CAROLINA GENÚNCIO DA CUNHA MENEZES COSTA
CONSTRUÇÃO DE UM BANCO DE TUMOR PARA ESTUDOS DIAGNÓSTICOS E PROGNÓSTICOS EM CARCINOMAS MAMÁRIOS
São José dos Campos, SP 2010
CONSTRUÇÃO DE UM BANCO DE TUMOR PARA ESTUDOS DIAGNÓSTICOS E PROGNÓSTICOS EM CARCINOMAS MAMÁRIOS
Relatório Final Apresentado como Parte das Exigências da Disciplina Trabalho de Conclusão de Curso à Banca Avaliadora do Curso de Ciências Biológicas da Faculdade de Educação e Artes da Universidade do Vale do Paraíba.
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Orientadora: Profª Drª. Renata de Azevedo Canevari Co-orientador: Prof. Dr. Leandro José Raniero
São José dos Campos, SP 2010
CONSTRUÇÃO DE UM BANCO DE TUMOR PARA ESTUDOS DIAGNÓSTICOS E PROGNÓSTICOS EM CARCINOMAS MAMÁRIOS
Trabalho de Graduação aprovado como requisito à obtenção do título de Bacharelado em Ciências Biológicas na Faculdade de Educação e Artes da Universidade do Vale do
Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Prof.ª Dr.ª Cristina Pacheco Soares (Univap) - Presidente Prof.ª Dr.ª Emilia Ângela Lo Schiavo Arisawa (Univap)
Prof.ª Dr.ª Renata de Azevedo Canevari (Univap) (Orientadora)
São José dos Campos - SP 2010
Agradeço aos meus pais sem os quais eu não teria conseguido chegar até aqui. Agradeço também aos meus amigos Cecília, Fabiana, Yasu, Carla, Maiara e Nicole, que me deram força para seguir em frente.
Agradeço à colaboração das minhas amigas Joze Galioti e Raquel Zarur, que ajudaram a fazer as coletas das amostras.
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente do mundo. No Brasil, as taxas de mortalidade ainda são altas, devido à doença ser geralmente diagnosticada em estágios avançados. Considerando que este tumor é a primeira causa de mortalidade por câncer nas mulheres brasileiras, que o tratamento individualizado é crítico e que os critérios anátomo-patológicos atuais e os marcadores moleculares disponíveis são insuficientes para uma classificação adequada e para um prognóstico seguro, este projeto tem como objetivo iniciar a construção de um banco de tecidos com amostras de tumores mamários primários, com o intuito de propiciar futuros estudos de expressão gênica e de espectroscopia óptica, que tenham enfoque no prognóstico e diagnóstico, respectivamente. As amostras foram identificadas, onde uma parte foi fixada em parafina para estudos histopatológicos, enquanto a outra foi congelada a -80°C para estudos moleculares e de espectroscopia óptica. As informações clínicas e histopatológicas obtidas foram registradas e constantemente atualizadas, as quais incluem idade da paciente, grau de diferenciação tumoral, estadiamento clínico, envolvimento de linfonodo, história de câncer familiar, recorrência, presença ou ausência de metástases, estado atual da paciente, expressão dos receptores hormonais, entre outras. Até o momento, foram coletados seis casos, dos quais 67% apresentaram pior prognóstico pelo programa Adjuvant! Online que utiliza as informações clínicas, histopatológicas e dos marcadores moleculares pela análise de IHC. O principal tipo histológico diagnosticado foi o carcinoma ductal invasivo e o tamanho do tumor de cada caso teve relação direta com o número de linfonodos acometidos. Os procedimentos de coleta das amostras e extração do RNA foram adequados e em todos os casos foram obtidos tecidos frescos de boa qualidade histológica assim como RNA de alta pureza e com ausência de degradação. As amostras e os dados clinicopatológicos obtidos serão disponibilizados para estudos na área de biologia molecular e de espectroscopia óptica.
Breast cancer is the second most common cancer worldwide. In Brazil the mortality rate for breast cancer is still high because there is not an affordable and efficient early detection system; therefore the disease is usually diagnosed in its advanced stages, where the mortality rate is much higher. Considering that breast cancer is the leading cause of cancer mortality among Brazilian women, early diagnosis and treatment are critical. The anatomic-pathological criteria and available molecular markers are insufficient for an appropriate classification and a secure prognosis. The objective of the this project has been to initiate the construction of a tumor bank composed by samples of primary breast cancer tumors in order to facilitate further studies of prognosis using gene expression and of diagnosis using optical spectroscopic methods, for example infared and Raman. The primary breast cancer tumor samples were indentified, and one section was fixed in paraffin for histological studies, while the other section was frozen at -80°C for molecular (gene expression) and optical spectroscopic (Raman and/or infrared) studies. The clinical and histopatological information obtained was input into the tissue database along with the patient’s age, degree of tumor differentiation, clinical stage, lymph node involvement, family cancer history, cancer recurrence state of individual and within family, presence or absence of metastasis, the current state of the cancer of the patient, and tumor marker expression. Four of the six cases analyzed (67%) using clinical and histopathological information and molecular markers had a bad prognosis using the program Adjuvant Online! The main histological type diagnosed was invasive ductal carcinoma, and the tumor size in each case was directly related to the number of lymph nodes affected. High purity and quality RNA was extracted from fresh and histological good quality tissue samples. The RNA and tissue samples and the corresponding clinicopathological information are available for further molecular biological and optical spectroscopic studies.
Tabela 1 – Fatores associados a baixo, médio ou alto risco de câncer de mama ...14 Tabela 2 – Classificação clínica segundo sistema TNM para tumores de mama...18 Tabela 3 – Classificação patológica segundo sistema pTNM para tumores de mama....19 Tabela 4 – Ficha de catalogação das amostras ...29 Tabela 5 – Informações clínicas e histopatológicas de seis pacientes diagnosticadas com carcinomas mamários ...33 Tabela 6 – Procedimentos cirúrgicos realizados em seis pacientes portadoras de tumores mamários ...35 Tabela 7 – Tratamentos realizados nas pacientes portadoras de carcinomas mamários .35 Tabela 8 – Classificação de estadiamento tumoral segundo a nomenclatura pTNM...36 Tabela 9 – Classificação dos linfonodos regionais acometidos segundo classificação pTNM ...36 Tabela 10 – Prognóstico das pacientes segundo programa “Adjuvant Online!”...37 Tabela 11 – Quantificação e grau de pureza de RNAs extraídos de carcinomas mamários (Nanodrop ND-1000, LabtradeTM)...38
Figura 1 – Ilustração dos passos realizados para a extração do RNA de tecido a fresco. A. Armazenamento do tecido para maceração. B. Maceração do tecido. C. Protocolo RNeasy Mini Kit (QiagenTM) ...30 Figura 2 – A. Eletroforese do RNA em gel de agarose. B. Visualização do gel de agarose em luz ultravioleta utilizando o Transluminador (Bio-Imaging SystemsTM) ...31 Figura 3 – Quantificação do RNA no espectrofotômetro NanoDrop®...32 Figura 4 – Idade das pacientes...34 Figura 5 – Resultados das análises de IHC para os marcadores ER, PgR, HER-2 e para o Ki-67 em seis amostras de carcinomas mamários ...37 Figura 6 – Eletroforese em gel de agarose ilustrando o RNA total extraído de quatro dos seis casos de carcinomas mamários analisados ...38
1 INTRODUÇÃO ...10 1.1 Objetivos Gerais...11 1.2 Objetivos Específicos...12 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...13 2.1 Câncer de mama...13 2.1.1 Etiologia ...14 2.1.2 Marcadores prognósticos ...14
2.1.3 Marcadores moleculares prognósticos ...20
2.1.4 Terapias em câncer de mama ...22
2.2 Banco de tumores...23
2.2.1 Aspectos éticos...24
2.2.2 Informática ...24
2.2.3 Modo de obtenção e conservação da amostra para estudos moleculares...24
2.3 Análise de expressão gênica em câncer de mama ...25
2.4 Espectroscopia Raman ...26
3 MATERIAL E MÉTODOS ...28
3.1 Casuística, coleta e armazenamento das amostras ...28
3.2 Banco de dados ...28
3.3 Extração e quantificação do RNA...29
4 RESULTADOS ...33
4.1 Características prognósticas gerais do banco de tumor ...33
4.2 Qualidade e quantificação do RNA ...38
4.3 Características prognósticas dos casos...38
4.3.1 Caso 1...38
4.3.5 Caso 5...40
4.3.6 Caso 6...41
6 DISCUSSÃO ...42
7 CONCLUSÃO...47
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...48
ANEXO A: Comitê de Ética em Pesquisa ...54
1 INTRODUÇÃO
O câncer de mama é considerado a primeira causa de mortalidade por câncer nas mulheres brasileiras (INCA, 2010), o que é consistente com o padrão detectado mundialmente (PISANI, 1999). O desenvolvimento destes tumores e outros cânceres é um processo de múltiplos passos (NOWELL, 1976; DEVILEE; CORNELISSE, 1994) caracterizado pelo acúmulo de múltiplas alterações genéticas.
