Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciência da Matemática e da Natureza – CCMN
Instituto de Química - IQ
Departamento de Bioquímica
Maysa Silva Barreto
Biodestoxificação do feijão-de-porco (Canavalia ensiformis)
por Fermentação em Estado Sólido
Rio de Janeiro 2018
2 Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciência da Matemática e da Natureza – CCMN Instituto de Química - IQ
Departamento de Bioquímica
Biodestoxificação do feijão-de-porco (Canavalia ensiformis) por Fermentação em Estado Sólido
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Denise Maria Guimarães Freire Coorientador: Mateus Gomes de Godoy
Rio de Janeiro 2018
3 Biodestoxificação do feijão-de-porco (Canavalia ensiformis) por Fermentação
em Estado Sólido
Maysa Silva Barreto
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências de Alimentos, Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências.
Aprovada por:
DSc. Denise Maria Guimarães Freire (Presidente) Instituto de Química – UFRJ
DSc. Elisa D Avila Costa Cavalcanti Escola de Nutrição - UNIRIO
DSc Carlos Adam Conte Júnior Instituto de Química – UFRJ
Dsc Érika Cristina Gonçalves Aguieiras (Suplente externo) Instituto de Química – UFRJ
DSc Melissa Limoeiro Estrada Gutarra (Suplente Interno) Escola de química – UFRJ
Rio de Janeiro 2018
4 AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente, Á Deus, por ter fé na vida.
Aos meus queridos pais Elisa e José que mesmo distantes, são os grandes incentivadores e apoiadores para que eu nunca desistisse.
Aos meus orientadores Denise e Mateus. A professora que mesmo sendo tão ocupada sempre arruma um tempinho para nossas dúvidas, seja na sua sala, na porta indo embora, no almoço, no café, no banheiro, enfim, seu entusiasmo com o trabalho nos motiva todos os dias. Ao Senhor Godoy por tudo que me ensinou ao longo desses 5 anos, pelas considerações fundamentais para esse trabalho e outros também, paciência, pela atenção, pela disponibilidade, seja em reuniões, carona ou Whatsapp, muito obrigada mesmo!
Aos colaborados desse trabalho prof Anderson de Sá Pinheiro, por ter me aceitado em seu laboratório, a Carol por todas as considerações no trabalho e disponibilidade, e além de tudo, ter se tornado uma grande amiga.
Aos meus colegas e amigos de todos dias do Labim: Aline, Ana Cristina, Anderson, Brini, Carol, Daniel, Douglas, Duda, Elisa, Erika, Fabio, Gabi, Jack 1, Jack2, Joab, Mateuzinho, Pri, Rodrigo Osama, Rui, Taissa, Vanessa. Na ordem alfabética porque todos são igualmente importantes para mim. Obrigada por tornarem esse ambiente de trabalho tão agradável e divertido.
Aos meus novos amigos do Labep que me receberam tão bem: Bia, Bianca, por me ajudarem na bancada e também serem tão amigas, Luiz Felipe, por ser sempre tão bem-humorado e fofo comigo, Gui, mesmo sendo má me ajudou tanto, Léo, Luisinho, João, Danielzinho, Bruna, prof Dani e Germana, que de alguma forma sempre me ajudaram também. Vocês estão no meu coração.
A todos meus colegas e professores do departamento. Em especial meus colegas de Ciências de Alimentos.
As minhas amigas maravilhosas Maiara, Mariana, Carol e Rafaelle por sempre apoiarem umas ás outras em tudo, e claro, serem tão divertidas e tornarem esses dois anos mais leves.
5 RESUMO
BARRETO, Maysa Silva. Biodestoxificação do feijão-de-porco (Canavalia
ensiformis) por Fermentação em Estado Sólido. Rio de Janeiro, 2018. Dissertação
(Mestrado em Ciências de Alimentos) – Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.
O feijão-de-porco (Canavalia ensiformis) é uma leguminosa amplamente cultivada no Brasil que, em condições ideias de manejo, chega a produzir 2,5 toneladas por hectare de massa seca da semente. Suas sementes têm valores nutricionais interessantes, no entanto sua aplicação é voltada basicamente para adubação verde. Isso se deve ao fato de C. esiformis possuir fatores antinutricionais: a lectina Concanavalina A, os inibidores de tripsina e ureases. Essa leguminosa também possui a canavanina que tem um papel importantíssimo no mecanismo de defesa da planta. Neste contexto, a Fermentação em Estado Sólido (FES) surge como uma alternativa no aproveitamento e valoração dessas sementes com a eliminação destes compostos antinutricionais. O objetivo deste trabalho foi utilizar dois microrganismos produtores de peptidases, Aspergillus oryzae e Aspergillus awamori, para a destoxificação do feijão-de-porco, visando a sua futura aplicação na alimentação animal. Ambos os fungos testados foram capazes de crescer e produzir peptidases. A. oryzae teve sua produção máxima em 5 dias de fermentação de 56,23 U.g-1 e A. awamori de 40,89 U.g-1 no oitavo dia de cultivo. A lectina Concanavalina A
foi totalmente reduzida em 3 dias de fermentação com A. awamori, enquanto A. oryzae reduziu 68,2% da Con A após 6 dias de cultivo. Os inibidores de tripsina se mantiveram constantes durante o processo fermentativo em ambas fermentações. O fungo A. oryzae também foi capaz de reduzir 92,6% da canavanina em 5 dias de fermentação, enquanto A. awamori reduziu 85,2% em 3 dias. Com esse trabalho foi possível desenvolver um processo biotecnológico, de baixo custo, de destoxificação do feijão-de-porco para a produção de um ingrediente para compor uma ração animal. Palavras-chave: Fermentação em estado sólido. Desintoxicação Canavalia ensiformis. Concanavalina A. Canavanina. Inibidores de tripsina
6 ABSTRACT
BARRETO, Maysa Silva. Biodestoxification of jackbean (Canavalia
ensiformis) by Fermentation in Solid State. Rio de Janeiro, 2018. Dissertation
(Master in Food Science) - Institute of Chemistry, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2018.
The jackbean (Canavalia ensiformis) is a leguminous vegetable widely cultivated in Brazil, which, under ideal management conditions, produces 2.5 tons per hectare of dry seed mass. Its seeds have interesting nutritional values, however their application is basically turned to green fertilization. This is due to the fact that C. esiformis has antinutritional factors: Concanavalin A lectin, trypsin inhibitors and ureases. This legume also has canavanine which plays an important role in the defense mechanism of the plant. In this context, Solid State Fermentation (FES) appears as an alternative in the use and valuation of these seeds with the elimination of these antinutritional compounds. The objective of this work was to use two microorganisms producing peptidases, Aspergillus oryzae and Aspergillus awamori, for the detoxification of the jackbean, with a view to their future application in animal feed. Both fungi tested were able to grow and produce peptidases. A. oryzae had its maximum production in 5 days of fermentation of 56.23 U.g-1 and A. awamori of 40.89 U.g-1 on the eighth day of culture. Concanavalin A lectin was completely reduced in 3 days of A. awamori fermentation, while A. oryzae reduced 68.2% Con A after 6 days of culture. Trypsin inhibitors remained constant during the fermentation process in both fermentations. A. oryzae fungus was also able to reduce 92.6% of canavanine in 5 days of fermentation, while A. awamori reduced 85.2% in 3 days. With this work it was possible to develop a low cost biotechnological process of detoxification of the jackbean for the production of an ingredient to compose an animal feed.
