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Avaliação histomorfométrica do efeito de diferentes temperaturas de síntese na resposta biológica de hidroxiapatitas carbonatadas contendo alginato de sódio em defeitos críticos de calvárias de ratos

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA

AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DO EFEITO DE

DIFERENTES TEMPERATURAS DE SÍNTESE NA

RESPOSTA BIOLÓGICA DE HIDROXIAPATITAS

CARBONATADAS NANOESTRUTURADAS CONTENDO

ALGINATO DE SÓDIO EM DEFEITOS CRÍTICOS DE

CALVÁRIAS DE RATOS

Niterói 2014

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FICHA CATALOGRÁFICA

U99 Uzeda, Marcelo José Pinheiro Guedes de

Avaliação histomorfométrica do efeito de diferentes temperaturas de síntese na resposta biológica de hidroxiapatitas carbonatadas contendo alginato de sódio em defeitos críticos de calvárias de ratos / Marcelo José Pinheiro Guedes de Uzeda ;orientador: Prof.ª Dr.ª Mônica Diuana Calazans Maia – Niterói: [s.n.], 2014.

50 f.: il.

Inclui gráficos e tabelas

Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2014.

Bibliografia: f. 39-43

1.Hidroxiapatita carbonatada 2.Reparo ósseo 3.Ratos I. Calasans-Maia, Mônica Diuana [orien.] III.Título

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA

AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DO EFEITO DE

DIFERENTES TEMPERATURAS DE SÍNTESE NA

RESPOSTA BIOLÓGICA DE HIDROXIAPATITAS

CARBONATADAS NANOESTRUTURADAS CONTENDO

ALGINATO DE SÓDIO EM DEFEITOS CRÍTICOS DE

CALVÁRIAS DE RATOS

MARCELO JOSÉ PINHEIRO GUEDES DE UZEDA

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.

Área de Concentração: Clínica Odontológica.

Orientador: Profa. Dra. Mônica Diuana Calasans Maia

Co-orientador: Prof. José Mauro Granjeiro

Niterói 2014

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BANCA EXAMINADORA

Prof(a). Dr(a). Mônica Diuana Calasans Maia Instituição: Universidade Federal Fluminense

Decisão: _________________________Assinatura: ________________________ Prof. Dr. Marcelo Henrique Prado da Silva

Instituição: Instituto Militar de Engenharia

Decisão: _________________________Assinatura: ________________________

Prof. Dr. José Mauro Granjeiro

Instituição: Universidade Federal Fluminense

Decisão: _________________________Assinatura: ________________________ APROVADO

APROVADO

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AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, quero agradecer a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho e peço desculpas antecipadas por alguma omissão.

Aos meus pais Conrado e Gilda pelo amor, carinho, exemplo, educação e apoio logístico. Meus Mestres pela vida afora.

À minha esposa Cristiana por todo seu amor, dedicação, incentivo, compreensão... por tudo. Minha genuína pesquisadora, sem você nada teria a menor importância!

Aos meus filhos queridos e amados João e Clara, alegria no meu cotidiano, motivação que me mantém sempre atento às minhas palavras e atitudes na tentativa de tornar-me cada vez melhor.

Aos meus irmãos, sobrinhos e amigos. A toda família de um modo geral, berço de paz, tranquilidade e apoio em todas as horas.

À querida professora Adriana Cury, minha colega e amiga, por abrir-me as portas e dar o “pontapé” inicial. Sem isso, provavelabrir-mente eu não estaria aqui agora.

Aos técnicos do LABA Marco Antônio e Welington pela competência e boa vontade em todas as horas.

Aos funcionários da PPGO João e Lucí por sua presteza e simpatia.

Ao colega e “parceiraço” Rodrigo Resende pela colaboração e orientação na experimentação animal. Sua ajuda foi fundamental. Agradeço também pela amizade.

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À querida professora Adriana Terezinha por sua boa vontade, amizade e disponibilidade na captura das imagens e na análise histológica.

A Silvia Albuquerque, Química do CBPF, por seu carinho em todos os momentos, seus ensinamentos na síntese dos materiais e por estar sempre disposta a ajudar e resolver prontamente nossos “problemas de última hora”.

Ao professor José Mauro Granjeiro, por sua enorme capacidade de contagiar a todos com seu entusiasmo e conhecimento mesmo sobre os supostamente mais áridos assuntos.

À minha querida orientadora, Mônica Calasans, faço aqui um agradecimento especial por sua dedicação, disponibilidade e competência. Por sua atenção e boa vontade em sempre ensinar e principalmente, por sua confiança em meu trabalho. Muito obrigado por tudo.

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Se tu estás verdadeiramente comprometido com tua meta...O universo inteiro conspira a teu favor para que apareçam os instrumentos e pessoas, que te

permitirão lográ-lo”

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RESUMO

Uzeda MJPG. Avaliação histomorfométrica do efeito de diferentes temperaturas de síntese na resposta biológica de hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas contendo alginato de sódio em defeitos críticos de calvárias de ratos[dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2014.

