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Localização de TNF alfa e Caspase 3 em endométrio de gata no ciclo e no adenocarcinoma do endométrio

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Academic year: 2021

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Localização de TNF alfa e Caspase 3 em Endométrio

de Gata no ciclo e no Adenocarcinoma do

Endométrio

Dissertação Mestrado

Biologia Clinica Laboratorial

Filipa Margarida Amaral Fontinha

Orientador:

Professora Doutora Maria dos Anjos Pires Co-Orientador;

Professora Doutora Rita Payan-Carreira

UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO

VILA REAL, 2014

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II

Localização de TNF alfa e Caspase 3 em Endométrio

de Gata no ciclo e no Adenocarcinoma do

Endométrio

Dissertação Mestrado

Biologia Clinica Laboratorial

Filipa Margarida Amaral Fontinha

Orientador:

Professora Doutora Maria dos Anjos Pires Co-Orientador;

Professora Doutora Rita Payan-Carreira

UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO

VILA REAL, 2014

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III A Orientadora

________________________ Professora Doutora Maria dos Anjos Pires

A Co-Orientadora ________________________ Professora Doutora Rita Payan-Carreira

Departamento de Ciências Veterinárias Escola de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Departamento de Zootecnia

Escola de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

(4)

IV

“Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade contínua misterioso diante de meus olhos.”

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V À minha Mãe

(6)

VI Ao Magnífico Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, ANTÓNIO AUGUSTO FONTAÍNHAS FERNANDES, pela disponibilidade dos meios para a

realização desta dissertação.

À Coordenação do mestrado em Biologia Clinica Laboratorial, na pessoa da

PROFESSORA DOUTORA ANA SAMPAIO, pela disponibilidade durante a realização do

mestrado.

À minha orientadora PROFESSORA DOUTORA MARIA DOS ANJOS PIRES, pela disponibilidade, ajuda compreensão e grande amizade demonstrada durante a realização desta tese, por todos os valiosos ensinamentos e pela leitura cuidada da presente dissertação de mestrado.

À minha co-orientadora PROFESSORA DOUTORA RITA PAYAN-CARREIRA, pelos ensinamentos, amizade, ajuda e disponibilidade na realização deste trabalho.

À Dª. LIGIA BENTO, pela disponibilidade prestada, pela ajuda técnica pelos valiosos ensinamentos e amizade, demostrados ao longo da realização deste trabalho.

À D. ANA PLACIDO e à D. GLORIA MILAGRE pela amizade e boa disposição, que facilitou o trabalho de muitas horas de laboratório.

A todas as professoras do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica, pelos valiosos ensinamentos em especial à PROFESSORA DOUTORA FERNANDA SEIXAS

TRAVASSOS pelos valiosos ensinamentos e amizade, demonstrada ao longo da realização

deste trabalho.

Ao PROFESSOR DOUTOR AMÂNCIO CARVALHO, pela ajuda no tratamento estatístico dos dados do presente trabalho, bem como pela leitura cuidada dos resultados.

A todos os meus colegas de laboratório em especial ao MIGUEL TAVARES

PEREIRA, pelos ensinamentos, pela elevada paciência e grande amizade.

À minha MÃE por ser a minha força motriz, por me incentivar durante toda a minha vida por nunca me deixar desistir, por fazer de mim uma pessoa melhor e por ser a minha melhor amiga. Ao meu PAI, por me incentivar e ajudar ao longo da minha vida e por toda a amizade. Tudo o que sou hoje devo-o aos meus PAIS.

Ao meu IRMÃO, pela grande amizade e paciência demonstrada não só durante a realização deste trabalho como durante toda a minha vida.

À minha FAMÍLIA por toda a amizade e apoio que tem demonstrado ao longo da minha vida.

(7)

VII Aos meus AMIGOS, agradeço todos os momentos em que me aturaram e animaram, mas principalmente os momentos de pura diversão que me proporcionam na minha vida.

(8)

VIII

Abstract

Uterine neoplasms are rare in cats, representing only 0.29 % of all found neoplasms. Although considered a rare tumor, several studies have shown the possibility of feline endometrial adenocarcinoma (FEA) may be more common than originally thought.

Being the endometrium a highly complex and dynamic tissue, where cycles of proliferation, secretion and renewal occurs in succession is response to sex steroids, responding to local cyclic changes in molecules, including cytokines, it is of major interest to study growth factors among other molecules to unveil the mechanisms orchestrating such changes and their putative role in pathology. TNF and activated caspase 3 are two examples for such molecules that aren’t characterized yet in the cat endometrium.

Thereby, this study had two main objectives: 1) the evaluation of the TNF and the activated caspase 3 protein location in normal endometrium, two molecular factors that might be involved in apoptosis and proliferation in the mammal uterus; 2) and the putative changes in these molecules expression in FEA.

To achieve these goals, an immunohistochemistry indirect technique was used, with anti TNF and anti - activated caspase 3 antibodies, For studying TNFα a total of 60 samples were used (13 in estrogenic stage; 10 in progestagenic and 37 of FEA), while for the activated Caspase 3 there were used 78 samples (15 samples in estrogenic and 13 in pragestagenic stages, and 50 of FEA).

For quantification of antibody labeling 2 regions of the endometrium were evaluated: 10 fields on the surface and 10 in deep of the endometrium for the normal cyclic stages (estrogen and progestagen; controls) and 20 fields in FEA. Moreover, the intensity of the immunoreaction for TNFwas scored according to the scale 0-negative; 1- faint; 2-moderate; 3 strong intensity. In contrast, for active caspase 3, the number of cells labeled in the total microscopic fields were counted.

Overall immunostaining for TNF decreased in the epithelium of progestagen compared to estrogen stage, but in both control stages the intensity of immunolabeling was increased when compared to FEA, though the differences were not significant. The intensity of immunostaining in the stroma was lower in FEA than for both phases of the cycle and adenocarcinomas.

(9)

IX In the evaluation of activated caspase 3 significant differences were observed between the oestrous cycle and FEA, the last one displaying a great increase in the number of apoptotic epithelial cells compared to the cycle samples.

In endometrial adenocarcinomas there is no correlation between these two markers, leading us to assume that the increased apoptosis in FEA may not be induced by the extrinsic pathway of the TNF.

(10)

X

Resumo

As neoplasias uterinas são raras em gatas, representando apenas 0,29% das neoplasias encontradas nesta espécie animal. Apesar de ser considerado um tumor raro, vários estudos têm mostrado a possibilidade do adenocarcinoma do endométrio felino (FEA) poder ser mais frequente do que se pensava.

Sendo o endométrio um tecido complexo e dinâmico (devido às suas renovações cíclicas) e sendo controlado por fatores autócrinos e parácrinos, incluindo citocinas, fatores de crescimento e outras moléculas, que são importantes estudar neste órgão. Na gata não há estudos que caracterizem o papel do TNFα e da caspase 3 ativada neste órgão.

Este estudo teve como principais objectivos: 1) a avaliação da expressão do TNFα e da caspase 3 ativada, no endométrio normal, dois factores moleculares que podem estar envolvidos na apoptose e proliferação no endométrio dos mamíferos; 2) bem como o estudo comparativo destas duas moléculas com os FEA.

Foram usadas para o TNFα 13 amostras na fase estrogénica, 10 na fase progestagénica e 37 FEA, para a Caspase 3 foram usadas 15 amostras na fase estrogénica, 13 na fase progestagénica e 50 adenocarcinomas do endométrio. A imunomarcação foi realizada pela técnica indireta de imunohistoquimica utilizando anticorpos anti- TNFα e anti- caspase 3 ativada.