O desenvolvimento do câncer de mama pode passar por vários estágios (NOWELL, 1976; DEVILEE; CORNELISSE, 1994) envolvendo alterações progressivas do tecido normal para hiperplasia epitelial atípica, carcinoma ductal in situ (DCIS), também conhecido como carcinoma intraductal, câncer de mama invasivo e eventualmente resulta na doença metastática (SHACKNEY; SILVERMAN, 2003). Contudo, nos últimos anos este conceito tem-se alterado. A progressão do câncer de mama não é mais vista como uma única via, mas sim como uma complexa série de eventos genéticos que levam a vias divergentes e distintas culminando no tumor invasivo (SIMPSON et al., 2005).
O câncer de mama é uma doença extremamente complexa e heterogênea, onde a recorrência e metástase são responsáveis pela maioria das morbidades pela doença. O prognóstico da paciente é muito diferente quando se considera os diferentes tipos histológicos. Alguns casos apresentam bom prognóstico considerando que a taxa de metástase em 10 anos é de aproximadamente 15%, mesmo se estas pacientes não tiverem sido submetidas ao tratamento pela quimioterapia. Por outro lado existe uma proporção significativa de pacientes com pior prognóstico, ou seja, apresentam recorrência ou metástase mesmo se tiverem sido submetidas à quimioterapia adjuvante.
Durante as últimas décadas, vários indicadores clínicos e patológicos foram extensivamente investigados para a predição do prognóstico deste tumor independente do tratamento, e mais de 100 fatores individuais foram relatados em literatura, entre eles, o grau histológico, o tamanho do tumor e o envolvimento de linfonodos.
Alguns sistemas de classificação prognóstica foram desenvolvidos com o objetivo de melhor caracterizar as pacientes com câncer de mama em relação ao risco de recidiva loco-regional e metástase à distância e deste modo selecionar as pacientes que devem ou não receber terapias adjuvantes. Estes sistemas são de alguma forma, arbitrários considerando-se
que o risco biológico de recorrência é heterogêneo e contínuo (BARRIOS et al., 2005). Os mais utilizados são os sugeridos pela European Society of Medical Oncology (ESMO) e pelo Consenso da Conferência Internacional de St. Gallen (GOLDHIRSCH et al., 2005; ESMO, 2007). O programa “Adjuvant! Online” (http://www.adjuvantonline.com) utiliza critérios clínicos (idade e presença de comorbidades) e patológicos (tamanho do tumor, grau histológico, presença de disseminação para linfonodos axilares e expressão da proteína ESR1) para predizer estatisticamente o risco de recorrência e morte em função do câncer de mama e tornou-se ferramenta útil na definição da necessidade de tratamento adjuvante.
Atualmente, poucos desses fatores possuem aplicação na prática clínica como ferramenta prognóstica, ou contribuem para o entendimento da biologia do tumor, e mesmo estes disponíveis são insuficientes para uma classificação adequada e um prognóstico seguro. Deste modo, é consenso que para se assegurar uma melhor caracterização e tratamento dos tumores de mama, são necessárias novas abordagens, tais como a busca de novos marcadores moleculares para complementar as análises clínico-patológicas clássicas.
Recentemente, inúmeros estudos em análise de expressão gênica têm sido descritos com o objetivo de aumentar o entendimento da complexa interação de genes e vias envolvidas na progressão do câncer de mama e com isso facilitar a busca de marcadores moleculares que sejam representativos e eficientes para a determinação de um diagnóstico e prognóstico seguro. Contudo, os dados ainda são preliminares e controversos e até o presente, não são conhecidos novos marcadores com implicação prognóstica que estão sendo aplicados rotineiramente na prática clínica.
Considerando que o câncer de mama é considerado a primeira causa de mortalidade por câncer nas mulheres brasileiras, que o tratamento individualizado para estes tumores é crítico e que os critérios anátomo-patológicos atuais e os marcadores moleculares disponíveis são insuficientes para uma classificação adequada e para um prognóstico seguro, este projeto foi elaborado com os seguintes objetivos:
1.1 Objetivos Gerais
Iniciar a construção de um banco de tecidos com amostras de tumores mamários primários de diferentes tipos histológicos, com o intuito de propiciar estudos de análises de expressão
gênica, e análises de espectroscopia óptica, para auxiliar na determinação de um melhor diagnóstico e prognóstico das pacientes com carcinomas mamários.
1.2 Objetivos Específicos
Obter tecidos frescos de cirurgias de tumores mamários primários e, quando possível, tumores metastáticos da mesma paciente e que estejam em boas condições histológicas, propiciando assim uma amostra de qualidade;
Obter RNAs íntegros e com alto rendimento para que possam ser utilizados futuramente em diferentes técnicas de biologia molecular, tais como extração de RNA, síntese de cDNA, RT-PCR, qRT-PCR, análise de microarray, entre outras;
Disponibilizar o banco de tecidos a todo o grupo de pesquisa, para que possa ser utilizado em vários projetos que possuem diferentes enfoques, tais como a análise molecular e a análise de espectroscopia óptica;
Propiciar futuros estudos de pesquisa básica que possuam enfoque no diagnóstico e prognóstico das pacientes com carcinomas mamários por meio da coleta de todos os dados histopatológicos, dados pessoais, história familiar, resultados de análise de imunohistoquímica (IHC), além de um acompanhamento constante dessas pacientes.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Câncer de mama
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente do mundo e o mais comum entre as mulheres, sendo diagnosticados aproximadamente 49.240 novos casos a cada ano. No Brasil, as taxas de mortalidade ainda são altas, devido à doença ser geralmente diagnosticada em estágios avançados, com sobrevida média de 61% após cinco anos. O número de mortes por ano chega a 11.860, sendo 11.735 mulheres e 125 homens. O surgimento deste tumor é relativamente raro antes dos 35 anos, porém, acima desta faixa etária, a incidência cresce rápida e progressivamente (INCA, 2010).
Esta doença é histologicamente e clinicamente heterogênea, constituída por uma variedade de tipos celulares, incluindo células epiteliais, estromais, linfoblásticas, endoteliais e com subtipos patológicos distintos. O carcinoma ductal é o tipo histológico mais comum, compreendendo aproximadamente 70 a 80% dos cânceres de mama invasivos. Os carcinomas lobulares ocorrem em aproximadamente 10% das pacientes, com uma maior freqüência em mulheres mais velhas (ARPINO et al., 2004). A diversidade no aspecto clínico do câncer de mama é indubitavelmente relacionada a diferenças nas taxas de crescimento do tumor, invasão tumoral, potencial metastático e outros sinais complexos de crescimento celular e sobrevivência (CHANG et al., 2005).
O câncer de mama é uma doença genética, onde há o crescimento desordenado de células que invadem tecidos e órgãos, e é causado principalmente por mutações nas células somáticas. Em geral, no mínimo seis alterações genéticas são requeridas para converter o epitélio de mama normal em câncer de mama maligno (WEINBERG, 1991; DEVILEE; COMELISSE, 1994), havendo um aumento da capacidade proliferativa ou de sobrevivência em cada evento relacionado a aquisição de uma alteração genética. Eventualmente, alterações genéticas se acumulam e essas células tornam-se capazes de penetrar a membrana basal e invadir o tecido estromal a sua volta. Em alguns casos, a invasão está associada a uma cascata de eventos que inclui a angiogênese, invasão vascular linfática, metástases de linfonodos e metástases à distância.
2.1.1 Etiologia
A etiologia do câncer de mama envolve a interação de diversos fatores de risco, dificultando um estudo mais adequado (Tabela 1). A doença encontra-se relacionada ao processo de industrialização, com risco de adoecimento associado a elevado status sócio-econômico, assim como outros fatores clássicos tais como baixa paridade, idade precoce da menstruação e tardia da menopausa, obesidade, altura, consumo de álcool e exposição a radiações ionizantes (BARROS et al., 2001; ABREU; KOIFMAN, 2002a). A associação entre o uso de pílulas anticoncepcionais e o aumento do risco do câncer de mama ainda não está comprovada, porém as mulheres que usaram contraceptivos com altas dosagens de estrógeno ou que fizeram uso do medicamento por longo tempo, ou mesmo que usaram anticoncepcionais antes da primeira gravidez, podem estar mais predispostas a ter esta doença (INCA, 2010).
