Theileria equi E PIROPLASMOSE EQUINA. Alice Corrêa Santos Rodrigo Casquero Cunha Guilherme Borges Weege Ana Muñoz Vianna

Theileria equi

E PIROPLASMOSE EQUINA

Alice Corrêa Santos

Rodrigo Casquero Cunha

Guilherme Borges Weege

Ana Muñoz Vianna

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Alice Corrêa Santos

Rodrigo Casquero Cunha

Guilherme Borges Weege

Ana Muñoz Vianna

Theileria equi

E PIROPLASMOSE EQUINA

Editora Santa Cruz

2020

4 Ficha catalográfica

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Autores

Me. Alice Corrêa Santos Dr. Rodrigo Casquero Cunha Me. Guilherme Borges Weege Dra. Ana Muñoz Viana

Organizador

Alice Corrêa Santos

Comissão editorial

Professor Dr. Leandro Quintana Nizoli Professor Ph.D. Fábio Pereira Leivas Leite Dra. Neida Lúcia Conrad

7

P

A piroplasmose equina é uma das principais enfermidades parasitárias que acometem equinos, sendo responsável por grandes perdas econômicas e restrições no mercado equestre internacional. Theileria equi é um dos agentes etiológicos da doença, caracterizado por causar uma apresentação clínica mais severa e manter portadores assintomáticos no rebanho. Sua ocorrência está diretamente ligada às regiões de clima subtropical, propícias ao desenvolvimento de seu vetor, o carrapato.

A região Sul do Rio Grande do Sul possui um grande número de criatórios de equinos da raça Crioula, além disso, tem proximidade de Bagé, o maior berço da raça Puro Sangue Inglês do Brasil, o que nos coloca em posição privilegiada para os estudos com a espécie equina. Além de divulgar uma das linhas de pesquisa de nosso grupo na Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), este livro tem como objetivo compilar informações relevantes a respeito de Theileria equi, atendendo a criadores e estudantes dos cursos de graduação e pós-graduação em Medicina Veterinária.

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S

Etiologia ... 11

Ciclo de vida ... 15

Aspectos epidemiológicos ... 19

Apresentação Clínica da Infecção por Theileria equi .... 23

Resposta Imunológica a Theileria equi ... 27

Métodos de Diagnóstico ... 31

Vacinas na profilaxia de Theileria equi ... 35

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E

Theileria equi é um protozoário pertencente ao Filo

Apicomplexa, sendo um parasito intracelular obrigatório. Juntamente com Babesia caballi, são causadores da piroplasmose equina, uma infecção parasitária mista e bastante complexa. Quando T. equi é o único agente causador da infecção, a doença é denominada teileriose. A piroplasmose recebeu este nome devido ao do formato piriforme que ambos os parasitos apresentam quando estão infectando hemácias.

Diferente de B. caballi, que apresenta apenas a forma intraeritrocitária, T. equi desenvolve-se inicialmente em linfócitos, infectando num segundo momento as hemácias – característica comum ao gênero Theileria sp. Outra particularidade de T. equi em relação a B. caballi é a sua divisão em quatro merozoítos nos eritrócitos, formando o corpúsculo patognomônico com formato de Cruz de Malta. Uma das características mais importantes que diferencia T. equi de B. caballi é que, uma vez infectado, após a fase aguda, o animal torna-se um

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reservatório da doença e, na maioria dos casos, portador assintomático.

Os vetores conhecidos de T. equi são os carrapatos ixodídeos, principalmente dos gêneros Rhipicephalus,

Amblyomma, Haemaphysalis e Hyalomma. É possível

que haja transmissão através de outros vetores invertebrados, como os tabanídeos, entretanto, até o presente momento, não foram encontradas evidências científicas para essa hipótese. Os equídeos são os únicos reservatórios de T. equi conhecidos e, mesmo em animais com parasitemia baixa, é possível que, no repasto sanguíneo, o carrapato seja infectado.