Por sua bioatividade e capacidade de bioabsorção, as hidroxiapatitas carbonatadas não cerâmicas contendo alginato de sódio (cHA) tem sido recomendadas como substitutos ósseos alternativos às hidroxiapatitas cerâmicas. Com o objetivo de estabelecer a melhor temperatura de síntese, este estudo avaliou a resposta biológica às cHAs nanoestruturadas não cerâmicas sintetizadas sob três diferentes temperaturas 5°C, 37°C e 90°C, comparadas à hidroxiapatita cerâmica (HA), em defeitos críticos de calvária de ratos. Foram utilizados 72 ratos Wistar divididos em 4 grupos de 18 indivíduos para cada biomaterial, com 6 indivíduos por período experimental de 30, 90 e 180 dias. Os defeitos críticos foram produzidos nas calvárias dos ratos e preenchidos com os diferentes biomateriais. Após os respectivos períodos experimentais os animais foram eutanasiados para obtenção das amostras. As amostras foram clivadas e cada metade foi processada para inclusão em parafina e em resina. As amostras descalcificadas, fixadas em solução de formaldeído e incluídas em parafina, foram coradas com HE, analisadas histologicamente e submetidas a avaliação histomorfométrica com análise estatística através dos testes de Análise de Variância para comparação entre os grupos e teste de Kruskal-Wallis (p<0,05) para comparação entre os períodos experimentais. As amostras não descalcificadas, fixadas em solução alcoólica e incluídas em resina, foram analisadas através de microscopia de luz polarizada. Os resultados mostraram que a temperatura de síntese exerce influência sobre a capacidade de bioabsorção do material assim como sobre sua capacidade de osteocondução. O teste de Kruskal-Wallis mostrou diferença para os grupos de cHA 5°C e 90°C entre 30 e 180 dias em relação a quantidade de osso neoformado (p<0,05). A análise de variância mostrou diferença significativa entre os grupos em relação à bioabsorção dos materiais (p<0,05). Em um animal do grupo cHA 5ºC de 180 dias, houve o completo fechamento do defeito crítico por osso neoformado. Concluímos que dentre todos os biomateriais comparados, a cHA 37ºC apresentou

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maior capacidade de bioabsorção enquanto que a cHA 5ºC, menos cristalina, conduziu a maior quantidade de osso neoformado.

Palavras-chave: Hidroxiapatita carbonatada, Reparo ósseo, Bioabsorção, Osteocondução, calvária, ratos.

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ABSTRACT

Uzeda MJPG . Histomorphometric evaluation of different synthesis temperatures effect in organic response of nanostructured carbonated hydroxyapatites containing calcium alginate in critical size defects in rat calvaria [dissertation]. Niterói: Fluminense Federal University, College of Dentistry; 2014.

Because of its bioactivity and biosorption capacity, non-ceramic carbonated hydroxyapatite containing calcium alginate (cHA) has been recommended as an alternative bone substitute to ceramic hydroxyapatite. In order to establish the best synthesis temperature, this study evaluated the biological response to non-ceramics cHAs synthesized under three different temperatures: 5°C, 37°C and 90°C, compared to ceramic hydroxyapatite (HA) in critical defects of rat calvaria. 72 Wistar rats were divided into 4 groups of 18 individuals for each biomaterial and 6 individuals were used per experimental period of 30, 90 and 180 days. Critical size defects were produced in rat calvaria and filled with various biomaterials. After the respective experimental period, the animals were euthanized to obtain samples. The samples were cleaved and each half was processed for embedded in paraffin and resin. Decalcified samples, fixed in formaldehyde and embedded in paraffin, were stained with HE and histologically analyzed and subjected to histomorphometric assessment with Kruskal-Wallis test (p < 0.05) for comparison between experimental periods. Non-decalcified samples, fixed in alcoholic solution and embedded in resin, were analyzed by polarized light microscopy. The results showed that the synthesis temperature influences the material biosorption capacity and its osteoconductive ability. The Kruskal-Wallis test showed significant difference for groups cHA 5° C and 90° C between 30 and 180 days in amount of new bone formation (p <0.05). The variance analysis showed significant difference between the groups regarding the material biosorption (p < 0.05). In one animal in the group cHA 5ºC 180 days, there was complete closure of the critical size defect by new bone. We conclude that, among all biomaterials compared, cHA 37°C showed the highest biosorption capacity while cHA 5°C , less crystalline, led to the largest amount of newly formed bone.

Keywords : Carbonate hydroxyapatite, Bone repair, Biosorption, Osteoconduction , Calvaria, Rat.

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1 - INTRODUÇÃO

Ao longo da história, a busca por materiais biomiméticos capazes de substituir os tecidos orgânicos desempenhando de forma competente as suas funções, tem sido uma grande obsessão para os pesquisadores. É consenso que os enxertos ósseos autógenos, dentre todos os substitutos ósseos são o padrão ouro. Entretanto, apresentam restrições que vão desde a sua limitada disponibilidade, passando pelo maior custo devido à necessidade de um segundo sítio cirúrgico para sua obtenção (área doadora), indo até ao aumento da morbidade pela necessidade de um maior período de recuperação do paciente e pelo maior risco de infecções. Associado a isto, há ainda a imprevisibilidade do seu grau de bioabsorção durante o período cicatricial. Diante desta realidade, torna-se imperiosa a necessidade de se desenvolver materiais osteosubstitutos que cumpram com eficiência o seu papel, criando assim uma alternativa de excelência para o campo médico e odontológico. Devido as suas características físico-químicas semelhantes às de tecidos ósseos e dentários, as cerâmicas à base de fosfato de cálcio vêm sendo intensamente estudadas nas últimas décadas. Dentre elas, a hidroxiapatita (HA - Ca10(PO4)6(OH)2 ) tem sido a mais investigada e utilizada, desempenhando ótimo papel como substituto ósseo em cirurgias ortopédicas e bucomaxilofaciais. Biocompatibilidade e bioatividade são as principais características necessárias para que esses materiais exerçam as funções desejadas. A HA, por ser o principal constituinte da fase inorgânica do osso, guarda características químicas e estruturais que possibilitam seu uso na área médica como material biocompatível em implantes e próteses. Na área odontológica, a HA é utilizada tanto na preservação da arquitetura alveolar após a extração de um ou vários elementos dentários, quanto para recuperar áreas estruturalmente ósseo-deficientes, seja por reabsorções fisiológicas ou mesmo por patologias destrutivas. No entanto, dependendo do processo de fabricação utilizado para sua obtenção, as HAs poderão apresentar características físico-químicas diferentes como acontece com as HAs na forma comercial para o uso clínico. Após a sinterização, tratamento térmico que lhe confere alta cristalinidade, as HAs perdem a característica de um material nanoestruturado, diminuindo sua capacidade de bioabsorção. Lembramos aqui que sendo o osso

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humano um nanocompósito, a perda da característica nanoestruturada confere ao material menor semelhança com o tecido que se deseja mimetizar.

