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Receitas para um Hemograma bem feito
Palestrante: Maria Silvia C. Martinho
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Sejam bem-vindos à mais um Webinar Sysmex.
Meu nome é Maria Silvia Martinho e sou consultora científica da Sysmex América Latina e Caribe. A apresentação de hoje será Receitas para um hemograma bem feito, um tema sempre atual. O hemograma, apesar de ser um teste muito conhecido de todos, desperta muitas dúvidas na interpretação das alterações do resultado automatizado, como veremos a seguir.
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O sangue é composto de plasma e elementos celulares, sendo que o hemograma analisa qualitativa e quantitativamente essas células sanguíneas
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Os leucócitos, os eritrócitos e as plaquetas
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As células do sangue são produzidas pela Stem Cell ou célula pluripotente, comum às diferentes linhagens celulares e o processo de produção, diferenciação e maturação destas células se
denomina Hematopoiese. Estes processos ocorrem na sua maioria na medula óssea, mas também nos nódulos linfáticos, no timo e menos frequentemente no baço e fígado e são regulados por fatores de crescimento mediados por interleucinas. A Hematopoiese vai originar as células maduras encontradas em situações normais circulando no sangue periférico, os leucócitos, eritrócitos e plaquetas.
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O hemograma é o exame mais solicitado em laboratórios clínicos, sejam eles públicos ou privados.
Seminário em português celulares e quanto à proliferação, maturação e aquisição de funções dessas células.
O hemograma nem sempre dá um diagnóstico, mas leva o clínico ao direcionamento para os testes auxiliares necessários para isso. Vejam nestas imagens que temos aqui:
Hemácias parasitadas por diferentes formas de Plasmodium falciparum presente na malária e na segunda imagem, linfócitos atípicos. Com a informação da presença de linfócitos atípicos o clínico pode deduzir que é um processo viral e solicitar as sorologias para chegar ao diagnóstico correto.
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O hemograma não é um exame simples, é um exame complexo que tem grande quantidade de parâmetros medidos por diferentes metodologias e que também tem vários interferentes. São várias análises dentro de um exame só.
O mais importante é que seja feito com qualidade para não dar uma informação equivocada.
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Vejam quantos parâmetros de série vermelha, série branca e plaquetas.
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Nas receitas antigas do hemograma, antes dos analisadores automatizados, os hemogramas eram feitos manualmente ou de forma semi automatizada, com grande quantidade de ingredientes variados, extremamente dependente dos analistas, o que tornava o processo trabalhoso e nem um pouco seguro.
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Nas receitas atuais, os ingredientes são 3 e essenciais para um hemograma bem feito: Tecnologia confiável, analistas bem preparados e empresas competentes.
Esses analistas, com conhecimento, perfil adequado e educação continuada é que vão poder trabalhar bem, vão saber lidar com os interferentes que surgirem e aproveitar todas as vantagens da tecnologia.
E, para ser uma empresa competente, se faz necessário trabalhar com processos otimizados para ter custo ajustado sem perder nunca a qualidade.
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3 Vamos começar pelos processos otimizados para se ter uma empresa competente.
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Para se otimizar o processo é essencial que se faça periodicamente a revisão dos procedimentos. Para isso deve se avaliar o fluxo de trabalho, ver os pontos fortes e pontos fracos e procurar alternativas para as deficiências e gargalos.
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Neste slide podemos ver um processo real bem complexo, com grandes quantidades de atividades manuais, muitos deslocamentos, gargalos e muitos colaboradores envolvidos.
Processos com muitas atividades manuais são sujeitos à maior quantidade de erros, inerentes a qualquer pessoa.
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Depois de avaliar as possibilidades de melhoria e sugerindo alterações, vejam como ficou o fluxo de trabalho do mesmo laboratório. Muito mais otimizado, com menor quantidade de
procedimentos manuais e consequentemente com menor quantidade de pessoas envolvidas e deslocamentos.
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Além de realizar a revisão do processo também é importante avaliar sistematicamente
possibilidades de melhoria. Isto é feito através de levantamento de dados da rotina e análise das atividades que causam maior impacto negativo para então poder retirar ou alterar estas
atividades.
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Neste exemplo vemos todos os passos de um procedimento de confecção e coloração de lâminas manual. Tem um total de 15 passos.
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Após avaliação, foi verificado que estes 15 passos de atividades manuais críticas poderiam acabar com a automação da confecção e coloração das lâminas. Com isso, o único passo seria
encaminhar as lâminas prontas e coradas para a microscopia, além da ótima qualidade do esfregaço.
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Para ter os processos otimizados e mantê-los é necessária atenção constante para a realização de melhorias. Este processo é contínuo, não para nunca e envolve todos os colaboradores. As
sugestões das pessoas que trabalham na rotina são essenciais para o sucesso das mudanças.
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Agora vamos aos parâmetros do hemograma e as tecnologias utilizadas.
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Vejam quantos parâmetros o hemograma tem na série vermelha, serie branca e plaquetária. Estes são os parâmetros mais habituais, mas além destes...
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... a Sysmex fornece os parâmetros clínicos avançados, que são o RET-He, o conteúdo de
hemoglobina dos reticulócitos, o IG, que é a contagem de granulócitos imaturos e também o IPF, que é a contagem de plaquetas imaturas.
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Vamos então à série vermelha.
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A eritropoiese, que é o processo de produção da linhagem eritrocitária se inicia a partir da stem cell na medula óssea que vai se diferenciar progressivamente, através da ação da eritropoietina, em pró-eritroblasto, eritroblasto basofílico, eritroblasto policromatófilo e eritroblasto
ortocromático. Ainda na medula óssea este eritroblasto perde o núcleo originando os
reticulócitos. Em situações normais são encontrados circulando no sangue periférico apenas uma pequena quantidade de reticulócitos e os eritrócitos maduros.
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A partir da contagem de eritrócitos, da dosagem de hemoglobina e da determinação do
hematócrito são obtidos os índices hematimétricos, HCM, VCM e CHCM, que dependem destes parâmetros.