Keywords: Solid-state fermentation. Detoxification. Canavalia ensiformis. Concanavalin A. Canavanine. Trypsin inhibitors
7
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 11 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 13 2.1 Canavalia ensiformis ... 13 2.1.1 Características ... 132.1.2 Metabólitos secundários e fatores antinutricionais do feijão-de-porco ... ...14
2.1.2.1Concanavalina A ... 14
2.1.2.1.1 Caractísticas estruturais...14
2.1.2.1.2 Ação antinutricional e efeito nos animais...15
2.1.2.1.3 Métodos de inativação...16
2.1.2.1.4 Aplicaçõe...16
2.1.2.2Inibidores de tripsina ... 17
2.1.2.2.1 Caractísticas estruturais...17
2.1.2.2.2 Ação antinutricional e efeito nos animais...17
2.1.2.2.3 Métodos de inativação...18
2.1.2.2.4 Aplicações...18
2.1.2.3Ureases ... 19
2.1.2.3.1 Característisticas estruturais...19
2.1.2.3.2 Ação antinutricional e efeito das ureases nos animais...19
2.1.2.3.3 Métodos de inativação...20
2.1.2.3.4 Urease do feijão-de-porco...20
2.1.2.3.5 Aplicações da urease do feijão-de-porco...20
2.1.2.4Canavanina ... 21
2.1.2.4.1 Características estruturais... 20
2.1.2.4.2 Ação antinutricional... 21
2.1.2.4.3 Aplicações...22
2.2 Fermentação em Estado Sólido ... 233
2.2.1 Fatores que afetam a FES ... 255
2.2.2 Vantagens e desvantagens da FES ... 266
2.2.3 Aplicação da FES ... 277
2.3 Ração animal ... 31
2.3.1 Uso do feijão-de-porco em alimentação animal...33
3 OBJETIVO ... 344
3.1 Objetivo geral ... 344
3.2 Objetivos específicos... 344
8
4.1 Materiais ... 355
4.1.1 Componentes do meio de propagação ... 355
4.1.2 Matéria-prima ... 355
4.1.3 Reagentes ... 355
4.1.4 Equipamentos ... 355
4.2 Métodos ... 366
4.2.1 Análise centesimal do feijão-de-porco ... 366
4.2.2 Microrganismos ... 377
4.2.3 Fermentação em Estado Sólido ... 388
4.2.4 Avaliação da lectina Con A por cromatografia de afinidade ... 399
4.2.5 Atividade dos inibidores de tripsina ... 4141
4.2.6 Análise de canavanina ... 41
5.2.7 Análise estatística ... 422
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 433
5.1 Distribuição granulométrica do feijão-de-porco triturado ... 433
5.2 Análise centesimal do feijão-de-porco ... 444
5.3 Parâmetros da FES ... 444
5.3.1 Umidade e atividade de água ... 444
5.3.2 Atividades de peptidases ... 466
5.4 Avaliação da lectina Con A do feijão-de-porco ... 488
5.4.1 Detecção de Con A nas amostras controle ... 488
5.4.2 Detecção de Concanavalina A nas amostras cultivadas com Aspergillus oryzae ... 5151
5.4.3 Detecção de Concanavalina A nas amostras cultivadas com Aspergillus awamori ... 545
5.4.4 Verificação da atividade biológica da lectina Con A por ensaio de hemaglutinação ... 577
5.5 Atividade de inibidores de tripsina ... 599
5.6 Análise de canavanina nas amostras cultivadas com ambos fungos... ... 61
6. CONCLUSÕES ... 64
7. PERSPECTIVAS...64
9 LISTA DE ILUSTRÇÕES
Figura 1: a) Plantação de feijão-de-porco b) Sementes de feijão-de-porco...13 Figura 2: Estrutura cristalográfica da Con A (HARDMANE AINSWORTH, 1972)....15 Figura 3: Estrutura do aminoácido arginina e canavanina...21 Figura 4: Distribuição granulométrica do feijão-de-porco...43 Figura 5: Parâmetros da FES. Umidade (▲) e atividade água (■) dos cultivos com a) A. oryzae b) A.awamori...45 Figura 6: Parâmetros da FES. Atividades de peptidases (▲) e pH (■) dos cultivos com
a) A.oryzae b)
A.awamori...46/47 Figura 7: Avaliação da Con A. Cromatografia de afinidade e o respectivo gel de SDS-PAGE referente ao pico de Con A do a) controle (1) sementes in natura, b) controle (2) autoclavado 1 ATM por 15 minutos; c) controle (3) autoclavado 0,5 ATM por 15 minutos; d) controle (4) autoclavado por 0,5 ATM por 15 minutos e colocados na mesma condição de cultivo por 8 dias, sem o inóculo; e) Padrão de Con A (5)... 48/49 Figura 8: Avaliação da Con A. Cromatografia de afinidade e o respectivo gel de SDS-PAGE referente ao pico da Con A das amostras cultivadas com A. oryzae por a) 24h; b) 48h; c) 72h d) 96h; e) 120h; f) 144h; g) 168h; h) 192h...52/53/54 Figura 9: Avaliação da Con A. Cromatografia de afinidade e o respectivo gel de SDS-PAGE referente ao pico da Con A das amostras cultivadas com A. awamori por a)
72h; b) 96h; c)120h; d) 144h; e)
168h...55/56 Figura 10: Verificação da atividade biológica Con A. Ensaio de hemaglutinação das amostras cultivadas com a) A.oryzae nos diferentes tempos b) A. awamori c) branco do ensaio...58 Figura 11: Concentração de canavanina. a) Amostras controle (1) e cultivadas com A. oryzae b) A.awamori...62
10 LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação científica do feijão-de-porco...13
Tabela 2: Efeitos dos fatores antinutrionais do feijão-de-porco em animais monogástricos e poligástricos...23
Tabela 3: Principais diferenças entre FES e FS (MITCHELL; LONSANE, 1992)...24
Tabela 4: Peptidases, suas origens e respectivas aplicações (WISEMAN, 1991)...28
Tabela 5: Aminoácidos essenciais e não-essenciais...32
Tabela 6: Aminoácidos limitantes para diferentes grupos animais (GABBI, 2010)....32
Tabela 7: Componentes do meio de cultivo e fornecedores...35
Tabela 8: Listagem dos produtos utilizados nas análises e fornecedores...35
Tabela 9: Principais equipamentos utilizados e seus respectivos fabricantes...36
Tabela 10: Composição centesimal das sementes do feijão-de-porco, e farelo de soja, milho moído e farelo de trigo (adaptada de ZAMBOM et al, 2001)...44
Tabela 11: Concentração de Con A nas amostras controle (1) e cultivadas com A. oryzae...54
Tabela 12: Atividade dos inibidores de tripsina das amostras cultivadas com ambos os fungos e controle in natura (1)...60
Tabela 13: Unidade de tripsina inibidas em diferentes cultivares de soja (adaptada de CARVALHO et al, 2002)...60
11 1. INTRODUÇÃO
Canavalia ensiformis, de nome popular feijão-de-porco, é uma leguminosa amplamente cultivada na região Sul e Sudeste do país por ser adaptável a uma vasta gama de condições climáticas. Atualmente, o feijão-de-porco vem sendo muito empregado como adubação verde pelos agricultores. A técnica consiste em plantar o feijão em rotação ou consorciação com outras culturas com o objetivo de melhorar a qualidade do solo. Normalmente, utilizam-se leguminosas devido sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico quando associadas a rizóbios (BARRADAS, 2010). Sua análise centesimal indica que a mesma poderia ser empregada para alimentação animal. Entretanto, o feijão-de-porco possui a presença de compostos antinutricionas que impossibilitam sua aplicação na alimentação animal. São eles a lectina Concanavalina A (Con A), os inibidores de tripsina e uréases.
A Con A, uma das lectinas vegetais mais estudadas, é considerada o fator antinutricional mais importante do feijão-de-porco, correspondendo a cerca de 20% do total de proteínas presente nas sementes (PUTSZTAI, 1989). São proteínas com capacidade de se ligar reversivelmente a carboidratos (glicogênio e amido) e aglutinar eritrócitos de várias espécies tornando-os indisponíveis em outros processos biológicos. Ela também se liga a glicoproteínas e lipoproteínas do trato digestivo inibindo a ação enzimática (BENDER, 1987; XAVIER-FILHO e CAMPOS, 1989).
Os inibidores de tripsina estão presentes em várias leguminosas e no feijão-de-porco não é diferente. A tripsina é uma enzima que tem como função catalisar a digestão das proteínas ingeridas pelos animais. Os inibidores de tripsina também são enzimas, as quais são capazes de se ligarem a tripsina, impedindo sua ação catalítica (BENDER, 1987; XAVIER-FILHO E CAMPOS, 1989).
Nesse feijão também é encontrado uréases vegetais, que são comuns em leguminosas (Sirko e Brodzik, 2000). Já foi isolada uma isoforma de uréases denominada canatoxina (CNTX), uma potente uréase com toxidade neurológica a camundongos (CARLINI E GUIMARÃES, 1981).
O feijão-de-porco também apresenta um aminoácido não-proteico, análogo da arginina, chamado de canavanina (KITAGAWA E TOMIYAMA, 1929). A canavanina apresenta toxicidade para bactérias, insetos e outros invertebrados, que não são capazes de reconhecer a diferença entre os análogos. Como os vertebrados possuem
12 a arginil-T-RNA sintetase, que é específica para arginina não reconhecendo a canavanina, este composto não é considerado tóxico para esse grupo de animais (CARLINI, 1998).