Tabela 1: Fatores associados a baixo, médio ou alto risco de câncer de mama Risco muito elevado Risco medianamente elevado Risco pouco elevado - Mãe ou irmã com câncer
de mama na pré-menopausa. - Antecedente de
hiperplasia epitelial atípica ou neoplasia lobular in situ.
- Suscetibilidade genética comprovada (mutação do gene BRCA 1 ou BRCA2).
- Mãe ou irmã com câncer de mama na pós-menopausa. - Nuliparidade.
- Antecedente de hiperplasia epitelial sem atipia ou macrocistos apócrinos.
- Menstruação precoce (≤ 12 anos).
- Menopausa tardia (≥ 55 anos.
- Primeira gestação depois de 34 anos.
- Obesidade. - Dieta gordurosa. - Sedentarismo. - Terapia de reposição hormonal por mais de 5 anos.
- Ingestão alcoólica excessiva.
Fonte: BARROS et al., 2001
2.1.2 Marcadores prognósticos
As características clínicas e histopatológicas permitirão prever o prognóstico, ou seja, a evolução e o tempo de sobrevida da paciente. O conhecimento destes fatores também é muito importante para a determinação do programa terapêutico (ABREU; KOIFMAN, 2002b).
Embora sejam necessários muitos marcadores prognósticos confiáveis para se estimar o risco de recorrência e progressão tumoral e elaborar decisões a respeito de terapia adjuvante, as decisões no tratamento pós-operatório são realizadas rotineiramente por meio dos fatores de risco convencionais que auxiliam na avaliação do prognóstico da paciente e na determinação do melhor tratamento, tais como idade, tamanho do tumor, envolvimento de linfonodos, tipo histológico do tumor, grau histológico, estadiamento tumoral, história de câncer familial, presença ou ausência de recorrência e/ou metástase e status dos receptores hormonais (revisado por ONDA et al., 2004).
Idade da paciente:
Os cânceres de mama que acometem mulheres mais jovens em geral são mais agressivos do que aqueles que ocorrem em mulheres com idade mais avançada. O câncer hereditário costuma a afetar as pacientes mais jovens, enquanto que o esporádico costuma a afetar as pacientes mais velhas (BARROS et al., 2001; ABREU; KOIFMAN, 2002a; INCA, 2010).
Tamanho do tumor:
O tamanho do tumor é um dos mais importantes indicadores prognósticos para o câncer de mama e se constitui na base do estadiamento TNM estabelecido pela UICC (2004). Quanto maior for o tumor pior é o prognóstico, pois é maior a chance de comprometimento dos linfonodos loco-regionais e maior o risco de recidiva (ABREU; KOIFMAN, 2002). Além disso, o tamanho do tumor é um fator determinante na indicação do tratamento, pois auxília o clínico na determinação do melhor procedimento cirúrgico, como também na indicação da quimioterapia ou radioterapia (GOLDHIRSCH et al, 2005).
Status dos linfonodos:
O conhecimento do envolvimento dos linfonodos axilares e do número de linfonodos comprometidos constitui uma das mais informativas informações prognósticas. As pacientes sem comprometimento dos linfonodos axilares no momento da cirurgia apresentam um melhor prognóstico em relação as pacientes com linfonodos comprometidos. Na prática, pacientes com quatro ou mais linfonodos positivos são consideradas como um subgrupo de prognóstico desfavorável (FANEYTE et al., 2004). As taxas de sobrevida após 10 anos sem comprometimento de linfonodos axilares são de 65 a 80% comparadas com pacientes com linfonodos acometidos, que é de 25 a 48% (FANEYTE et al., 2004).
De acordo com Barros et al (2001), Abreu e Koifman (2002a) e Marinho et al (2008), o comprometimento dos linfonodos está diretamente relacionado ao tamanho do tumor. Quanto maior o tumor, maior a chance de comprometimento dos linfonodos.
Tipo histológico:
O carcinoma ductal invasivo e o carcinoma lobular invasivo são as formas mais comuns de carcinomas de mama. O carcinoma ductal é o tipo histológico mais comum, compreendendo aproximadamente 70 a 80% dos cânceres de mama invasivos. Os carcinomas lobulares ocorrem em aproximadamente 10% das pacientes, com uma maior freqüência em mulheres mais velhas (ARPINO et al., 2004). As pacientes com carcinoma ductal invasivo geralmente possuem um pior prognóstico e um maior envolvimento do sistema linfático quando comparado aos outros tipos histológicos (VIEIRA et al., 2008; KALAGER et al., 2010).
De acordo com a padronização do Armed Forces Institute of Pathology (2003) e da Organização Mundial de Saúde (2003), os tipos histológicos de carcinomas mamários podem ser identificados como:
Carcinoma in situ – é um câncer restrito ao seu sítio de origem, sem se estender para tecidos vizinhos. Pode ser classificado em:
o Ductal ou intra-ductal – são tumores que se caracterizam por ductos preenchidos com células carcinomatosas que podem estar arranjadas nos padrões papilar, cribiforme ou sólido, com ou sem necrose central.
o Lobular ou intra-lobular – se caracteriza por lóbulos distendidos e preenchidos por células redondas com núcleos uniformes e rara atividade mitótica.
Carcinoma infiltrante ou invasivo – é o câncer que se estende para os tecidos vizinhos. Pode ser classificado em:
o Ductal – está relacionado com as células que formam os ductos mamários e possui inúmeras variações morfológicas. O tipo tubular possui células regulares e dispostas em túbulos bem definidos, sem apresentar necrose e mitoses. O medular apresenta numerosos linfócitos e mitoses.
o Lobular – inicia-se nos lóbulos, glândulas secretoras de leite, e infiltra nos tecidos vizinhos. Frequentemente pode coexistir com o lobular in situ e é a sua contrapartida infiltrante. Pode ser também encontrado com outros tipos.
Grau histológico:
O grau histológico reflete o grau de diferenciação das células. Quanto maior o grau histológico, menor a diferenciação celular. Esses fatores se caracterizam em um pior prognóstico para a paciente (BARROS et al., 2001; ABREU; KOIFMAN, 2002a).
o Grau histológico I – células bem diferenciadas. o Grau histológico II – células pouco diferenciadas. o Grau histológico III – células indiferenciadas. Estadiamento tumoral:
O estadiamento em câncer de mama é baseado nas classificações TNM e pTNM, criadas por Pierre Denoix, entre os anos de 1943 e 1952, e estabelecidas pela União Internacional de Controle do Câncer (UICC, 2004).
O Sistema TNM para descrever a extensão anatômica da doença tem por base a avaliação de três componentes: T (a extensão do tumor primário), N (a ausência ou presença e a extensão de metástase em linfonodos regionais) e M (a ausência ou presença de metástase à distância) A adição de números a estes três componentes indica a extensão da doença maligna.
Duas classificações são descritas para cada localização anatômica:
Classificação clínica (classificação clínica pré-tratamento), designada TNM (ou cTNM), tem por base as evidências obtidas antes do tratamento. Tais evidências surgem do exame físico, diagnóstico por imagem, endoscopia, biópsia, exploração cirúrgica e outros exames relevantes.
Classificação patológica (classificação histopatológica pós-cirúrgica), designada pTNM, tem por base as evidências conseguidas antes do tratamento, complementadas ou modificada pela evidência adicional conseguida através da cirurgia e do exame histopatológico.
Na tabela 2 estão listadas as definições da nomenclatura TNM e, na tabela 3 as definições da nomenclatura pTNM, de acordo com a UICC (2004).
Tabela 2: Classificação clínica segundo sistema TNM para tumores de mama T: Tumor
TX O tumor primário não pode ser avaliado. T0 Não há evidência de tumor primário. Tis (CDIS)
Tis (CLIS) Tis (Paget)
Carcinoma ductal in situ. Carcinoma lobular in situ.
Doença de Paget do mamilo sem tumor na mama. T1 T1a T1b T1c T1mic Tumor ≤ 2 cm. De 0,1 a 0,5 cm. De 0,5 a 1,0 cm. De 1,0 a 2,0 cm. Microinvasão ≤ 0,1 cm. T2 Tumor > 2 cm e ≤ 5 cm. T3 Tumor > 5 cm. T4 T4a T4b T4c T4d
Tumor com extensão direta à parede torácica ou à pele. Extensão à parede torácica.