A parasitemia varia em torno de 1 a 7% de hemácias infectadas. Uma vez infectado, o equino torna-se portador e os tratamentos empregados provocam a remissão dos sinais clínicos, porém, nem sempre eliminam o parasito. Equinos portadores são os principais responsáveis pela manutenção da doença nos rebanhos e, como atualmente o controle de vetores não é satisfatório, a melhor maneira de evitar a disseminação da doença é não introduzir animais infectados em áreas livres de T. equi.

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A transmissão de T. equi ocorre pelo repasto sanguíneo do carrapato contendo suas formas infectantes (esporozoítos) que invadem os leucócitos antes de penetrarem nos eritrócitos. A transmissão pode ocorrer de forma transestadial, na qual as larvas ao se alimentarem em equinos portadores se infectam, mantendo os esporozoítos em suas glândulas salivares. Ao mudarem para ninfa, esta se tornará infectada disseminando o parasito. A ninfa dará origem a um adulto também infectado. Deste modo, larvas, ninfas e adultos ao se alimentarem num animal infectado poderão transmitir o parasito a outro animal.

O macho adulto de Rhipicephalus microplus realiza transmissão intraestadial, ou seja, adquire o parasito durante sua alimentação em animais infectados, tanto na fase aguda como na fase crônica da doença, infectando outros animais. A transmissão transplacentária de T. equi já foi relatada, e pode resultar em abortos, natimortos ou no nascimento dos potros com piroplasmose neonatal. Na piroplasmose neonatal, os potros nascem sem sintomatologia clínica, entretanto, 24 - 48 horas após o nascimento começam a demonstrar os primeiros sinais clínicos, como letargia, icterícia intensa, febre e elevada

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parasitemia. Outra forma de transmissão é a iatrogênica, através do uso comum de seringas e agulhas contaminadas, e nas transfusões sanguíneas.

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C

O ciclo de vida de T. equi é bifásico no hospedeiro mamífero, com uma fase de desenvolvimento extraeritrocitária seguida de uma fase intraeritrocitária. A fase extraeritrocitária inclui a infecção de linfócitos B e T e monócitos/macrófagos.

As formas infectantes, esporozoítos, penetram nos leucócitos do hospedeiro vertebrado dando origem a esquizogonia com a formação macroesquizontes e microesquizontes, resultando em aproximadamente 200 merozoítos por célula infectada. Após, os merozoítos penetram nos eritrócitos, tornam-se globosos e iniciam a divisão por fissão binária (merogonia), originando as formas piriformes, que podem agrupar-se pela porção apical em quatro formando a “Cruz de Malta”.

Depois da ruptura do eritrócito, os merozoítos penetram em novos eritrócitos, no entanto, algumas destas formas tornam-se ovoides e são consideradas gametócitos, dando início a fase de gametogonia. Após a

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ingestão dos eritrócitos pelo carrapato, os gametócitos crescem rapidamente, formano microgametas e macrogametas que se fundem formando o zigoto que se diferencia na forma móvel chamada cineto. O cineto é móvel e migra através da hemolinfa até as glândulas salivares dos carrapatos.

A esporogonia inicia-se com a penetração dos cinetos nas glândulas salivares dos carrapatos dando origem aos esporoblastos e, por fim, aos esporozoítos que serão inoculados juntamente com a saliva quando o carrapato iniciar seu repasto.

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FIGURA 1. Representação esquemática do ciclo de vida de T. Equi. Adaptado de SCOLES E UETI (2015).

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A

Theileria equi é um parasito de grande importância

epidemiológica, sobretudo em regiões tropicais e subtropicais, com prevalência variando entre 15% e 100%, diretamente relacionada à distribuição de carrapatos aptos a transmitir o agente. O Brasil, em razão das condições climáticas, é considerado área endêmica para T. equi.

A Figura 2 apresenta dados da distribuição mundial de piroplasmose equina referente ao primeiro semestre de 2019 de acordo com as notificações recebidas pela Organização Mundial da Saúde Animal (OIE). Nesta, destaca-se a América do Sul como o principal continente em ocorrência da doença.

