no território nacional, sendo considerado endêmico com maior intensidade de transmissão na região Nordeste do país, há outros estados que ocorre a propagação, porém apresentam focos isolados (ARAÚJO, 2010).

A doença está vinculada a condições socioambientais precárias como falta de saneamento básico, que constitui um dos principais meios para a contínua propagação da enfermidade, pois sua transmissão ocorre por meio hídrico (CANTANHEDE et al., 2010).

Contribuem também para o favorecimento da transmissão o tipo de ocupação, lazer, grau de educação e informação da população exposta ao risco da doença. Esses fatores podem ocorrer em maior ou menor intensidade, de acordo com a área de transmissão (BRASIL, 2014).

A esquistossomose continua sendo um problema de saúde pública sendo fundamental o seu controle para a interrupção do ciclo do parasito, que consequentemente evita o surgimento de novos focos. E para que isso ocorra devem-se ter ações governamentais como saneamento básico, instalação de água e esgoto nas casas, educação sanitária, mudanças no meio ambiente, combate aos caramujos, o diagnóstico e tratamento de pessoas infectadas (KATZ; ALMEIDA, 2003).

É considerada doença debilitante gerando incapacidades em homens e mulheres em idades mais produtivas, comprometendo a qualidade de vida dos pacientes (ENGELS et al., 2002). Sua patologia é variável e depende tanto das características do hospedeiro como: idade, estado nutricional e grau de imunidade,

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quanto da linhagem do parasito e da carga parasitária acumulada ao longo do tempo. (REY, 2001).

O praziquantel (PZQ) é o principal fármaco no tratamento da esquistossomose, sendo amplamente utilizado em todas as espécies do gênero Schistosoma. O seu emprego visa atingir a cura terapêutica e evitar a propagação da doença por meio da redução da carga parasitária e da produção de ovos, principais fatores relacionados ao aparecimento das formas graves (CATANHEDE et al., 2010; VITORINO et al., 2012). No entanto, apresenta alguns efeitos adversos como desconforto ou dor abdominal, náusea, vômito, anorexia e diarreia, sintomas observados em 50% dos pacientes (CIOLI; PICA-MATTOCCIA; ARCHER, 1995).

Embora a eficácia deste medicamento seja confirmada na prática médica, alguns estudos sugerem a possibilidade de resistência do verme ao fármaco (DOENHOFF et al., 2002; MELMAN et al., 2009; COUTO, 2014). Essa limitação associada ao fato que o PZQ está em uso clínico há mais de 30 anos, estimula a busca de novas quimioterapias que possam substituir ou complementar o tratamento atual. Neste contexto, umas das possibilidades é o emprego de produtos naturais, que utiliza a biodiversidade da fauna e flora, fontes importantes de substâncias biologicamente ativas, para desenvolvimento de novos fármacos (BARRERO; BOLZANI, 2009).

O presente trabalho tem como justificativa o aprimoramento de pesquisas e inovação tecnológica, com objetivo de desenvolver novas linhas de tratamento voltado para esquistossomose considerada agravo de relevância em saúde pública. A pesquisa abre perspectiva futura, na qual os resultados poderão ser incorporados ao Programa Nacional de Controle da Esquistossomose e nas diferentes ações de Vigilância em Saúde das Doenças Transmitidas por Vetores e Hospedeiros Intermediários, conduzidas pelos estados e municípios.

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2. OBJETIVOS

Objetivo Geral: O presente projeto visa compor novos candidatos terapêuticos, advindos da biodiversidade brasileira, como alternativa para tratamento da esquistossomose, subsidiando futuras ações de controle da doença.

Objetivos Específicos

 Coletar a planta Victoria amazonica e obter de um extrato bruto em metanol.  Fracionar os metabólitos secundários do extrato em metanol da planta

Victoria amazonica por meio de partição líquido-líquido.

 Avaliar a atividade esquistossomicida do extrato metanólico e das frações (hexano, diclorometano e acetato de etila) da partição da planta Victoria amazonica em vermes adultos.

 Avaliar o efeito das frações da planta no tegumento, viabilidade, oviposição e acasalamento dos vermes.

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3. REFERENCIAL TEÓRICO

A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que afeta quase 240 milhões de pessoas ao redor do mundo e mais de 700 milhões vivem em áreas endêmicas sendo predominante em áreas tropicais e subtropicais (WHO, 2019).