Edema/ulceração cutânea, nódulos cutâneos satélites. T4a + T4b.
Carcinoma inflamatório.
N: Linfonodos regionais NX Os linfonodos não podem ser avaliados.
N0 Ausência de metástase nos linfonodos. N1 Metástase em linfonodos axilares móveis. N2a
N2b
Metástase em linfonodos axilares fixos.
Metástase em linfonodos mamários internos, clinicamente aparente.
N3a N3b N3c
Metástase em linfonodos infraclaviculares.
Metástase em linfonodos mamários internos e axilares. Metástase em linfonodos supraclaviculares.
M: Metástase à distância
MX A presença de metástase não pode ser avaliada. M0 Ausência de metástase.
M1 Metástase.
Tabela 3: Classificação patológica segundo sistema pTNM para tumores de mama pT: Tumor primário
As categorias pT correspondem às categorias T (pTX, pT0, pT1, pT2, pT3, pT4). pN: Linfonodos regionais
pNX Os linfonodos não podem ser avaliados. pN0 Ausência de metástase nos linfonodos. pN1mi Micrometástase > 0,2 e < 2,0 mm.
pN1a pN1b
pN1c
Metástase de 1-3 linfonodos axilares.
Metástase microscópica em linfonodos mamários internos detectada por dissecção de linfonodo sentinela, mas não clinicamente aparente.
Metástase em 1-3 linfonodos axilares e metástase microscópica em linfonodos mamários internos detectada por dissecção de linfonodo sentinela, mas não clinicamente aparente.
pN2a pN2b
Metástase em 4-9 linfonodos axilares.
Metástase em linfonodos mamários internos, clinicamente aparentes, sem linfonodos axilares.
pN3a pN3b
pN3c
Metástase em ≥ 10 linfonodos axilares ou infra-claviculares.
Metástase em linfonodos mamários internos, clinicamente aparentes, com linfonodos axilares ou > 3 linfonodos axilares e mamários internos com metástase microscópica por biopsia de linfonodos sentinela, mas não clinicamente aparente.
Metástase em linfonodos supraclaviculares. pM: Metástase à distância
História familial:
A história familial é um importante marcador prognóstico, mesmo sendo a frequência de câncer de mama hereditário inferior a 10% do total de cânceres de mama diagnosticados. Pacientes com casos na família de parentes de primeiro grau acometidos por câncer antes dos 50 anos têm maior chance de desenvolverem câncer de mama hereditário (INCA, 2010). O desenvolvimento destes cânceres está relacionado com a presença dos genes de predisposição/suscetibilidade BRCA-1 ou BRCA- 2 que podem promover um acúmulo de alterações genéticas levando à iniciação e progressão tumoral (THOMPSON; EASTON, 2004).
Presença ou ausência de recorrência e/ou metástase:
A presença de metástase é um fator de mau prognóstico, pois a partir do momento em que a célula consegue invadir tecidos vizinhos e se propagar, o tratamento se torna mais difícil. Vários estudos relacionam o desenvolvimento de metástase com sobrevida reduzida em pacientes com câncer de mama. Moraes et al (2006) relatam em seu estudo que pacientes com metástase tem a taxa de sobrevida global por volta de 50%, enquanto que em pacientes sem metástase, a taxa de sobrevida é por volta de 90%.
O risco de recorrência é um fator muito importante na recomendação da terapia adjuvante a ser indicada. Pacientes com risco mínimo de recorrência, geralmente são acompanhadas ao seguimento clínico. Pacientes com risco baixo de recorrência podem ser tratadas com tamoxifeno, enquanto pacientes com risco elevado prosseguem com quimioterapia (INCA, 2004).
2.1.3 Marcadores moleculares prognósticos
Marcadores moleculares são úteis na detecção do câncer em estágio precoce, na avaliação do tumor, no monitoramento da progressão da doença e na determinação da resposta à terapia (ANDRIOLO, 1996). Atualmente, há poucos marcadores moleculares em câncer de mama que servem como prognósticos corretos da sobrevivência total ou livre da doença na ausência de tratamento (fatores prognósticos) ou que predizem respostas a terapias particulares (fatores preditivos).
Para o câncer de mama, os marcadores prognósticos moleculares rotineiramente utilizados na clínica médica são os receptores hormonais: receptor de estrôgeno (ER), receptor de
progesterona (PgR), receptor de tirosina quinase (ERBB2/HER2) e o antígeno nuclear de proliferação celular (Ki-67).
Receptores hormonais:
Os receptores hormonais são proteínas que se ligam aos hormônios circulantes, controlando-os. Os mais estudados em câncer de mama são os receptores de estrógeno (ER) e de progesterona (PgR) (EISENBERG; KOIFMAN, 2001).
Estudos mostram que o crescimento de certos tumores, tais como o carcinoma de mama, é regulado pelos hormônios esteróides. Cerca de dois terços dos cânceres de mama não possuem expressão para os receptores hormonais, sendo 60% a 81% negativos para o ER e 44% a 61% negativos para o PgR. Os receptores de estrógeno e de progesterona estão diretamente relacionados com a idade da paciente, sendo encontrados em menor quantidade em mulheres na pós-menopausa (STIERER et al., 1993; ELLIOT et al., 1994). Os tumores positivos para receptores hormonais têm um prognóstico mais favorável e respondem melhor à terapia hormonal em relação aos tumores receptores hormonais negativos (EISENBERG; KOIFMAN, 2001; ABREU; KOIFMAN, 2002a; ABREU; KOIFMAN, 2002b; MARINHO et al, 2008).
ERBB2/HER2
Estudos com o receptor hormonal ERBB2/HER2 (receptor de tirosina quinase) demonstraram que a amplificação do gene está presente em 10% a 40% dos carcinomas de mama e sua expressão aumentada está associada a um pior prognóstico, onde as pacientes apresentam baixa resposta ao tratamento quimioterápico e sobrevida menor. Foi demonstrado que o aumento da expressão deste gene, juntamente com o TP53, está relacionado ao pior prognóstico, devido à perda do controle inibidor da proliferação celular e ao ganho de um ativador em potencial. Vários estudos demonstraram que a maioria dos tumores HER2 positivos responde melhor à quimioterapia não hormonal (EISENBERG; KOIFMAN, 2001; ABREU; KOIFMAN, 2002a; ABREU; KOIFMAN, 2002b; ALMEIDA et al., 2007).
Ki-67:
Outro marcador avaliado rotineiramente na prática clínica para fim prognóstico é o antígeno nuclear de proliferação celular Ki-67. Esta proteína é encontrada em todas as fases do ciclo celular, onde seus níveis correlacionam-se à proliferação celular e à síntese de DNA.
Uma alta proporção de células tumorais com alto índice de proliferação do Ki-67 associa-se com baixo grau de diferenciação tumoral e indica um pior prognóstico. (JEZIORSKI et al., 2000; EISENBERG; KOIFMAN, 2001; MARINHO et al., 2008).
Embora a utilização dos marcadores prognósticos convencionais seja útil na prática clínica, eles possuem uma capacidade limitada em predizer corretamente a verdadeira extensão prognóstica de uma grande proporção de cânceres clinicamente localizados. Deste modo, vários estudos têm sido realizados para se determinar novos marcadores moleculares que sejam mais efetivos e seguros na determinação do prognóstico das pacientes com câncer de mama. Entretanto, os dados ainda são preliminares e controversos e até o presente, não são conhecidos novos marcadores com implicação prognóstica ou de tratamento.
2.1.4 Terapias em câncer de mama
Atualmente, o tratamento em câncer de mama consiste, além da cirurgia, na quimioterapia, radioterapia ou hormonioterapia.
Quimioterapia
A quimioterapia é um método de tratamento que utiliza compostos químicos chamados quimioterápicos. Quando aplicada ao tratamento de câncer, é chamada de quimioterapia antineoplásica ou antiblásica, e pode ser neoadjuvante ou adjuvante (INCA, 2010).
o Neoadjuvante – é aplicada antes da cirurgia de retirada do tumor. Tem como objetivo reduzir o volume tumoral, tornando o tumor irressecável em ressecável, e/ou possibilitar uma cirurgia conservadora em tumores inicialmente indicados para mastectomia radical. Uma resposta positiva a este tratamento é um fator preditivo de sobrevida livre da doença. Alguns medicamentos utilizados são as antraciclinas e taxanes ou ciclofosfamida e fluoracil (BARROS et al., 2001; INCA, 2010).
o Adjuvante – é aplicada após a cirurgia. Geralmente recomendada para pacientes com tumores maiores do que 1 cm e independente do status linfonodal, receptores hormonais e idade. Em caso de linfonodos axilares negativos, utiliza-se os medicamentos CMF (ciclofosfamida, metrotrexate, fluorouracil) ou AC (adriblastina, ciclofosfamida). Em caso de linfonodos axilares positivos, utiliza-se CMF, FAC
(fluorouracil, adriblastina, ciclofosfamida), FEC (fluorouracil, epiruicina, ciclofosfamida) e AC (BARROS et al., 2001; INCA, 2010).