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5 Neste slide podemos ver como são calculados os índices hematimetricos e é importante que vocês saibam como utilizar estas fórmulas em caso de necessidade, como quando houver alguma interferência em algum parâmetro.
O VCM, o volume corpuscular médio é a relação entre o hematócrito e a global de eritrócitos. O HCM, a hemoglobina corpuscular média, é obtida pela relação entre a hemoglobina e a global de eritrócitos.
E por fim, o CHCM, a concentração de hemoglobina corpuscular média é a relação entre a dosagem de hemoglobina e o hematócrito.
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Os índices hematimétricos são utilizados na classificação laboratorial das anemias, de acordo com o tamanho – pelo VCM e com a quantidade de hemoglobina – pelo HCM.
Como podemos ver no quadro, um VCM diminuído e um HCM também diminuído vai caracterizar uma anemia como microcítica/hipocrômica. Já num caso de anemia, que tenha um VCM e um HCM normais, será caracterizada como anemia normocítica/normocrômica. E no caso de uma anemia com o VCM aumentado e o HCM normal será caracterizada como anemia
macrocítica/normocrômica.
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A contagem de eritrócitos, na maioria dos analisadores hematológicos é realizada por impedância que é uma tecnologia que se baseia na obstrução da passagem da corrente elétrica por uma célula, o que vai gerar um pulso elétrico que é diretamente proporcional ao tamanho da célula. Esses pulsos elétricos vão gerar os histogramas, também chamados de curva de distribuição das células. A impedância também é utilizada na contagem de plaquetas e é uma tecnologia muito boa, mas temos que ter em mente que ela leva em consideração somente o tamanho das células. Os histogramas que podemos ver no lado direito do slide são respectivamente de plaquetas e de eritrócitos, se diferenciando apenas pelo tamanho das células.
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Desenhei estas duas curvas simulando os histogramas de plaquetas e de eritrócitos para mostrar como o equipamento conta e separa as duas populações. Ele tem o que se chama de
discriminador flutuante, que vai procurar o vale entre as duas contagens e assim separar as duas populações. Isto funciona muito bem normalmente, mas em algumas situações podemos ter
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Nestas situações, o discriminador flutuante vai ter dificuldade em separar as populações e pode fazer contagens erradas.
A boa notícia é que os analisadores vão emitir alarmes ou flags, avisando que a contagem não é confiável, além de colocar um asterisco ao lado do parâmetro comprometido.
Atenção: sempre que tiver a presença de asterisco em algum parâmetro num resultado de equipamento da Sysmex, este parâmetro não deve ser liberado sem ser avaliada a causa e resolvido o problema. Não adianta repassar a amostra, que a interferência não vai sumir e o resultado será o mesmo. Mais à frente falarei sobre os interferentes e como solucionar os problemas que eles podem causar.
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Outra tecnologia encontrada nos equipamentos da Sysmex é o foco hidrodinâmico.
Ele faz com que as células passem uma a uma pelo orifício para serem contadas e na forma e na velocidade correta, minimizando interferências.
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O hematócrito é medido pela detecção cumulativa da altura dos pulsos, que é a soma do volume de cada célula que passa pelo orifício num volume conhecido. Neste ponto os equipamentos da Sysmex diferem dos demais disponíveis no mercado. Os equipamentos Sysmex medem o hematócrito e calculam o VCM. Nos demais, o VCM é medido e o hematócrito calculado.
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Isto é importante porque explica a diferença de range para CHCM que encontramos nos
equipamentos da Sysmex em relação aos outros. Quem já trabalhou com outros equipamentos algumas vezes questiona os valores mais baixos e mais altos do CHCM dos equipamentos da Sysmex. A maneira de medir o hematócrito aliada ao foco hidrodinâmico faz com que os eritrócitos tenham a alteração na sua forma adequada para passar pelo orifício, não permitindo que os eritrócitos hipocrômicos se alonguem demasiado e também fazendo com que os
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7 CHCM falsamente aumentados ou diminuídos.
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Podemos ver neste gráfico de um trabalho do Dr. Bull a diferença entre os valores de CHCM obtidos somente por impedância e por impedância mais foco hidrodinâmico.
Neste caso, teremos um intervalo mais amplo, variando de 32 a 36 como podemos ver no gráfico à direita. Este foi um trabalho realizado com pacientes normais, doadores de sangue. Por este motivo, quando tivermos um caso com esferocitose, por exemplo, o CHCM nos analisadores da Sysmex será bem mais alto, acima de 36,5.
Então se faz importante relembrar que os valores de referência devem ser definidos por cada laboratório, preferencialmente com a população que atende e para a metodologia utilizada. Na impossibilidade de se fazer este estudo, procurar sempre utilizar valores de referência da literatura realizados em equipamentos que usam a mesma tecnologia.
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A hemoglobina, nos equipamentos Sysmex, é dosada pelo método do lauril sulfato de sódio. Felizmente estes equipamentos não utilizam mais cianeto, para dosar a ciano meta hemoglobina e sim o lauril sulfato de sódio que é um produto encontrado em shampoos para o cabelo e assim muito menos perigoso para se manusear e também a natureza agradece.
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Este produto promove uma lise intensa dos eritrócitos, que liberam a hemoglobina que será dosada por espectrofotometria.
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A hemoglobina diminuída, segundo a organização mundial da saúde, é que vai definir a presença de anemia. É importante que se saiba que a anemia é um sintoma tardio da deficiência
continuada de ferro. Por que tardio? Porque as hemácias têm um tempo de vida de 120 dias em que circulam pelo sangue periférico. Então, se a medula não estiver produzindo hemoglobina por falta de ferro, esta diminuição só será percebida quando vierem novas hemácias, ou seja, em até quatro meses. Ou seja, tardiamente.
Já os reticulócitos dão a informação atualizada do conteúdo de hemoglobina, já que circulam por volta de 36 horas no sangue periférico.