Dentro deste contexto, a utilização do feijão-de-porco como um ingrediente de ração animal fica inviável, em razão disso existe a necessidade de desenvolver metodologias para estudar a redução destes compostos.
A Fermentação em Estado Sólido (FES) é uma técnica que consiste no crescimento de microrganismo em um suporte sólido que servirá como uma fonte de nutrientes, na ausência ou quase ausência de água livre visível (MITCHELL, 2002). Essa técnica vem sendo aplicada para produção de compostos com valor agregado, tais como enzimas e outros metabólitos; enriquecimento proteico, e destoxificação de resíduos por meio de eliminação de substâncias indesejáveis (RAIMBAULT, 1998; PANDEY, 2003).
Neste cenário, o feijão-de-porco tem se mostrado um produto de interesse para aplicação em alimentação animal devido às suas características agronômicas que, em condições ideiais de manejo, chega a produzir 2,5 toneladas por hectare de massa seca da semente. A composição centesimal das sementes de feijão-de-porco podem variar 26,15 - 42% quanto ao percentual de proteína bruta, 5,38 - 3,5% de lipídios, entre 2,92- 1,28 de cinzas (LEÓNet al, 1989; BULIAN, 2015). Sendo assim, o objetivo principal deste trabalho foi utilizar a FES como uma técnica para redução dos fatores antinutricionais do feijão-de-porco, visando uma futura aplicação na alimentação animal.
13 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Canavalia ensiformis 2.1.1 Características
Canavalia ensiformis, conhecido popularmente como de-porco, feijão-bravo ou fava-brava, é uma leguminosa pertencente à família da Fabaceae (Tabela 1). Este gênero, por sua vez, compreende espécies de plantas nativas do Novo Mundo. Trata-se de uma planta de colheita anual ou bianual, herbácea, muito rústica, ereta chegando até 1,2 m de altura. Suas folhas são alternadas, trifolioladas, com folíolos grandes, elíptico-ovais, de cor verde escura, com nervuras proeminentes. Suas vagens são achatadas, largas e compridas e possuem em torno de 4 a 18 sementes. Estas sementes podem ser brancas ou rosadas, de formato arredondado ou ovalado (RAYOL, 2018) (Figura 1).
Tabela 1: Classificação científica do feijão-de-porco. Classificação científica Domínio Eukaryota Reino Plantae Divisão Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Ordem Fabales Família Fabaceae Subfamília Faboideae Gênero Canavalia
Epíteto específico Ensiformis
a) b)
Figura 1: a) Plantação de feijão-de-porco b) Sementes de feijão-de-porco.
O feijão-de-porco possui resistência a seca e temperaturas elevadas, suporta sombreamento médio, porém não resiste a geadas. É adaptada a todos os tipos de solos, mas preferencialmente se desenvolve melhor em solos ácidos (RODRIGUES
14 et al, 2004). Embora as sementes não sejam consumidas na alimentação humana, pois contêm fatores antinutricionais, apresenta valores nutricionais interessantes. 2.1.2 Metabólitos secundários e fatores antinutricionais do feijão-de-porco
Fatores antinutricionais são habitualmente empregados para descrever compostos ou classes de compostos presentes numa ampla variedade de alimentos de origem vegetal que, ao serem consumidos, reduzem o valor nutritivo desses alimentos. Eles interferem na digestibilidade, absorção ou utilização de nutrientes e, se ingeridos em elevadas concentrações, podem ocasionar efeitos danosos à saúde (SANTOS,2006).
Para os vegetais, os metabólitos secundários atuam como proteção natural aos ataques de fungos, bactérias, insetos e pássaros, sendo importantes em seu mecanismo de defesa. Sendo assim, a maiorias das fontes de proteínas de procedência vegetal têm fatores antinutricionais que em alguns casos são metabólitos secundários que devem ser reduzidos, para que possam ser empregados na alimentação animal. O feijão-de-porco possui a lectina Concanavalina A, os inibidores de tripsina e uréases que são considerados fatores antinutrionais e metabólitos secundários, já a canavanina é considerada somente um metabólito secundário, envolvido no mecanismo de defesa da planta, ao ataque de herbívoros.
2.1.2.1 Concanavalina A
2.1.2.1.1 Características estruturais
A Concanavalina A (Con A) é uma lectina vegetal e foi purificada pela primeira vez por Sumner e Howell (1936), correspondendo a cerca de 20% das proteínas totais presente nas sementes da Canavalia ensiformis (PUTSZTAI, 1989). É um homotetrâmero de 110 kDa com quatro subunidades iguais de aproximadamente 26,5 kDa (Figura 2).
15 Figura 2: Estrutura cristalográfica da Con A (HARDMANE AINSWORTH, 1972). 2.1.2.1.2 Ação antinutricional e efeito nos animais
As lectinas são glicoproteínas que se ligam de modo específicos a grupos α-D-manosil e α-D-glicosil e açucares não-redutores, e esses grupos estão presentes em receptores celulares. Portanto, a Con A possui a capacidade de aglutinar eritrócitos, de várias espécies, tais como de cavalo, cão, gato, coelho, rato. Não tem ação sobre eritrócitos de humanos e vacas, pouca ou nenhuma ação sobre os do bode, ovelha ou porco (SUMNER&HOWELL,1936).
A utilização das sementes in natura na alimentação de animais não-ruminantes pode diminuir a digestibilidade dos nutrientes, afetando o consumo e o desempenho animal e até mesmo serem tóxicas, podendo leva-los a morte (CARLINI e UDEDIBIE 1996). Isto se dá pelo fato de a maioria das lectinas resistirem ao ataque das enzimas do sistema digestivo (MAENZ et al,1999).
Uma vez ingeridas e alcançando o intestino, essas lectinas causam a desordem e aniquilamento dos microvilos alargando assim o turnover das células intestinais. Esta desestruturação começa a interferir gravemente na digestão e absorção de vários nutrientes, reduzindo a secreção de enzimas pelos enterócitos, gerando hipersecreção de proteína endógena com maior produção de muco e prejuízos de proteínas plasmáticas para o lúmen intestinal. Além disso, aumenta o tamanho e peso do intestino delgado por conta da hipertrofia e hiperplasia, acarretando uma competição por nutrientes por parte do hospedeiro como microrganismos presentes
16 no intestino e favorecendo assim a adesão de Salmonella typhimurium na mucosa intestinal (GRANT, 1991).
Os danos causados no epitélio afrouxam a permeabilidade intestinal, permitindo que lectinas sejam absorvidas quando atingem a circulação sanguínea e consequentemente demais órgãos, pode causar graves lesões renais; atrofia do timo; hipertrofia do fígado e pâncreas; atrofia muscular; e aumento do catabolismo proteico, lipídico e de carboidratos (MAENZ et al, 1999).
2.1.2.1.3 Métodos de inativação
Udedibie e Carlini (1998) propuseram uma metodologia de destoxificação que se baseava na quebra e cozedura em panelas de pressão domésticas. Os autores observaram que após 45 minutos de cozimento as sementes não apresentavam mais atividades hemaglutinantes. Entretanto, esse trabalho avaliou a presença da Con A apenas através do ensaio de hemaglutinação.
2.1.2.1.4 Aplicações
A capacidade da Con A de se ligar a receptores celulares inclui o receptor de insulina, a qual a lectina pode se ligar e aumentar a taxa de transporte de glicose (CUATRECASAS, 1973). Também pode se ligar a lipoproteínas de baixa densidade (LDL) do plasma humano, os quais estão relacionados à regulação do metabolismo do colesterol e ao desenvolvimento de doenças ateroscleróticas (HARMONY & CORDES, 1975).
Estudos também mostram a capacidade da Con A de aglutinar células cancerosas, direcionando-as para a apoptose e bloqueando a angiogênese de tumores (KAKIZOE,1980;BETTON,1976;BECKEReSHURGIN,1975). Dentro desse contexto, Lei & Chang (2009) propuseram que essa lectina apresenta um potencial terapêutico contra o câncer de fígado estudado em murinos. Seu mecanismo se dá da seguinte forma: após a interação da Con A com glicoproteínas da membrana celular, ela é internalizada até a mitocôndria e uma autofagia é desencadeada levando a morte celular, resultando na irradiação do tumor.
Foi descrito que a Con A também interage com resíduos de superfícies de bactérias Bacillus subtilis evidenciando que a lectina A pode ser usada como sonda para estudar as características estruturais das paredes celulares bacterianas (DOYLE & BIRDSELL, 1972). Esse estudo também apontou para que Zhuang et al (2017) desenvolvessem uma nanocarregador magnético com estruturas enxertadas com Con
17 A para reconhecer especificamente Escherichia coli recombinante por meio de glicoconjugados e glicoproteínas de superfícies celulares. A célula imobilizada exibiu alta atividade específica e boa reutilização. O método mostrou um futuro promissor para a catálise celular em biotecnologia, pois permite a imobilização da célula de uma maneira simples e de baixo custo.