Para a quantificação da marcação destes anticorpos foram avaliados 10 campos na superfície do endométrio e 10 na profundidade, para os animais controlo (em fase estrogénica e progestagénica) e 20 campos nos FEA. A intensidade imunorreacção do TNFfoi avaliada de acordo com uma escala, 0-negativo, 1-fraco, 2-moderado e 3-intenso. Em contraste, para a caspase 3 foram contadas as células em apoptose presentes no campo do microscópio

A intensidade de marcação do TNFα no epitélio diminuiu da fase estrogénica para a progestagénica, sendo a intensidade de marcação dos FEA é mais intensa do que esta última fase e sobreponível com a fase estrogénica. No estroma a intensidade de marcação é menor que no epitélio tanto nas fases do ciclo como nos adenocarcinomas.

Na avaliação da caspase 3 ativada, no epitélio foram encontradas diferenças significativas entre as fases do ciclo e entre estas e os FEA, apresentando os últimos um número de células

(11)

XI em apoptose muito mais elevado que nos tecidos controlo. No estroma verificaram-se diferenças significativas entre as fases do ciclo e os FEA.

Nos adenocarcinomas do endométrio não há correlação entre estes dois marcadores, levando-nos a supor que a apoptose aumentada levando-nos FEA poderá não ser induzida por via extrínseca do receptor do TNF

(12)

XII

Índice

1. Introdução 1

1.1 Cancro e Carcinogénese 4

1.2 Adenocarcinoma do endométrio Felino (FEA) 4

1.3 Apoptose 6

1.3.1 TNF-α (Factor de Necrose Tumoral alfa) 10

1.3.2 Caspase 3 ativada 11 2. Objetivos 15 3. Material e Métodos 17 3.1 Material Biológico 17 3.2 Imuno-Histoquimica 18 3.3 Avaliação da marcação 20 3.4 Tratamento Estatístico 21 4.Resultados 23

4.1 Intensidade de marcação do Fator de Necrose Tumoral (TNFα) 23

4.2 Quantificação da Caspase 3 ativada 26

4.2.1 Quantificação da Caspase 3 ativada no epitélio 26

4.2.2 Quantificação da Caspase 3 ativada em células do estroma 29

4.3 Comparação entre o TNFα e a Caspase 3 nas fases do ciclo e nos FEA 30

5. Discussão 33

6. Conclusão 39

7. Trabalhos Futuros 42

(13)

XIII

Índice de Figuras

Figura 1. Representação esquemática do útero de gata. 1-ovário, 2-ovidutos, 3-corno uterino,

4 - corpo do útero, 5-cervix , 6-bexiga (http://curiosidades-felinas.blogspot.pt, consultado em 5/05/2013) 1

Figura 2. A-Morfologia do útero normal na fase Estrogénica (HE. Estalão= 300µm); B-

Morfologia do útero normal na fase Progestagénica (HE. Estalão= 300µm) 3

Figura 3. Aspetos morfológicos dos adenocarcinomas do endométrio de gata. 3A.

Adenocarcinoma papilar seroso (Estalão= 100µm) 3B. Adenocarcinoma de células claras (Estalão= 100µm

)

3C. Adenocarcinoma in situ. (Estalão= 300µm) coloração HE 5

Figura 4. Esquema representativo da Necrose versus. Apoptose

(http://minutosaber.blogspot.pt/2010/08/caracteristicas-celulares-da-necrose-e.html

consultado em 9/2/2014) 7

Figura 5. Activação da caspase-3 através da via intrínseca e da via extrínseca (Boland et al.,

2013). 9

Figura 6. Via de sinalização celular do TNFα, induzindo a apoptose (Gaur & Aggarwal,

2003). 10

Figura 7. Estrutura geral das caspases e sua classificação com base no tamanho do

pró-dominio (Degterev et al., 2003) 12

Figura 8. Constituição das caspase 3, mostrando o pró-domínio, a subunidade grande e a

subunidade pequena bem como os locais de clivagem do pró-domínio Asp-9 ou Asp-28. Após esta clivagem a caspase 3 fica ativa (Cohen, 1997) 12

Figura 9. A-Peça cirúrgica de ovariohisterectomia em gata, constituída pelo segmento

ovário-útero.B- Corte transversal de um corno uterino numa cassete para ser incluído em parafina 18

Figura 10. Corte longitudinal de um útero de gata com adenocarcinoma do endométro. 18 Figura 11. Marcação do TNFα no epitélio do endométrio na fase proliferativa/estrogénica (A)

e na lutea ou progestagénica (B). Método imunohistoquimica indireto de avidina-biotina contrastado com hematoxilina de Gill. A - Estalão= 30µm; B - Estalão= 100µm) 24

(14)

XIV

Figura 12. Marcação do TNFα num adenocarcinoma do endométrio de gata (Estalão=

100µm) 25

Figura 13. Comparação da intensidade de marcação do TNFα nas diferentes fases do ciclo e

nos FEA: ES E - epitélio de superfície da fase estrogénica, GS E – Epitélio glandular superficial da fase estrogénica; GP E – Epitélio glandular profundo da fase estrogénica; ES P - Epitélio de superfície da fase progestagénica; GS P – Epitélio glandular superficial da fase progestagénica; GP P- Epitélio glandular profundo da fase progestagénica; Estroma E- Estroma da fase estrogénica; Estroma P- Estroma da fase progestagénica. 26

Figura 14. Número de células em apoptose do epitélio nas fases do ciclo e nos tumores 27 Figura 15. Células em apoptose no endométrio de gata na fase Estrogénica (método indireto

de avidina-biotina contrastado com hematoxilina de Gill Estalão= 20µm) 27

Figura 16. FEA com células em apoptose positivas para a caspase 3 ativada

(Estalão= 20µm) 28

(15)

XV

Índice de Tabelas

Tabela 1. Número de amostras utilizadas em cada fase (estrogénica e progestagénica) e nos

tumores por cada anticorpo (TNF α e caspase 3 ativada) 17

Tabela 2. Detalhes dos anticorpos contra o TNF α e a Caspase 3 ativa, e dos procedimentos

seguidos na IHQ 20

Tabela 3. Intensidade de marcação do TNFα por tipo de tecidos nas amostras controlo do

endométrio de gata na fase estrogénica/proliferativa e na fase progestagénica/secretora 24

Tabela 4. Intensidade de marcação do TNFα no epitélio e no estroma, nos adenocarcinomas

do endométrio de gata 25

Tabela 5. Resultados entre o número de células em apoptose do epitélio nas duas fases do

ciclo e nos tumores 29

Tabela 6. Resultados entre o número de células em apoptose do estroma nas duas fases do

ciclo e nos tumores 30

Tabela 7. Correlação entre a Caspase 3 ativada e o TNFα nas fases do ciclo e nos

(16)

XVI

Lista de abreviaturas

 2

– Qui-quadrado

 µm – Micrómetro

 Apaf-1 - Fator Apoptótico Ativador de Peptidases

 BSA- Albumina Sérica Bovina

 CARD – Dominio de Recrutamento e Ativação de Caspases

 Caspase- cysteine-aspartic-acid-proteases

 DAB- 3,3- Diaminobenzina

 DED- Dominio Efetor de Morte

 DNA- Ácido desoxirribonucleico

 FEA- Adenocarcinoma do Endometrio Felino

 KW- Kruskall-Wallis

 MAPK- Proteina Cinase Ativadora de Mitogénios

 NF- Kβ – Fator de Ativação Nuclear Kβ

 PBS- Solução de Fosfato Salina

 TNF R1 e R2- Recetor 1 e 2 do Fator de Necrose Tumoral

 TNFα- Fator de Necrose Tumoral alfa

(17)
(18)
(19)