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Outro parâmetro de série vermelha muito importante é o RDW, que nos dá o índice de
anisocitose, ou seja, informa a variação de tamanho dos eritrócitos. Antes desse parâmetro ser disponibilizado, a anisocitose era detectada ao microscópio por analistas com os olhos bem treinados. Este fator continua sendo muito importante, mas o fato do equipamento medir esta variação padroniza e melhora a precisão.
Nos equipamentos da Sysmex temos dois tipos de RDW: o CV, que é mais comumente utilizado e o SD.
O RDW-CV é medido na altura de 60% da curva de distribuição de células e é calculado por uma fórmula que utiliza o VCM. Já o RDW-SD é medido na altura de 20% da curva, aonde tem maior variação de tamanho e não é calculado pelo VCM. Desta maneira, a importância da utilização do SD é quando o paciente tem um VCM muito alterado que pode levar à uma interferência no valor do RDW-CV.
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Vejam aqui algumas informações que o RDW nos proporciona:
Temos dois resultados de série vermelha lado a lado com seus respectivos histogramas. Os dois resultados mostram casos de anemia, com hemoglobina abaixo de 12 para mulher e com microcitose moderada. Os valores da hemoglobina e VCM do caso do lado esquerdo são mais alterados que os do caso do lado direito. Prestem atenção nas curvas, elas são iguais? Não são, não é? Uma é mais larga e a outra é mais estreita e podemos ver que a mais larga tem um RDW mais alto, apresentando maior variação de tamanho. Já no caso da direita, o RDW está mais próximo do normal. Laboratorialmente falando podemos pensar que, provavelmente, o caso da esquerda é uma anemia ferropriva e o da direita, uma talassemia. O que nos leva a pensar isto? Já falamos que que os eritrócitos circulam por cerca de 120 dias, então poderemos ter em determinado momento, no caso de deficiência de ferro, células normocíticas e microcíticas cuja variação de tamanho vai levar a um RDW aumentado. Esta é uma situação. Podemos ter também duplas populações com macro e normócitos, macro e micro... Já nas talassemias, em geral não se encontra RDW muito aumentado por ser um processo clonal e as hemácias terem tamanhos semelhantes.
Importante frisar que estes diagnósticos não podem ser dados somente com estas informações, serão necessários testes adicionais como marcadores bioquímicos para a suspeita de anemia
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9 ferropriva e eletroforese de hemoglobinas no caso suspeito de talassemia, para se chegar a uma conclusão.
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Neste outro slide podemos ver um histograma característico da presença de dupla população eritrocitária, com duas curvas ligadas, cada uma correspondendo à uma população de hemácias. Podemos ver na lâmina também, a presença destas duas populações.
Podemos verificar que o VCM deste caso está normal, já que ele foi calculado pela média do tamanho das duas populações; por este motivo é importante analisar o esfregaço para referir as populações presentes corretamente.
É importante, sempre que houver, relatar a presença destas duas populações. Esta informação permitirá ao clínico saber se o tratamento está dando resultado e também se este paciente recebeu alguma transfusão.
Nesta situação com duas populações, muitas vezes o equipamento não consegue medir o RDW e libera o resultado tracejado. A sugestão é que se libere a observação: presença de dupla
população eritrocitária, anisocitose acentuada ou 3 cruzes, conforme o protocolo de cada laboratório.
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Além do VCM e do HCM, para a classificação laboratorial das anemias também são importantes o RDW, a contagem de reticulócitos e a análise microscópica.
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Na eritropoiese, a última célula que apresenta núcleo, ainda na medula óssea, é o eritroblasto ortocromático. Essas células não são encontradas em situações normais circulando no sangue periférico. São encontradas em recém-nascidos nas primeiras horas de vida e também em situações em que há problemas no controle de maturação desta célula.
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É sempre importante referir a presença de eritroblastos circulantes, mesmo que seja apenas um, pois eles são marcadores de gravidade. Estão presentes em pacientes graves e determinam um mal prognóstico. Vários trabalhos científicos mostram um aumento de eritroblastos circulantes nos dias que precedem o óbito. É essencial que estas células sejam identificadas corretamente, pois como se assemelham à linfócitos podem causar confusão.
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A identificação dos eritroblastos pode ser feita de maneira manual, pela microscopia, ou
automatizada, através de analisadores hematológicos com canais específicos para esta contagem. A capacidade de detecção destas células é maior no método automatizado, que pode detectar até em quantidades menores que 100 eritroblastos por microlitro.
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Como podem ver nas imagens, o eritroblasto ortocromático é uma célula de tamanho pequeno e com núcleo, que se assemelha à um linfócito. Por este motivo, se o analisador hematológico não tiver um canal para a contagem destas células irá confundi-las com linfócitos e aí teremos
interferências nas contagens global de leucócitos e na diferencial de linfócitos. Ao microscópio é importante que o analista consiga distinguir uma célula da outra para fornecer um resultado correto.
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Ainda na medula óssea o núcleo do eritroblasto é expulso e vai dar origem aos reticulócitos. Quanto mais jovem o reticulócito, maior quantidade de retículos terá. Esta quantidade vai diminuindo progressivamente e assim, os reticulócitos encontrados normalmente no sangue periférico tem uma granulação mais dispersa.
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Reticulócitos são eritrócitos imaturos, não tem núcleo mas possuem uma malha reticular de RNA ribossômico. Para que seja vista esta malha reticular e para sua quantificação manual é necessária uma coloração especial com corante supra vital, como o azul de cresil brilhante ou o new
methilene blue. Na figura ao lado podemos ver os reticulócitos corados por este método e vemos também que sua distribuição na lâmina não fica homogênea. Esta é uma das dificuldades das contagens manuais. No esfregaço do hemograma, corado normalmente pelo Leishman, Wright ou May Giensa os retículos não são visualizados e estas células aparecerão como hemácias
policromáticas, mais azuladas e maiores que as demais.
Normalmente os reticulócitos são encontrados em pequena quantidade no sangue periférico, de 0,5 a 2% e sua grande importância é que sua presença reflete a atividade eritropoiética da medula óssea.