A Con A também é utilizada na ciência como um modelo de hepatite aguda em camundongos. Utilizando Con A para simular a hepatite imunoimediada em humanos, hepatite autoimune e hepatite viral aguda os resultados foram melhores em comparação a outros modelos experimentais pelo fato da Con A impulsionar a ativação e recrutamento de células T do fígado. Estas, por sua vez, possuem o papel de mensageiro mais importante do sistema imune enviando mensagens de ataque para diversos leucócitos para realizar a defesa imunológica contra o agente agressor, neste caso o vírus da hepatite (HEYMANN et at, 2015)
2.1.2.2 Inibidores de tripsina 2.1.2.2.1 Características estruturais
Os inibidores de tripsina, como o próprio nome sugere, são enzimas que inibem a ação da enzima tripsina sobre as proteínas ingeridas pelos animais (BENDER, 1987; XAVIER-FILHO E CAMPOS, 1989). Na semente do feijão-de-porco foi relatada a presença de duas classes desses inibidores Kunitz e Bowman-Birk, sendo o primeiro de maior massa molar (20 kDa) e duas pontes de sulfeto, e o segundo de menor massa (6-10 kDa) porém com várias pontes de dissulfeto, lhe conferindo uma maior estabilidade frente a variação de pH e temperatura (ORRU E DEMEL, 1941).
2.1.2.2.2 Ação antinutricional e efeito nos animais
A descoberta desses inibidores em leguminosas, principalmente na soja, instigou estudos em modelos animais, por ser um dos ingredientes mais utilizados em alimentação animal (RACKIS, 1974). Al-Wesali et al (1995) atribuíram a ingestão de inibidores de tripsina a alterações metabólicas no pâncreas (aumento da secreção enzimática, hipertrofia e hiperplasia) e redução da taxa de crescimento em animais monogástrico. Estudos empregando soja, tratada previamente com aquecimento, na dieta de ratos não observaram prejuízos no pâncreas, quanto a hipertrofia e hiperplasia (CHURELLA et al, 1976).
O inibidor de tripsina bloqueia a ação da tripsina procedendo um aumento exagerado da concentração plasmática de colecistoquinina e desta forma, o pâncreas
18 é fortemente estimulado a liberar mais enzima, causando hipertrofia pancreática (LIDDLE et al, 1984).
A redução da taxa de crescimento em animais monogástricos jovens alimentados com leguminosas cruas é provocada pela exagerada perda fecal de proteína secretada pelo pâncreas. As enzimas pancreáticas são ricas em aminoácidos sulfurados e esta perda endógena não pode ser equilibrada pela ingestão de leguminosas, por serem deficientes em tais aminoácidos, acarretando prejuízos no crescimento desses animais (RACKIS E GUMBMANN, 1982).
2.1.2.2.3 Métodos de inativação
Dentre os métodos de inativação de atividade anti-tripsina normalmente são empregados, calor, calor úmido e pressão. Carlini e Udedibie (1997) propuseram um método de inativação da ação anti-tripsina das sementes de feijão-de-porco colocando as sementes trituradas em cozedura sobre pressão por 30 minutos, e alcançaram a completa inativação das sementes do feijão.
A inativação de inibidores de tripsina também foi estudada em outras leguminosas. No feijão (Phaseolus vulgaris), foi visto que quando deixados embebidos em água por uma noite e depois colocados a 97°C por 7,5 minutos, houve total inativação (ANTUNES e SGARBIERI, 1980). Já com feijão-guandu (Cajanus cajan), observou-se a total redução utilizando radiação ultravioleta por 90 minutos e aquecimento dos grãos embebidos em água por 5 minutos a 100°C (MULIMANI & PARAMJYOTHI, 1993).
2.1.2.2.4 Aplicações
Os inibidores de tripsina já foram estudados quanto ao seu papel no mecanismo de defesa do vegetal, devido sua capacidade de inibir enzimas digestivas de insetos (ARAUJO et al, 2005; GOMES et al, 2005; BHATTACHARYYA et al, 2007). Os inibidores de tripsina da classe Kunitz da planta Pithecellobium dumosum tem maior afinidade com serina peptidases, sugerindo que poderia ser usado no desenvolvimento de controle de pragas, suprimindo o crescimento e a sobrevivência de tais insetos quando incorporados em sua dieta (RUFINO et al, 2012).
Já o papel dos inibidores em modelos de estudos em animais está associado a proteção contra o câncer, por exemplo. Estudos em modelos animais comprovaram que inibidores da classe dos Bowman Birk presente em várias fontes de leguminosas, incluindo soja, ervilha, lentilha e grão-de-bico, pode prevenir ou suprimir substâncias
19 carcinogênicos e processos inflamatórios dentro do trato gastrointestinal. Isso é explicado devido ao importante papel que a serina peptidase apresenta nesses processos e que é fortemente inibida por essa classe de inibidores (CLEMENTE E ARQUES, 2014).
Lima et al (2011) demonstraram uma proteína bactericida isolada de Xanthosoma blandum estruturalmente semelhante com os inibidores da classe de Kunitz apresentavam atividade inibitória para serina peptidases, a proteína foi denominada Xb-KTI e é o primeiro inibidor com atividade antimicrobiana descrito. Do ponto de vista farmacológico, essa nova proteína pode ser utilizada como um medicamento bactericida com a finalidade contornar o problema das bactérias resistentes causado pelo uso desenfreado de antibióticos.
Também dentro do contexto farmacológico, inibidores de proteínas do grupo cisteína-peptidases foram testados quanto ao seu papel de interrupção do desenvolvimento do Plasmodium falciparum, agente causador da malária. Dentre eles, dois inibidores foram eficazes no bloqueio do desenvolvimento do P. falciparum no interior das hemácias, com concentrações semelhantes aos da cloroquina, um antimalárico amplamente utilizado (ROCKETT, 1990).
2.1.2.3 Ureases
2.1.2.3.1 Característisticas estruturais
Ureases vegetais são proteínas homo-oligoméricas, constituídas por trímeros ou hexâmeros de uma única subunidade de aproximadamente 90 kDa (SIRKO & BRODZIK, 2000; FOLLMER, 2008).
2.1.2.3.2 Ação antinutricional e efeito das ureases nos animais
A ingestão de ureases pelos animais implica negativamente dependendo da quantidade, porque a uréase catalisa a ureia em amônio, água, gás carbônico, e amônia. Quanto mais alcalino for o pH do rúmen e maior for a concentração da ureia na dieta maior será a concentração de amônia e amônio no órgão. A problemática está associada ao fato de a amônia alterar a permeabilidade do epitélio favorecendo a passagem de amônia na corrente sanguínea que pode atingir o fígado, e esse excedente de amônia que chega aos hepatócitos bloqueia o ciclo da ureia diminuindo a oferta de ATP para transformação de amônia em ureia (ANTONELLI et al, 2009).
Os animais apresentam sinais logo após a ingestão de dietas ricas em uréases, o primeiro sinal visível é uma marcante hipersensibilidade, que resulta num quadro de
20 inquietude e irritabilidade. Outros sinais são notados como desconforto, apatia, tremores musculares, salivação excessiva, dejeções (fezes e urina) contínua, respiração rápida e difícil, em alguns casos até a convulsão (BELLAVER & SNIZEK, 1999).
2.1.2.3.3 Métodos de inativação
Na alimentação animal, as uréases, são consideradas um fator antinutricional. A soja in natura, por exemplo, apresenta atividade ureática de 2,0 a 2,5 (BUTOLO, 2002). No Brasil as indústrias estabelecem em média valores entre 0,03 e 0,16 para recebimento de farelo de soja. Exigindo assim que a soja seja previamente tratada, podendo ser por processamento de tostagem por tambor rotativo, tostagem por vapor úmido, tostagem por vapor seco, tostagem por “jet sploder”, micronização, extrusão úmida ou seca e microndas (GOLDFLUS, 2001).
2.1.2.3.4 Urease do feijão-de-porco
Quanto as uréases presentes no feijão-de-porco Carlini e Guimarães, (1981) isolaram uma isoforma de C. ensiformis que denominaram canatoxina (CNTX), uma potente proteína neurotóxica, que induz convulsões e morte em camundongos e ratos a partir de administração intraperitoneal e intravenosa. No entanto, vale salientar que a toxina é inativa se administrada por via oral, talvez devido ao baixo pH do estômago. Correspondendo a 0,5% do peso seco das sementes.