1

1. Introdução

A utilização do gato como animal de estimação tem vindo a aumentar nos últimos anos (Santos et al., 2009), tendo-se observado uma evolução nos seus objetivos primários de caçador de ratos para animal de companhia. Em paralelo, os serviços médico-veterinários que lhe são disponibilizados, assim como a evolução observada no nível de qualidade da prevenção e controlo da saúde animal, colocaram esta espécie no foco da investigação médica, sabendo-se que um gato não é um cão pequeno (Goodrowe et al., 1989). O estudo da fisiologia e fisiopatologia de vários sistemas nos felídeos, necessários ao desenho das abordagens terapêuticas mais adequadas à espécie, inclui o conhecimento aprofundado do sistema reprodutivo destes animais. Este conhecimento é imprescindível não só para definir as melhores estratégias no controlo a uma reprodução indiscriminada que ainda hoje se encontra subjacente ao abandono, frequente nesta espécie, mas pode servir também como modelo para o estudo da reprodução humana e de outras espécies felinas não-domésticas, em particular as que se encontram em risco de extinção (Zambelli & Couto, 2005a).

O aparelho reprodutivo da gata (figura 1) é constituído por um par de ovários, envolvidos numa bolsa ovárica completa mas aberta, por um par de ovidutos, por um útero com morfologia bicórnea, compreendendo dois cornos uterinos relativamente extensos, o corpo do útero pouco desenvolvido e uma cérvix, que se abre centralmente numa vagina relativamente longa e a vulva (Zambelli & Couto, 2005b).

O útero, órgão estudado neste trabalho, é constituído por três camadas: o endométrio, o miométrio e a serosa, a camada mais externa. O endométrio é a mucosa que reveste a

Figura 1. Representação esquemática do útero de gata. 1-ovário, 2-ovidutos, 3-corno uterino, 4 - corpo do útero, 5-cervix , 6-bexiga (http://curiosidades-felinas.blogspot.pt, consultado em 5/05/2013)

(20)

2 superfície interna do útero e é constituído por um epitélio de superfície e glândulas superficiais e profundas, suportadas por um estroma funcional. A altura e enovelamento das glândulas do endométrio e o próprio estroma variam, em morfologia e/ou em quantidade, ao longo do ciclo éstrico, refletindo a alternância das hormonas sexuais produzidas nos ovários (Bacha & Bacha, 2012).

A gata é uma fêmea poliéstrica sazonal, de ovulação induzida pelo coito, apesar de haver relatos de que pode ocorrer, num número reduzido de animais e sob condições adequadas, ovulação espontânea. No hemisfério Norte, a sua atividade sexual manifesta-se geralmente desde Janeiro até Outubro, se o animal se encontrar sujeito às condições climatéricas. Gatas que não tenham possibilidades de sair de casa, e se submetidas a temperatura e luminosidade praticamente constantes, podem apresentar uma pausa reprodutiva menos marcada ou mesmo inexistente.

A gata pode apresentar, durante a estação reprodutiva, dois tipos de ciclos, consoante ocorra ou não ovulação, e que se designam respetivamente por ciclo ovulatório e ciclo não-ovulatório. No caso deste último, não ocorrendo ovulação não se observa fase lútea ou progestagénica, e as fases foliculares sucedem-se separadas por uma curta pausa que corresponde apenas ao período de atrésia do folículo dominante e ao arranque de nova onda de desenvolvimento folicular. Neste tipo de ciclos, regista-se um episódio de cio a intervalos regulares de 7 a 10 dias (Johnston et al., 2001).

Os ciclos ovulatórios, ou seja naqueles em que ocorre ovulação, são constituídos por quatro fases sucessivas: proestro, estro, pós-estro ou diestro (Shille et al., 1979). As duas primeiras compreendem o período de desenvolvimento folicular, e como não são distinguíveis do ponto de vista comportamental, são muitas vezes designadas por fase folicular (também designada de estrogénica). Nesta fase dominam os estrogénios (Figura 2 A). Após a ovulação observa-se uma fase de dominância da progesterona, que dependendo do autor é designada de diestro ou pós-estro (termo que pode ser aplicado também ao período entre dois ciclos consecutivos nos ciclos anovulatórios, ou ainda de fase lútea ou progestagénica (Figura 2 B). O anestro, embora seja fisiológico, está limitado a um curto período pós-parto e à estação não-reprodutiva do ciclo dos felinos (Shille et al., 1979, Johnston et al., 2001).

(21)

3 No que respeita à duração da fase do ciclo com dominância da progesterona, no caso das gatas os ciclos ovulatórios podem ter durações diferentes da fase lútea, consoante exista ou não uma gestação ou o estímulo para a persistência do corpo lúteo (por vezes designada de pseudo-gestação). Após a ovulação a produção de progesterona aumenta nas 24 a 48 horas imediatas e atinge a sua concentração máxima 25 a 30 dias depois. Os elevados níveis de progesterona inibem o desenvolvimento folicular diminuindo a concentração de estrogénio (Shille et al., 1979). Na ausência de gestação, o corpo lúteo regride aos 35 a 37 dias pós-ovulação, e as concentrações de progesterona diminuem para níveis muito baixos, permitindo que a gata arranque com um novo ciclo de desenvolvimento folicular (Shille et al., 1979). No entanto, nas situações de pseudo-gestação, há sinais que promovem a persistência do corpo lúteo até próximo dos 45 a 50 dias, alongando um pouco o intervalo entre dois ciclos consecutivos. O mecanismo que concorre para a situação de pseudo-gestação ainda é desconhecido. Caso exista gestação, a progesterona mantém-se elevada por 62 dias após a ovulação, sendo produzida não só pelos corpos lúteos mas também pela placenta; é nesta altura que o parto é estimulado e ocorre decréscimo acentuado da produção de progesterona (Johnston et al., 2001).

Figura 2. A-Morfologia do útero normal na fase Estrogénica (HE. Estalão= 300µm); B- Morfologia do útero normal na fase Progestagénica (HE. Estalão= 300µm)

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4

1.1. Cancro e Carcinogénese

O cancro ou neoplasia maligna é uma doença que tem a sua origem na disfunção de genes por consequência de mutações resultando na alteração do controlo do ciclo celular. Como consequência verifica-se o crescimento descontrolado destes tecidos que são anómalos formando uma neoplasia, tumor ou cancro (Locasale, 2012)

Ao longo da vida de um organismo milhares de células podem vir a ser alvo estas disfunções genéticas propícias ao desenvolvimento de um ciclo celular e comportamentos anómalos contudo, a maioria tem um crescimento limitado, acabando por ser eliminado pelas defesas do organismo ou manifestando-se apenas como situações benignas. Ocasionalmente pode acontecer que um desses conjuntos de células adquiram mutações que lhes permitam uma proliferação contínua e ilimitada, e possuam meios que lhes possibilitem ultrapassar os mecanismos de vigilância do sistema imunitário do organismo, levando à sua progressão e proliferação como neoplasias malignas (Locasale, 2012).