Radioterapia
A radioterapia é um método capaz de destruir células tumorais, empregando feixe de radiações ionizantes. Aplica-se uma dose pré-calculada de radiação no tecido que engloba o tumor, buscando erradicar todas as células tumorais com o menor dano possível às células normais circunvizinhas (INCA, 2010).
Esta terapia é mais indicada para pacientes com carcinoma ductal e com menos de 50 anos, quando o câncer em geral é mais agressivo. Nos casos de mastectomia há alguns fatores que devem ser considerados antes da indicação deste tratamento, como tumores maiores ou iguais a 5 cm, pele comprometida, grau III, dissecção de menos de 10 linfonodos, margem comprometida e quatro ou mais linfonodos comprometidos (BARROS et al., 2001).
Hormonioterapia
A hormonioterapia ou terapia hormonal visa evitar que o tumor de mama cresça, se espalhe ou retorne. Esta terapia utiliza medicamentos para alterar a ação dos hormônios. Os medicamentos mais utilizados no tratamento destes tumores são o tamoxifeno e o herceptin, indicados para pacientes ER e HER-2 positivo, respectivamente (BARROS et al., 2001; INCA, 2010).
2.2 Banco de tumores
Os bancos de tumores armazenam tecidos tumorais e normais para estudos na área oncológica. As principais funções de um banco de tumores são: coleta, catalogação, armazenamento e disponibilização das amostras para estudos. Os principais objetivos são facilitar a investigação na área oncológica, como a busca de um diagnóstico mais correto, a busca de novas técnicas terapêuticas e novos fármacos e entender os efeitos e exposições ambientais; facilitar estudos moleculares com a obtenção das informações clínicas, pessoais e histopatológicas; permitir novos estudos na área molecular, obtendo amostras de qualidade que possibilitem análises de DNA e RNA e manter a integridade das amostras dos pacientes, caso haja necessidades futuras de novas pesquisas (CARVALHO et al., 2007).
2.2.1 Aspectos éticos
Para a construção de um banco de tecidos deve-se seguir procedimentos e regras estabelecidos pelo país em questão. Na Europa, a obtenção e estabelecimento de um banco de tecidos seguem as normas da European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) (TEODOROVIC et al., 2003).
Em geral, para o estabelecimento de um banco de tecidos é necessário: (1) obter o Consentimento de Doação para Pesquisa do paciente; (2) submeter a um Comitê de Ética local todos os trabalhos que serão realizados com amostras obtidas do banco; (3) identificar todo o material com codificação única e padrão; (4) atualizar o inventário constantemente; (5) residir o banco de dados em um banco de tumores único e (5) proibir a comercialização de todas as amostras pertencentes ao banco (KNOX; KERR, 2004; QUALMAN et al., 2004) 2.2.2 Informática
A catalogação das amostras deve ser padronizada devendo constar o registro da paciente, a localização, catalogação e disponibilidade da amostra. Os registros devem estar disponíveis a longo prazo, em formato padrão e caso seja necessário poderão ser divulgados a outros bancos de tumores. Além disso, deve-se construir um banco de dados contendo as seguintes informações (FLORELL et al., 2001; QUALMAN et al., 2004):
Nome da paciente Data de nascimento
Número do registro médico Data da coleta
Diagnóstico final Sítio da doença Natureza da amostra
Número de alíquotas preparadas Número de alíquotas restantes
2.2.3 Modo de obtenção e conservação da amostra para estudos moleculares
O banco de tumores poderá ser constituído por blocos de parafina, células, tecidos, ácidos nucléicos (DNA e RNA), plasma e lâminas histológicas. Os tecidos, soro, sangue e RNA
deverão ser armazenados em freezers à -80°C, enquanto que os reagentes e o DNA deverão ser armazenados em freezers à -20°C (JEWELL et al., 2002; CARVALHO et al., 2007). Para se obter o RNA intacto é necessária grande quantidade de tecido fresco extraído antes da completa oclusão de suprimento de sangue. Alguns fatores podem afetar a integridade da amostra, como o tempo e a forma de estocagem. Há também fatores que afetam a qualidade da amostra, como exemplo, o sítio de origem e a natureza da amostra, que contém quantidades diferentes de DNA e RNA (FLORELL et al., 2001; CHU et al., 2002 ; CARVALHO et al., 2007).
O bom rendimento de DNA e RNA é conseguido pelo adequado armazenamento da amostra: o DNA deverá ser armazenado à -20°C sem risco de sofrer degradações mesmo após muitos anos de estocagem e o RNA deverá ser armazenado a -80°C, pois é extremamente suscetível a degradações após cinco anos ou mais de estocagem. Para uma melhor preservação do RNA poderão ser utilizado solventes orgânicos ou agentes desnaturantes, como o fenol e a guanidina, embora estes possam destruir a integridade do tecido. Deste modo, o reagente mais indicado é o RNAlater, pois preserva as propriedades histopatológicas e imunohistoquímicas (IHC) dos tecidos. Alternativamente, a amostra poderá ser mantida em nitrogênio líquido, contudo neste caso deverá haver a reposição constante do mesmo devido a sua grande volatilidade (CHU et al., 2002; JEWELL et al., 2002; OOSTERHUIS et al., 2003; CARVALHO et al., 2007).
Durante a manutenção do banco de tumores alguns cuidados deverão ser considerados, entre eles: a manutenção deverá ser realizada regularmente observando a integridade dos tecidos; as informações do banco de dados deverão ser sempre atualizadas; e um cuidado especial deverá ser tomado para não se perder ou misturar as informações clínicas, principalmente em relação ao diagnóstico, origem, história do tratamento, estado da coleta, manutenção e utilização (FLORELL et al., 2001; CARVALHO et al., 2007).
2.3 Análise de expressão gênica em câncer de mama
A célula exerce o controle da expressão gênica durante a transcrição por meio de várias proteínas envolvidas no mecanismo da regulação (SCHRANK et al., 2001). Vários trabalhos na literatura demonstraram por diversas técnicas que a expressão alterada de genes envolvidos nas vias de proliferação celular, adesão celular, diferenciação, apoptose, angiogênese, entre outras, estão estritamente relacionadas ao desenvolvimento da maioria dos tumores malignos,
dentre os quais, o câncer de mama (VAN DE VIJVER et AL, 2002; VAN´T VEER et al, 2002; KNAUNER et al, 2010; MOOK et al, 2010).
A análise de expressão gênica têm demonstrado a capacidade de identificar as características que refletem a biologia molecular e o comportamento do tumor, podendo revelar novos marcadores moleculares que estão relacionados a recorrência e progressão da doença. Esta análise tem reforçado a idéia que o câncer de mama é uma doença extremamente heterogênea, sendo esse padrão também compartilhado pelo aspecto clínico e de resposta terapêutica.
O advento da tecnologia de microarray trouxe novas perspectivas na avaliação da expressão gênica e no prognóstico do câncer de mama. A análise simultânea da expressão de milhares de genes em um único experimento pode permitir um melhor entendimento das complexas propriedades moleculares do câncer de mama. Nestes tumores a relação entre a progressão neoplásica e a expressão de oncogenes, genes supressores de tumor e genes envolvidos nas vias hormonais tem sido avaliada (JEFFREY, 2002). Essas informações podem levar a identificação de novos marcadores moleculares para predição do risco de metástase em pacientes acometidos por esta neoplasia.
Deste modo, o uso da técnica de microarrays favorece não somente o entendimento da taxonomia, mas também pode permitir a identificação de assinaturas genéticas, definidas como uma coleção de genes que podem auxiliar na discriminação de subtipos tumorais, consideradas como mais efetivas do que os marcadores prognósticos utilizados atualmente na rotina clínica (PEROU et al., 2000). A técnica auxilia no diagnóstico e pode-se associar o perfil genético dos tumores com fatores como velocidade de crescimento, potencial de recorrência local, surgimento de metástases, resistência à quimioterapia e o prognóstico pós-operatório (CASSALI et al., 2007).