2.1.2.3.5 Aplicações da urease do feijão-de-porco
Essa usease, CNTX, já foi descrita com atividade antifúngica em um ensaio de difusão em placa de disco, onde 1 mg de CNTX purificado inibia o crescimento dos fungos fitopatogênicos Macrophamina phaseolina, Sclerotium rofstii e Colletotrichum gloesporioides (OLIVEIRA et al, 1999). Outro estudo para avaliar propriedades antifúngicas de ureases da espécie de feijão-guandu (Cajanus cajan) mostraram inibir o crescimento vegetativo e germinação de Curvularia lunata, Fusarium solani, F. oxysporum, Penicillium herquei, Trichoderma viride, T. pseudokoningii, e Colletotrichum musae e com isso ficou claro que o efeito antifúngico das ureases é claramente específico em relação a espécie, tanto quando da origem de urease e as espécies de fungos. Nem todos os fungos eram suscetíveis e com respostas contrárias até no nível do gênero (BECKER-RITT et al, 2007).
A fim de entender se o papel fisiológico da canatoxina na planta estaria atrelado ao mecanismo de defesa do vegetal, esta proteína foi testada na alimentação de
21 diferentes insetos. A canatoxina foi letal para insetos que continham catepsinas B e D como principais enzimas digestivas, como C. maculatus e R. prolixus. Em contrapartida, insetos com digestão à base de tripsina não foram afetados (CARLINI et al, 1997).
2.1.2.4 Canavanina
2.1.2.4.1 Características estruturais
A canavanina é um aminoácido não-proteico, análogo da arginina, primeiramente isolado por Kitagawa e Tomiyama (1929) a partir da semente de feijão-de-porco, podendo chegar a concentração de até 3,5 % do peso seco da semente. A canavanina difere da arginina apenas por apresentar um oxigênio a mais na sua estrutura (Figura 3).
Figura 3: Estrutura do aminoácido arginina e canavanina.
2.1.2.4.2 Ação antinutricional
Este aminoácido não-proteico apresenta toxicidade para bactérias, insetos e outros invertebrados, que não são capazes de reconhecer a diferença entre os análogos. Já os vertebrados, possuem a enzima tRNA sintetase que é especifica para arginina não reconhecendo a canavanina (CARLINI, 1998).
O caráter antinutricional da canavanina está associado aos animais vertebrados de uma forma indireta, visto que possuem ação contra bactérias a canavanina poderia influenciar a microbiota ruminal de animais poligástricos afetando o seu crescimento e desenvolvimento (SANDOVAL-CASTRO E GÓMEZ, 2001).
Muitas leguminosas apresentam canavanina em suas sementes, frequentemente até o dobro da concentração da Canavalia ensiformis (TSCHIERSCH, 1961; VAN ETTEN, MILLER, WOLFF E JONES, 1961; ROSENTHAL, 1974). Um estudo recente com diferentes espécies de Vicia evidenciaram que a cianamida é biossentizada a partir da canavanina nesses vegetais, que, até então, só era sintetizada a partir de amônia e cloreto de cianogênio. A cianamida é um importante
22 composto para fins agrícolas, que até então só era sintetizado artificialmente, porque serve no solo como um inseticida, fungicida e herbicida um tempo após a aplicação, então se decompõe em uréia no solo e finalmente é absorvido pelas culturas como um fertilizante (KAMO et al, 2015).
Estudos apontaram um declínio na concentração de canavanina ao longo do crescimento da planta, sugerindo que seu papel na semente seja um metabólito de armazenamento de nitrogênio (BELL, 1960; MOTHES, 1961; NAKATU, HARATAKE, SAKURAI, ZYO, NISHIHARA E HAYASIDA, 1964; ROSENTHAL, 1970).
2.1.2.4.3 Aplicações
Conforme mencionado anteriormente, alguns estudos comprovaram que o papel da canavanina também estava associado a proteção dos vegetais quanto ao ataque de insetos, ou seja, provocando a morte desses insetos quando ingeriam Canavalia ensiformis (HEGDEKAR, 1970; VANDERZANT & CHREMOS, 1971; ISOGAI, et al 1973; REHR ET AL 1973; JANZEN, 1975). Um estudo com larva de Manduca sexta, uma espécie de mariposa, criada com uma dieta contento 0,02 % de canavanina resultou em malformação significativa e reduziu as taxas de sobrevivência (DAHLMAN E ROSENTHAL, 1975,; DAHLMAN E JANZEN, 1976). Já uma espécie de besouro Caryedes brasiliensis foi capaz de desenvolver a enzima tRNA sintetase e diferenciar os análogos, de modo que suas larvas não foram afetadas com a ingestão de canavanina (ROSENTHAL et al, 1976).
A canavanina também foi investigada quanto ao seu papel terapêutico anti-câncer in vitro. Células humanas cancerosas foram tratadas com doses baixas de canavanina, levando à ativação das caspase-9, caspase-3 e caspase-7, clivagem da enzima de reparação, poli ADP-ribose polimerase e fragmentação de DNA, que são características típicas da apoptose intrínseca percebida pela via mitocondrial. Esses relatos comprovaram o efeito pró-apoptótico da canavanina e indicaram que pode vir ser utilizada como um coadjuvante no tratamento antineoplásico de alguns tipos de câncer (VYNNYTSKA et al, 2011).
Também foi relatado que a canavanina é capaz de se ligar ao receptor imidazolínico, o qual está envolvido no processo de regulação da secreção de insulina. Ratos com diabetes tipo 1 foram tratados com canavanina e tiveram diminuição da hiperglicemia, sugerindo que o efeito de se ligar a esse receptor melhorou a captação
23 de glicose no músculo esquelético, podendo a canavanina ser, portanto, desenvolvida com um agente para tratar distúrbios de diabéticos no futuro (CHANG et al, 2015).
Além desses componentes isolados da C. ensfiformis apresentarem diversas aplicações na ciência, as sementes de feijão-de-porco veem sendo empregado como adubação verde, técnica na qual empregam-se plantas que produzem grande quantidade de biomassa e que sejam ricas em nutrientes. Normalmente, são utilizadas leguminosas devido sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico quando associadas a rizóbios. A técnica consiste em plantar o feijão-de-porco em consórcio ou rotação com a cultura de interesse econômico, principalmente milho, café ou citrus, no qual o feijão-de-porco é roçado e os resíduos decompõem-se fornecendo os nutrientes e melhorando a qualidade do solo (BARRADAS,2010).
A Tabela 2 elucida de maneira resumida os principais efeitos dos componentes antinutricionais do feijão-de-porco citados anteriormente.
Tabela 2: Efeitos dos fatores antinutrionais do feijão-de-porco em animais monogástricos e poligástricos.
Efeitos dos compontentes do feijão-de-porco em animais monogástricos e poligástricos
Concanavalina A
Interfere na digestão e absorção dos nutrientes; Aumento do tamanho e peso do intestino delgado; Facilita a adesão da Salmonella typhimurium a parede do
intestino;
Graves lesões renais; Atrofia muscular; Morte.
Inibidores de tripsina
Alterações metabólica no pâncreas; Exagereda perca fecal;
Prejuízo no crescimento dos animais. Ureases
Afeta o ciclo da ureia diminuindo a oferta de ATP;
Inquietude, irritabilidade, desconforto, apatia, tremores musculares, salivação excessiva, dificuldade de respirar e convulsão.
Efeito em animais monogástricos e poligástricos Efeitos dos compontentes do feijão-de-porco em animais poligástricos
Canavanina Possível alteração na microbiota do rúmel de animais poligástricos, devido sua ação anbacteriana.
2.2 Fermentação em Estado Sólido
A Fermentação em Estado Sólido (FES) é um processo biológico que consiste no crescimento de microrganismos sobre uma matriz sólida, com ausência ou quase
24 ausência de água livre visível. A quantidade de água é o suficiente apenas para o metabolismo celular (MILTCHELL et al, 2000).
As bactérias, leveduras e fungos filamentosos podem ser utilizadas na FES. Entretanto, os mais adaptados a este processo são os fungos filamentosos, como por exemplo, Rhizopus, Trichoderma, Penicillium ou Aspergillus (PINTO et al 2003). Os fungos são capazes de crescer em baixos valores de atividade de água e o próprio modo de crescimento dos fungos gera uma vantagem sobre os microrganismos unicelulares. A penetração das hifas nas partículas sólidas aumenta o contato e a disponibilidade dos substratos macromoleculares, bem como a assimilação e metabolização dos nutrientes (DEL BIANCHI et al 2001).