1.2 Adenocarcinoma do endométrio Felino (FEA)

Os adenocarcinomas do endométrio são considerados raros em animais domésticos, representando os tumores uterinos apenas 0.29% de todas as neoplasias diagnosticadas em gatos (Miller et al., 2007). Na sua maioria são diagnosticados como achado acidental em necropsias de animais a partir de meia idade. Encontram-se com maior frequência em vacas e coelhas (Kennedy et al., 2004).

No adenocarcinoma, o endométrio encontra-se espessado e por vezes séssil nodular, podendo ainda este tipo de tumor pode ser sólido, quistico, muitas vezes acompanhando-se de piómetra (Miller et al., 2007, Saraiva et al., 2012).

A classificação destas lesões é baseada na observação histológica dos tecidos (McIntyre et al., 2010). Atualmente para a gata foi proposta a descrição de 3 tipos morfológicos de FEA: adenocarcinoma papilar seroso, adenocarcinoma de células claras e adenocarcinoma in situ (Figura 3) (Saraiva et al., 2012).

O adenocarcinoma papilar seroso é o tipo mais comum, havendo a formação de papilas constituídas essencialmente por células colunares com uma quantidade moderada de

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5 citoplasma eosinófilico, que assentam num feixe de tecido conjuntivo em geral escasso (Figura 3 A). Apesar da morfologia papilar serosa ser predominante, pode ocorrer, concomitantemente em algumas áreas, um crescimento sólido (Saraiva et al., 2012). O tumor pode invadir os vasos sanguíneos ou os vasos linfáticos, o miométrio ou, em casos mais graves invadir e fracionar a camada serosa (Saraiva et al., 2012), podendo haver então a disseminação do tumor na cavidade peritoneal.

O adenocarcinoma in situ é menos frequente que o papilar seroso apesar de apresentar algumas semelhanças morfológicas (Figura 3 B). Contudo, a proliferação papilar é mais localizada na superfície do endométrio, havendo manutenção das glândulas profundas. A maior diferença é que este adenocarcinoma não é invasor (Saraiva et al., 2012).

Por último o adenocarcinoma de células claras é o menos frequente dos 3 tipos; apresenta disposição mais sólida, podendo por vezes distribuir-se por papilas, mas as células apresentam uma morfologia diferente dos anteriores, com núcleos atípicos e citoplasma abundante e claro (Figura 3 C). Pode em alguns casos, invadir o miométrio e os vasos linfáticos (Saraiva et al., 2012).

Alguns autores supõem que o desenvolvimento destes tumores se possa dever à influência excessiva de estrogénio (17β-estradiol) nestes tecidos, resultando numa proliferação descontrolada do endométrio (Vaskivuo et al., 2002), o que poderia estar associada aos efeitos anti apoptóticos dos estrogénios sobre as células uterinas (Vaskivuo et al., 2002).

(24)

6

1.3 Apoptose

A boa função intercelular que caracteriza as formas de vida avançada não seria possível sem mecanismos que permitem a remoção individual de células que já não estão aptas a desempenhar uma função normal. Estas células são removidas individualmente através da apoptose, um tipo de morte celular que não promove a inflamação porque ocorre dentro dos limiares fisiológicos das células, não danificando assim as células adjacentes (Vinatier et al., 1996).

B

C

Figura 3 B - Adenocarcinoma de células claras (Estalão= 100µm)

(25)

7 O termo apoptose foi introduzido em 1972 por Kerr, Wyllie e Currie para descrever a alteração de células previamente denominadas cromatolíticas pois apresentavam a cromatina em forma de meia lua, mas o conceito de morte celular pela destruição das células só surgiu com o desenvolvimento de uma microscopia mais eficiente na década de 80 (Kerr et al., 1972, Henson & Hume, 2006).

As células que morrem através deste processo mantêm a sua membrana intacta praticamente até ao fim do processo, e no seu interior ocorrem várias alterações morfológicas e bioquímicas, como a condensação da cromatina, a segmentação das lâminas nucleares; por fim, ocorre a formação de corpos apoptóticos através da fragmentação da membrana citoplasmática (Figura 3). Os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por macrófagos ou pelas células adjacentes impedindo a libertação dos componentes celulares tóxicos que possam promover reação inflamatória (Vale et al., 2003).

Ao contrário da apoptose, a morte celular por necrose é caracterizada por acontecer quando os estímulos ultrapassaram os limites fisiológicos da célula resultando em danos metabólicos que não lhe permitem a adaptação e assim promovendo a sua morte. Neste caso as células apresentam uma morfologia diferente da apoptose, aumentando de volume, com degradação de imediata da membrana citoplasmática com libertação do conteúdo celular, promovendo a inflamação e danificando as células adjacentes (Vale et al., 2003).

Figura 4. Esquema representativo da Necrose versus.Apoptose(http://minutosaber.blogspot.pt/2010/08 /caracteristicas-celulares-da-necrose-e.html 9/2/2014)

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8 A apoptose é um fenómeno muito importante no desenvolvimento de um organismo, sendo também a responsável pela manutenção da homeostasia ao longo da vida. Estudos no endométrio humano referem que a proliferação e a apoptose estão dependentes das variações hormonais nas diferentes fases do ciclo éstrico (Dahmoun, 1999).

O balanço entre mitose e apoptose são fatores determinantes no crescimento das células neoplásicas, torna-se por isso um dos grandes alvos da terapia contra o cancro (Li et al., 2009).

Um recente tratamento para os adenocarcinomas do endométrio em humanos tem como alvo a superfamília do Fator de Necrose Tumoral (TNF). Esta classe de ligandos e seus receptores gerou um enorme interesse académico desde a sua descoberta em 1980. Esta superfamília é constituída actualmente por 20 ligandos e 30 receptores (Thangaraju et al., 2012).

Os ligandos desta família normalmente possuem apenas um receptor específico, contudo alguns podem ter mais do que um. Esta superfamilia inclui lingandos como “apoptosis inducing-ligand” (APRIL), “B-cell activating factor (BAFF), citocinas que induzem a proliferação de linfócitos T e B (CD30, CD40, CD70, CD95), “Lymphotoxin-alpha” (LTα), “lymphotoxin-beta” (LTβ), ”Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand” (RANKL), TNFα e “TNF-related apoptosis inducing ligand “ (TRAIL). Os seus receptores são proteínas transmembranares que actuam através de vias de sinalização citoplasmática. Baseado nestas vias os receptores podem ser classificados em 3 grupos:

1 Grupo dos receptores do Domínio de Morte (DD)- a activação destas provoca a apoptose da célula. Ex. “Cluster of Diferentiation 95”(CD95), “Death Domain Receptor” (DR3, DR4, DR5, DR6) e “ Tumor Necrosis Factor Receptor 1” (TNFR1) 2 Grupo dos receptores de activação do Factor Nuclear κB (NF-κB) - Jun N- terminal

cinase (JNK), p38 cinase reguladora do sinal extracelular (ERK), phosphoinisitide-3 cinase (PI-3 K). Ex. CD27, CD30, CD40, LTβR, OX40 e RANK

3 Grupo de receptores sem conhecimento de vias intracelulares. Ex. “Decoy Receptors (DcR1, DcR2, DcR3) e “Ostioprotegerin” (OPG) que por competição tentam inibir os outros grupos.

Ligando-os como o TNFα, TRAIL e CD95L são capazes de se ligar ao primeiro grupo, activando assim as vias de apoptose celular, a qual por sua vez promove geralmente a activação de um conjunto de proteínas que se ativam em cascata, denominadas caspases

(27)

9 (Thangaraju et al., 2012). Nesta situação as caspases são ativadas através da via extrínseca.