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FIGURA 2. Ocorrência de piroplasmose equina nos diferentes continentes de janeiro a junho de 2019, segundo dados da Organização Mundial da Saúde Animal (OIE).

A Organização Mundial da Saúde Animal (OIE) inclui a piroplasmose equina na lista de doenças de notificação obrigatória, e existem restrições de tráfego internacional para equinos positivos. Para ingressar em países livres da doença, existe a obrigatoriedade de sorologia negativa, o que pode restringir a participação de animais em competições e até mesmo o comércio internacional de equinos.

No Rio Grande do Sul, em um estudo epidemiológico utilizando imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos anti-T. equi relatou-se soroprevalência em torno de 57,9%. Altas prevalências de

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equinos e bovinos. Esta relação sugere que, pelo menos no Brasil, R. microplus, principal carrapato de bovinos e em muitas áreas o único encontrado também em equinos, desempenha um papel importante na transmissão do parasito.

Equinos criados separadamente de bovinos apresentam soropositividade para T. equi em torno de 12%, já os criados no mesmo ambiente apresentam sorologia positiva de 81%. Nos equinos criados em conjunto com bovinos, normalmente são encontrados apenas carrapatos R. microplus, sugerindo a importância destes na transmissão da enfermidade.

Os portadores assintomáticos são uma das principais fontes de infecção. Muitas vezes o equino é portador de T. equi sem apresentar sintomatologia clínica, entretanto, mesmo que em baixos níveis, o parasito está circulante e outros animais podem ser infectados pelas diversas formas de transmissão citadas anteriormente.

Os aspectos epidemiológicos envolvidos na teileriose demonstram que essa é uma doença de difícil controle, sobretudo no Rio Grande do Sul, onde é comum a criação de bovinos juntamente com equinos. Cabe ressaltar que o diagnóstico de teileriose a campo não é

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uma prática comum, o que dificulta o mapeamento da doença. Nesse contexto, e considerando que ainda não existem vacinas específicas no mercado, o desenvolvimento de uma formulação vacinal eficaz contra esta doença é necessário e acredita-se que seja uma alternativa a longo prazo para a profilaxia da infecção por

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A

C

I

T

A infecção pode manifestar-se clinicamente de três formas: aguda, subaguda e crônica. Ainda, uma forma hiperaguda rara pode ocorrer, em que os animais vão a óbito sem apresentar sinais clínicos prévios tem se tornado relevante nos últimos anos.

A doença aguda caracteriza-se por febre intermitente, anorexia moderada, mal-estar, decúbito frequente, desidratação, mucosas congestas, taquicardia, taquipnéia, sudorese, edema, anemia, icterícia, e hemoglobinúria , podendo ocorrer a morte dos animais se não tratados adequadamente. Também são descritos envolvimento gastrointestinal, onde observam-se sinais de cólica, enterite catarral e diarreia. Em casos mais graves podem ocorrer insuficiências renal e hepática.

Na manifestação subaguda podem ocorrer diferentes graus de anorexia, perda de peso, febre intermitente, anemia normocítica e normocrômica,

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edema de membros, queda de desempenho, taquicardia e taquipnéia. As mucosas variam entre rosa pálido ou amarelo pálido, com petéquias e equimoses ocasionais. Pode ocorrer cólica intermitente e constipação seguida por diarreia. A urina pode ser amarela escura, alaranjada, marrom ou vermelha, dependendo do grau de hemoglobinúria.

Apesar da gravidade da doença aguda, a maioria dos animais desenvolve a forma crônica, a qual é descrita por uma série de sinais clínicos inespecíficos, incluindo inapetência leve, baixo desempenho, perda de peso, baixa condição corporal e possivelmente anemia.

Alterações no hemograma de cavalos com infecção crônica podem incluir diminuição na contagem de células vermelhas, plaquetas e concentração de hemoglobina. Já na infecção aguda há neutropenia e linfopenia com possível desvio à esquerda. Em cavalos infectados experimentalmente foi vista eosinopenia e monocitose nas fases iniciais da doença, sendo desenvolvida, posteriormente, linfocitose.

