DESENVOLVIMENTO DE VEÍCULO DE INOCULAÇÃO A BASE DE
SPIRULINA/CARBOXIMETILCELULOSE: ESTUDO DA VISCOSIDADE, DA ESTABILIDADE E DA SOBREVIVÊNCIA DE CÉLULAS DE RIZÓBIO
C. S. FREITAS1, N. G. RUMJANEK2, G. R. XAVIER2 e P. J. OLIVEIRA1 E-mail para contato: pjansen@ufrrj.br
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Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Departamento de Engenharia Química, Laboratório de Tecnologia de Polímeros
2Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA RESUMO
Nos processos biológicos voltados para agricultura, a turfa é o material mais utilizado como veículo de inoculação, no entanto, necessita de refrigeração, esterilização e é proveniente de fonte não renovável. Por isso, a busca por materiais que a substitua é uma demanda atual. Nesse trabalho foi investigada a mistura Spirulina/CMC. A Spirulina é uma cianobactéria composta por ácidos orgânicos, proteínas, aminoácidos e carotenóides, substâncias que podem servir como fonte de carbono, apresentando assim, um elevado potencial como veículo de inoculação. Neste trabalho foram investigadas as misturas Spirulina/CMC nas composições 2,5%, 5%, 10%, 40% e 50% em massa de Spirulina. Testes de viscosimetria mostraram um comportamento pseudoplástico para as misturas. As misturas com melhor estabilidade dimensional foram as amostras autoclavadas. Os resultados dos testes de sobrevivência mostram que as amostras contendo 2,5% e 10% de Spirulina foram as que apresentaram os melhores resultados após quatro semanas de inoculação.
Palavras-chave: Spirulina; carboximetilcelulose; viscosimetria; rizóbio; inoculante.
1. INTRODUÇÃO
A prática da inoculação vem sendo feita há muitos anos e tem contribuído significativamente para o aumento do rendimento da produção de grãos. O material mais utilizado como veículo de inoculação é a turfa. No entanto, a composição física e química da turfa nem sempre a qualifica como um bom veículo, pois dependendo da sua origem a mesma pode não apresentar as características necessárias para a sobrevivência das bactérias. Além disso, a turfa não está disponível em todos os países e é um recurso natural de fonte não renovável (Schuh, 2005). Para aplicação da Turfa como veículo de inoculação é necessário a esterilização e a refrigeração do material, o que aumenta os custos de produção. Por esse motivo, a busca por novos materiais que superarem as limitações técnicas apresentadas pelo uso da turfa, especialmente no que se refere a facilidade de aplicação em sementes, é uma demanda tecnológica atual. (Keyser, 1992),
tecnológico devido às suas características físicas e químicas. A Spirulina contém nutrientes que incluem proteínas, carboidratos, vitaminas, minerais, betacaroteno, super antioxidantes, além de oligoelementos. O teor de proteína é elevado, correspondendo a 60-70% do seu peso seco (Cifferi, 1983). A Spirulina contém elevada concentração de vitaminas e de 4 a 7% de lipídios. Os ácidos graxos essenciais como o ácido linolênico e também carboidratos fazem parte da sua composição química (Mahajan, 1997; Cohen, 1997). Estas substâncias podem servir como fonte de carbono e nutrientes para as bactérias, conferindo a Spirulina um elevado potencial como veículo de inoculação. Por outro lado, a Spirulina apresenta baixa estabilidade térmica e dimensional, o que limita a sua aplicação como veículo de inoculação.
Para contornar esse problema foram produzidas misturas da Spirulina com a Carboximetilcelulose (CMC). A Carboximetilcelulose (CMC) tem se mostrado um polímero bastante promissor na preparação de misturas poliméricas, como no caso da misturas entre CMC/amido, desenvolvido para aplicação tecnológica como veículo de inoculação (Rhor, 2007; Fernandes Júnior et al., 2009).
Neste trabalho, a mistura Spirulina/Carboximetilcelulose foi desenvolvida e testada como veículo de inoculação. Foram realizados testes preliminares de viscosimetria e de estabilidade dimensional (visual e olfativo), bem como testes de sobrevivência do rizóbio após a inoculação.