Devido a essas variações, diversas propriedades ainda precisam ser determinadas para que se assegure seu adequado comportamento in vivo. O controle de tais parâmetros é de extrema importância, pois variam de acordo com a metodologia empregada na preparação da amostra e nos tratamentos durante e após a sua síntese. Motivados por essas dificuldades e no intuito de ampliar a capacidade terapêutica das HAs, a modificação de sua composição química através da substituição do grupo fosfato (PO4) pelo grupo carbonato (CO3), levou os pesquisadores à síntese de uma hidroxiapatita carbonatada, que se não tratada termicamente permanece com as características nanométricas e não cerâmicas superando as limitações anteriormente citadas. A síntese da cHA e sua associação a polímeros bioabsorvíveis a torna mais similar ao osso natural, de maneira a estimular suas propriedades como agente osteocondutor e facilitar seu processamento no formato mais adequado à aplicação clínica. O objetivo desta pesquisa foi, portanto, estabelecer a melhor temperatura de síntese, dentre as cHAs estudadas, observando as propriedades de osteocondução e bioabsorção.

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2 - OBJETIVOS

2.1 - Objetivo Geral

Avaliar o reparo tecidual e absorção de biomaterial osteosubstituto constituído de hidroxiapatita carbonatada nanoestruturada não cerâmica contendo alginato de sódio sintetizada sob três diferentes temperaturas (5°C, 37°C e 90°C) comparadas com a hidroxiapatita estequiométrica sinterizada (controle) após a implantação em defeitos críticos em calvária de ratos.

2.2 - Objetivos Específicos

2.2.1- Caracterizar físico-quimicamente os biomateriais antes da sua implantação através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Difração de RX (DRX) e Espectroscopia Vibracional no Infra Vermelho por Transformada de Fourier (EVIF);

2.2.2- Avaliar quantitativamente, por histomorfometria, a área de osso neoformado e de tecido conjuntivo nos diferentes grupos de acordo com os períodos experimentais;

2.2.3- Avaliar quantitativamente, por histomorfometria, a área de biomaterial remanescente nos diferentes grupos, de acordo com os períodos experimentais;

2.2.4- Avaliar a propriedade osteocondutora dos biomateriais;

2.2.5- Avaliar, através microscopia de luz polarizada, as amostras não desmineralizadas.

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3 - METODOLOGIA

3.1 Biomateriais

As amostras de cHA compostas por partículas menores que 20nm com estequiometria variando entre 1,6<Ca/P<2,0, e as amostras de hidroxiapatita estequiométrica (Ca/P = 1,67), foram sintetizadas e caracterizadas no Laboratório de Biomateriais (LABIOMAT) do Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF) sob a coordenação do pesquisador Dr. Alexandre Malta Rossi. As cHAs foram sintetizadas em 3 diferentes temperaturas 5ºC, 37ºC e 90ºC e não receberam tratamento térmico (não sinterizadas) sendo comparadas com a hidroxiapatita sintetizada a 90ºC com tratamento térmico de sinterização a 1100ºC. Os biomateriais foram caracterizados antes da implantação na calvária dos animais para definir características estruturais e superficiais através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura(MEV), difração de RX(DRX) e espectroscopia vibracional no infravermelho por transformada de Fourier(EVIF).

3.1.1 Confecção das Esferas

A preparação das cHA seguiu o método de precipitação por via úmida contendo 6 wt% CO3 e razão Ca/P de 1,72, nas temperaturas de síntese de 5°C, 37°C, e 90°C pela adição de fosfato de amônio ((NH4)2HPO4), carbonato de amônio ((NH4)2CO3) e nitrato de cálcio (Ca(NO3)2.4H2O) (Figura 1). Utilizou-se uma taxa de adição de 30mL/min, com agitação magnética de 240 rpm, tempo de digestão de 180 minutos e pH=12 (Figura 2).

Figura 1: Material da adição para confecção da cHA: (A) Fosfato de amônio; (B) Carbonato de

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Uma vez que a adição dos reagentes foi concluída, o sólido sintetizado foi lavado com água ultrapura (MilliQ®, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) até a neutralização do pH ao nível de pH=7 sendo então filtrado sob vácuo para obtenção de uma pasta (Figura 3).

O material pastoso foi seco por processo de liofilização e separado através de peneiras de aço inox, para evitar a contaminação, segundo faixa de granulometria entre 37 m e 74 m (Figuras 4A, 4B, 4C).

Figura 2: Processo da digestão da cHA. (A) Antes da adição; (B) Depois da adição.

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Os materiais em forma de pó (de 37m a 74m) das respectivas cHAs foram misturados a uma solução de alginato de sódio 1% na proporção de 15:1 com agitação para a formação de uma pasta cerâmica. Por extrusão através de agulha 24G (BD), a pasta cerâmica foi gotejada em solução de cloreto de cálcio (CaCl2), para a conversão do alginato de sódio em alginato de sódio, transformando-se em esferas. As esferas ficaram na solução de cloreto de cálcio durante 24h e após este período foram lavadas 5 vezes com 500mL de água ultrapura (MilliQ®). As esferas obtidas foram liofilizadas e após 24h foram selecionadas através de peneiras graduadas para a faixa de 425 a 600μm de tamanho. Uma amostra destas esferas com dimensões de 425 μm à 600μm foi separada para a caracterização estrutural e superficial através de MEV(FEI Quanta FEG 250 – Instituto Militar de Engenharia), DRX(Zeiss HZG4; radiação de CuKa (= 1,5418 Å) e varredura angular de 10 – 100° com passo de 0,05/s) e EVIF(Schimadzu, IR-Prestige 21 com detector DTGS KBr e separador de feixes de KBr). A outra parte foi embalada e esterilizada em radiação gama (15 kGy por amostra), através do Irradiador de Cobalto 60 numa taxa de dose de19.72 Gy/min durante 760 minutos (COPPE – Instituto Alberto Luiz Coimbra/UFRJ), sendo lacradas até o procedimento cirúrgico (Figura 5A, 5B, 5C).