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11 Para realizar a contagem automatizada de reticulócitos os equipamentos da Sysmex utilizam a tecnologia da citometria de fluxo fluorescente, que identifica estas células pela coloração dos retículos de RNA por um corante fluorescente, a polimetina, e também pela informação do tamanho das células.
No eixo vertical temos a informação do tamanho da célula e no horizontal a da fluorescência, ou seja, do conteúdo de RNA destas células.
Podemos verificar no escatergrama que os eritrócitos maduros estão localizados na primeira população em azul porque não tem RNA, portanto não tem fluorescência. Depois vão aparecendo sequencialmente as populações de reticulócitos com baixa fluorescência em vermelho, média fluorescência na cor laranja e alta fluorescência em amarelo. Esta separação permite aos equipamentos da Sysmex fornecer um parâmetro adicional, o IRF- que é a fração imatura dos reticulócitos. O IRF é obtido pela soma dos reticulócitos com média e alta fluorescência e é um indicador importante da recuperação medular.
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Comparando a contagem manual com a automatizada vemos que a manual necessita uma coloração especial, tem uma variação interpessoal nas contagens proporcionando pouca confiabilidade e tem um coeficiente de variação muito alto. Já as contagens automatizadas são mais confiáveis, avaliam grande quantidade de células e avalia o comprometimento medular através do IRF, que separa os reticulócitos por grau de maturidade.
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O parâmetro clínico avançado de série vermelha é o RET-He, o conteúdo de hemoglobina dos reticulócitos. Conforme já falei anteriormente, os reticulócitos nos fornecem uma informação atualizada da eritropoiese, de como está a produção medular, diferentemente do HCM cuja informação de algum problema na produção só aparecerá tempos depois.
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O conteúdo de hemoglobina dos reticulócitos é importante nos casos de deficiência funcional de ferro, comum nos casos de anemia de doença crônica. Na deficiência funcional de ferro os estoques estão normais, mas o ferro não está sendo utilizado para a síntese de hemoglobina. Podemos ver no trabalho de Brugnara, no gráfico da esquerda temos um caso sem tratamento, com eritrócitos pequenos e pequena quantidade de reticulócitos. Já no escatergrama da direita, após o tratamento correto, ainda vemos os micrócitos, mas já aparece uma população de
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A importância clínica do RET-He é que ele indica a quantidade real de ferro disponível para a síntese de hemoglobina na medula óssea detectando precocemente o nível da deficiência de ferro. Este parâmetro não sofre interferência por quadros de infecção, inflamação ou gravidez e ainda é utilizado para monitorar tratamentos com eritropoietina. É utilizado também no
screening de doping nas olimpíadas.
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Com isso podemos ver que a série vermelha automatizada fornece importantes informações, tanto sobre a produção quanto sobre os glóbulos vermelhos em circulação, permitindo ao clínico um diagnóstico mais rápido e seguro.
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Vamos agora falar sobre os parâmetros da série branca, aonde será avaliada a contagem global de leucócitos e a diferencial, relativa e absoluta.
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A contagem global de eritrócitos é obtida após a lise dos eritrócitos. Os diferentes equipamentos disponíveis no mercado utilizam diferentes tecnologias para essa contagem cada uma com suas vantagens e interferentes.
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Os leucócitos são produzidos pela stem cell na sua maioria na medula óssea mas tem produção extra-medular no caso dos linfócitos, que são majoritariamente produzidos nos linfonodos e timo e em algumas situações no baço e fígado.
Os leucócitos vão passar por todo o processo de proliferação e diferenciação, mas o que se encontra no sangue periférico em situações normais são apenas as formas maduras de cada linhagem, os neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, basófilos e monócitos.
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Para a contagem diferencial dos leucócitos os equipamentos utilizam a citometria de fluxo, onde as células passam uma a uma num fluxo contínuo para serem analisadas e cada tipo de analisador
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13 disponível no mercado utiliza sua própria metodologia.
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No caso dos equipamentos da Sysmex é utilizada a tecnologia de citometria de fluxo fluorescente. Nestes analisadores, os leucócitos vão passar um a um num fluxo e a luz de um laser vai incidir sobre a célula que vai desviar a luz de três maneiras: frontalmente, dando a informação do tamanho da célula, lateralmente que vai dar a informação da complexidade interna, e vai emitir fluorescência de acordo com o conteúdo de DNA e RNA da célula. Como vocês podem ver na figura ao lado direito, como exemplo, os granulócitos mais imaturos tem núcleo bem maior que os maduros e vão emitir mais fluorescência devido à maior quantidade de DNA.
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O corante fluorescente polimetina é que vai corar o material genético dos leucócitos, após fazer furinhos microscópicos na membrana citoplasmática destas células.
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Este é um gráfico da contagem diferencial normal, chamado escatergrama. No eixo vertical teremos a informação da fluorescência e no eixo horizontal a informação da complexidade interna da célula.
A população em rosa, à esquerda no gráfico, corresponde aos linfócitos, que são pequenos, tem baixa florescência e menor complexidade interna.
A população ao lado, em verde, corresponde aos monócitos, que tem mais fluorescência e estrutura interna mais complexa.
Em azul claro teremos os neutrófilos, que tem alta complexidade interna e baixa fluorescência e por fim a população em vermelho corresponde aos eosinófilos, que tem muita complexidade interna devido à intensa granularidade e baixa fluorescência.
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E este é um escatergrama aonde podemos ver aonde cairiam as populações de células anormais. Acima da localização dos linfócitos normais, teríamos os linfócitos anormais, atípicos e blastos, pois estas células tem, em geral maior conteúdo de ácidos nucleicos e assim vão apresentar mais fluorescência.
Seminário em português Já na posição acima dos neutrófilos maduros teremos os granulócitos imaturos, com maior fluorescência.
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Os equipamentos da Sysmex têm uma tecnologia para contagem chamado de análise adaptativa de grupos de células, o ACAS, que faz com que as contagens não sejam prejudicadas por
diferenças entre as células.