Possui ampla distribuição mundial com registro em 54 países, principalmente na África, Leste do Mediterrâneo e América do Sul. No Brasil, estima-se que aproximadamente 1,5 milhões de pessoas estejam infectadas pelo parasito. Distribui-se de forma endêmica nos estados de Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Maranhão, Minas Gerais, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte e Sergipe. E em áreas com transmissão focal nos estados do Pará, Ceará, Piauí, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina, Goiás e Rio Grande do Sul (BRASIL, 2019). No país a doença é disseminada pela espécie Schistosoma mansoni conhecida popularmente como barriga d’água, xistose ou bilharzíase (NEVES, 2004). Na figura 1 podemos ver a distribuição da doença, baseado no sistema de informação do programa de vigilância e controle da esquistossomose.

Figura 1: Distribuição da esquistossomose segundo percentual de positividade entre 2009 – 2017. Fonte: Sistema de Informação do Programa de Vigilância e Controle da Esquistossomose – SISPCE/SVS/MS

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Do ponto de vista biológico, os vermes adultos apresentam dimorfismo sexual, o macho tem cerca de 1 cm, cor esbranquiçada com tegumento recoberto por tubérculos, já a fêmea mede cerca de 1,5 cm, cor mais escura e tegumento liso, ambos possuem na porção anterior duas ventosas, oral e acetabular. O macho apresenta uma fenda longitudinal em seu corpo denominada de canal ginecóforo utilizado para o acasalamento e fecundação da fêmea. (NEVES, 2004). O ciclo de vida do parasito envolve hospedeiros intermediários, representados por caramujos da Família Planorbidae, Gênero Biomphalaria com as principais espécies B. glabrata, B. tenagophila e B. stramineae como hospedeiros definitivos o homem e outros mamíferos (CUNHA, 1970).

A transmissão ocorre quando indivíduos infectados eliminam ovos viáveis nas fezes, que ao entrarem em contato com água doce sofrem influência de estímulos fotoquímicos e térmicos eclodindo para liberação de miracídios. Após a eclosão, estas formas ciliadas nadam até encontrar seu hospedeiro intermediário. A partir da penetração dos miracídios nos tecidos dos moluscos são observadas profundas mudanças na morfologia e fisiologia destas larvas, transformando-se em esporocistos primários e em seguida esporocistos secundários até a diferenciação em cercárias. O período de evolução é de aproximadamente de 30 dias (REY, 2001; NEVES, 2004).

Estimuladas pela luminosidade ao saírem do molusco, as cercárias nadam ativamente em busca de um hospedeiro definitivo. O processo de penetração ocorre no indivíduo pela pele ou mucosa, com a perda a cauda e transformação em esquistossômulos. Estes são levados pela circulação até pulmão e a partir daí chegam ao sistema porta hepático, no qual se alimentam de sangue até desenvolverem e alcançarem a fase adulta, diferenciando-se em machos e fêmeas. Após o acasalamento, migram contra a corrente sanguínea para a veia mesentérica inferior e nas vênulas da parede intestinal acontece a oviposição. (Rey, 2001; Neves, 2004)

Os ovos são postos um de cada vez, sendo produzidos cerca de 300 ovos por dia. Ao atravessarem a mucosa intestinal metade dos ovos são eliminados nas fezes atingindo o meio externo e a outra metade fica retida nas paredes do intestino ou retornam pela circulação portal até chegarem ao fígado (MONTEIRO, 2017). O ciclo de vida do parasito está representado na figura 2.

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Figura 2: Ciclo biológico da espécie Schistosoma mansoni. Fonte: Centers for Disease Control - CDC (adaptado pelo autor)

As manifestações clínicas na fase aguda são caracterizadas por prostração, febre, dores abdominais e diarreia que surge após alguns dias da exposição às cercárias, coincidindo com o começo da eliminação de ovos nas fezes. O contato com as cercárias pode causar dermatite cercariana devido à penetração ativa da mesma na pele. (NEVES, 2004; GRYSEELS et al., 2006).

A fase crônica aparece entre três a seis meses após a infecção, sendo capaz de progredir por anos, com acometimento de vários órgãos com diferentes níveis de gravidade (PORDEUS et al., 2008). As lesões são causadas pelos ovos que ficam retidos nos tecidos devido à migração para a parede intestinal e fígado, estes secretam enzimas que provocam respostas inflamatórias e granulomatosas. Portanto a gravidade dos sintomas está relacionada com a intensidade da infecção e a imunidade individual (GRYSEELS et al., 2006). As manifestações clínicas que podem aparecer são: intestinal, hepatointestinal, hepatoesplênica e até neurológica (REY, 2001).

O diagnóstico laboratorial em áreas endêmicas é realizado pelo exame parasitológico das fezes que detecta os ovos do parasito (ESPIRITO SANTO, 2014).