Figura 4: (A) Material pastoso colocado nos potes para a liofilização; (B) Material sendo liofilizado;

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3.2 Caracterização dos animais

Este projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense (CEUA/UFF) sob o nº 194/10 (Anexo 1) e os procedimentos realizados seguiram as Diretrizes da Prática de Eutanásia do CONCEA, disponível em http://concea.mct.gov.br

Foram utilizados 72 ratos Wistar, de ambos os gêneros, com peso entre 300 a 400 gramas, fornecidos pelo Núcleo de Animais de Laboratório (NAL), da Universidade Federal Fluminense localizada em Niterói, Rio de Janeiro. Antes e durante o período experimental os animais foram mantidos em mini-isoladores (n=2) sendo alimentados por ração peletizada e água à vontade. Seis animais foram escolhidos aleatoriamente para cada grupo experimental (cHA 5°C, cHA 37°C, cHA 90°C e HA 90°C) nos períodos experimentais de 30, 90 e 180 dias, totalizando 24 animais por período experimental (Figura 9). Os animais foram privados de ração seis horas antes do ato operatório sendo permitido o consumo de água. Os animais foram operados sob anestesia geral, recebendo como medicação anestésica 20mg/kg de Quetamina (Francotar® – Virbac, São Paulo, SP, Brasil) associada a 1 mg/kg de Xilazina (Sedazine® – Fort Dodge, IA, USA), por via intraperitoneal. Após observar ausência de reflexos à dor, foi realizada tricotomia das calvárias, degermação e antissepsia com solução de Digliconato de Clorexidina 2% (Figura 10A). Os animais foram instalados na mesa operatória para colocação dos campos cirúrgicos esterilizados. Uma incisão semilunar foi realizada sobre a calvaria de cada

Figura 5: (A) Gotejamento para formação das esferas; (B) Esferas selecionadas; (C) Esferas

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animal através do uso de cabo de bisturi n°3 (Bard Parker®, Caledonia, MI, USA) com lâmina n°15 C (Becton- Dickinson®, Curitiba, PR, Brasil) (Figura 10B). Após a incisão e o descolamento subperiostal com exposição da área óssea desejada, foi realizada uma perfuração com broca trefina de diâmetro interno de 8mm (SIN®, São Paulo, SP, Brasil) em rotação baixa e intermitente (1200 RPM) acoplada ao contra-ângulo redutor 16:1 (Kavo®, Joinvile, SC, Brasil) e micro motor elétrico (BLM 600 Plus, V K Driller®, Jaguaré, SP, Brasil), com irrigação profusa de solução de cloreto de sódio a 0,9% (Darrow Laboratórios S.A., Areal, RJ, Brasil) (Figura 10C). Os defeitos críticos criados (Figura 10D), foram preenchidos com os biomateriais de acordo com os respectivos grupos experimentais numa quantidade de aproximadamente de 1g para cada calvária. Após a implantação das esferas de cHA nos defeitos (Figura 10E), a pele foi suturada em um único plano com pontos simples e separados de fio de sutura mononylon 5.0 (J&J Ethicon®, São Paulo, SP, Brasil) (Figura 10F). As feridas operatórias foram deixadas descobertas e todos os animais receberam medicação anti-inflamatória e analgésica por meio de injeção intramuscular de Maxicam® (Ourofino Pet®, Cravinhos, SP, Brasil) 1mg/kg, em dose única. Para a recuperação anestésica, os animais foram devolvidos aos mini isoladores, recebendo ração e água à vontade.

Figura 6: Distribuição dos materiais e dos animais de acordo com os períodos experimentais.

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Figura 7: Procedimentos cirúrgicos realizados para implantação dos biomateriais. (A) Tricotomia e

antissepsia da região; (B) Incisão e descolamento do periósteo para exposição do plano esquelético;

(C) Fresa trefina de 8 mm de diâmetro posicionada no centro da calvária; (D) Defeito crítico realizado

preservando as camadas da meninge; (E) Defeito preenchido com as microesferas do biomaterial; (F) Sutura realizada com pontos simples interrompidos.

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Decorridos os períodos experimentais de 30, 90 e 180 dias sem apresentarem qualquer sinal inflamatório ou necrose nas regiões operadas, os animais foram avaliados clinicamente e em seguida eutanasiados através de dose letal de anestésico geral (150 mg/kg de Tiopental). Os blocos ósseos contendo os implantes de HA e cHA foram removidos com discos diamantados montados em mandril (K. G. Sorensen®, Cotia, SP, Brasil) para peça reta (Kavo®) acoplado a micro motor elétrico (Driller BLM 600 Plus®), sob baixa e intermitente rotação, com irrigação constante de solução salina fisiológica 0,9% (Figura 11A e 11B).