A FES apresenta várias diferenças básicas da Fermentação Submersa (FS) e as principais estão listadas na Tabela 3.
Tabela 3: Principais diferenças entre FES e FS (MITCHELL; LONSANE, 1992). Fermentação em Estado Sólido Fermentação Submersa Meio de cultivo sem fase líquida Meio de cultivo com fase líquida
Substratos insolúveis em água Substratos solúveis em água Água presente apenas o suficiente para o
crescimento do micro-organismo Grande quantidade de água A absorção de nutrientes ocorre a partir do
substrato sólido umedecido
Ocorre a absorção de nutrientes dissolvidos no líquido
Presença de gradientes de calor, nutrientes, produtos e O2
Calor, nutrientes, produtos e O2 uniformemente distribuídos Fase líquida descontínua Fase líquida contínua
Maiores concentrações de inóculo Menores concentrações de inóculo Aeração disponibiliza O2 e remove calor
metabólito e os produtos gasosos
Aeração disponibiliza O2 e remove produtos gasosos
Agitação facultativa Agitação geralmente essencial Produtos mais concentrados Produtos menos concentrados
O crescimento fúngico envolve penetração de hifas no meio de cultivo
O crescimento fúngico ocorre em forma de micélios individuais ou em aglomerados uniformemente distribuídos no meio agitado Bactérias e leveduras crescem aderidas ao
meio de cultivo
Bactérias e leveduras crescem
25 2.2.1 Fatores que afetam a FES
De todos os fatores que influenciam a FES, a água apresenta papel de maior relevância, dado seu alto grau de influência mútua com a fase sólida (GERVAIS E MOLIN, 2003). Além da granulometria dos sólidos, temperatura, transferência de calor do processo, pH, concentração de nutrientes e inóculo utilizado (GUTIERREZ; FAVELA- TORRES; CORDOVA-LOPES, 1998; PANDEY, 2002).
2.2.1.1 Atividade de água e umidade
A umidade inicial do cultivo é o primeiro passo do processo a ser definido e depende das características da matéria-prima escolhida. O emprego de uma umidade muito alta pode ter como efeito baixa porosidade e difusão dos gases, aumento do risco de contaminação por bactérias e formação de micélios aéreos. Em contrapartida, níveis de umidade baixos podem levar a menor crescimento do microrganismo e subutilização da matéria prima (SATO; SUDO, 1999).
A definição de atividade de água é a razão da pressão vapor água do substrato e a pressão do vapor da água pura, em determinada temperatura (ORIOL et al, 1988). A ideia de atividade de água foi introduzida na microbiologia com a finalidade de diferenciar a fração de moléculas de água do meio que está de fato disponível para o microrganismo, da umidade total (BHARGAV et al, 2008). A atividade de água limita o crescimento e metabolismo dos microrganismos crescendo na FES. Algumas bactérias só se desenvolvem em alta Aw (em torno de 0,98). Em contrapartida,
diversos fungos filamentosos só param seu crescimento em valores de atividade de água inferiores a 0,62. Assim sendo, atividade de água afeta diretamente o crescimento microbiano e a síntese de metabólitos (ORIOL et al, 1988).
2.2.1.2 Granulometria dos sólidos
A granulometria dos sólidos deve ser definida de acordo com cada matéria-prima empregada no processo. Como, na maioria das vezes são resíduos e ou coprodutos agroindustriais, normalmente é necessário que sejam submetidos a um processo de moagem e tamisação para definir a melhor faixa granulométrica para o microrganismo escolhido. O emprego de partículas muito finas pode acarretar compactação do meio e consequentemente um prejuízo na transferência de oxigênio. Em contrapartida, processos com partículas maiores reduzem a superfície de contato microrganismo/substrato podendo levar a diminuição no rendimento do processo.
26 Logo, o tamanho da partícula deve ser estudado exclusivamente para casa processo, levando em consideração o microrganismo e a matéria-prima que será empregada (PANDEY et al, 1999).
2.2.1.3 Temperatura e transferência de calor
A temperatura inicial é a mesma em todo o biorreator, no entanto, com reações metabólicas dos microrganismos durante o crescimento é gerado calor que precisa ser disseminado para evitar danos celulares (GHILDYAl et al, 1994; MITCHELL; LOSANE, 1992; MITCHELL et al, 1999; RAGHAVARAO; RANGANATHAN; KARANTH, 2003). Controlar a transferência de calor durante um bioprocesso tem sido indicado como uma das maiores dificuldades de escalonamento da FES (MITCHELL et al, 1999; SAUCEDO-CASTANEDA et al, 1992).
Na tentativa de solucionar esse problema algumas medidas são adotadas: Biorreatores de leito fixo, com aeração forçada; Aeração forçada com ar seco para remover calor por evaporação; Aeração forçada com ar úmido para remover calor por condução; Resfriamento da superfície externa do biorreator (PALMA, 2003).
2.2.1.4 pH
Normalmente a matéria-prima utilizada na FES tem propriedades distintas e devido a isso o pH do meio pode variar muito. Como o processo é conduzido todo em meio sólido torna-se difícil o monitoramento do pH. Entretanto, os fungos filamentosos, habitualmente empregado na FES, costumam tolerar uma larga faixa de pH, embora seu rendimento seja, em geral, melhor entre 5-7(PANDEY, 2003).
2.2.1.5 Inóculo
A concentração de inóculo empregado na FES deve ser otimizada. Um processo conduzido com fungos filamentosos com baixas concentrações de esporos pode levar a contaminação bacteriana, por outro lado, concentrações elevadas podem esgotar os nutrientes do meio de cultivo (ARAÚJO, 2004).
2.2.2 Vantagens e desvantagens da FES
Algumas das vantagens da FES sobre a Fermentação Submersa (FS) foram apontadas pelos autores Bramorski (1997) e Lu, Maddox e Brooks (1998).
I. As matérias-primas geralmente são oriundas da agricultura, não necessitando de um pré-tratamento complexo e tendo disponível a maioria dos nutrientes necessários para o metabolismo dos microrganismos;
27 II. No tratamento de efluentes geralmente todo o resíduo é aproveitado para fermentação, resolvendo a questão de descarte de resíduos ao final do processo, principalmente se for aplicado na alimentação animal;
III. A esterilização do material, geralmente utilizado na fermentação, será menos onerosa por ter menos água no meio;
IV. A área ocupada o processo fermentativo é menor, por ter uma quantidade de água reduzida;
V. A contaminação por bactérias é incomum por necessitarem de altos níveis de atividade de água.
VI. Maior facilidade de aeração entre o substrato; VII. Maior difusão dos gases oxigênio e carbônico;
VIII. O material remanescente desse processo normalmente não apresenta condições de desenvolvimento de patógenos;
IX. Normalmente só é necessário adicionar água para iniciar a FES; X. É possível obter esporos;
XI. Equipamentos de menor custo;
XII. Menor gasto com energia durante o processo.
Esses mesmos autores também relataram algumas desvantagens da FES: I. Limitação de microrganismos que podem ser empregados;
II. Dificuldade de remover calor do meio, em grande escala;
III. Matéria-prima de maior granulometria pode atrapalhar a transferência de oxigênio;
IV. Medição de pH, O2, CO2 e cálculo de rendimentos são dificultados;
V. Dificuldade no controle da temperatura no meio;
VI. Dificuldade de homogeneização dos nutrientes e produtos, em relação a FS; 2.2.3 Aplicações da FES
A FES vem sendo aplicada para produção de compostos com valor agregado, tais como enzimas e outros metabolitos; enriquecimento proteico, e destoxificação de resíduos por meio de eliminação de substancias indesejáveis (RAIMBAULT, 1998; PANDEY, 2003).
2.2.3.1 Produção de enzimas
Umas das finalidades da FES é a produção de compostos de alto valor agregado entre eles estão as enzimas de interesse comercial (JOO et al, 2003). Com esse
28 objetivo Chahal (1985) aumentou o rendimento de celulase em 72% por meio da FES, empregando Trichoderma reesei em palha trigo. Com o mesmo propósito Gombert (1999) avaliou diferentes suplementações na FES com resíduo de babaçu, e Penicillium restrictum foi capaz de produzir 30,3 U/g de lipase em apenas 24h de cultivo.
A indústria de alimentos também gera muitos resíduos que podem ser aproveitados em processos de FES. Li et al, (2015) utilizou casca de laranja e farelo de trigo com Aspergillus japonicus PJ01 para produzir pectinase, CMCase e xilanase, após 72h de cultivo esse microrganismo produziu 966, 58 e 1004 U / gramas de substrato seco, respectivamente.