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A técnica de Kato-Katz é recomendada para detectar a infecção, entretanto foi relatada menor sensibilidade em áreas com baixas transmissões focais (ZHANG et al., 2009). Técnicas imunodiagnósticas podem complementar os estudos epidemiológicos em áreas com baixa endemicidade (NOYA, 2006). Os exames de Imunofluorescência Indireta (IFI), técnica imunoenzimática (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – ELISA), e Reação de Precipitado Periovular (RPPO) têm sido empregados no auxílio da esquistossomose (VITORINO et al., 2012).

Nos últimos anos, os tratamentos para esquistossomose progrediram de tóxicos (antimoniais, lucanthone, niridazol, hycanthone) e incômodos, para baixa toxicidade, tolerabilidade e de administração por via oral (ARAÚJO, 2010).

O primeiro tratamento empregado para esta doença surgiu com os antimoniais trivalentes. Em 1918, foi empregado o uso do tártaro emético (tartarato de antimônio e potássio), administrado por via intravenosa. Efeitos colaterais como alterações cardíacas, hepáticas, e distúrbios dermatológicos foram observados durante o tratamento. Foram relatados casos letais com a administração desse fármaco, levando a interrupção do tratamento por parte dos pacientes, o que levou a pesquisa de novos medicamentos (CIOLI; MATTOCCIA; ARCHER, 1995).

Novos compostos começaram a aparecer nos anos seguintes como tartarato de antimônio de sódio, dissulfatto de antimônio de sódio (Stibofen®), tiomalato de antimônio de sódio (Anthiomaline®), glucanato de antimônio de sódio (Triostam®) e antimônio de sódio dimercaptano (Astiban®). O mecanismo de ação dos antimoniais estaria relacionado com a inibição da enzima fosfofuctruquinase, responsável pela redução da taxa de glicólise, considerada a principal fonte de energia para o parasito (BUEDING; MANSOUR, 1957). Entretanto todos esses compostos eram tóxicos para o músculo cardíaco e desagradáveis quando aplicados por via intramuscular ou intravenosa (COURA; CONCEIÇÃO, 2010).

Programas de pesquisas iniciado em 1932 desenvolveram o fármaco miracil D (Lucanthone) atuando contra as espécies S. mansoni e S. haematobium, tendo sua ação farmacodinâmica sobre os órgãos reprodutores dos vermes adultos, influenciando assim na oviposição (DE CARVALHO, 1982). Entretanto apresentava efeitos colaterais graves no sistema nervoso central e cardiovascular. Mais tarde descobriu com experimentos in vitro que o fármaco não tinha atividade sobre vermes adultos indicando que a substância provavelmente era um metabólito, hipótese

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apoiada pelo fato de estar ativo apenas quando administrado por via oral, sugerindo a necessidade de ser metabolizado pelo organismo (PITTA et al., 2013).

Em 1964 surge como alternativa aos compostos antimoniais, o niridazol (Ambilhar®), de administração oral, com tratamento de 5 a 7 dais, e com ação no aparelho reprodutor dos parasitos originando uma atrofia (DE CARVALHO, 1982). Porém os pacientes apresentavam efeitos colaterais graves, provocando toxicidade nos rins e sistema nervoso central, carcinogênese e mutagênese (FONTANILLES, 1969; URMAN et al., 1975; LEGATOR, M. S.; CONNOR, T. H.; STOECKEL, 1975; FANTEL et al., 1986).

Durante o ano de 1965, estudos sobre a hidroximetilação obtido do Miracil D (Lucanthone), deram origem ao hycanthone através da atividade biológica de um fungo Aspergillus sclerotiorum. Este composto mostrou elevada atividade quando administrado por via intramuscular ou oral (KATZ; PELEGRINO, 1967). Entretanto os efeitos colaterais após a administração do fármaco foram graves, incluindo necrose hepática letal (ARAÚJO, 2010). Em consequência dos seus efeitos foi colocado fora de uso a partir do surgimento do oxamniquine, medicamento menos tóxico (CARVALHO, 1982).

Em 1969 houve o desenvolvimento do fármaco oxamniquine (OXA), porém efetivo somente contra S. mansoni, dessa maneira seu uso ficou restrito somente em locais onde havia a existência dessa espécie (Siqueira, 2017). Sua administração foi por via oral e em dose única e ausência de efeitos colaterais graves em relação aos fármacos anteriores (CIOLI; PICA-MATTOCCIA; ARCHER, 1995).