3.3 Processamento das amostras

Cada amostra obtida foi dividida em dois segmentos iguais contendo, cada um, a metade do defeito. Setenta e duas metades das amostras foram fixadas em solução de formol tamponado 4% e enviadas ao Laboratório Histotech Lâminas Didáticas onde foram descalcificadas e incluídas em parafina (Quadro 1) recebendo cortes seriados de 5μm de espessura, paralelo ao plano sagital e corados com Hematoxilina e Eosina (HE) (Figura 12B). As outras setenta e duas metades das amostras não descalcificadas e fixadas com álcool 70º foram incluídas em blocos de resina acrílica (Quadro 2) no Laboratório de Biotecnologia Aplicada (LABA) da Universidade Federal Fluminense, sendo cortados e polidos até a espessura de cerca de 100 μm (Figura 12A).

Figura 8: Procedimentos para obtenção das amostras. (A) Animal eutanasiado com as

osteotomias realizadas na calvária mantendo uma margem em torno da árae da implantação; (B) o bloco ósseo contendo o biomaterial implantado que será dividido em duas metades iguais.

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As lâminas obtidas dos blocos descalcificados foram observadas em um microscópio optico em campo claro (Zeiss - AXIO) e as imagens selecionadas, capturadas por uma câmera digital (AxioCam – MRC). A análise descritiva da resposta tecidual aos biomateriais foi realizada em função da presença de tecido conjuntivo e osso neoformado no defeito criado, além da bioabsorção dos biomateriais. A histomorfometria foi realizada através do programa Image Pro Plus 6.0® (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA) através do qual foi criada uma grade de 156 cruzes que foi superposta as imagens. Em seguida foram estabelecidas as classes de Osso Neoformado, Biomaterial, Tecido Conjuntivo, Osso pré-existente e

Figura 9: Amostra dicotomizada e cada metade recebeu um tipo de processamento

histológico. (A) metade não descalcificada incluída em resina e (B) Metade descalcificada incluída em parafina.

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Outros (Figura 13). Os registros quantitativos dessas informações foram armazenados em um banco de dados elaborado em planilha do software Microsoft Excel® e transferidos para o software Prism® versão 6.0 utilizado para a realização da análise estatística. A descrição quantitativa da área de tecido conjuntivo e da área de osso neoformado foi representada através de descrição paramétrica com médias e desvio padrão. As medidas de variabilidade foram avaliadas com significância de 5% (α=0,05). Para comparar as variáveis da área de osso neoformado, de tecido conjuntivo e biomateriais, foram utilizados o teste de Análise de Variância e o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis*, indicando as diferenças entre os períodos. A análise estatística entre os grupos experimentais e o controle foi realizada através da comparação entre a quantidade de área de osso neoformado e de tecido conjuntivo na área do defeito crítico além da presença do biomaterial remanescente em cada período experimental.

As lâminas obtidas dos blocos não descalcificados com 100 µm de espessura foram analisadas microscopicamente pela técnica de microscopia de Luz polarizada, realizadas no Laboratório de Biomineralização da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, RJ).

*Utilizado devido ao fato dos resultados do teste paramétrico não terem apresentado normalidade

Figura 10: Imagem representativa da grade de 156 cruzes e os pontos considerados (Image

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4 – ARTIGO (Formatado para a revista Journal of Biomedical Materials Research Part B)

THE SYNTHESIS TEMPERATURES INTERFERE ON BIOLOGICAL RESPONSES OF CARBONATED HYDROXYAPATITE/SODIUM ALGINATE

Marcelo José Uzeda – Student Graduate, Dentistry School, Fluminense Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.

Adriana T. N. Novelino Alves – MS, Student Graduate, Dentistry School, Fluminense Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.

Rodrigo F. B. Resende – MS, Student Graduate, Dentistry School, Fluminense Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.

Alexandre Malta Rossi – PhD, Senior researcher Brazilian Center for Physics Research, CBPF, Rio de Janeiro Brazil, Coordinator LABIOMAT - Biomaterials Laboratory from Brazilian Center for Physics Research.

José Mauro Granjeiro – PhD, Senior Researcher from Bioengineering Program, National Institute of Metrology, Quality and Technology, Duque de Caxias, RJ, Brazil. Associate Professor, Dentistry School, Fluminense Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.

Monica Diuana Calasans-Maia PhD, Associate Professor of Oral Surgery, Dental Clinical Research Center, Oral Surgery Department, Dentistry School, Fluminense Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.

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Corresponding author: Marcelo José Uzeda

R. Cel. Moreira César 229/1120 - Niterói

24230-052 – Rio de Janeiro – Brazil Tel.: 55 21 99884674

mjuzeda@oi.com.br

Reprint:

Marcelo José Uzeda

R. Cel. Moreira César 229/1120 - Niterói

24230-052 – Rio de Janeiro – Brazil Tel.: 55 21 99884674

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study evaluated the biological behavior of carbonated hydroxyapatite containing sodium alginate (cHA) synthesized under three different temperatures (5°C, 37°C and 90°C) and compared to stoichiometric sintered hydroxyapatite. Seventy-two Wistar rats were divided into four groups of 18 animals each and distributed over three experimental periods of 30, 90 and 180 days (n=6). Critical size defects were produced in the rat calvaria and filled with biomaterials according to each experimental group. Decalcified samples were histologically processed as follows; after being embedded in paraffin, the samples were cut into 5 μm-thick sections and stained with hematoxylin and eosin (HE) for light microscopy and histomorphometric evaluation. Polarized light microscopy was used to evaluate newly formed bone in the samples. The results showed that cHA synthesized at 37°C (p<0.05) had the highest resorption capacity, while cHA synthesized at 5ºC led to greatest amount of new bone formation (p<0.05). There was only one animal in the cHA 5ºC group after 180 days that showed complete closure of the critical-size defect with newly formed bone. According to the results obtained, we conclude that the synthesis temperature of biomaterials influences biological responses, resorption and bone repair.

KEY-WORDS: Carbonated hydroxyapatite, Bone repair, Osteoconduction, Critical-size defect, Rats.