Em éguas prenhes infectadas pode ocorrer a infecção transplacentária, causando aborto ou

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nascimento de potros com teileriose neonatal. Os sinais clínicos nos potros são inespecíficos e podem ocorrer imediatamente após o nascimento ou com 2 - 3 dias de vida. Os sinais clínicos incluem fraqueza e diminuição do reflexo de sucção, podendo progredir para sinais semelhantes aos descritos em adultos. As lesões em fetos abortados incluem anemia, icterícia moderada a grave, petéquias nas superfícies visceral e serosas, hidrotórax, congestão e edema pulmonares, esplenomegalia e hepatomegalia.

É importante ressaltar que nem todos os animais portadores apresentam sintomatologia clínica e, quando apresentam, esta pode se manifestar de distintas formas. Como muitos animais tornam-se portadores crônicos, na prática, observa-se que após episódios de estresse, como transporte, competições ou a ocorrência de outras doenças concomitantes, os animais manifestam a sintomatologia aguda.

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R

I

T

Os mecanismos precisos da imunidade adaptativa para o controle da teileriose equina não são totalmente elucidados, mas possivelmente envolvem respostas humoral e celular. É provável que a maior proteção contra a infecção por T. equi requeira anticorpos e respostas de células T específicas contra os merozoítos nos eritrócitos e, também, contra os esporozoítos em estágios anteriores.

Para controlar a parasitemia é necessário desencadear uma resposta adquirida. Após a lise dos eritrócitos, os parasitos tornam-se acessíveis aos anticorpos e aos mecanismos de imunidade mediados por estes. No entanto, somente altos títulos de anticorpos não são suficientes para desencadear uma resposta imune protetora contra infecções por T. equi. Os anticorpos neutralizam os parasitos bloqueando sua entrada nas células, opsonizam os eritrócitos infectados e, por fim, promovem a lise celular.

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Em animais imunocompetentes, há a produção de anticorpos IgGa (IgG1) e IgGb (IgG4,7) específicos contra merozoítos durante a fase aguda da teileriose equina, enquanto a IgG (T) (IgG5) somente aparece após o controle da parasitemia (fase crônica). IgG1, IgG3, IgG4 e IgG7 ativam o complemento e interagem com receptores de Fc presentes em células imunes e desempenham importante papel na resolução da parasitemia aguda.

Os títulos de anticorpos aumentam gradativamente após a infecção podendo ser detectados em 7-10 dias, dependendo da técnica de imunodiagnóstico utilizada, e atingem o título máximo em 30-45 dias. Após este período o nível de anticorpos cai lentamente atingindo níveis indetectáveis após alguns meses, caso não ocorra reinfecção.

Anticorpos direcionados contra as proteínas de superfície de merozoítos são importantes na imunidade às infecções por T. equi. O reconhecimento deste protozoário pelo sistema imunológico ocorre principalmente pelos antígenos na superfície do merozoito (EMAs - equi merozoite antigen). Esses antígenos são expressos em diferentes estágios do ciclo do protozoário.

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EMA-1 e EMA-2 são expressos em várias etapas; no entanto, EMA-2 é um dos primeiros antígenos a serem reconhecidos pelo sistema imunológico, o que o torna potencialmente útil para o desenvolvimento de ferramentas profiláticas, como vacinas.

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M

D

As infecções por T. equi e B. caballi apresentam sintomatologia muito semelhante e, por isso, não podem ser diferenciadas clinicamente. Contudo o diagnóstico diferencial é importante para o sucesso do tratamento e controle da doença.

A teileriose pode ser diagnosticada pelos sinais clínicos associados a visualização do parasito nos eritrócitos detectados em esfregaços sanguíneos corados por Giemsa. Entretanto, esse método apresenta falhas, como a não detecção do parasito no sangue de animais com baixa parasitemia e a dificuldade na diferenciação do agente causador da piroplasmose, T. equi ou B. caballi, o que pode causar resultados falso-positivos. Outra falha deste método é que devido ao pequeno tamanho, T. equi pode ser confundida com artefatos da técnica de coloração.