Os equipamentos da Sysmex, são fabricados no Japão e vem de lá com um ajuste do local onde cairão as diversas populações celulares, chamados centroides. Então temos os centroides de linfócitos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos.
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Quando se processa um sangue, o equipamento vai medir a distância de cada célula que está sendo analisada, dos centroides iniciais. Neste caso, esta célula está mais próxima do centroide de linfócitos e será identificado como tal.
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A seguir, vai ser gerado um novo centroide na posição intermediária entre o centroide inicial e aquela célula.
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Quando aparece outra célula classificada como linfócito, o equipamento vai gerar outro centroide na posição intermediária entre o anterior e esse novo.
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Isso acontece com todas as populações leucocitárias e desta forma os centroides são otimizados para aquela amostra. Quando se processa uma nova amostra acontece tudo novamente e os centroides são otimizados para a nova amostra.
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Então primeiro é realizada a análise de 500 células e o centroide é fixado, depois são analisadas mais quinhentas células e esse passos são repetidos até 5 vezes. Desta maneira são analisadas no total até 32.000 células.
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15 Assim, o equipamento consegue analisar e contar as células de diferentes amostras, mesmo elas não sendo exatamente iguais umas às outras.
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Nos analisadores da linha XN, além do princípio ACAS, também tem o princípio SAFLAS, que utiliza um algoritmo que faz com que as populações de monócitos e linfócitos alteradas fiquem mais separadas, permitindo a contagem correta, sem interferências.
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O parâmetro clínico avançado de leucócitos é o IG, a contagem de granulócitos imaturos.
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Este parâmetro quantifica as células imaturas de linhagem mielóide, os metamielócitos,
mielócitos e promielócitos. Ele não separa estas células, o resultado compreende estes leucócitos agrupados.
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Podemos ver neste resultado do equipamento o alarme de Presença de IG e alarme de suspeita de desvio à esquerda com as contagens específica e absoluta dos granulócitos imaturos.
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Estes gráficos são os resultados obtidos em um trabalho realizado na universidade de Kyoto, que comparou a contagem automatizada do IG respectivamente com a citometria de fluxo tradicional, no gráfico à esquerda e com a contagem manual de 400 células no gráfico à direita. Em ambos os casos a correlação foi muito boa, com um r de 0,95 para a primeira avaliação e de 0,90 na
segunda.
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Nos equipamentos da linha XN da Sysmex, temos a contagem de granulócitos imaturos para todas as amostras e com isso podemos dizer que que eles fornecem uma contagem diferencial de 6 partes, não mais de cinco.
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Este é um resultado do equipamento XN, aonde podemos ver o alarme da presença de granulócitos imaturos e as contagens relativa e absoluta.
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Agora vamos falar da série plaquetária.
Alguns equipamentos têm mais de uma tecnologia para a contagem de plaquetas, o que auxilia muito no caso de interferência em uma contagem.
As plaquetas têm alguns índices semelhantes aos dos eritrócitos, mas que não estão ainda bem padronizados e não são muito utilizados. O mais utilizado é o VPM, o volume plaquetário médio, que é liberado por alguns laboratórios e que fornece informação importante para o clínico em determinadas situações.
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As plaquetas são produzidas na medula óssea a partir da célula pluripotente ou stem cell, que no processo de diferenciação e maturação vai dar origem ao megacarioblasto e depois ao
megacariócito. Esta é uma célula muito grande, com citoplasma abundante, que vai se romper e dar origem às plaquetas. As plaquetas são fragmentos do citoplasma dos megacariócitos.
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São as menores estruturas do sangue periférico e os valores de normalidade variam de 150.000 a 450.000 por milímetro cúbico.
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A contagem de plaquetas é importante porque permite avaliar um sangramento ou risco de sangramento.
Mas as plaquetas muitas vezes são difíceis de avaliar devido à alta reatividade, elas se ativam muito rapidamente, como podem ver na imagem ao lado.
As contagens manuais têm grande variação, e o principal método de contagem automatizada é a impedância, que é um ótimo método, mas que tem baixa precisão nas plaquetopenias acentuadas e que também podem sofrer algumas interferências.
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Nas contagens manuais a variação é muito grande, tanto na contagem em lâmina quanto na contagem em câmara de Neubauer. O CV da contagem em câmara pode chegar a 25% e na contagem em esfregaço de sangue pode ser maior que 30%. Realmente uma variação muito
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17 grande demonstrada nestes estudos.
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Nas contagens em câmara são muito os fatores que propiciam este CV elevado, tais como diluição, número de quadrantes contados e experiência do analista.
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Nas contagens de plaquetas em lâmina temos um coeficiente da variação ainda maior, devido principalmente à qualidade dos esfregaços, à variação da quantidade de células nos campos escolhidos para a contagem, à variação interpessoal, enfim, à difícil padronização do método. Por este motivo não se recomenda a contagem de plaquetas em lâmina e sim que seja feita a avaliação da quantidade sempre que necessário.
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Já a contagem automatizada de plaquetas por impedância tem um coeficiente de variação bem baixo, menor que 3%, sendo confiável desde que não tenha nenhum alarme na contagem. Atenção: não se pode liberar um resultado de plaquetas que tenha alarme ou asterisco, pois isto significa que ocorreu alguma interferência na contagem. A causa tem que ser verificada e a interferência corrigida.
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Em geral, quando não se tem interferência, estas contagens têm boa exatidão acima de 20.000 por milímetro cúbico.
Nas contagens de plaquetas abaixo de 20.000 há uma perda de precisão e exatidão por estar nos limites da linearidade, pela pequena quantidade de eventos contados e por interferência por partículas de fundo.
Nos analisadores da Sysmex encontramos uma alta linearidade para contagem de plaquetas, que pode chegar até 5.000.000 por milímetro cúbico.
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Já as contagens tanto óptica quanto fluorescente por citometria de fluxo fluorescente também tem CV bem baixo, abaixo de 3% e são utilizadas como uma segunda metodologia em casos que apresentam interferências na contagem por impedância.