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To regenerate bone tissue lost from surgical removal due to trauma, cancer or other pathologic conditions, autografts, or healthy bone from the host, have always been the ideal choice to fill the defect site1. The consensus is that autogenous bone grafts are the gold standard among all bone substitutes. However, there are restrictions such as its limited availability (and higher cost) due to the need for a second surgical site to obtain it (donor area) and increased morbidity with the need for a longer period of patient recovery and the increased risk of infection1-4. Additionally, the degree of their resorption during the healing period is unpredictable. Given this reality, it is imperative to develop artificially prepared materials that work efficiently as bone substitutes, thus creating an excellent alternative.

Because it has similar physicochemical characteristic to those of dental tissues and bone, calcium phosphate ceramic has been intensively studied in recent decades. Among them, hydroxyapatite (HA; Ca10(PO4)6(OH)2) has been widely applied as a bone substitute for several decades, is the most widely investigated and used bone substitute and plays a large role in orthopedic and maxillofacial surgery5-9.

Biocompatibility and bioactivity are key characteristics required for these materials to perform the desired functions. HA is the main constituent of the inorganic phase of bone and has chemical and structural features that allow its use in the medical field as biocompatible implants and prostheses10,11. In maxillofacial surgery, HA is used both in the preservation of alveolar bone after extraction and to augment bone area that is deficient through either physiological resorption or even destructive pathologies12-14. However, HA is scarcely resorbed and remains in the body for an extended period of time, so replacement with new bone tissue is very minimal. After sintering, HA loses the characteristics of a nanostructured material, which reduces its

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nanostructural characteristics by HA leads to low similarity with the tissue that it is meant to mimic16,17.

Due to these variations, several properties have yet to be determined to ensure its appropriate behavior "in vivo”. The control of these parameters is of utmost importance, as they will vary depending on the methodology used to prepare the sample and the treatments performed after its synthesis. Motivated by these difficulties and to broaden the therapeutic capacity of HA, modification of its chemical composition by replacing either the phosphate group (PO4) and/or hydroxyl group (OH) with carbonate (CO3) led researchers to the synthesis of a carbonated hydroxyapatite. Without heat treatment, it remains a nanosized ceramic that overcomes the limitations cited above. The synthesis of carbonated hydroxyapatite and its association with resorbable polymers makes it more similar to natural bone in order to encourage its properties as an osteoconductive agent and to facilitate its processing in forms that can be used in clinical applications18,19. Therefore, the aim of this study was to establish the best synthesis temperature for nanostructured carbonated hydroxyapatite containing sodium alginate (cHA) by observing its properties of osteoconduction and resorption and bone repair.

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Biomaterial Processing

In this study, 425 to 600 μm microspheres composed of nanostructured carbonated hydroxyapatite containing sodium alginate prepared by a wet precipitation method and containing 6 wt % CO3, with stoichiometry ranging between 1.6 < Ca/P <2.0, as well as stoichiometric HA microspheres (Ca/P=1.67), were synthesized and characterized in the Biomaterials Laboratory (LABIOMAT) of the Brazilian Center for Physics Research (CBPF). The cHA was synthesized at 3 different temperatures (5ºC, 37ºC and 90ºC) without receiving heat treatment (not sintered), thus maintaining their nanoscale features, while HA was synthesized at 90°C with thermal treatment (sintering at 1100°C). Prior to implantation in the rat calvaria, the biomaterials were characterized by scanning electronic microscopy (SEM – JEOL FEG 250) to examine the spheres’ morphology and their surface. Vibrational spectroscopy with Fourier-transformed infrared (FTIR – Prestige 21, Schimadzu) was performed to determine the chemical groups present, and the crystalline mineral phases present in the samples and their crystallinity were examined by X-ray diffraction (XRD – CuKa Radiation, ZeissHZG4). The biomaterials were packaged and sterilized by gamma irradiation (15 kGy/sample – Cobalt 60 irradiator at a dose rate of 19.72 Gy/min for 760 minutes).

Animals and Protocol Design

This project was approved by the Ethics Committee on Animal Use of Fluminense Federal University (CEUA / UFF) number 194/10, and the procedures performed followed the CONCEA Guidelines of Euthanasia Practice20.

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400 grams were divided into four groups of 18 animals each distributed over experimental periods of 30, 90 and 180 days. Each group was divided into 3 subgroups of 6 individuals for each biomaterial and experimental period. The animals underwent general anesthesia with 20 mg/kg ketamine (Francotar®, Virbac, São Paulo, Brazil) and 1 mg/kg Xylazine (Sedazine®, Fort Dodge, USA) intraperitoneally. After noting the absence of pain reflexes, trichotomy and antisepsis of the calvaria were performed. A semilunar incision was made on the calvaria of each animal. After the incision and subperiosteal detachment, a surgical defect was created using an 8 mm internal diameter trephine drill at intermittent low speed (1200 rpm) coupled to a 16:1 handpiece and micro-electric motor with profuse irrigation with 0.9 % sodium chloride. The critical-size defects created were filled with around 1g the biomaterials according to their experimental groups. After filling the defect with cHA microspheres, the skin was sutured in a single plane with simple interrupted sutures with mononylon 5.0 (J&J Ethicon®, São Paulo, Brazil). The wounds were left uncovered, and all animals received anti-inflammatory medication by intramuscular injection of a single dose of Maxicam® 1 mg/Kg (Ourofino Pet, Cravvinhos, SP, Brazil). For recovery from anesthesia, the animals were returned to the isolators and received food and water ad libitum. After 30, 90 and 180 days and without presenting any inflammatory signs in the operated area, the animals were euthanized with an overdose of general anesthetic (Thiopentax®, 150 mg/kg; Cristália, São Paulo, Brazil). Bone blocks containing the cHA and HA implants were obtained and divided into two equal segments, each containing half of the defect. Seventy-two halves of the samples were decalcified and embedded in paraffin and were then sliced into serial sections of 5 μm thickness transverse to the plane of the implant, then stained with hematoxylin and eosin (HE). The slides obtained from the decalcified blocks were