2. MATERIAIS E METÓDOS Materiais
Foi utilizada neste trabalho a Spirulina, uma cianobactéria conhecida cientificamente como Arthrospira platensis, desidratada, de procedência da Brasil Vital®. A biomassa foi mantida ao abrigo da luz e umidade até a sua utilização.
O polímero utilizado foi a Carboximetilcelulose de Sódio (CMC) de média viscosidade (2000-3000) da marca Quimesp.
A mistura Spirulina/CMC foi inoculada com rizóbio da estirpe BR3262.
Métodos
As misturas de Spirulina/CMC foram feitas nas concentrações de 2,5%, 5%, 10% 40% e 50% em massa de Spirulina, em quadruplicata.
Teste de Estabilidade: Foi observado a separação de fases das misturas armazenadas a temperatura ambiente e armazenadas sob refrigeração controlada. Parte da amostra foi autoclavada e condicionada em tubos do tipo Falcon, enquanto a outras amostras, não autoclavada, foram condicionadas em garrafas de 200 mL.
A análise visual e olfativa foi realizada durante 8 dias, a fim de avaliar a estabilidade, separação de fases, e a contaminação da mistura.
Teste viscosimétrico: Foi realizada a análise viscosimétrica das amostras Spirulina/CMC, utilizando um viscosímetro do tipo Brookfield DV-III LV Ultra Programmable Rheometer (Fig.1), com spindle modelo LV3, à temperatura de 45ºC e velocidade de 0,1 a 250 rpm.
Figura 1- Brookfield DV-III LV Ultra Programmable Rheometer
Devido à alta viscosidade, a misturas com concentração de 2,5%, 5% e 10% foram diluídas com água Milli-Q. A 10g de amostra foi diluída com 20 mL de água Milli-Q, exceto as amostras contendo 2,5%, diluídas com 30 mL de água Milli-Q. As misturas foram agitadas no Vortex até atingirem a homogeneidade. As misturas foram colocadas no banho à 70ºC durante uma hora antes da realização do teste.
Avaliação da sobrevivência do rizóbio: Foram selecionadas 3 concentrações (2,5%, 10% e 40% de Spirulina), em triplicata, para a inoculação com rizóbio da estirpe BR3262 na densidade de 109 células g-1. Foram realizadas contagens em placas de petri, utilizando o método da gota, no 3º dia, 7º dia 14º dia e 30º dia a fim de avaliar a sobrevivência do rizóbio na mistura Spirulina/CMC.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise visual e olfativa das amostras foram realizadas diariamente durante um período de 8 dias a fim de investigar a sua estabilidade dimensional, separação de fases. O resultado de estabilidade dimensional das misturas mostrou que todas as amostras autoclavadas não apresentaram separação de fases, indicando uma boa estabilidade dimensional da amostra, e tampouco apresentaram mudança de odor. No entanto, como mostrado na Fig.3, observou-se uma mudança na coloração em todas as amostras atribuída à alteração química dos pigmentos, no caso a ficocianina, ocorrido durante o processo de esterilização por autoclave. Edwards et al. (1997) mostrou que entre 60 e 70ºC ocorre a desnaturação da ficocianina.
Figura 2 – Amostra autoclavada (esq) e amostra não autoclavada (dir.).
Para as amostras não autoclavadas, os resultados mostraram que, a partir do 3º dia, as amostras contendo 40 e 50% de Spirulina apresentaram separação de fases, sugerindo a baixa estabilidade dimensional da amostra. Enquanto que as amostras de 2,5%, 5% e 10%, mostraram sinais de separação de fases somente a partir do 5º dia.
As amostras armazenadas em geladeira contendo 40 e 50% de Spirulina, não autoclavadas, começaram a se decompor a partir do 5º dia, indicando que a conservação em baixas temperaturas diminui o processo de separação de fases. Por outro lado, as amostras de 2,5%, 5% e 10%, nas mesmas condições, começaram a se decompor a partir do 6º dia.
A Fig. 3 apresenta os resultados das análises viscosimétricas das amostras Spirulina/CMC. Os resultados mostraram uma diminuição da viscosidade como o aumento da quantidade de Spirulina na mistura. Observa-se também uma diminuição da viscosidade com o aumento da velocidade (cisalhamento), indicando um comportamento reológico é típico de fluidos pseudoplásticos.