No ano de 1977 descreveram a atividade do praziquantel (PZQ) eficaz contra infecções por trematódeos e cestódeos (LIU; WELLER, 1996). No entanto, foi constatado que em menores concentrações o fármaco não age nas formas imaturas de S. mansoni, tendo assim, uma desvantagem como diminuição ou ausência na atividade contra esquistossomos juvenis (XIAO et al., 1985). Sua administração é em dose única e por via oral sendo bem tolerado pelos pacientes (CIOLI; PICA-MATTOCCIA; ARCHER, 1995).

Após um longo período de utilização deste medicamento, Alonso et al., (2006) verificou que houve falha no tratamento com PZQ em dois viajantes, ambos vindo da África onde há transmissão da doença. Desse modo, possibilita levantar dúvidas sobre o medicamento, acarretando assim preocupações sobre a existência ou

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desenvolvimento de potencial tolerância e/ou resistência de esquistossomos ao PZQ.

Outra possível evidência de falha no tratamento é relatada por Praticò et al. (2014), que notificou em um relato de caso, 4 viajantes que tiveram contato em um lago localizado em Uganda e que desenvolveram esquistossomose. Após um período de tratamento com PZQ, os autores verificaram que não houve cura terapêutica, tendo que persistir com até seis doses do medicamento.

Além disso, O PZQ não impede a fase crônica da doença se for administrado na fase aguda, devendo esperar algumas semanas após a exposição para que ocorra a cronificação da doença para iniciar o tratamento, sendo ainda necessário repetir a dose do medicamento para garantir uma eficácia maior, já que o medicamento não tem atividade nas formas jovens do parasito (JAURÉGUIBERRY; CAUMES, 2011).

O PZQ ainda oferece benefícios à população, em locais onde há alta prevalência da doença seu uso visa prevenir a morbidade. O tratamento é voltado a grupos de alto risco e evita que indivíduos infectados desenvolvam formas grave da esquistossomose, por isso não seria justificável interromper seu uso. O que é fundamental no momento é inserir novas estratégias terapêuticas para minimizar riscos de resistências que possam surgir ao decorrer do tempo (CIOLI; PICA-MATTOCCIA; ARCHER, 1995).

Com a falha em tratamentos devido a ocorrência de resistência ou tolerância a esses fármacos e a baixa atividade nas formas imaturas (FREZZA et al., 2007), são necessários estudos de novas alternativas de drogas esquistossomicidas que visam aprimorar os fármacos já existentes ou ter mais escolhas de medicamentos disponíveis para a população exposta (SILVA et al., 2012). Nesse contexto, a procura por compostos naturais com propriedades ativas contra esse parasito tem aumentado.

Os produtos naturais atribuem um significado importante na descoberta e desenvolvimento de medicamentos (NEWMAN; CRAGG, 2007). Podem ser encontrados em todos os tipos de ambientes, como no mar, florestas tropicais e fontes termais, e produzidas por todos os tipos de organismos como, plantas, fungos, bactérias, animais invertebrados, insetos e organismos marinhos (KAYSER et al., 2003).

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Nos últimos anos, tem crescido o interesse da comunidade científica na busca por extratos e compostos puros, principalmente os derivados de plantas que exibem alguma atividade esquistossomicida (DE MORAES et al., 2012). Na tabela 1 estão listados alguns destes compostos que obtiveram atividade contra vermes adultos de S. mansoni.

Tabela 1: Compostos naturais esquistossomicidas isolados de plantas. Composto químico Fonte biológica Referências

artemisina Artemisiaannua (Asteraceae) Utzinger et al., (2001) goyazensolide Eremanthus goyazensis (Compositae) Barth et al., (1997) mirazid Commiphora molmol (Burseraceae) Botros et al., (2005)

piplartina Piper tuberculatum (Piperaceae) De Moraes et al., (2012) epiisopiloturina Pilocarpus microphylus (Rutaceae) Guimarães et al., (2015)

Fonte: Elaborada pelo autor, 2019.

A biodiversidade brasileira é considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas e sua preservação é essencial pela imensa riqueza biológica e potencial fonte de novos fármacos (BARRERO; BOLZANI, 2009). Metabólitos secundários encontrados em plantas são utilizados para tratamentos de várias doenças (Karakaya et al., 2019). Estes são sintetizados em resposta aos estímulos do meio ambiente, o que desperta interesse, não só pelas atividades biológicas exercidas pela planta para sua própria defesa, mas também pela atividade farmacológica (PEREIRA; CARDOSO, 2012). Tendo em vista a biodiversidade no território brasileiro e o amplo estudo de atividades antiparasitárias de determinadas

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plantas, foi avaliada a atividade in vitro da planta V. amazonica (Nymphaeaceae) (Figura 3) contra vermes adultos de S. mansoni, considerando que não há nenhuma prospecção na literatura corroborando que a mesma tenha potencial anti-helmíntico.