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camera. A descriptive analysis of the tissue response to the biomaterials was performed due to the presence of connective tissue and newly formed bone in the defects beyond the resorption of the biomaterials. Histomorphometric evaluation was performed using Image-Pro Plus® 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Quantitative records of this information were stored in a database developed in Microsoft Excel® spreadsheet software and transferred to Prism® 6.0 software (GraphPad Software, Inc., California, USA) for statistical analysis. A quantitative description of the connective tissue area and the area of newly formed bone was performed by parametric description with means and standard deviations. Variability measures were evaluated with a significance level of 5 %. To compare the variables in the areas of newly formed bone, connective tissue and biomaterials, analysis of variance (ANOVA) and the Kruskal-Wallis test were used to investigate the differences between periods. Statistical analysis between experimental and control groups were performed by comparing the amount of area of newly formed bone and connective tissue in the critical defect and the presence of the remaining biomaterial for each experimental period. The other 72 halves of the samples were not decalcified and were embedded in methylmethacrylate in the Laboratory of Applied Biotechnology (LABA) at Fluminense Federal University; they were then cut and polished to a thickness of approximately 100 µm. These halves were analyzed using polarized light microscopy (Zeiss Axioplan) at the Biomineralization Laboratory, Biologic Science Institute, Rio de Janeiro Federal University, Rio de Janeiro, Brazil.

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SCANNING ELECTRON MICROSCOPY

The analysis of the biomaterials by SEM that was performed before implantation showed that cHA synthesized at 5º C had denser and more amorphous surface morphology when compared with the other cHAs and HA. HA had higher surface roughness compared to all other materials (Figures 1 and 2).

X-RAY DIFFRACTION

The XRD patterns of the cHA showed peaks corresponding to a standard hydroxyapatite (PCPDFWIN 09.0432 / CBPF). It was noted that as the synthesis temperature decreased, there was a broadening of peaks characteristic of a decrease in material crystallinity (Figure 3). This decrease in crystallinity has a direct influence on the degree of dissolution of these materials.

VIBRATIONAL SPECTROSCOPY WITH FOURIER-TRANSFORM INFRARED

The vibrational spectra with Fourier-transform infrared spectroscopy of samples prepared at different temperatures showed that the bands correspond to a hydroxyapatite pattern (PCPDFWIN 09.0432 / CBPF). We observed intense and wide water bands as well as carbonate ions, showing that replacement had occurred as expected. We also observed bands characteristic of phosphate ions (Figure 4).

DESCRIPTIVE ANALYSIS BY LIGHT MICROSCOPY

Newly formed bone growing from the periphery toward the center of the critical defect was observed in all samples from all groups and all experimental periods (Figure 5).

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dispersed moderate mononuclear inflammatory infiltrate in samples of cHA and moderate to intense mononuclear inflammatory infiltrate in samples of HA. In samples of cHA 5ºC, biomaterial islands surrounded by giant cells (MGCs) were noted. In samples from the cHA 37ºC group, it was noted that the MGCs surrounding the biomaterial were more dispersed and less concentrated. In addition, small islands of newly formed bone covered with osteoblasts encompassing the biomaterial were observed in the middle of the defects. Samples of cHA 90°C and HA showed the biomaterial as dispersed particles surrounded by MGCs.

After 90 days, we observed sparse inflammatory infiltrate in cHA samples and moderate inflammatory infiltrate in the HA group. In the cHA 5ºC group, we observed the presence of the biomaterial surrounded by small MGC islands. The cHA 37°C samples showed little residual biomaterial, and in only one specimen from this group, the formation of a bridge of newly formed bone was observed. In the cHA 90ºC group, the presence of abundant residual biomaterial surrounded by MGCs and islands of new bone formation involving the biomaterial was noted. Small pieces of biomaterial surrounded by MGCs were also observed in the samples of HA .

After 180 days, samples of cHA synthesized at 5ºC showed new bone formation in the proximity of the defects involving the biomaterial, and thick connective tissue rich in collagen fibers filling the centers of the defects. In samples from cHA 37º C, a sparse presence of the biomaterial was observed as well as a small amount of newly formed bone. Scarce fragments of biomaterial were also observed in samples of cHA 90° C, and as in the cHA 5ºC, we also observed peripheral hyalinization of the biomaterial. In the HA samples, small particles of the biomaterial were observed surrounded by many MGCs and moderate mononuclear inflammatory infiltrate

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the critical defect with newly formed bone involving the biomaterial islands (Figure 7).

STATISTICAL ANALYSIS

The ANOVA showed significant differences (P<0.05) when the presence of newly formed bone, biomaterial and tissue were compared among the four groups at their respective experimental periods. The nonparametric Kruskal-Wallis test, performed to compare new bone formation between experimental periods, showed P<0.05 for cHA 5°C and cHA 90°C between 30 and 180 days and for HA between 30 and 90 days. The other comparisons were not statistically significant. The volume density analysis showed a gradual increase of new bone formation in the cHA 5°C group after 180 days in greater proportions than in the other biomaterials in the same time period. At 30 days, samples of cHA 37°C showed more new bone formation than other biomaterials, peaking at 90 days and decreasing slightly at 180 days. Both the cHA 90°C and the HA showed a pattern of increasing bone growth in consecutive experimental periods but on a smaller scale than cHA 5°C and cHA 37°C (Figure 8). Regarding the volume density of the remaining biomaterial samples, the cHA 5°C showed little resorption at all experimental periods, as did the cHA 90°C and HA, although to a lesser extent. However, the cHA 37°C had little remaining biomaterial since the experimental period of 30 days (Figure 9).