Infecções por T. equi têm sido detectadas por ensaios moleculares e sorológicos. Ambos os testes são objetivos e acurados. A detecção de DNA por reação de

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polimerase em cadeia (PCR) convencional tem sido feita utilizando-se como alvo a sequência 18S rRNA de T. equi ou B. caballi. Esse método molecular, no entanto, pode ser falho devido à baixa parasitemia em animais na fase crônica. Normalmente, ensaios moleculares são feitos em conjunto com ensaios sorológicos como a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático de competição (cELISA) ou esfregaços sanguíneos corados por Giemsa.

O teste de fixação do complemento foi muito utilizado por alguns países e, em algumas regiões, ainda é utilizado para qualificar cavalos para importação. É um método preciso para detectar infecções agudas, mas não identifica animais que receberam tratamento com drogas, além disso, a IgG (T), principal classe de imunoglobulina presente na fase crônica, apresenta incapacidade para fixar o complemento.

Os estudos de diagnóstico imunológico para teileriose concentram-se na obtenção de frações antigênicas de proteínas de superfície de merozoítos, devido a sua importância na imunidade às infecções por

T. equi. As sensibilidade e especificidade de testes de

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utilização de antígenos recombinantes contendo frações com maior capacidade de gerar resposta imune (epítopos imunodominantes) e com alta especificidade diminui a ocorrência de reações cruzadas e inespecífica, sendo por isso proposto para a detecção de T. equi.

O cELISA baseia-se na utilização da proteína EMA-1 como antígeno e em um anticorpo monoclonal contra um epítopo da proteína de superfície de merozoíto. O cELISA mostrou-se superior em comparação com a RIFI e o teste de fixação de complemento. Resultados discrepantes entre o cELISA e PCR quantitativo (qPCR) podem ocorrer devido às sequências variáveis do gene da EMA-1, a existência de inibidores de PCR ou à baixa parasitemia.

Em estudos realizados por nosso grupo de pesquisa, a proteína recombinante rEMA-2, expressa pela levedura

P. pastoris, apresentou epítopos que foram reconhecidos

por anticorpos presentes nos soros de equinos naturalmente infectados por T. equi. A partir desses resultados, foi desenvolvido um ELISA indireto utilizando a proteína rEMA-2 como antígeno, este apresentando especificidade de 83,3% e sensibilidade de 90,9%. Também estão em desenvolvimento estudos com a

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proteína de superfície EMA-3 para utilização como antígeno para o desenvolvimento de mais um teste para diagnostico sorológico.

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V

T

Embora a piroplasmose seja uma doença de impacto comercial e tenha importâncias epidemiológica e sanitária, ainda não há uma vacina disponível no mercado. Nosso grupo de pesquisa trabalha com o desenvolvimento de potenciais antígenos de T. equi, que possam ser expressos de forma recombinate para serem utilizados como antígenos no desenvolvimento de testes de imunodiagnóstico, assim como imunógenos vacinais para equinos.

Dados já publicados demonstram que uma vacina utilizando a proteína rEMA-2 adsorvida ao adjuvante hidróxido de alumínio estimulou a produção de IgG total em camundongos e equinos adultos. A mesma vacina utilizada em éguas prenhas estimulou a produção de IgG total, estas éguas concentraram imunoglobulinas vacinais no colostro e os potros provenientes destas apresentaram incremento nos níveis séricos de anticorpos vacinais após

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a primeira mamada, se mantendo circulantes até cerca de 2 meses de vida. Os resultados obtidos sugerem que o uso de uma vacina contendo o antígeno recombinante EMA-2 é uma forma de profilaxia promissora para o controle das infecções por T. equi. Estudos avaliando o tempo de duração do efeito vacinal estão sendo realizados.

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R

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