2.4 Espectroscopia Raman
Diagnosticar doenças através da Biópsia Óptica é o grande objetivo dos estudos que envolvem Espectroscopia Vibracional na aplicação em tecidos humanos. Esta técnica viabiliza não somente informações para promoção de diagnóstico, através do uso de sistemas in vivo por fibras ópticas, bem como, através de suas variantes de microscopia, informações importantes sobre a bioquímica tecidual que auxiliam na compreensão do processo tumoral.
Tem sido bem estabelecido recentemente na literatura que, por estudos in vitro de materiais biopsiados e tecidos cortados, que condições pré-malignas podem ser detectadas e distinguidas das normais utilizando dados espectrais da espectroscopia Raman (KANTER et al., 2009) e da espectroscopia de absorção de infravermelho (BIRD et al., 2009). Métodos de espectroscopia vibracional também são capazes de identificar estados de transição entre um tecido normal e patológico (MARZULLO et al., 2007).
Estes métodos são rápidos, não destrutivos, oferecem alta resolução espacial e não necessitam de preparação da amostra (coloração). Além disto, os dados espectrais podem ser facilmente correlacionados com os resultados histopatológicos, podem ser armazenados em bancos de dados digitais os quais podem ser enriquecidos, transferidos e utilizados em estágios posteriores. Deste modo, esta metodologia poderá se tornar uma ferramenta clínica que poderá ajudar profissionais da área médica a melhorar os diagnósticos e tratamento de doenças.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Casuística, coleta e armazenamento das amostras
As amostras são provenientes de tecidos tumorais obtidos imediatamente após as cirurgias de carcinomas mamários. As amostras, com colaboração do cirurgião mastologista Dr. Luis Henrique Ferreira de Moraes, foram obtidas do Hospital São Francisco de Assis, em Jacareí, e do Hospital Antoninho da Rocha Marmo, em São José dos Campos/SP após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa, protocolo H67/CEP/2010 (ANEXO A).
As coletas foram feitas durante o procedimento cirúrgico. Após a coleta, a peça total obtida da mastectomia foi transportada para a Clínica CIPAX, São José dos Campos, SP, onde foi realizada a macrodissecção realizada pelo Dr. Ricardo Macarenco, médico patologista. Este procedimento permitiu a presença de aproximadamente 80% de células tumorais no fragmento. Posteriormente, a amostra já identificada foi transportada em nitrogênio líquido e armazenada em um freezer à -80°C no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica - LEVB do Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento - IP&D, UNIVAP. O tecido restante foi fixado em parafina para estudos histopatológicos realizados na Clínica CIPAX. Em seguida as informações foram passadas para o banco de dados.
3.2 Banco de dados
Todas as amostras foram identificadas de forma padrão e conectadas a um banco de dados, que foi criado exclusivamente para este banco de tumores, contendo todas as informações obtidas da paciente. Para isso foi realizada a consulta em prontuários constantemente disponíveis no hospital ou no consultório médico. O RNA extraído foi identificado de acordo com a amostra e também incluído no banco de dados, sendo armazenado no mesmo local (freezer à -80°C).
As informações clínicas e histopatológicas foram obtidas dos centros clínicos e serão constantemente atualizadas, as quais incluem entre outras informações, idade, grau de diferenciação tumoral, estadiamento clínico, história de câncer familial, recorrência, presença ou ausência de metástases e estado atual da paciente. (Tabela 2). A classificação para determinação da graduação, classificação histológica e estadiamento clínico seguiu as recomendações de Bloom e Richardson (1957); Who (2000) e UICC (2004), respectivamente.
Tabela 4: Ficha de catalogação das amostras Nº do caso: Nome da Paciente:
Idade: Registro clínico: Hospital:
Data da cirurgia e coleta: Procedimento cirúrgico: Nome do cirurgião:
Nome do patologista:
Hipótese diagnóstica:
Diagnóstico histopatológico: História familial:
Quimioterapia: Radioterapia: Natureza da amostra: Tipo histológico:
Estadiamento tumoral: Tamanho do tumor: Grau histológico: Número de linfonodos envolvidos: Índice de proliferação celular: Ki-67 Status dos receptores hormonais:
ER: PgR: HER-2: Sítio Metastático: Intervalo livre da doença:
Seguimento clínico:
Nº de amostras iniciais: Nº de amostras atuais:
3.3 Extração e quantificação do RNA
A extração e purificação do RNA foram realizadas seguindo o protocolo Rneasy Mini Kit (QiagenTM) (Figura 1). Este método de isolamento de RNA foi escolhido com a finalidade de originar RNA de alto peso molecular e com o máximo grau de pureza. Neste estudo, todos os procedimentos de biossegurança para extração do RNA foram utilizados. O protocolo de extração utilizando o Rneasy Mini Kit (QiagenTM) está descrito a seguir.
Um total de aproximadamente 30 mg do tecido foi macerado em nitrogênio líquido, adicionando-se em seguida 600µL de solução tampão RLT e transferido para um microtubo de 1,5 mL. A amostra foi centrifugada por 3 minutos em velocidade máxima e o sobrenadante foi transferido para um novo microtubo de 1,5 mL. Em seguida foram adicionados 350 µL de etanol 70%, homogeneizando a solução por pipetagem. Foi transferida 700µL da amostra para a coluna Rneasy Mini Spin, acoplada a um tubo coletor de 2 mL, e centrifugada por 15
segundos a 10.000 rpm. Foi descartado o conteúdo do tubo coletor e transferida a coluna Rneasy Mini Spin para um novo tubo coletor de 2 ml. Em seguida foi adicionado 500 µL de solução tampão RPE na coluna e centrifugada por 15 segundos a 10.000 rpm. Novamente, foi descartado o conteúdo do tubo coletor, que foi reutilizado para o próximo passo. Foi adicionado mais 500 µL de solução tampão RPE e centrifugada por 15 segundos a 10.000 rpm para secar a membrana de gel sílica. A coluna Rneasy Mini Spin foi transferida para um microtubo convencional de 1,5 mL e adicionado 40 µL de água livre de RNase diretamente na membrana. Esta solução foi centrifugada por 1 minuto a 10.000 rpm para eluição do RNA. Após a extração foi dado um choque térmico na amostra à 65°C por 2 minutos e em seguida foi armazenada em microtubo de 1,5 mL a -80oC. Na figura 4 estão ilustrados os passos da metodologia de extração de RNA.
Figura 1: Ilustração dos passos realizados para a extração do RNA de tecido a fresco. A. Armazenamento do tecido para maceração. B. Maceração do tecido. C. Protocolo
RNeasy Mini Kit (QiagenTM)
Para a avaliação da qualidade do RNA extraído, as amostras foram analisadas em eletroforese em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídeo (0,5µg/ml) (APÊNDICE
A B
A) e posterior visualização em luz ultra-violeta utilizando o Transluminador (Visible & Ultraviolet Transilluminator, Bio-Imaging SystemsTM) (Figura 2).
Figura 2: A. Eletroforese do RNA em gel de agarose. B. Visualização do gel de agarose em luz ultravioleta utilizando o Transluminador (Bio-Imaging SystemsTM)
A técnica de espectofotometria de absorção no ultravioleta foi empregada para avaliar a qualidade (razão) e a concentração do RNA. Para isso, foi utilizado o espectrofotômetro NanoDrop (ND-1000 Spectrophotometer v.3.0.1, LabtradeTM) que é capaz de medir volumes pequenos como 1 μL de solução, sem a necessidade de cubetas ou outros porta-amostras. O procedimento para a realização da medida consistiu em pipetar a alíquota de 1,5 µL de água DEPC para a ponta da fibra óptica receptora identificando ao aparelho como branco, em A
4 RESULTADOS
4.1 Características prognósticas gerais do banco de tumor
As amostras tumorais são provenientes de seis pacientes do sexo feminino com carcinomas mamários. As informações clínicas e histopatológicas coletadas incluíram idade, grau de diferenciação tumoral, estadiamento clínico, história de câncer familial, recorrência, presença ou ausência de metástases e estado atual da paciente (Tabela 5).