Seminário em português A contagem de plaquetas ótica é realizada no canal de reticulócitos dos equipamentos da série X e utiliza o corante fluorescente polimetina.
A contagem de plaquetas fluorescentes está disponível nos equipamentos da série XN, é realizada num canal específico para contagem de plaquetas e utiliza o fluorocromo Oxazina, que tem grande afinidade por plaquetas.
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As plaquetas fluorescentes dos equipamentos XN é uma segunda metodologia que vem resolver as dificuldades encontradas em alguns casos com a contagem por impedância. Por exemplo, nos casos de contagens muito baixas em que há uma perda de exatidão é realizada uma contagem estendida de 6 vezes, que vai melhorar a precisão e minimizar as interferências.
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Para se ter um resultado correto de plaquetas, nos casos com contagens abaixo de 100.000, deve sempre ser verificado o exame anterior, a presença de coágulos e fibrinas no tubo de coleta e verificar a presença de interferentes. Sempre deve ser realizada a checagem na lâmina nos casos que a contagem estiver fora dos limites de aceitação, que tiver algum alarme nos resultados automatizados e que houver grande variação do resultado anterior.
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O parâmetro clínico avançado de plaquetas é a contagem de plaquetas imaturas, o IPF.
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Plaquetas imaturas são plaquetas jovens, que acabaram de ser liberadas da medula óssea e que ainda tem RNA citoplasmático.
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São semelhantes aos reticulócitos da série vermelha, são maiores que as plaquetas maduras e tem conteúdo de RNA.
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As plaquetas imaturas refletem a velocidade da trombopoiese e seu conteúdo de RNA está correlacionado com a atividade megacarocítica.
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19 estão ativos na medula óssea.
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Uma das grandes aplicações da contagem de plaquetas imaturas é que permite diferenciar as causas das trombocitopenias.
Se o motivo da baixa contagem de plaquetas for por falha da medula óssea, a contagem de plaquetas imaturas- IPF será normal ou baixa.
Já se a contagem de plaquetas estiver baixa devido a uma destruição periférica, como ocorre nos casos de purpura autoimune, ou devido a um maior consumo, como nos casos de purpura trombótica, síndrome hemolítica urêmica ou mesmo na coagulação intravascular disseminada, encontraremos uma contagem de plaquetas imaturas aumentada, devido à necessidade da medula repor a perda das plaquetas no sangue periférico.
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Podemos ver neste gráfico de plaquetas ópticas por citometria de fluxo fluorescente, que as plaquetas maduras, que são menores e não tem fluorescência, aparecem nesta população em azul claro e as plaquetas imaturas, maiores e com conteúdo de RNA, que vai emitir fluorescência, aparecem em verde.
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Aqui temos alguns exemplos: em situações normais como no gráfico da esquerda, temos pequena quantidade de plaquetas imaturas circulando, dentro do valor de normalidade.
Já no gráfico da direita, que é um caso de purpura autoimune em uma gestante, temos uma contagem de plaquetas imaturas muito aumentada devido a destruição periférica.
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Já neste slide, podemos ver no gráfico da direita um caso de anemia aplástica onde a medula tem dificuldade de produzir células e aí a contagem de plaquetas imaturas será de normal à baixa.
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Além de ser útil no diagnóstico das causas das trombocitopenias o IPF também fornece uma informação precoce da recuperação das plaquetas pós transplantes e quimioterapia e auxilia na decisão da necessidade da transfusão de plaquetas.
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Esses são alguns valores de referência estabelecidos internacionalmente para o IPF nos equipamentos XE e podemos ver que são muito semelhantes.
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Este é um resultado gentilmente cedido pelo Hospital Aliança de um caso de purpura autoimune com plaquetas baixas e IPF alto, mostrando que a medula está produzindo plaquetas e logo esta plaquetopenia será revertida.
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Já falamos sobre os processos otimizados, sobre tecnologia e agora vamos falar de analistas bem preparados, uma necessidade inquestionável para se ter um hemograma bem feito.
Estes analistas competentes é que vão saber como solucionar os problemas que surgem nos hemogramas automatizados e as interferências que poderemos ter nos resultados.
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No hemograma, podemos ter interferências nas fases pré-analítica, na analítica e na pós- analítica e tanto nos processos manuais quanto nos automatizados.
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Nesta apresentação vamos falar sobre as interferências na fase analítica nas séries vermelha, branca e plaquetária.
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Como já vimos anteriormente, qualquer problema que possamos ter na global de eritrócitos, na hemoglobina e no hematócrito vai acarretar alterações nos índices hematimétricos que são dependentes destes parâmetros.
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Uma amostra muito lipêmica, com plasma leitoso, vai interferir na dosagem de hemoglobina e nos índices hematimétricos que dependem dela, o HCM e o CHCM, que em geral, nos
equipamentos da Sysmex estará muito alto, acima de 37.
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21 equipamento. Para isso, separe uma alíquota, centrifugue levemente somente para separar o plasma, dos eritrócitos e retire cuidadosamente esse plasma com uma pipeta. Atenção: a exata quantidade de plasma retirado deve ser reposta com diluente do equipamento. Então se homogeneíza bem a amostra e repassa no equipamento. A hemoglobina será corrigida e os índices ficarão corretos.
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Outra maneira de solucionar este problema é utilizar um cálculo matemático, mas atenção!!!! Só pode ser usado em amostras com VCM normais.
A fórmula é VCM vezes a global de eritrócitos, sobre o índice constante 2,98 vezes 10.
Aí se tem o valor corrigido da hemoglobina e devem ser usadas aquelas fórmulas que vimos lá atrás para corrigir os índices hematimétricos.
Também serve para corrigir hemoglobina de amostras muito ictéricas.
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Outro interferente importante é a presença de crioaglutininas, que vai fazer com que as hemácias se aglutinem, como podemos ver na imagem, e vai interferir na contagem global de eritrócitos e nos índices hematimétricos que dependem dela, ou seja, o VCM e o HCM.