Contudo estas também podem ser activadas através da via intrínseca, com a libertação de Citocromo C pela mitocôndria. Para que este composto seja libertado tem de haver a permeabilização da membrana da mitocôndria, fenómeno associado às proteínas Bcl-2/Bax. O

Citocromo C provoca a oligomerização do fator citosólico Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor) e a formação do apoptossoma. Em ambos os casos o apoptose vai ativar as pro-caspases iniciadoras (caspase 9 ou 8), que após clivagem do pró-domínio se tornam ativas

e processam uma reação em cadeia das pro-caspases executoras (com inicio na caspase 3) e dão assim inicio aos processos apoptóticos no interior da célula (Figura 5). O reconhecimento

dos corpos apoptóticos pelos macrófagos é feito através da emissão de sinais “eat me” pela célula em apoptose: um destes sinais é a presença de fosfatidilserina na superfície externa da membrana celular quando normalmente esta se encontra na superfície interna. Esta molécula

passa para a superfície externa da membrana quando as células entram em apoptose (Vaskivuo et al., 2002, Joswig et al., 2003, Jin & El-Deiry, 2005).

Figura 5. Activação da caspase-3 através da via intrínseca e da via extrínseca (Boland et al., 2013).

(28)

10

1.3.1 TNF-α (Factor de Necrose Tumoral alfa)

O Factor de Necrose Tumoral (TNF-α) é produzido por macrófagos, linfócitos e outras células imunocompetentes (Yu et al., 1998, Diamantopoulos et al., 2012). É uma proteína homotrimérica que possui 157 aminoácidos em cada subunidade (Wu et al., 2011).

Esta molécula é uma citocina pleiotrópica que induz uma grande variedade de respostas celulares, como a inflamação, a proliferação celular e a apoptose (Wang et al., 2003). O TNFα liga-se aos receptores TNF-R1 e TNF-R2 e inicia as cascatas de sinalização pro-apoptotica e anti-apoptotica respectivamente (Aggarwal et al., 2002).

Innins et al. (1992), demonstrou que o TNFα em baixas concentrações promove o crescimento

in vitro de linhas celulares de neoplasias endometriais, mas em elevadas concentrações inibe o

seu crescimento. Provou também que a atividade pro-apoptotica do TNFα é mediada pela ligação deste com o TNF-R1, que activa a cascata de sinalização do domínio de morte (Ininns

et al., 1992, Aggarwal et al., 2002).

procurar

Para além da indução da apoptose, o TNFα promove também a sobrevivência celular, recrutando moléculas intracelulares adaptadoras, tais como o RIP (proteína que interage com o receptor), o TNFα associado ao recetor 2, o NF-kB (fator de ativação nuclear kB) e os MAPKs (proteínas cinases ativadas por mitogéneos) (Thi et al., 2013).

Figura 6. Via de sinalização celular do TNFα, induzindo a apoptose (Gaur & Aggarwal, 2003)

(29)

11 O NF-kB está presente numa ampla gama de tumores, incluindo o adenocarcinoma do endométrio em humanos. O estudo deste factor de transcrição sugere que este poderá desempenhar um papel importante na inibição da carcinogénese do adenocarcinoma do endométrio, pois suprime a apoptose inibindo a ativação das caspases efectoras pelo TNF-α (Thangaraju et al., 2012).

O TNFα foi identificado no útero de varias espécies animais, como nos bovinos, roedores, humanos e canídeos, e a sua expressão ao longo do ciclo sugere que é regulado pelas hormonas sexuais produzidas no ovário (Hunt et al., 1992).

No útero do rato o TNFα sofre um aumento durante a fase proliferativa e no final da fase secretora, enquanto na fase inicial desta última sofre um decréscimo (Sato et al., 2003). No endométrio de cadela verifica-se imunoexpressão do TNFα, tanto no estroma como no epitélio durante todo o ciclo éstrico e também no trofoblasto aos 13-16 dias de gestação. A marcação no estroma e mais intensa que a marcação epitelial em todas as fases do ciclo. Na cadela verifica-se também uma diminuição da intensidade de marcação no diestro inicial, ou seja no início da fase secretora (Payan-Carreira et al., 2011).

1.3.2 Caspase 3 ativada

As caspases foram pela primeira vez descritas por Horvitz e Sulston, quando este descreveu a descoberta do gene ced-3 da C. elegans que codifica de forma independente uma enzima análoga à interleucina-1β (ICE) humana. A demonstração que expressão elevada da ICE (mais tarde denominada caspase-1) nos mamíferos leva à apoptose, foi o suficiente para sugerir que as caspases tinham um papel semelhante ao ced-3 nos mamíferos, ou seja um papel fundamental no decorrer e desenvolvimento da apoptose (Ellis & Horvitz, 1986). As caspases são uma das principais famílias de proteínas reguladoras da apoptose, pelo que a sua activação constitui um marco deste fenómeno (Jin & El-Deiry, 2005). Nas células dos mamíferos, a acumulação e ativação destas proteínas induz a apoptose (Jin & El-Deiry, 2005). As caspases são sintetizadas sob a forma de zimogénios/proteases inativos, constituídas por um pró-dominio, por uma subunidade grande (p20) e por uma subunidade pequena (p10). Este pro-domínio é mais longo nas caspases iniciadoras que nas efectoras. Estes zimogénios para se tornarem enzimas ativas necessitam de ser clivados, o que ocorre no resíduo de

(30)

12 aspartato. Uma vez ativadas, as caspases são então capazes de induzir a apoptose através de uma cascata de eventos (Jin & El-Deiry, 2005).

Com base na sua função as caspases podem ser classificadas em 3 grupos:

3. As caspases inflamatórias (Caspases -1,-4,-11,-12,-13 e -14), que estão envolvidas na inflamação;

4. As caspases indutoras da apoptose (Caspases -2, -8, e -10), que possuem longos pró-domínios, que podem conter um domínio efector de morte “death effector domain” (DED) (Caspases -8 e -10) ou um domínio de ativação e recrutamento de outras Caspases “Caspase activation and recruitment domain” (CARD) (Caspases -2 e -9), sendo este pró-domínio que medeia a interação com a parte adaptadora das moléculas;

5. E as caspases efectoras da apoptose (Caspases -3,-6 e -9), que representa as moléculas executoras da apoptose, que se caracterizam pela presença de um pró-domino pequeno (Figura 7). Estas são ativadas pelas caspases do grupo anterior através da clivagem do seu pró-domínio, num mecanismo de retroacção, e são responsáveis pelo desencadeamento dos passos seguintes, através da clivagem dos substratos, dando assim origem a uma “cascata” de ativação das Caspases (Degterev et al., 2003).

A caspase 3 (Figura 8) é a aquela efectora que se encontra melhor caracterizada, sendo homóloga das caspases efetoras 6 e 7. Estas 3 caspases participam na degradação do DNA e formação de Corpos apoptóticos (Ramuz et al., 2003).

Figura 7. Estrutura geral das caspases e sua classificação com base no tamanho do pró-dominio (Degterev et al., 2003).

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13 Em animais knockout (129X1/SvJ e C57BL/6J), a análise da morte celular em vários tipos de células onde foi isolada a caspase-3 revelou a total inibição de alguns processos característicos da apoptose, tais como a formação do corpo apoptótico, fragmentação da membrana nuclear e a degradação do DNA, (Degterev et al., 2003) evidenciando que esta degradação ocorre pela ligação da caspase 3 ativa ao fator de fragmentação do DNA (DFF) (Kim et al., 2000).