Tabela 5: Informações clínicas e histopatológicas de seis pacientes diagnosticadas com carcinomas mamários
Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4 Caso 5 Caso 6
Idade 27 anos 48 anos 58 anos 51 anos 56 anos 47 anos
Hospital Antoninho da Rocha Marmo São Francisco de Assis São Francisco de Assis São Francisco de Assis São Francisco de Assis São Francisco de Assis Data da cirurgia e coleta 02/09/2010 22/09/2010 23/09/2010 29/09/2010 06/10/2010 21/10/2010 Procedimento cirúrgico Mastectomia radical modificada Mastectomi a radical modificada Mastectomia radical modificada Mastectomia simples Mastectomia radical modificada Mastectomia simples
Tipo Histológico Carcinoma ductal invasivo Carcinoma ductal invasivo Carcinoma ductal invasivo Carcinoma ductal invasivo Carcinoma ductal invasivo Carcinoma ductal invasivo Quimioterapia Neoadjuvante NR* Neoadjuvante NR* NR* Neoadjuvante
Radioterapia NR* NR* NR* NR* NR* NR*
Hormonioterapia NR* NR* NR* NR* NR* NR*
História familial ausente ausente ausente ausente ausente ausente Natureza da amostra Tumor primário Tumor primário NR e fibroadenoma Tumor primário Tumor primário Tumor primário Tamanho do tumor 15,5 x 10,9 cm 3,8 x 2,4 cm 0,8 x 0,6 cm 6,2 x 4,0 cm 3,5 x 2,2 cm 1,1 x 0,8 cm
Grau Histológico III III I III III III
Linfonodos acometidos
Estadiamento tumoral
pT3 pN3a pT2 pN1a NA** pT3 pN1mi
pMX pT2 pN3a pT1c pN0 pMX ER (IHC) - NA** - NA** NA** NA** PgR (IHC) - NA** - NA** NA** NA** Ki-67 (IHC) + NA** + NA** NA** NA** HER-2 (IHC) - NA** + NA** NA** NA** Legenda: *NR: Não realizado. **NA: Não analisado.
As amostras tumorais coletadas até o momento são provenientes de pacientes com idades entre 27 e 58 anos. Três pacientes têm mais de 50 anos, duas tem entre 30 e 50 anos e uma paciente tem menos de 30 anos (Figura 4).
< 30 anos 30 - 50 anos > 50 anos
Figura 4: Idade das pacientes
Do total de amostras, cinco são provenientes do Hospital São Francisco de Assis em Jacareí e uma foi proveniente do Hospital Antoninho da Rocha Marmo em São José dos Campos.
A mastectomia radical modificada foi o procedimento cirúrgico mais utilizado em 67% das pacientes (Tabela 6). Neste procedimento, a mama inteira é retirada junto com os linfonodos axilares e a pele, mas há preservação de um ou dois músculos peitorais. Nas 33% pacientes restantes, o procedimento cirúrgico utilizado foi a mastectomia simples, onde há a retirada apenas da mama com a pele, sem os linfonodos.
Tabela 6: Procedimentos cirúrgicos realizados em seis pacientes portadoras de tumores mamários Total de casos Procedimentos cirúrgicos N % Mastectomia simples 2 33 Mastectomia radical modificada 4 67
O tipo histológico diagnosticado em todas as amostras coletadas foi o carcinoma ductal invasivo.
Do total das seis pacientes, três não foram submetidas a nenhum tratamento prévio e três passaram por quimioterapia neoadjuvante. Dessas, uma (caso 1) houve progressão da doença, com o crescimento do tumor, enquanto que as duas outras paciente (caso 3 e 6) responderam ao tratamento utilizado, ocorrendo redução do tamanho do tumor.
A quimioterapia adjuvante, hormonioterapia e radioterapia são prováveis terapias que serão indicadas para estas pacientes. Contudo, como estas amostras foram coletadas de pacientes recentemente submetidas à cirurgia, no momento não dispomos destes dados para registrá-los em nosso banco de tecidos (Tabela 7).
Tabela 7: Tratamentos realizados nas pacientes portadoras de carcinomas mamários Total de casos Tratamentos N % Quimioterapia neoadjuvante 3 50 Quimioterapia adjuvante - - Radioterapia - - Hormonioterapia - - Nenhum 3 50
Considerando o estadiamento tumoral segundo a classificação pTNM, um tumor foi diagnosticado como pT1c (tamanho do tumor >1,0 e < 2,0 cm), dois tumores como pT2
5 cm). No caso 3, o estadiamento não foi analisado. A tabela 8 ilustra os casos separados de acordo com a classificação pTNM (UICC, 2004).
Tabela 8: Classificação de estadiamento tumoral segundo a nomenclatura pTNM Total de amostras Estadiamento tumoral N % pT1c 1 17 pT2 2 33 pT3 2 33 Nenhum 1 17
Todas as amostras tumorais coletadas apresentam grau histológico III, indicando que o tumor é constituído em sua maioria por células tumorais em um grau indiferenciado. Com relação ao envolvimento de linfonodos, 67% das pacientes tiveram lifonodonos axilares acometidos. Destas pacientes, duas tiveram mais da metade dos linfonodos axilares acometidos. A tabela 9 ilustra a classificação dos linfonodos regionais segundo a classificação pTNM.
Tabela 9: Classificação dos linfonodos regionais acometidos segundo classificação pTNM Total de amostras Linfonodos regionais N % pN0 2 33 pN1mi 1 17 pN1a 1 17 pN3a 2 33
Em relação aos receptores hormonais, todos os casos analisados apresentaram ausência de expressão para os marcadores ER e PgR pela análise de IHC (ER - e PgR -) e presença de expressão do marcador de proliferação celular Ki-67 (Ki-67 +). O marcador HER-2 apresentou ausência de expressão em uma paciente (HER-2 -) (caso 1) e presença de
expressão (HER-2 +) em outra paciente (caso 3). Em quatro casos não foi realizada a análise de IHC. 0 1 2 3 4 5 6
Positivo Negativo Não analisado
ER PgR Ki-67 HER-2
Figura 5: Resultados das análises de IHC para os marcadores ER, PgR, HER-2 e para o Ki-67 em seis amostras de carcinomas mamários
As características clínicas (idade e a presença de comorbidades) e patológicas das pacientes e das amostras coletadas (tamanho do tumor, grau histológico, presença de disseminação para linfonodos axilares e expressão da proteína ER) foram inseridas no programa “Adjuvant Online!” (http://www.adjuvantonline.com) com o objetivo de predizer estatisticamente o risco de recorrência e metástase, e definir a necessidade de um tratamento adjuvante. Após a análise dos dados inseridos, este programa indicou que 67% das pacientes apresentam um mau prognóstico (tabela 10).
Tabela 10: Prognóstico das pacientes segundo programa “Adjuvant Online!” Total de casos
Prognósticos N %
Mau prognóstico 4 67
4.2. Qualidade e quantificação do RNA
O RNA extraído de cada amostra foi avaliado em gel de agarose com o objetivo de avaliar a sua qualidade (Figura 6), e quantificado no espectrofotômetro NanoDrop (Tabela 11) que mede a concentração e apresenta a razão do RNA (grau de pureza).
Foi realizada a extração do RNA em seis amostras, sendo que em quatro obteve-se sucesso no procedimento, com RNAs de ótima qualidade (Figura 6) e grau de pureza (>1,8 e <2,0) (Tabela 11) mesmo sem a realização do tratamento com DNase. Em duas amostras (casos 2 e 3) não foram obtidos RNAs com concentrações e grau de pureza satisfatórios devido a erros técnicos durante o procedimento de extração.
Tabela 11: Quantificação e grau de pureza de RNAs extraídos de carcinomas mamários (Nanodrop ND-1000, LabtradeTM)
Figura 6: Eletroforese em gel de agarose ilustrando o RNA total extraído de quatro dos seis casos de carcinomas mamários analisados
4.3 Características prognósticas dos casos 4.3.1 Caso 1
A paciente tinha a idade de 27 anos no momento da cirurgia e não possui casos de câncer de mama na família. Esta paciente foi submetida à quimioterapia neoadjuvante, mas houve
progressão da doença, com o crescimento do tumor. Após a mastectomia radical modificada, foi diagnosticado carcinoma ductal invasivo, com o tumor medindo 15,5 x 10,9 cm e com grau histológico III. O estadiamento tumoral foi classificado como pT3 pN3a (tumor > 5 cm e metástase em ≥ 10 linfonodos axilares ou infra-claviculares). Dos 35 linfonodos avaliados, foi observado acometimento em 30 linfonodos. Os receptores hormonais ER e PgR, e o HER-2 foram negativos (ausência de expressão) pela análise de IHC e o marcador Ki-67 foi positivo (presença de expressão), com grau de proliferação entre 80% e 90%.