Figura 3: V. amazonica coletada no Jardim Botânico Plantarum de Nova Odessa, São Paulo. Fonte: www.plantarum.org

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Obtenção da planta Victoria amazonica e do extrato metanólico

A V. amazonica foi coletada em propriedade particular do botânico Prof. Harri Lorenzi, especificamente no Jardim Botânico Plantarum de Nova Odessa, São Paulo, Brasil. Um exemplar da folha pesando 2,2 kg foi triturado em liquidificador com 7 litros de metanol 100%. A maceração se deu em temperatura ambiente por 3 dias. Após filtração em papel Whatman, o extrato metanólico foi reduzido em evaporador rotativo a uma temperatura de 40ºC.

4.2. Fracionamento do extrato bruto da Victoria amazonica utilizando processo de partição líquido-líquido

O extrato metanólico proveniente da V. amazonica foi inicialmente submetido às partições líquido-líquido com solventes orgânicos de diferentes polaridades, com o objetivo de separação inicial dos constituintes do extrato, e desses rendimentos foram obtidas 3 frações: (i) V. amazonica fração em hexano (VAFH); (ii) V. amazonica fração em diclorometano (VAFD); (iii) V. amazonica fração em acetato de etila (VAFA). As frações obtidas foram secas em evaporador rotativo nas mesmas condições acima e armazenadas a -20ºC até o momento do uso.

4.3. Manutenção experimental do parasito

A cepa (BH) de Schistosoma mansoni é mantida rotineiramente em caramujos da espécie Biomphalaria glabrata (cepa BH) e hamsters Mesocricetus auratus no núcleo de Enteroparasitas do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo. Para tanto, os moluscos são expostos a miracídios para que ocorra a infecção, e após 49 dias estes são expostos a luz incandescente para a obtenção das cercárias. Na infecção dos roedores são inoculados aproximadamente 230 cercárias pela via subcutânea e, após completar 7 semanas de infecção, os animais são eutanasiados e em seguida realiza-se perfusão porta-mesentérica para isolamento dos vermes, além da retirada

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dos fígados que serão utilizados no processo de isolamento dos ovos, visando a obtenção de miracídios.

4.4. Estudos in vitro com S. mansoni

Os vermes recuperados foram lavados em meio RPMI 1640 (Sigma) com adição de 20 µg de gentamicina. Em seguida os parasitos acasalados foram transferidos para placas de cultura de 24 poços (Kasvi) contendo 1 casal de verme por poço, contendo 2 ml do meio suplementado com 10% de soro fetal bovino. As placas foram então incubadas a 37°C em atmosfera a 5% de CO2. Após este

processo, as frações da V. amazonica foram diluídas em DMSO e adicionadas numa concentração de 300 µg/mL e para controle positivo foi adicionado 20 µM PZQ.

Como controles do ensaio foram considerados: (i) Ausência de atividade farmacológica (Controle Negativo): vermes incubados em meio RPMI com 2% de DMSO e vermes incubados somente em meio RPMI; (ii) Com atividade farmacológica (Controle Positivo): vermes incubados com a menor concentração de praziquantel que promove máxima atividade do fármaco. Os experimentos foram realizados em duplicatas e repetidos em 2 tempos distintos. Para avaliação farmacológica foram considerados os seguintes parâmetros: oviposição, motilidade, alterações do tegumento e sobrevida dos vermes. Os parâmetros citados foram avaliados diariamente por um período máximo de 96 horas (4 dias) por meio de observação em microscópio invertido (Nikon Eclipse TS100). Para análises comparativas entre os grupos controles (Positivo e Negativo) e os diferentes grupos experimentais foram atribuídos valores “0” na ausência e “1” na presença dos parâmetros utilizados. A sobrevida dos vermes submetidos aos diferentes extratos foi estimada a partir da constatação da ausência de motilidade e do aparecimento de lesões tegumentares ao longo do período de observação de 96 horas.

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5. RESULTADOS

Nos controles negativos: meio RPMI com 2% de DMSO e grupo incubado somente RPMI, não foram observados qualquer alteração no comportamento dos vermes relacionados à oviposição, motilidade, tegumento e sobrevida, comprovando que não houve efeitos sobre os parasitos avaliados (Figura 4a e 4b).

Figura 4: Vermes adultos de S. mansoni não tratados. (a) Fêmea apresentando tegumento liso sem alteração. (b) Macho apresentando tegumento recoberto por tubérculos sem alteração. Fonte: Autor, 2019.