A caspase 3 encontra-se sob forma latente (pro-enzima inativa) nos diferentes compartimentos celulares, e a sua ativação está dependente de vários mecanismos, tais como a proteólise (auto-proteólise), a oligomerização ou a ligação a receptores de membrana (Ramuz et al., 2003, Kim et al., 2000).

A localização das pro-caspases nos diferentes compartimentos celulares, impede a sua ativação, por manter estas separadas dos seus substratos. A transmissão do sinal de morte depende da translocação proteica da e para as membranas mitocondriais e nucleares (Ramuz et al., 2003) com o desencadear do fenómeno.

Segundo Kim et al. (2000), nas células de Leydig, a caspase 3 encontra-se no citoplasma sendo translocada para o núcleo no momento da sua ativação (Kim et al., 2000), num mecanismo de transporte ativo, o que foi corroborado por outros autores (Faleiro & Lazebnik, 2000).

Figura 8. Constituição das caspase 3, mostrando o pró-domínio, a subunidade grande e a subunidade pequena bem como os locais de clivagem do pró-domínio Asp-9 ou Asp-28. Após esta clivagem a caspase 3 fica ativa (Cohen, 1997).

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14

Objetivos

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15

2. Objetivos

Foram objetivos deste trabalho:

 A optimização da técnica de imuno-histoquimica para a marcação do TNFα e da caspase 3 em tecido de gata;

 O estudo da expressão do TNFα e da caspase 3 ativada no endométrio de gata sem doença e da sua variação nas duas fases do ciclo éstrico (considerando-se para este trabalho apenas a fase estrogénica e a progestagénica);

 O estudo comparativo da imunoexpressão destas duas moléculas em amostras de adenocarcinomas do endométrio de gata, procurando identificar qualquer desvio ao padrão definido como normal para este tecido.

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16

Material e Métodos

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17

3. Material e Métodos

3.1 Material Biológico

Todo o material biológico utilizado neste trabalho pertence ao arquivo do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (LHAP-UTAD). Úteros normais (sem sinais de lesão) de gata foram avaliados para a formação de dois grupos, de acordo com o estadio do ciclo em que se encontravam: fase estrogénica ou proliferativa (predomínio de estrogénios) e fase progestagénica ou lútea (predomínio de progesterona) (Tabela 1). O estadiamento foi feito pela avaliação dos ovários para determinação da estrutura dominante (folículos  fase estrogénica; corpos lúteos  fase lútea), e pela histologia (morfologia microscópica) ovárica e uterina. Estas duas fases permitiram a caracterização do padrão de normal expressão no endométrio de gata e foram também utilizados como controlos para efeitos de análise comparativa com a expressão destas proteínas nos FEA.

Foram ainda utilizadas amostras de FEA, tendo o seu diagnóstico sido realizado por dois anatomopatologistas. Não se utilizou uma diferenciação do seu subtipo morfológico, por haver poucos casos de FEA do tipo in situ e de células claras. De cada caso, foi utilizada apenas um corte considerado representativo do tipo de lesão.

O número de amostras foi distinto para cada uma das fases e para os anticorpos utilizados (Tabela 1), decorrente de contingências ao qual fomos alheias. Contudo foram sempre superiores a 10 amostras por cada grupo.

TNF α Caspase 3 ativada Fase Estrogénica 13 15

Fase Progestagénica 10 13

Tumores 37 50

Tabela 1. Número de amostras utilizadas em cada fase (estrogénica e progestagénica) e nos tumores por cada anticorpo (TNF α e caspase 3 ativada).

(36)

18 As amostras foram recebidas no laboratório já fixadas em formol a 10%, e posteriormente incluídas em parafina e processadas segundo o procedimento de rotina para microscopia de luz.

3.2 Imuno-Histoquimica

Esta técnica baseia-se na detecção de um antigénio num corte histológico através de uma reação antígeno-anticorpo altamente específica, com revelação desse complexo por um

Figura 9 A- Peça cirúrgica de ovariohisterectomia em gata, constituída pelo segmento ovário-útero. B- Corte transversal de um corno uterino numa cassete para ser incluído em parafina.

Figura 10. Corte longitudinal de um útero de gata com adenocarcinoma do endométro.

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19 cromógeno. Neste trabalho, para a identificação do TNFα e da caspase 3 ativada, as amostras foram submetidas à técnica indireta de imuno-histoquimica por avidina-biotina.

Para a realização desta técnica, cortes de 3µm de espessura foram colados em lâminas adesivadas com Silane (3-aminopropiltrietoxisilane, Sigma®). No início de cada sessão, os cortes foram desparafinados em xilol e reidratados numa série de álcoois de concentração decrescente (100º  95º  80º  70º) e, por fim colocados em água destilada.

Uma vez que a fixação com formol promove a alteração da estrutura terciaria das proteínas celulares e a formação de ligações cruzadas que bloqueiam o acesso de anticorpos aos epítopos alvo, mascarando o antigénio, torna-se necessário expor dos epítopos, o que é conseguido através de um passo denominado de recuperação antigénica. Este processo pode fazer-se por ação do calor ou por ação enzimática.

No nosso estudo, efetuamos o tratamento térmico durante 3 minutos em panela de pressão em tampão citrato (pH 6), que foi executado após a hidratação das lâminas.,.

Após o tratamento térmico as lâminas foram colocadas em peróxido de hidrogénio a 3% (v/v) durante 30 minutos, promovendo a inactivação das peroxidases endógenas. Uma vez bloqueadas as peroxidases endógenas, os cortes foram lavados com PBS (solução de fosfato salina, a pH 7,4) para retirar o excesso de peroxido de hidrogénio, após o que se seguiu a incubação com soro normal (Ultra V. Block), em camara húmida à temperatura ambiente durante 5 minutos.

Terminado o tempo de incubação com o soro normal, as lâminas foram incubadas com o anticorpo primário, na diluição de 1:25 para o TNFα e de 1:500 para a caspase 3 ativada (tabela 2), os dois anticorpos foram diluídos com BSA (albumina sérica bovina, Sigma®). A incubação dos anticorpos primários fez-se em câmara húmida à temperatura de 4ºC, durante a noite.

Segue-se então a incubação com o soro biotinilado (anticorpo secundário), e posteriormente a incubação com o complexo enzimático (tabela 2), que se liga às moléculas de biotina associadas ao anticorpo secundário. Por último incubou-se com DAB (3,3- Diaminobenzidina), que reage com o complexo enzimático produzindo cor castanha. A hematoxilina de Gill foi usada como coloração de contraste, para que as estruturas não coradas com o DAB possam também ser observadas ao microscópio de cor azul. As lâminas

(38)

20 foram desidratadas, através de concentrações crescentes de álcoois (95º  95º  100º  100º) e por xilol. Por fim procedeu-se à montagem das lâminas, usando Entelan® (Merck), para obter uma preparação definitiva.

Em todos as sessões de coloração foram realizadas em simultâneo controlos positivos e negativos. Como controlo positivo foi usado o gânglio linfático de gato (como controlo interno foi usado o ovário), e no controlo negativo o anticorpo primário foi substituído por PBS no mesmo corte.