Além da produção das enzimas de interesse comercial, Oliveira et al (2017) estudaram o melhoramento da torta de dendê por FES para uma futura aplicação como ração animal. A produção de lipase reduziu os teores de lipídios da torta até níveis aceitáveis para alimentação animal, e a produção de xilanases reduziu o teor de fibras do material aumentando a digestibilidade da torta.
Entres as enzimas produzidas por FES, estão as peptidases, que podem ser obtidas por meio de microrganismos, plantas e animais. Industrialmente são produzidas por microrganismos em cultivo submerso (WISEMAM, 1991). A tabela 4 exemplifica algumas peptidases, suas origens e respectivas aplicações.
29 Como pode ser observado na tabela 3, fungos filamentosos são amplamente utilizados na produção dessas enzimas, as quais também podem ser obtidas empregando FES. Germano et al (2003) utilizou farelo de soja desengordurado para otimizar a produção de peptidase utilizando uma cepa de Penicillium sp., e alcançou uma atividade máxima de 55 U/g em 48h de cultivo a 28°C. Paranthaman et al (2009) testou resíduos diferentes cultivares de arroz utilizando a cepa de A. niger para produção de peptidases, e a maior atividade foi em 67,7 U/g em 96h de cultivo a 35°C, e menor de 44,7 U/g nas mesmas condições. Outros microrganismos também podem produzir peptidases em FES como o descrito por PRAKASHAM, 2006 onde uma cepa de Bacillus sp. produziu 3500 U/g de atividade de peptidase alcalina tendo casca de grama verde como matéria-prima.
2.2.3.2 Enriquecimento proteico
Entre as propostas da FES, está listado o enriquecimento proteico, normalmente sendo empregado os resíduos agroindustriais que apresentam em sua composição proteínas que são consideradas de baixa qualidade ou incompletas, por não apresentarem níveis apropriados de determinados aminoácidos essenciais (SGARBIERI, 1996).
Joshi & Sandhu (1996) estudaram o enriquecimento proteico do bagaço da maçã por FES utilizando três diferentes leveduras, Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis e Torula utilis. Para as três espécies de leveduras, os autores observaram um aumento de três vezes mais do teor de proteína bruta, duas vezes mais de gordura e vitamina C além dos minerais, fibras e cinzas. Regina et al (2005) também com o mesmo objetivo, avaliaram o bagaço do pedúnculo de caju com a utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae, para a produção de uma ração animal alternativa, rica em proteínas. Com essa mesma finalidade Shojaosadati et al (1999) estudaram o enriquecimento da polpa da beterraba, farelo de trigo e resíduo de citrus através de FES utilizando o microrganismo Neurospora sitophila, visando utilizá-los como alimentação animal. Para os três substratos, após 5 dias de fermentação, alcançaram um aumento de 15% da polpa de beterraba, 13% do farelo de trigo e 7% do resíduo de citrus.
2.2.3.3 Destoxificação de resíduos
A destoxificação dos resíduos é aplicação da FES na qual normalmente são empregados os resíduos agroindustriais. Em países em desenvolvimento são
30 produzidos milhares de toneladas ao ano desses resíduos, tornando-os um problema ambiental (NIGAM;GUPTA;ANTHWAL,2009; SALIHU et al, 2012).
Com o beneficiamento do cacau há uma grande geração de farelo de cacau, o qual tem seu uso limitado na alimentação animal devido a presença de metilxantinas, que podem causar prejuízos nutricionais aos animais. Em função disso, Amorim (2017) estudou a redução das metilxantinas, por FES, utilizando Aspergillus awamori e alcançou a redução de 67% teobromina e 63% cafeína. Além disso, o fungo produziu xilanase concomitantemente, chegando a 72 U / g após a otimização do processo. Dentro desse mesmo contexto Brand et al (2000) estudaram desintoxicação biológica da casca de café em FES usando cepas de Rhizopus sp, Phanerochaete sp, e Aspergillus sp. para remover compostos antinutricionais com intuito de aplicar como ração animal. Utilizando Rhizopus sp., em 6 dias de fermentação, os autores relataram uma redução de 87% de cafeína e 65% de taninos, com Phanerochaete sp uma redução de 70,8 % de cafeína e 45% de taninos em 14 dias. Já com Aspergillus sp, foi obtida uma melhor redução: 92% de cafeína e 65% de taninos em 108h de cultivo. E também Godoy et al (2009) utilizaram rejeito tóxico de mamona como substrato para FES utilizando o fungo filamentoso Penicillium simplicissimum e os níveis de ricina foram reduzidos 100% após 72h de fermentação (Patente sob registro PI0703290-0, concedida em 20/12/2016). Igualmente, Madeira et al (2011) desintoxicaram a torta de mamona por FES utilizando Paecilomyces variotii, e concomitantemente conseguiram alta produção de fitases e tanases. Com a mesma finalidade mas usando bactérias Orozco et al (2008) usaram três actinobactérias em polpa de café, resíduo oriundo da produção de grãos de café e os autores descobriram que as bactérias foram capazes de degradar os polifenóis, taninos, ácidos clorogênicos e cafeína, e simultaneamente aumentar o teor de proteína da polpa de café. A concentração inicial de proteínas na polpa de café foi de 10,5%, e depois da fermentação com Streptomyces chattanoogensis, S. UAH 47 e S. UAH Nic-C, este conteúdo aumentou para 15,1%, 14,0% e 14,9%, respectivamente.
O processo de destoxificação por FES frequentemente permite a redução ou eliminação de compostos indesejáveis, tornando o resíduo agroindustrial apropriado para outros usos, como ração animal, por exemplo (PANDEY, 2000; BON, 2008; HOLKER,2005).
31 2.3 Alimentação animal
A Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO, 2006) estima que o entre 2000 e 2050 consumo total de carnes aumentará 102%, isso em números reais implicará no consumo de 233 milhões de toneladas de carne. O estudo levou em consideração a taxa de crescimento e consumo de cada continente.
O custo com alimentação animal pode chegar a 70% do custo total da criação de animais de corte. Uma das estratégias do setor tem sido utilizar resíduos da agroindústria a fim de reduzir estes custos totais (LINHARES; JÚNIOR, 2008).
As rações destinadas a animais monogástricos, como aves, suínos, por exemplo, são, principalmente, a base de milho e a soja. E este mercado vem apresentando um crescente aumento. A produção nacional de frangos no ano de 2017 foi de 13.150 mil toneladas, desses, 3.847 mil toneladas foram para exportação, colocando o Brasil em primeiro lugar em exportação de aves e o segundo maior produtor. Quanto a bovinos, em 2017, o Brasil foi maior exportador com 1.950 mil toneladas, e segundo maior produtor com 9.470 mil toneladas (USDA - Foreign Agricultural Service). Consequentemente a produção de ração para alimentação animal também cresceu. O Brasil bateu o recorde na safra 2016/2017 com uma produção de 238 milhões de toneladas de grãos destinados a alimentação animal, soja e milho, principalmente (Companhia Nacional de Abastecimento). Segundo os números divulgados pela Agência Embrapa de Informação Tecnológica (AGEITEC), o uso do milho em grão destinado a alimentação animal representa a maior parte do consumo desse cereal, cerca de 60% a 80%.
Os ruminantes possuem a vantagem de serem capazes de degradar as fibras (celulose e hemicelulose) das quais animais monogástricos não são capazes de degradar. Sendo assim, torna-se interessante aproveitar essa característica dos poligástricos para se alimentarem de insumos que não são destinados a alimentação humana, evitando a competição (ZAMBOM et al 2008).
Os animais não possuem a capacidade de sintetizar todos os aminoácidos necessários para seu crescimento e desenvolvimento. Por isso, é necessário que alguns sejam ingeridos na sua dieta, estes são chamados de essências (Tabela 5).
32 Tabela 5: Aminoácidos essenciais e não-essenciais.
Aminoácidos essenciais Aminoácidos não essenciais
Arginina (Arg) Alanina (Ala)
Histidina (His) Ácido aspártico (Asp) Isoleucina (Ile) Glutamato (Glu)
Leucina (Leu) Glicina (Gly)
Lisina (Lys) Prolina (Pro)
Metionina (Met) Serina (Ser)
Fenilalanina (Phe) Tirosina (Tyr) Treonina (Thr)
Valina (Val)
Dentro do contexto de alimentação animal, existem os aminoácidos denominados de limitantes. Como o nome sugere, são os aminoácidos que limitam o crescimento e desenvolvimento máximo do animal. A Tabela 6 aponta alguns dos aminoácidos limitantes de alguns animais.