As características clínicas e patológicas deste caso foram inseridas no programa “Adjuvant Online!” (http://www.adjuvantonline.com). Baseado nos dados inseridos, este programa indicou que esta paciente apresenta um mau prognóstico com 97% de chance de recidiva em 10 anos se não ocorrer nenhum tratamento adjuvante. Caso esta paciente seja submetida a quimioterapia ou terapia combinada, a chance de recidiva diminui para 74%. A hormonioterapia não é indicada devido à negatividade dos receptores hormonais.
4.3.2 Caso 2
A paciente tinha 48 anos de idade no momento da cirurgia e não foram detectados casos de câncer de mama na família. Esta paciente não foi submetida a nenhum tratamento antes da cirurgia, na qual o procedimento adotado foi mastectomia radical modificada. O tipo histológico diagnosticado foi o carcinoma ductal invasivo, com diâmetro tumoral de 3,8 x 2,4 cm e grau histológico III. O estadiamento tumoral foi classificado como pT2p N1a (tumor > 2 cm e ≤ 5 cm e metástase de 1-3 linfonodos axilares). Dos 20 linfonodos axilares examinados, dois estavam acometidos.
Para este caso não foi solicitado à análise de IHC para os marcadores tumorais ER, PgR, HER-2 e Ki-67. Entretanto, os dados anatomopatológicos indicaram um mau prognóstico quando inseridos no programa “Adjuvant Online!”, com 67% de chance de recidiva em 10 anos caso não ocorra tratamento adjuvante. Contudo, se esta paciente for submetida à quimioterapia, a chance de recidiva cai para 39% e para 31% com terapia combinada. A hormonioterapia não foi indicada para esta paciente, acreditamos que este fato se deva a ausência de informações sobre o status dos marcadores tumorais.
4.3.3 Caso 3
diagnosticado carcinoma invasivo misto, sendo 80% do tipo lobular e 20% do tipo ductal. A paciente foi submetida à quimioterapia neoadjuvante e, devido à presença de células tumorais residuais no tecido mamário pós quimioterapia, foi indicado mastectomia total. Na análise patológica não se detectou a presença de nódulos do carcinoma e sim a presença de um fibroadenoma, amostra esta adicionada ao banco de tecidos. Neste caso, como somente o fibroadenoma foi detectado, por este não ser um carcinoma, não recebeu a classisficação pTNM. O grau histológico tumoral observado foi I e nenhum dos 11 linfonodos axilares examinados estavam acometidos. A análise de IHC indicou receptores hormonais ER e PgR negativos, HER-2 positivo (3+) e Ki-67 positivo com índice de proliferação entre 10 e 15%. 4.3.4 Caso 4
A paciente tinha 51 anos no momento da cirurgia e não tem casos de câncer de mama na família. Esta paciente não foi submetida a nenhum tratamento quimioterápico antes da cirurgia, na qual o procedimento adotado foi mastectomia simples. O tipo histológico diagnosticado foi carcinoma ductal invasivo, com tumor medindo de 6,2 x 4,0 cm e grau histológico III. O estadiamento tumoral foi classificado como pT3 pN1mi pMX (tumor > 5 cm, micrometástase > 0,2 e < 2,0 mm e presença de metástase não pode ser avaliada). Apenas um linfonodo sentinela foi enviado para biópsia e mostrou um foco de micrometástase carcinomatosa de 2,0 mm.
Para este caso não foi solicitado à análise de IHC para os marcadores tumorais ER, PgR, HER-2 e Ki-67. Contudo, os dados anatomopatológicos indicaram um mau prognóstico quando estes dados foram inseridos no programa “Adjuvant Online!”, com 41% de chance de recidiva em 10 anos caso não seja realizado nenhum tipo de tratamento adjuvante, diminuindo para 35% se esta paciente for submetida ao tratamento quimioterápico e 29% caso for ministrado a terapia combinada. A hormonioterapia não foi indicada para esta paciente.
4.3.5 Caso 5
A paciente tinha 56 anos no momento da cirurgia e não possui casos de câncer na família. Esta paciente não foi submetida a nenhum tratamento antes da cirurgia, na qual o procedimento adotado foi mastectomia radical modificada. Após a análise patológica, foi diagnosticado carcinoma ductal invasivo, com tumor medindo 3,5 x 2,2 cm e grau histológico III. Dos 27 linfonodos avaliados, foram observados 20 linfonodos acometidos. Após análise
patológica, o tumor foi classificado com estadiamento pT2 pN3a (tumor > 2 cm e ≤ 5 cm e metástase em ≥ 10 linfonodos axilares ou infra-claviculares).
Até o momento não foi realizado a análise de IHC para os marcadores tumorais ER, PgR, HER-2 e Ki-67. A utilização do programa “Adjuvant Online!” com a inserção dos dados anatomopatológicos indicou que este caso é de mau prognóstico com 92% de chance de recidiva em 10 anos se não ocorrer nenhum tratamento adjuvante. Com tratamento quimioterápico a chance de recidiva decai para 71% e 61% com terapia combinada. A hormonioterapia não foi indicada para esta paciente
4.3.6 Caso 6
A paciente tinha 47 anos no momento da cirurgia e não possui casos de câncer na família. Esta paciente foi submetida à quimioterapia neoadjuvante, com redução do tumor. Após mastectomia simples, a análise patológica, diagnosticou carcinoma ductal invasivo, com tumor medindo 1,1 x 0,8 cm e grau histológico III. Dos 6 linfonodos avaliados por biópsia, nenhum estava acometido. Após análise patológica, o tumor foi classificado com estadiamento pT1c pN0 pMX (tumor > 1 cm e ≤ 2 cm, ausência de metástase nos linfonodos e a presença de metástase não pode ser avaliada).
Até o momento não foi realizado a análise de IHC para os marcadores tumorais ER, PgR, HER-2 e Ki-67. A utilização do programa “Adjuvant Online!” com a inserção dos dados anatomopatológicos indicou que este caso é de bom prognóstico com 31% de chance de recidiva em 10 anos se não ocorrer nenhum tratamento adjuvante. Com tratamento quimioterápico a chance de recidiva decai para 14% e 11% com terapia combinada. A hormonioterapia não foi indicada para esta paciente.
6. DISCUSSÃO
O câncer de mama é uma doença complexa e clinicamente heterogênea. Por ser o tumor mais freqüente entre as mulheres e por sua incidência ter aumentado consideravelmente nos últimos anos, um grande número de estudos genéticos e moleculares tem sido realizado com o intuito de compreender o significado dos marcadores moleculares conhecidos e principalmente descobrir novos marcadores genéticos que possam tornar a prática clínica mais eficaz (GIANCOTTI, 2006).
Recentemente, a biopsia óptica especialmente a espectroscopia Raman, tem sido utilizada na detecção de condições normais, pré-malignas e malignas de tecidos mamários por meio de dados espectrais com o objetivo de se tornar uma ferramenta clínica que poderá ajudar profissionais da área médica a melhorar os diagnósticos e tratamento destes tumores (BITTAR et al, 2006).
Um dos primeiros passos para o estudo e posterior análise molecular e de espectroscopia vibracional destes tumores, é a construção de um banco de tumor que contenha amostras tumorais em boas condições de uso tanto para análises de expressão gênica quanto para análises de espectroscopia Raman, respectivamente. Além disso, para possibilitar a análise molecular com fins prognósticos, é de alta importância obter e armazenar em um banco de dados as informações pessoais, clínicas e histopatológicas das pacientes, pois além de auxiliar na identificação de pacientes que possuem evoluções clínicas distintas é um indicativo de terapia adjuvante (GOLDHIRSCH et al., 2005; KATAJA; CASTIGLIONE, 2009).
Atualmente, os dados clinicopatológicos tais como tamanho do tumor, grau histológico, envolvimento de linfonodos, entre outros, além dos marcadores tumorais ER, PgR, HER-2 e Ki-67 são utilizados rotineiramente na prática clínica com o objetivo de caracterizar as pacientes com relação ao risco de recidiva loco-regional e metástase à distância. O caso 1 é uma paciente que tem 27 anos no momento da cirurgia e todas as características de um câncer muito agressivo. De acordo com o INCA (2010), pacientes mais jovens costumam ser acometidas por câncer de mama hereditário, porém neste caso a paciente não tem casos conhecidos na família. Além disso, a paciente não respondeu a quimioterapia neoadjuvante. Kataja e Castiglione (2009) citam que isto pode ocorrer em casos de câncer muito agressivos, onde o único procedimento cirúrgico a ser utilizado é a mastectomia, como foi o caso desta paciente. O caso 2 possui um tumor de tamanho relativamente grande e linfonodos acometidos. De acordo com Goldhirsch et al. (2005), pacientes com tumor de mesmo