TNF α Caspase 3 ativada Anticorpo

Clone/Refª. Sc-80386 Cleaved Caspase-3 (Asp175) #9661

Distribuidor Santa Cruz Biotchnology Inc.,

Europe, Germany Cell Signaling Technology®

Diluição 1:25 1:500

Tempo de incubação Over-Night

Método de deteção

Referência Lab Vision™ UltraVision

Detection System

NovoLink® Max Polymer Detection System

Distribuidor Thermo Fisher Scientific, CA, USA Newcastle Upon Tyne , UK Leica Biosystems Percentagem de BSA 50%

Revelação DAB (Sigma®) 10 minutos

3.3 Avaliação da marcação

Para a avaliação microscópica, nos animais controlo foi quantificada a marcação dos anticorpos em estudo em 10 campos da superfície do endométrio e 10 na profundidade, sendo avaliados em cada local a componente epitelial (epitélio superficial, glândulas superficiais e glândulas profundas) e o estroma de forma independente, quer para a fase estrogénica quer para a fase progestagénica. Nos tumores foram avaliados 20 campos da superfície (parte adluminal) e da profundidade da lesão (zona mais próxima do miométrio), também de forma independente para o epitélio e para o estroma dos tumores.

Para a avaliação da intensidade de marcação citoplasmática do TNFα foi usada uma escala de avaliação em que o 0 corresponde ao negativo, o 1 à marcação fraca, o 2 a uma marcação

(39)

21 moderada e finalmente o 3 a uma marcação intensa ou forte. Para a caspase 3 ativada procedeu-se à contagem do número de células positivas e morfologicamente em apoptose. A observação foi feita na objectiva de 40x.

Esta avaliação foi também feita por dois observadores independentes, com recurso a um microscópio NIKON Eclipse E600® (Nikon Instruments Europe BV, Kingston, Surrey, UK), e as imagens capturadas através da camara NIKON Digital Câmara DXM200® e pelo programa NIKON ACT-1® (version2.12).

3.4 Tratamento Estatístico

O tratamento estatístico foi realizado utilizando o programa IBM SPSS Statistics Base 21.0. Os dados foram analisados pela aplicação do teste de Kruskal Wallis (no caso da Caspase 3 ativada) e do qui-quadrado por simulação de Monte Carlo (no caso do TNF) e para a comparação dos dois anticorpos foi usado o teste de Correlação de Pearson. Foram considerados resultados estatisticamente significativos, os valores de p<0,005.

(40)

22

Resultados

(41)

23

4.

Resultados

A técnica de imunohistoquímica permitiu evidenciar uma reação positiva tanto para o TNFα como para a Caspase 3 ativada em todas os tecidos utilizados neste trabalho.

4.1 Intensidade de marcação do Fator de Necrose Tumoral (TNFα) alfa

O padrão de expressão do TNFα no endométrio da gata revelou que os diferentes epitélios deste tecido (epitélio de superfície, das glândulas superficiais e das glândulas profundas) na fase estrogénica do ciclo apresentavam sempre uma marcação mais intensa do que o estroma, o qual apresentava uma intensidade de marcação sobretudo fraca (Tabela 3; Figura 11 e 13). Nesta fase, o epitélio de superfície mostrou uma intensidade de marcação menor, estatisticamente diferente do epitélio glandular (p <0,001). Entre os dois estratos glandulares não se verificaram diferenças estatisticamente significativas na intensidade de marcação. Em comparação, na fase lútea, observa-se uma semelhança quanto ao padrão de marcação, com um decréscimo na intensidade de marcação para o TNFα comparativamente à fase estrogénica, tanto no que respeita à marcação do epitélio como na marcação do estroma (p <0,001). Também nesta fase se observou que o estroma é significativamente menos marcado com esta citocina do que os diferentes epitélios. Entre estes, observou-se uma intensidade superior de marcação para o TNF no epitélio glandular profundo do que nos outros epitélios, mas sem significado estatístico (Tabela 3; Figura 11 e 13).

Ao longo do ciclo éstrico, é o epitélios glandular profundo aquele que apresentou uma marcação mais intensa, com diferenças significativas entre a fase estrogénica (mais intensa) e a fase progestagénica (p<0,001, Tabela 3; Figura 11 e 13). O estroma apresenta-se pouco marcado em qualquer uma das fases do ciclo, sendo esta marcação estatisticamente inferior do que a observada para os epitélios (p<0,001).

(42)

24 Variáveis Epitélio de Superfície Glândulas Superficiais Glândulas Profundas Estroma Intensidade de marcação do TNFα Fase Estrog. Fase Proges. Fase Estrog Fase Proges Fase Estrog. Fase Proges Fase Estrog. Fase Proges 0 neg. 1 fraco 2 moderado 3 intenso 2 4 4 3 0 8 2 0 2 0 8 3 0 6 4 0 2 0 6 5 0 2 4 4 5 9 1 0 8 2 0 0

Relativamente aos tumores, a marcação epitelial foi mais heterogénea, encontrando-se dispersa entre as diferentes classes de intensidade de marcação. A intensidade de immuno-reação para o TNF alfa no epitélio dos tumores foi mais intensa do que na fase progestagénica sendo mais ou menos sobreponível à intensidade observada para a fase estrogénica, não sendo, no entanto estas diferenças estatisticamente significativas (Figura 12 e 13 e Tabela 4).

Tabela 3.Intensidade de marcação do TNFα por tipo de tecidos nas amostras controlo do endométrio de gata na fase estrogénica/proliferativa e na fase progestagénica/secretora

Figura 11. Marcação do TNFα no epitélio do endométrio na fase proliferativa/estrogénica (A) e na lútea ou progestagénica (B). Estalão= 50µm)

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25 No estroma, a intensidade de marcação é praticamente ausente, mantendo-se próxima da descrita para o ciclo, não se observando assim diferenças significativas entre os tumores e os casos controlo (p=0,082) (Figura 12 e 13)

Epitélio Estroma Intensidade de marcação do TNFα Tumores (n=36) Tumores (n=36) 0 neg. 1 fraco 2 moderado 3 intenso 6 8 19 4 26 9 2 0

Tabela 4. Intensidade de marcação do TNFα no epitélio e no estroma, nos adenocarcinomas do endométrio de gata.

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26

4.2 Quantificação da Caspase 3 ativada

Foram consideras células positivas para a caspase 3 ativada, aquelas que se encontravam marcadas com este anticorpo e apresentavam morfologia de apoptose (núcleo condensado e/ou corpos apoptóticos). Foram avaliados de forma independente o número de células em apoptose no epitélio e no estroma, quer dos tecidos durante o ciclo éstrico quer nos tumores. Foram usadas 15 amostras na fase estrogénica, 13 na fase progestagénica e 50 FEA.

4.2.1 Quantificação da Caspase 3 ativada no epitélio

Em cada uma das duas fases do ciclo éstrico foram também avaliadas os diferentes epitélios do endométrio (o epitélio de superfície, as glândulas superficiais e as glândulas profundas). Nos tumores, devido à indiferenciação das estruturas nesta lesão, foi avaliado apenas a componente epitelial como um todo.

0 10 20 30 40 3 2 1 0

Figura 13. Comparação da intensidade de marcação do TNFα nas diferentes fases do ciclo e nos FEA: ES E - epitélio de superfície da fase estrogénica, GS E – Epitélio glandular superficial da fase estrogénica; GP E – Epitélio glandular profundo da fase estrogénica; ES P - Epitélio de superfície da fase progestagénica; GS P – Epitélio glandular superficial da fase progestagénica; GP P- Epitélio glandular profundo da fase progestagénica; Estroma E- Estroma da fase estrogénica; Estroma P- Estroma da fase progestagénica.

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27 Nas diferentes fases do ciclo éstrico (Figura 14) verificamos não haver diferenças estatisticamente significativas no que respeita ao número de células em apoptose, entre os diferentes epitélios.