Estes mesmos parâmetros foram comparados e utilizados como referência para determinação de características anormais de comportamento dos parasitos nos diferentes grupos experimentais, tanto do extrato bruto metanólico da V. amazonica quanto das frações em hexano (VAFH), diclorometano (VAFD) e acetato de etila (VAFA).

O extrato bruto metanólico determinou a morte de todos os vermes na concentração de 300 μg/mL, a partir de 24 horas do experimento (dados não apresentados). A partir desse resultado foram avaliadas as três frações supracitadas, com monitoramento diário, com os resultados expressos na tabela 2.

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Tabela 2: Efeitos in vitro dos extratos VAFH, VAFD e VAFA de V. amazonica contra vermes de S. mansoni quando comparados aos controles negativos e ao fármaco referência (PZQ). Grupo Período de incubação (h) Oviposição (0/1) Motilidade (0/1) Alteração no tegumento (0/1) Controle negativo 24 48 72 96 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 DMSO 2% 24 48 72 96 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 PZQ 20µM 24 48 72 96 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 VAFH 300 µg/mL 24 48 72 96 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 VAFD 300 µg/mL 24 48 72 96 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 VAFA 300 µg/mL 24 48 72 96 1* 1* 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 Legenda: 0 ausência; 1 presença; 1* com alteração

Fonte: Elaborada pelo autor, 2019.

Como apontado na tabela 2, o fármaco referência determinou efeito na oviposição, motilidade e alteração no tegumento a partir de 24 horas de incubação, já estes efeitos foram observados nas três frações a partir de 48 horas. Assim, considerando a perda da motilidade e o aparecimento de lesões no tegumento dos vermes em ambos os sexos, presumiu-se a morte dos parasitos neste período.

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5.1. Atividade esquistossomicida in vitro da fração VAFH

O efeito da fração em hexano (VAFH) nos adultos de S. mansoni nas primeiras 24 horas apresentou as seguintes características: poucos ovos viáveis (2); pequenas alterações no tegumento, tanto dos machos quanto das fêmeas (Fig. 5a e 5c); e motilidade exclusiva das fêmeas com movimentos intermitentes, rápidos e ondulatórios. Após 48 horas, não houve oviposição, observado apenas os dois ovos assinalados anteriormente; ausência de motilidade em todos os vermes comparada ao grupo controle negativo; e alterações tegumentares expressivas caracterizadas por erupções semelhantes a pequenas bolhas em algumas extensões do corpo dos parasitos em ambos os sexos, cutícula descontínua destacada do corpo com aspecto descamativo nas fêmeas (Fig. 5b) e atrofia de tubérculos nos machos (Fig. 5d).

Figura 5: Efeitos do extrato VAFH no tegumento de vermes adultos de S. mansoni. (a) Fêmea após 24 horas de incubação. Setas indicando pequenas bolhas no tegumento. (b) Fêmea após 48 horas de incubação. Setas indicando descamação no tegumento. (c) Macho após 24 horas de incubação. Setas indicando bolhas no tegumento. (d) Macho após 48 horas de incubação. Setas indicando atrofia dos tubérculos. Fonte: Autor, 2019.

a b

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5.2. Atividade esquistossomicida in vitro da fração VAFD

Análises dos vermes incubados com a fração em diclorometano (VAFD) após 24 horas constataram-se a presença de ovos viáveis (4); redução considerável na motilidade em ambos os sexos; alterações tegumentares, com o surgimento de estruturas semelhantes a bolhas de tamanhos irregulares mais pronunciadas nas fêmeas (Fig. 6a); pequenas descamações cuticulares observadas exclusivamente no tegumento das fêmeas (Fig. 6b); e degeneração de tubérculos nos machos (Fig. 6c e 6d). A partir de 48 horas verificou-se somente a presença dos quatros ovos, concluindo que não houve mais oviposição; ausência da motilidade dos vermes; e observadas às mesmas alterações tegumentares descritas nas primeiras 24 horas, tanto nos machos quanto nas fêmeas.

Figura 6: Efeitos do extrato VAFD no tegumento de vermes adultos de S. mansoni. (a) Fêmea após 24 horas de incubação. Setas indicando bolhas no tegumento. (b) Fêmea após 24 horas de incubação. Setas indicando descamação no tegumento. (c) Macho após 24 horas de incubação. Setas indicando degeneração de tubérculos. (d) Macho após 24 horas de incubação. Setas indicando pequenas bolhas e degeneração de tubérculos. Fonte: Autor, 2019.

a b

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5.3. Atividade esquistossomicida in vitro da fração VAFA

Na fração acetato de etila (VAFA) após 24 horas, foi observada a presenças de ovos com aspectos disformes considerados não viáveis (Fig. 7a); redução relevante da motilidade; e presença de poucas bolhas de tamanhos irregulares nas cutículas das fêmeas. A partir de 48 horas, foi constatada ainda a presença de ovos inviáveis; falta de motilidade dos vermes; e alteração no tegumento, com descamação acentuada nas cutículas das fêmeas (Fig. 7c) e aumento notável de estruturas em forma de pequenas bolhas expostas nos tubérculos dos machos (Fig. 7d).