Figura 3 – Viscosidade das amostras com 40 e 50% de Spirulina [A] e com 5 e 10% de Spirulina [B] a 45ºC.
A avaliação da sobrevivência do rizóbio na mistura Spirulina/CMC mostrou que a densidade de células inoculadas aumentou na mistura a partir do 7º dia, passando de 10-8 para 10-11 no 28º dia, conforme mostrado na Fig. 4, sugerindo que a mistura, além de garantir a sobrevivência do rizóbio, promover seu crescimento através dos nutrientes fornecidos pela Spirulina.
Figura 4 – Contagens de Rizóbios no 3º, 7º, 14º e 28º dias. 4. CONCLUSÃO
Os resultados de estabilidade dimensional mostraram que é possível a obtenção de misturas sem separação de fases através da esterilização das amostras por autoclave, o que contribuirá para uma maior sobrevivência das células quando da preparação do inoculante.
Os resultados das análises viscosimétricas mostraram que a presença de Spirulina torna a mistura menos viscosa, apresentando comportamento pseudoplástico. Este comportamento reológico é importante para manutenção das propriedades e para aplicações tecnológicas de inoculantes líquidos ou em gel.
A análise da sobrevivência do rizóbio na mistura Spirulina/CMC indica que a mistura permite a sobrevivência do rizóbio e pode promover seu crescimento através dos nutrientes fornecidos pela Spirulina.
Com base no exposto, resultados preliminares obtidos neste trabalho permitem concluir que a mistura CMC/Spirulina apresenta um potencial para ser utilizada como veículo de inoculação.
5. REFERÊNCIAS
CIFFERI, O. Spirulina, the edible microorganism. Microbiological Rev., 47: 551-578, 1983.
COHEN, Z. The chemicals of Spirulina In:Vonshak,A.,Ed.Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell Biology and Biotechnology. Taylor and Francis, London, pp: 175-204. 1997.
EDWARDS, M.R.; HAUER, C.; STACK, R. F.; EISELE, L.E.; MACCOLL, R. Thermophilic C- phycocyanin: effect of temperature, monomer stability and structure. Biochimica et
Biophysica ACTA, v.1321, p. 157-164, 1997.
FERNANDES JÚNIOR, P. I. Composições poliméricas a base de carboximetilcelulose (CMC) e amido como veículos de inoculação de rizobio em leguminosas. Dissertação.
(Mestrado em Ciências do Solo) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
Seropédica, RJ, 43 f.2006.
KEYSER, H.H. et al. Rhizobial ecology and technology. In: Metting, F.B. (Ed) Soil
Microbial Ecology: Applications in Agricultural and Environmental Management, New York:
Marcel Decker, p. 205 – 226, 1992.
MAHAJAN, G.; KAMAT, M. G-linolenic acid production from S.platensis. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 43: 466-469, 1995.
RHOR, T.G. Estudo reológico da mistura carboximetilcelulose/amido e sua utilização como veículo de inoculação bacteriano.124p. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2007.
SCHUH, C.A. Biopolímeros como suporte para inoculantes. Dissertação de Mestrado,
Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, RS, Brasil. (81p.). 2005.
USE OF MIX SPIRULINA/CARBOXYMETHYLCELLULOSE AS INOCULATION VEHICLE - EFFECT OF VISCOSITY AND STABILITY AND RHIZOBIUM SURVIVAL
IN THE MIX ABSTRACT
In biological processes focused on agriculture, peat is the most common material used as an inoculation vehicle, however, it requires refrigeration, sterilization and comes from non-renewable source. Therefore, the search for materials to replace the peat is a current demand. The present work investigates the mixture of Spirulina/CMC. Spirulina is a cyanobacterium composed of organic acids, proteins, amino acids and carotenoids, substances which can serve as a carbon source, thereby having a high potential as an inoculation vehicle. In this work, mixtures of Spirulina/CMC compositions containing 2.5%, 5%, 10%, 40% and 50% by weight of Spirulina were investigated. Viscometry tests revealed a shear thinning behavior of the mixtures. The samples that showed the bests results of dimensional stability were the autoclaved samples. The results of survival tests show that the samples containing 2.5% and 10% Spirulina were those who had best results after four weeks of inoculation