Como esta aglutinação é causada por um anticorpo frio, a solução é aquecer a amostra a 37º em banho maria, repassar a amostra aquecida no equipamento e fazer um esfregaço. Na maioria dos casos o aquecimento por 15 a 20 minutos resolve esse problema. Em algumas situações temos casos muito resistentes e que podem ficar por horas aquecendo e o grumo de eritrócitos não se desfaz. Nestes casos, muitas vezes temos que manter a amostra aquecida até o processamento, ou coletar o sangue ao lado do equipamento ou ainda aquecer os reagentes do analisador. Outra opção é centrifugar, retirar o plasma, lavar os eritrócitos com salina aquecida por três vezes, ressuspender com salina aquecida com o mesmo volume de plasma retirado e então passar no equipamento. Esta lavagem vai retirar os anticorpos frios, acabando com a aglutinação.
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Na série branca podemos ter problemas tanto na contagem global de leucócitos quanto na contagem diferencial.
Seminário em português Na contagem global de leucócitos por impedância podemos ter vários interferentes devido a tamanho semelhante ao destas células, já que a impedância leva em consideração somente o tamanho. Então a presença de agregados plaquetários, eritrócitos que resistem à lise,
eritroblastos e leucoagregação podem interferir nestas contagens.
Outra situação que temos que levar em conta é quando temos um caso com leucocitose acentuada, que pode ultrapassar o limite de detecção do equipamento.
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Se a contagem de leucócitos é realizada por lise específica teremos uma interferência menor, já que será levada em conta tanto o tamanho da célula quanto sua complexidade interna.
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Isto vai separar mais os leucócitos de interferentes como plaquetas agregadas e eritrócitos resistentes à lise, minimizando os problemas.
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Já nos equipamentos da série XN a contagem global utiliza a fluorescência e a complexidade interna, sendo que neste canal, além da contagem dos leucócitos e dos basófilos, também é realizada a contagem de eritroblastos.
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Esta metodologia também vai separar bastante os interferentes dos leucócitos, minimizando as possíveis interferências.
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Como já abordado anteriormente, os eritroblastos, por serem morfologicamente semelhantes aos linfócitos, vão interferir na contagem global, todos os eritroblastos serão contados como
leucócitos.
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Em casos com contagens de eritroblastos acima de 10, se faz necessária a correção da global de leucócitos por esta fórmula que está no slide.
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23 Se o equipamento fizer a contagem automatizada de eritroblastos -dos NRBC, não será necessário corrigir nem a global de leucócitos nem a contagem diferencial dos linfócitos.
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Os equipamentos XN, qualquer que seja o modelo, liberam a contagem de eritroblastos em todas as amostras. É mais uma importante informação disponível para todos os laboratórios.
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Este é um resultado do XN onde podemos ver o alarme de presença de NRBC e a contagem em porcentagem e absoluta, liberadas em todos os casos.
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Os casos com leucoagregação são mais raros que os de agregação de eritrócitos, mas podem ocorrer, formando estes amontoados de células. Nestes casos vamos ter contagens falsamente diminuídas de leucócitos e interferências na contagem diferencial. Vocês podem pensar em contar a diferencial mesmo com estes agregados, mas não podem. Por cima, em geral ficam os neutrófilos, mas embaixo estarão os monócitos e eosinófilos.
Para solucionar este problema deve coletar uma nova amostra com anticoagulante citrato e EDTA, mantendo os tubos aquecidos à 37ºC.
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Em casos de leucocitose acentuada que ultrapasse a capacidade de detecção do equipamento é necessário fazer a diluição da amostra para que o equipamento consiga fazer a contagem. Nos equipamentos da Sysmex temos uma linearidade muito alta para leucócitos que vai até 440.000 por milímetro cúbico e isto auxilia a não ter que fazer muitas diluições. Atenção, nunca esquecer de multiplicar pelo fator de diluição.
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Falamos até agora na contagem global de leucócitos, vamos ver agora as interferências que podemos ter na contagem diferencial.
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Neste slide está foto de meu pai, que era o responsável pelo laboratório da beneficência portuguesa de Bauru e a minha, no último ano de faculdade. As duas tem muito tempo, mas
Seminário em português porque as coloquei aqui? Primeiramente para homenagear a meu pai, de quem tenho muito orgulho e depois para vocês verem que em 50 anos a contagem diferencial manual continua a mesma: um microscópio, um contadorzinho e um analista. Nada mudou no processo.
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E neste tempo todo, tudo mudou: hoje temos grandes quantidades de exames, a contagem diferencial manual consome muito tempo, há sempre dificuldade de treinar profissionais, aonde é correto realizar a contagem, como está o esfregaço, bem feito, bem corado? E acima de tudo é importante levar em consideração a baixa reprodutibilidade das contagens de 100 células. E quantas células contamos geralmente? 100, não é?
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Podemos ver nesta tabela estatística do Rumke, que em contagens de 100 células quando se encontra por exemplo, 10 monócitos, isto pode variar de 4 a 18. Vejam só a diferença
estatisticamente aceitável! Se forem contadas 10.000 células, esta variação cai para 9,4 a 10,6. Por isto quero dizer, que se o equipamento conta até 32.000 células como no caso dos da Sysmex e se não tiver nenhum alarme, o controle de qualidade estiver OK, não tiver interferentes, o equipamento fornecerá uma diferencial melhor que a de uma contagem manual de 100 células. E porque eu dei o exemplo com monócitos? É comum se escutar: estes equipamentos contam muitos monócitos, eu reconto e sempre acho menos.
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Em geral se faz a contagem diferencial neste zig e zag no meio do esfregaço, mas vejam para onde vão os neutrófilos e monócitos.... Essas células maiores e mais pesadas acabam indo para a
margem e para a cauda do esfregaço e assim não são contadas. Além disso dependendo da qualidade do esfregaço vamos ter a boa distribuição de células comprometida.
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Mas em algumas situações é realmente necessária a contagem diferencial manual: quando tem blastos circulantes e quando o equipamento não consegue separar as populações leucocitárias.