Tabela 6: Aminoácidos limitantes para diferentes grupos animais (GABBI, 2010). Espécie/ Categoria Aminoácidos limitantes
Vacas leiteiras de alta produção
Lisina, Metionina
Suínos em crescimento
Lisina, Treonina, Triptofano, aas sulfurados
Frango de corte Metionina, Cisteína, Lisina Equinos de corridas Leucina, Isoleucina e Valina
A indústria de alimentação animal está procurando o uso de substratos antes inexplorados como ingredientes em formulações de rações, com a finalidade de diminuir custos. No caso de resíduos de hortaliças e frutas, o uso mais lógico é como ração animal. Apesar disso, em certas ocasiões, a baixa quantidade e a qualidade das proteínas ou o alto teor de fibras podem limitar essa aplicação. A presença de compostos antinutricionais como taninos, fenólicos e cafeína também pode representar um problema, embora a maior parte desses fatores possa ser reduzida ou inativada com alguma forma de tratamento. Outra possibilidade é adição de nutrientes como vitaminas, suplementos ou enzimas a matérias-primas nutricionalmente carentes, mas isso implicará no aumento dos custos finais da ração (ULLOA,2004).
33 2.3.1 Uso do feijão-de-porco em alimentação animal
Devido a presença dos fatores antinutricionais o feijão-de-porco não é aplicado diretamente na alimentação animal. No entanto já foram feitos alguns testes de tolerancia a ingestão de sementes de feijão-de-porco na proporção de 2,5; 5 e 10% na dieta de pinto de 6 semanas em um período de 15 dias, apenas na proporção de 10% o consumo de ração e ganho de peso dos animais foram reduzidos (MENDEZ et al,1997).
34 3. OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Eliminar os compostos tóxicos/antinutricionais do feijão-de-porco (Canavalia ensiformis) por Fermentação em Estado Sólido (FES) utilizando fungos produtores de peptidases.
3.2 Objetivos específicos
a) Selecionar fungos GRAS (Geralmente Reconhecido como Seguro) capazes de crescer no feijão-de-porco por FES;
b) Avaliar a produção de peptidases pelos fungos selecionados; c) Avaliar a presença da Con A antes e após o processo de FES;
d) Avaliar a atividade dos inibidores de tripsina antes e após processo de FES; e) Avaliar a presença da canavanina antes e após o processo de FES.
35 4. MATERIAIS E METÓDOS
4.1 Materiais
4.1.1 Componentes do meio de propagação
Os reagentes utilizados na formulação dos meios de cultura e seus respectivos fornecedores encontram-se listados na Tabela 7.
Tabela 7: Componentes do meio de cultivo e fornecedores.
Reagente Fornecedor
Ágar Vetec
Potato Dextrose Ágar (PDA) Sigma Aldrich
4.1.2 Matéria-prima
Como matéria-prima para FES foram utilizadas sementes de feijão-de-porco (Wolf Seeds), que foram moídas em moinho de disco e submetidas a um processo de separação granulométrica em peneiras possuindo malhas com variação de 0,42 a 2,8 mm.
4.1.3 Reagentes
Na Tabela 8 estão listados os principais reagentes utilizados nos ensaios analíticos e os respectivos fornecedores.
Tabela 8: Listagem dos produtos utilizados nas análises e fornecedores.
Reagentes Fornecedor
Azocaseína Sigma Aldrich
Concanavalin A Sigma Aldrich
Hidróxido de amônio Vetec
L-Canavanine Sigma Aldrich
N-benzoil-L-arginil-p-nitroanilida Sigma Aldrich
Nitroprussiato de sódio Sigma Aldrich
Persulfato de amônio Sigma Aldrich
Pierce 660nm Protein Assay Thermo Scientific
4.1.4 Equipamentos
Os principais equipamentos utilizados e seus respectivos fabricantes estão apresentados na Tabela 9.
36 Tabela 9: Principais equipamentos utilizados e seus respectivos fabricantes:
Equipamentos Fornecedor
Balança analítica Mettler
Espectrofotômetro UV/VIS Shimadzu LC-10AD
Balança de umidade AND
Medidor de atividade de água Aqualab Decagon
Câmara de fluxo laminar Elzividros
Câmara Climática Forlab
Akta Explorer GE
Estufa para incubação Fabbe-Primar
Microcentrífuga Novatecnica
Centrífuga Sorval
Sistema de Eletroforese Bio-rad
4.2 Métodos
4.2.1 Análise centesimal do feijão-de-porco 4.2.1.1 Proteína bruta
Cerca de 0,2 g da amostra seca e desengordurada foi colocada em digestor com ácido sulfúrico e catalisador à temperatura de 370ºC durante 7 horas e depois colocado em destilador Kjeldhal. A amostra, após a digestão, foi destilada e recolhida em solução de ácido bórico 2% (m/v). Esta foi titulada com HCl 0,04N, até ficar incolor, utilizando uma mistura indicadora. O teor de proteínas calculado foi determinado em porcentagem (%) (AOAC, 1990).
4.2.1.2 Lipídios
Para determinar o teor de lipídios da amostra, um balão de fundo chato foi previamente pesado depois de 1 h/105°C e resfriado em dessecador com vácuo. Foram adicionados 150 mL de éter de petróleo no balão, 5 g de amostra no cartucho de extração e tampado com algodão depois disso, o cartucho e balçao foram acoplados a um sistema de Soxhlet. Foi feita a lavagem das amostras por 6 h. A massa de lipídios da amostra corresponde à diferença entre a massa do balão após a extração e o balão vazio (AOAC, 1990).
4.2.1.3 Material mineral
O material mineral da amostra foi determinado utilizando cadinhos de porcelana previamente tarados após 1 hora/550 °C e resfriados em dessecador com vácuo. Foi utilizado 1 g de amostra de feijão in natura que foram mineralizadas em uma mufla 6 horas/550 °C em seguida resfriadas em um dessecador com vácuo e pesadas. O teor
37 de material mineral corresponde à diferença entre a massa do cadinho contendo a amostra e o cadinho vazio (AOAC, 1990).
4.2.1.4 Matéria seca
Para determinação de matéria seca da amostra, 2 g foram pesados em papel de filtro previamente tarados e adicionados em uma estufa a 105°C por 6 horas. Em seguida resfriado em dessecador com vácuo e pesados. A matéria seca corresponde à diferença entre massa do filtro contendo a amostra e o filtro de papel (AOAC, 1990). 4.2.1.5 Análise de fibras
Foram feitas análises de Fibras em Detergente Neutro (FDN) e Fibras em Detergente Ácido (FDA). Em neutro são quantificados celulose, hemicelulose, lignina e nitrogênio ligados a fibra. Em detergente ácido, lignocelulose.
Foram adicionados 100 mL, nos frascos com os cadinhos, de solução neutra de (Na0H–1,25%) a temperatura ambiente e 250 ul da enzima de alfa-amilase termoestável (Total Dietary Fiber Assay Kit - Sigma), com a finalidade de inativar possíveis enzimas contaminantes que possam degradar o material fibroso. Em seguida, os frascos foram levados para autoclave (0,5 atm/1 h). Posteriormente os cadinhos foram retirados da autoclave e lavados novamente em água destilada com temperatura superior a 90°C e acetona para remoção do detergente. Os cadinhos foram colocados na estufa sem ventilação a 60°C por 24 horas e na sequência por mais 2 horas em estufa sem ventilação a 105°C, e acondicionados em dessecador para igualar a temperatura ambiente e foram pesados em balança analítica de precisão 0,0001g. Para FDA utilizado foi o uma solução ácida (H2SO4 – 1,25%). (VAN
SOEST&ROBERTSON, 1985). 4.2.2 Microrganismos
Foram utilizadas cepas de Aspergillus awamori e Aspergillus oryzae, pertencente à cultura do Laboratório de Biotecnologia Microbiana (LaBiM IQ/UFRJ). Os fungos selecionados foram Aspergillus oryzae e Aspergillus awamori por serem descritos como produtores de peptidases (SANDHYA, 2005; NEGI, 2006).
4.2.2.1 Obtenção do inóculo
O inóculo foi obtido por propagação em 7 dias de cultivo a 30 °C no meio PDA (Potato Dextrose Agar). Os esporos foram raspados, suspensos em tampão fosfato de sódio (100mM, pH 7,0) e contados em câmara de Neubauer (FREIRE, 1996).