POLARIZED LIGHT MICROSCOPY

The samples examined by polarized light microscopy confirmed the results observed previously. All biomaterials showed potential osteoconductive capacity. However, we observed that the largest birefringence in the cHA groups suggested greater osteoconductive capacity when compared to the HA group (Figure 10). Once again,

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The animal model used was adequate, relatively simple to perform and supported previous studies21,22. Only critical-size defects allow the determination of biomaterial efficacy. According to our results and those of others, critical-size defects of 8 mm in rat calvaria were unable to spontaneously self-regenerate even after 6 months23.

Sintering temperature influences crystallinity24, and together with the chemical composition and particle size, crystallinity affects the solubility of ceramics25. Following these principles, the tested biomaterials received no heat treatment, causing low levels of crystallinity that were confirmed in the XRD spectra. We emphasize that these materials were not pressed during processing, and their resulting low crystallinity had a direct relationship with the rates of resorption observed when compared to those of the control group. The presence of pores in the granules of biomaterials favors osteoconduction and allows bone growth in the pores26,27. The polymer, sodium alginate, was associated with the biomaterial because of its biological inertness, porosity and biodegradation capacity, which permits easy dissolution in a biological environment and allows synthesis with spherical morphology28,29.

Nanostructured carbonated hydroxyapatite containing sodium alginate (cHA) was shown to be an alternative bone substitute biomaterial to stoichiometric hydroxyapatites, confirming results from studies of calcium phosphates30-31. Recent studies concluded that the reaction temperature is the key parameter for both the initial decomposition of calcium carbonate particles and the formation of carbonated hydroxyapatite32. Their combination of biocompatibility and low crystallinity (due to the absence of sintering during synthesis) gives cHAs the ability to maintain their

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bones and teeth, and thereby increases their solubility33. Similarly to other authors, we observed in this study that the lower the synthesis temperature was, the more amorphous the biomaterial became, which directly affected its ability to dissolve in biological environments15. In agreement with a study that compared sintered and non-sintered nanoHA, we also observed the better capacity of non-sintered, nanostructured biomaterials to repair bone34.

Although all of the biomaterials showed osteoconductive capacity, the cHA 5°C, more amorphous and less crystalline, and the cHA 37°C showed a higher capacity for bone formation than the others. However, the cHA 5°C had the worst resorption capacity, in contrast to studies in mice that compared subcutaneous cHA 5°C and sintered HA 90°C 35. Despite the complete closure of the critical-size defect in one animal, which has not been observed in any similar studies, the abundant presence of the biomaterial among the newly formed bone in all samples even after 180 days leads us to question the potential clinical indications for this biomaterial. However, the cHA prepared at a temperature of 37°C, less amorphous and more crystalline than cHA synthesized at 5°C; showed a higher resorption capacity, and the observations at 90 days suggesting its almost complete degradation indicate that it was the most balanced bioactive material among all the materials studied, with a more efficient ratio of bone formation to bone resorption. We also note the decreased amount of inflammatory infiltrate in the cHA samples compared to that in the HA samples, which is similar to observations from another study36.

The samples examined by polarized light microscopy confirmed the histological analysis by light microscopy showing the high osteoconductive potential of cHAs37. The collagen fibrils of the new bone around the spheres had a different organization

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between groups 90 days after implantation. This technique was performed to further characterize the regions around the spheres.

Based on this study, we conclude that the nanostructured carbonated hydroxyapatites/sodium alginate are bioactive materials presenting optimal osteoconductivity and biocompatibility and can be used as bone substitutes in clinical applications. We also conclude that the synthesis temperature and subsequent heat treatment (sintering) are directly related to the resorption and osteoconductive properties of these biomaterials.

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Figure 1: Micrographs of the materials characterizing the surface morphology of the samples according to the experimental groups (magnification 3000X).

Figure 2: Micrographs of the materials characterizing the surface morphology of the samples according to the experimental groups (magnification 100X).

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Figure 3: XRD patterns of implanted materials; note that the lower the

temperature of synthesis is, the lower the peak intensity and the wider the base are.

Figure 4: FTIR spectra showing the presence of bands of water, CO3 and PO4 in biomaterials synthesized at the three temperatures.

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Figure 5: Presence of newly formed bone from the periphery to the center

of the defect in 4 groups after 30 days. Arrows - direction of growth. Traces - boundary between native and newly formed bone. A. cHA 5°C; B. cHA 37°C; C. cHA 90°C and D. HA

Figure 6: After 180 days. A. cHA 5°C - collagenized tissue surrounding the

biomaterial; B. cHA 37°C - rare presence of biomaterial; C. cHA 90°C - peripheral biomaterial hyalinization; D. HA - moderate mononuclear inflammatory infiltrate involving the biomaterial and CGM (magnification 20X).

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Figure 7: Complete filling of critical defect by new bone formation in a sample of cHA 5°C after 180 days. Dotted line - limits the periphery of the defect (mounting on magnification 10x).

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Figure 9: Volume density of remaining biomaterial at 30, 90 and 180 days

Figure 10:Polarized light microscopy after 90 days. A. cHA 5°C; B. cHA 37°C; C. cHA 90°C and D. HA

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5- CONCLUSÕES

Concluímos que as hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas são biomateriais bioativos apresentando ótima osteocondutividade e biocompatibilidade podendo ser usados como substituto ósseo de excelência. Concluímos também que a temperatura de síntese bem como o tratamento térmico posterior (sinterização) tem direta relação com as propriedades de bioabsorção e osteocondução desses biomateriais. As cHA sintetizadas a 5°C e 37°C são mais osteocondutoras que as demais, enquanto que as cHA sintetizadas a 37°C são mais bioabsorvíveis.

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Referências

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