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No primeiro escatergrama vemos grande quantidade de blastos, conforme podemos ver no quadro abaixo. Já no escatergrama da direita, que era um caso de hairy cell, o equipamento não conseguiu separar corretamente as populações.
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Podemos ver neste resultado que toda a diferencial ficou marcada com asteriscos, demonstrando a necessidade da contagem manual.
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Além das situações já comentadas, quando temos um alarme de presença de granulócitos imaturos também se faz necessária a contagem diferencial manual.
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Mas sabemos que diferenciar estes granulócitos imaturos nem sempre é fácil e que é difícil chegar à um consenso.
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A contagem de granulócitos imaturos automatizada, o IG, como já vimos tem ótima correlação com outros métodos e agrupa na contagem os metamielócitos, mielócitos e promielócitos. Isto significa que não será mais necessária a contagem nesses casos? Não! Cada laboratório deve definir o valor de corte. Alguns laboratórios seguem normatização para considerar, desde que não tenha nenhuma outra alteração como neutrofilia, leucocitose, um valor de corte de 3%. Alguns utilizam 2%, depende do laboratório se sentir confortável com estes valores para a população que atende. Por exemplo, é anormal em uma paciente grávida, com todos os parâmetros dentro da normalidade, se encontrar 2 metamielócitos circulantes? Não, não é anormal, mas esta decisão da necessidade da contagem manual será do profissional. Agora, tem uma contagem aumentada de IG, 5,10%, aí sim é obrigatória a contagem manual para separar estas populações de células imaturas.
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E por fim vamos aos problemas que podemos ter na série plaquetária, não adianta fazer que não viu, estes problemas têm que ser resolvidos.
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Já vimos que diferentes tamanhos de células podem interferir nas contagens por impedância, que levam em consideração somente tamanho.
As plaquetas vão estar falsamente aumentadas na presença de esquisócitos, que são fragmentos de eritrócitos e de micrócitos muito pequenos, que serão contados como plaquetas.
Seminário em português Já nos casos com macrotrombócitos e agregados plaquetários as contagens de plaquetas estarão falsamente diminuídas, já que não serão reconhecidas como tal.
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Um problema que aflige a todos é a presença de agregados plaquetários. Este fenômeno acontece apenas in vitro em alguns pacientes e é chamado de pseudo plaquetopenia EDTA dependente. E por que pseudo? Por que não é uma plaquetopenia real... Nestes casos as plaquetas formam grumos que não serão contados como plaquetas, causando uma contagem falsamente diminuída.
Como lidar com esta situação? Importante: nunca liberar a contagem de plaquetas do equipamento, que estará com um asterisco ao lado e que terá um alarme.
Uma primeira solução é liberar apenas uma observação qualitativa, que as plaquetas estão agregadas, mas que estão em número aparentemente normal ou aumentado ou diminuído e à critério do clínico coletar uma nova amostra para a quantificação. Esta nova amostra deve ser coletada em um tubo de EDTA e outro tubo com outro anticoagulante, como citrato ou magnésio. Utilizar apenas a contagem de plaquetas dos tubos com citrato ou magnésio e o restante do hemograma usar os valores obtidos do tudo de EDTA. Se a contagem de plaquetas for realizada em tubo com citrato, não esquecer de levar em conta que este anticoagulante é líquido e vai diluir a amostra em aproximadamente 10%.
Outra maneira para solucionar este problema é solicitar uma nova coleta ao lado do analisador, não dando tempo para que as plaquetas se agreguem.
E por fim, como fazer se se deseja uma contagem naquela amostra com plaquetas agregadas? A alternativa é utilizar o vortex, aquele equipamento que promove uma agitação intensa da amostra. A sugestão é que se retire uma alíquota da amostra, coloque o tubo no vortex em velocidade alta de 3 a 5 minutos. Depois disso passar a amostra no equipamento e fazer uma lâmina para verificar se os eritrócitos não fragmentaram. Em cerca de 80% dos casos os grumos serão desfeitos e as plaquetas poderão ser contadas corretamente.
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Coágulos, microcoágulos e fibrinas podem causar resultados errados de plaquetas. O importante é ser criterioso e verificar se está impactando no resultado. Em caso positivo, solicitar nova coleta.
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27 Em casos com contagem muito elevada de plaquetas, que podem ultrapassar a linearidade do equipamento, se faz necessária a diluição da amostra como o explicado nos casos de leucocitose acentuada. Uma grande vantagem dos equipamentos da Sysmex é a alta linearidade para
plaquetas, que chega a 5.000.000 por milímetro cúbico.
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Vimos até aqui que os problemas são muitos...
Slide 134:
Mas ainda bem que tem soluções... O importante é saber como lidar com eles, ter conhecimento e ser criativo.
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Não se deve ter medo da tecnologia, desde que saiba trabalhar com ela.
Slide 136:
Porque a tecnologia com conhecimento é maravilhosa, mas sem conhecimento é perigosíssima.
Slide 137:
E para concluir, gostaria de falar sobre o verdadeiro diferencial competitivo dos laboratórios. São os profissionais competentes, aqueles que tem uma formação sólida. Que se reciclam, atualizam como vocês tem feito com os Webinars da Sysmex e que tem perfil adequado.
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E para serem bons profissionais, além do já comentado, também são importantes, para não dizer essenciais, algumas habilidades pessoais: bom relacionamento interpessoal, saber trabalhar em equipe, ser flexível, saber negociar. Ter habilidade gerencial é importante para todos, mesmo que não sejam gerentes, para que possam sugerir melhorias, auxiliar na gestão.... Ser proativo sempre e, acima de tudo, saber aprender.
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Este profissional deve ter também bons conhecimentos de informática, de idiomas e técnico-científico.
Seminário em português difícil, triste...
Slide 140:
Mas mudando e se adaptando ás mudanças, tudo pode ficar melhor!!!!
Slide 141:
Agradeço em meu nome e em nome da Sysmex a atenção de vocês e espero que possam aproveitar os outros webinars que estarão sendo disponibilizados para todos.