Figura 7: Efeitos do extrato VAFA nos ovos e tegumento de vermes de S. mansoni. (a) Ovos de S.

mansoni após 24 horas de incubação apresentando morfologia alterada e ausência de espículos,

considerados não viáveis. (b) Ovos de S. mansoni após oviposição sem alteração morfológica, observe formato oval e presença de espículos. (c) Fêmea após 48 horas de incubação. Setas indicando descamação no tegumento. (d) Macho após 48 horas de incubação. Setas indicando pequenas bolhas no tegumento. Fonte: Autor, 2019.

a b

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6. DISCUSSÃO

Produtos naturais representam uma fonte rica de novos protótipos farmacêuticos, no qual, desempenham um papel significativo para descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos (NEWMAN; CRAGG, 2007). Estudos na literatura constataram que as plantas contêm metabólitos secundários com propriedades antimicrobianas, antivirais, antitumorais, assim como anti-helmínticas (NEWMAN; CRAGG, 2012). Neste estudo, avaliamos o potencial dos metabólitos secundários da planta V. amazonica contra vermes adultos da linhagem S. mansoni, constituindo-se o primeiro estudo desta espécie de planta na literatura para este fim. Os efeitos da fração VAFA provocando deformidades nos ovos e tornando-os inférteis sugere uma atividade direta desta fração no processo de formação dos ovos. Analisando essa ação hipoteticamente, do ponto de vista do controle da esquistossomose, medicamentos com essa característica poderiam interferir no ciclo de transmissão da doença, uma vez que induziriam a eliminação de ovos inférteis/inviáveis pelo hospedeiro humano, independente da redução da carga parasitária. Em contrapartida, foi observado que no tratamento feito com as frações VAFH e VAFD, apenas foi observada a postura de ovos somente nas primeiras 24 horas de avaliação; após esse período não foi constatada a oviposição, sugerindo um efeito direto no sistema reprodutor dos vermes produzindo esterilidade. A alteração da viabilidade dos ovos foi observada no tratamento com outras plantas, como avaliado no composto presente na Curcuma longa (MAGALHÃES et al., 2009) e com algumas sementes trituradas de Nigella sativa (MOHAMED et al., 2005). Diminuição na oviposição também foi observada com o composto extraído da Piper tuberculatum (DE MORAES et al., 2011) e com óleos essenciais de Baccharis trimera (DE OLIVEIRA et al., 2012). Nos estudos supracitados, esses efeitos resultaram na separação dos vermes, impedindo qualquer processo reprodutivo; entretanto, nas três frações os vermes permaneceram acasalados, reforçando a hipótese de ação direta no aparelho reprodutor dos vermes ou no caso da fração VAFA na formação dos ovos.

Neste ensaio, todas as frações avaliadas promoveram mudanças no padrão da atividade motora dos vermes após 48 horas quando comparadas ao grupo controle negativo. Os efeitos sobre a motilidade dos vermes foram também assinalados em outros estudos como: na avaliação do composto de C. longa

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(MAGALHÃES et al. 2009) e na planta Eremanthus goyazensis (BARTH et al., 1997) que mostraram diminuição dos movimentos dos vermes, além do óleo essencial de B. trimera (DE OLIVEIRA et al., 2012) que apresentou ausência completa de motilidade dos parasitos. A atividade na motilidade dos vermes pode ser considerada uma característica importante, uma vez que pesquisas revelaram que S. mansoni possui um sistema de neurotransmissão e controle da atividade motora similar ao dos mamíferos, todavia, com receptores diferentes entre parasito e hospedeiro, o que tornaria estas estruturas possíveis alvos para fármacos esquistossomicidas (NOEL, 2008).

Todos os extratos utilizados nos testes in vitro foram capazes de causar lesões no tegumento dos parasitos. Na fração VAFH observou-se intensas alterações tegumentares com aspecto descamativo na camada epidérmica das fêmeas e atrofia dos tubérculos nos machos. Já nas frações VAFD e VAFA as modificações decorreram em menor intensidade com formação de bolhas de tamanhos irregulares e descamações nas cutículas das fêmeas. Características similares foram observadas por Veras et al. (2012), sobre o efeito do extrato isolado de Pilocarpus microphyllus, e por Utzinger et al. (2001), que realizaram estudos com a planta Artemisia annua. Esses autores verificaram mudanças morfológicas nas células epiteliais do parasito como descamação em machos e fêmeas, e indução de vacuolização, respectivamente. A atrofia nos tubérculos dos machos observada neste estudo foi verificada também por De Moraes et al, (2011) com extratos da planta P. tuberculatum que apontaram danos progressivos nessas estruturas, incluindo descamação e indução de colapso e consequente ruptura. Atividades direcionadas ao tegumento dos vermes adultos em modelos in vivo podem interferir nos mecanismos de escape do parasito, contribuindo para a eliminação dos esquistossomos (HARNETT; KUSEL, 1986).

Para indicativo de sobrevida dos vermes nas diferentes frações foram analisados os seguintes critérios ao longo do período de observação (96 horas): ausência de motilidade e lesões no tegumento. Desta forma, após 48 horas houve ausência de atividade motora e surgimento de descamações e formações de bolhas nos tegumentos dos vermes em ambos os sexos, presumindo-se assim a morte dos parasitos. Em contrapartida nos controles negativos os vermes mantiveram-se ativos e sem lesão no tegumento em todo período de observação. Dias et al. (2017) avaliaram a mortalidade do extrato de Arctium lappa somente pela falta de

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movimentos, após 48 horas de incubação. No estudo com Mitracarpus frigidus (FABRI et al., 2014) foi considerada a paralisia completa dos vermes como parâmetro de morte, sendo esta observada após 24 horas de exposição na concentração de 400 µg/mL, diferente da utilizada neste trabalho. Experimento realizado com a planta P. tuberculatum, a morte do parasito foi definida por meio da ausência de movimentos por pelo menos 1 minuto de observação (DE MORAES et al., 2012). Entretanto este critério pode ser de difícil avaliação, uma vez que o verme pode ter contrações ou motilidade no período em que não está sendo analisado.

Os efeitos do PZQ nos vermes de S. mansoni são geralmente agrupados em três categorias: (1) contração muscular; (2) modificações tegumentares; (3) alterações metabólicas (CIOLI; MATTOCCIA; ARCHER, 1995). Estudo anterior realizado por Oliveira (2005) revelou que vermes adultos expostos ao PZQ causaram pequenas lesões nos tegumentos dos parasitos, já os apresentados por Jiraungkoorskul et al. (2006) mostraram bolhas, vacuolização em ambos os sexos, alterações específicas como descamações das superfícies dorsais nas fêmeas e alterações nos tubérculos nos machos. Desse modo, estas alterações interferem na função muscular e danificam o tegumento acarretando a morte do parasito. Os efeitos observados no PZQ em relação ao tegumento foram semelhantes aos avaliados neste estudo, diferenciando-se apenas no tempo de ação (24 horas após incubação). A atividade das três frações se deu a partir das 48 horas, revelando as mesmas alterações quando comparadas com o fármaco referência.

As frações VAFD e VAFH apresentaram bons resultados contra os parasitos, como diminuição da oviposição, redução na motilidade e alteração no tegumento, estes dois últimos agindo em conjunto causando a morte de todos os vermes após 48 horas de observação. A fração VAFA também se mostrou promissora, tendo os mesmos resultados com ausência de motilidade e alteração no tegumento, quando comparada as frações citadas acima. Em contrapartida, os efeitos na formação dos ovos e na ovoposição podem ser uma condição reversível.

Os resultados de testes in vitro são essenciais para descoberta de potenciais fármacos para o controle da esquistossomose (KEISER, 2010). Uma análise dos constituintes químicos das frações ativas da Victoria amazonica se faz extremamente necessária para se determinar os compostos presentes. Ainda, um estudo de fracionamento biomonitorado poderia levar ao isolamento do composto(s)

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bioativo(s) no S. mansoni, possibilitando a identificação de protótipo(s) para estudos de Drug Discovery.

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7. CONCLUSÕES

1- Um extrato bruto metanólico foi obtido da planta Victoria amazonica.

2- O extrato bruto metanólico resultou em 3 frações orgânicas, contendo metabólitos nas fases em hexano, diclorometano e acetato de etila.

3- As frações em hexano, diclorometano e acetato de etila induziram morte dos vermes de ambos os sexos.

4- As frações em hexano, diclorometano e acetato de etila afetaram o tegumento e motilidade dos vermes, oviposição (hexano, diclorometano) e apenas a fração em acetato de etila alterou a morfologia dos ovos.

5- O fármaco praziquantel apresentou atividade contra os vermes de S. mansoni, demonstrando que os parasitos estavam susceptíveis ao composto químico.

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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Referências

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