No entanto, quando comparados os epitélios das duas fases do ciclo, encontrámos diferenças significativas (p<0,001) entre elas, sendo observada maior número de células em apoptose na fase estrogénica do que na fase progestagénica (Tabela 5; Figura 15).

Figura 15. Células em apoptose no endométrio de gata na fase Estrogénica (Estalão= 20µm) Figura 14. Número de células em apoptose do epitélio

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28 Os adenocarcinomas do endométrio da gata, apresentam um número muito mais elevado de células positivas à caspase 3 ativada (Figura 14 e 16) do que o observado durante as fase normais do ciclo (Figura 11), sendo estas diferenças altamente significativas (p<0,001, tabela5).

Média +/-Desvio Padrão

Mediana Máximo Mínimo p

Fase Estrogénica Epit. Sup. 0,73 +/- 0,884 1,00 3 0 <0,001 Gland Sup. 1,80+/-2,007 1,00 6 0 Gland .Prof. 2,67+/-5,260 1,00 20 0 Fase Progestagénica Epit. Sup. 0,15+/-0,376 0,00 1 0 Gland Sup. 0 0,00 0 0 Gland Prof. 1,54+/-2,904 0,00 10 0 Tumores 36,72 +/-22,23 34,00 104 2

Figura 16. FEA com células em apoptose positivas para a caspase 3 activada (Estalão= 20µm)

Tabela 5. Resultados entre o número de células em apoptose do epitélio nas duas fases do ciclo e nos tumores

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29

4.2.2 Quantificação da Caspase 3 ativada em células do estroma

A caspase 3 ativada foi também avaliada no estroma do endométrio, durante o ciclo e nos FEA (Figura 17).

Entre a fase estrogénica e a fase progestagénica não existe diferença significativa entre o número de células observadas em apoptose no estroma (Tabela 6). No entanto, este parâmetro mostra uma diferença significativa do número de células em apoptose no estroma do endométrio durante o ciclo e o estroma dos FEA, sendo que o número de células em apoptose é superior nos tumores (p<0,001; Tabela 6 e Figura 17).

Média +/-Desvio Padrão

Mediana Máximo Mínimo p

Fase Estrogénica Epit. Sup. 0,75+/-0,622 1,00 2 0 <0,001 Gland Sup. 0,33+/-0,242 0,00 1 0 Gland .Prof. 0,29+/-0,488 0,00 1 0 Fase Progestagénica Epit. Sup. 0,43+/-0,787 0,00 2 0 Gland Sup. 0,29+/-0,488 0,00 1 0 Gland Prof. 0,40+/-0,699 0,00 2 0 Tumores 0,29+/-0,488 0,00 1 0

Figura 17. Número de células em apoptose no estroma nas fases do ciclo e nos tumores

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30

4.3 Comparação entre o TNFα e a Caspase 3 nas fases do ciclo e nos FEA

Na avaliação destes dois factores, fomos verificar se existia correlação entre a intensidade de marcação do TNFα e o número de células em apoptose (positivas para a caspase 3 ativada), nas fases do ciclo (estrogénica e progestagénica) e nos adenocarcinomas do endométrio, através do teste de Pearson.

Na fase estrogénica verificou-se que não existe correlação entre a intensidade de marcação do TNFα e o número de células em apoptose.

Na fase progestagénica existe uma correlação negativa (p <0,05) entre a intensidade de marcação do TNF e o número de células em apoptose, sendo que perante uma diminuição na marcação do TNFα se constata o aumento do número de apoptoses (R=-0,678) (Tabela 7). Nos FEA não existe correlação entre a marcação destes dois anticorpos.

Caspse 3

Fase Estrogénica Fase Progestagénica FEA

Fase Estrogénica P= 0,695 R= 0,120 - - Fase Progestagénica - P= 0,045 R= -0,678 - FEA - - P= 0,608 R= -0,101 Tabela 7. Correlação entre a caspase 3 e o TNFα nas fases do ciclo e nos adenocarcinomas do endométrio

TNFα α

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32

Discussão

(51)

33

5. Discussão

O endométrio dos mamíferos é um tecido altamente complexo e dinâmico, cuja função principal é garantir condições favoráveis ao crescimento e desenvolvimento do embrião, a sua implantação e sua sobrevivência até atingir um estadio que lhe permita a sua subsistência no exterior do organismo (Payan-Carreira et al., 2011). Em resposta aos estímulos hormonais, o endométrio dos mamíferos passa por renovações cíclicas. Este processo é controlado por fatores autócrinos e parácrinos, incluindo citocinas, fatores de crescimento bem como outras moléculas (Payan-Carreira et al., 2011). Os diferentes tipos de células do endométrio como fibroblastos, células imunocompetentes, células glandulares epiteliais e células vasculares, produzem diferentes factores, sendo descrito nos humanos que todas elas expressam TNFα que também está presente nos ovários e nos ovidutos (Philippeaux & Piguet, 1993, Wolff et

al., 1999)

Os estrogénios regulam a expressão das citocinas, dos fatores de crescimento e dos seus receptores e, possuem também um papel importante na inflamação e nos processos neoplásicos (Tabibzadeh, 1994, Gori et al., 2011) do endométrio.

O TNFα é conhecido como sendo uma das mais versáteis citocinas. Esta molécula está presente em vários tecidos funcionando como mediador da homeostasia dos tecidos, com efeitos fisiopatológicos em elevadas concentrações (Wolff et al., 1999).

Existem evidências que sugerem que o TNFα possui um papel importante nas modificações cíclicas do endométrio, sendo regulado pelos diferentes tipos celulares (Wolff et al., 1999). Estudos anteriores em cadela, realizados pelo grupo de trabalho do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica (LHAP) onde realizámos este nosso trabalho, verificaram que existe imunoexpressão do TNFα tanto no epitélio como no estroma do endométrio nesta espécie animal, sendo a sua expressão mais intensa neste último. Ao longo do ciclo éstrico verificou-se uma diminuição da expressão desta molécula no diestro inicial (Payan-Carreira et al., 2011).

No nosso trabalho em gata também observámos que existe imunoexpressão do TNF tanto no epitélio como no estroma, mas neste caso a expressão epitelial é mais intensa que a do estroma. Ao longo do ciclo éstrico verificámos uma maior expressão na fase estrogénica

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34 (proliferativa) do que na fase progestagénica (secretora), o oposto do descrito na cadela (Payan-Carreira et al., 2011).

Estudos realizados na mulher revelaram que as glândulas do endométrio aumentam a produção de TNFα durante a fase proliferativa, diminuindo a sua produção no início da fase secretora voltando a ser elevada a sua produção no meio da fase secretora (Hazout, 1995, Laird et al., 1996, Hunt et al., 1992), e os estudos de Gori et al. (2011) na mulher relatam que a expressão desta molécula depende do ciclo hormonal, sendo influenciada principalmente pelos estrogénios, corroborando assim os resultados por nós obtidos. A presença do TNFα no endométrio humano gera diferentes respostas celulares, podendo tanto inibir como promover a tumorigénese (Erten, 2011).

Na mulher, a inflamação e uma disfunção na sinalização da produção de estrogénios, são as principais causas para as duas doenças ginecológicas mais frequentes: a endometriose e o adenocarcinoma do endométrio (Gori et al., 2011). Dentro dos tumores do trato genital os adenocarcinomas do endométrio são os mais comuns. Estes tumores são classificados em 2 tipos; tipo I- adenocarcinoma do endométrio e tipo II carcinoma seroso. O desenvolvimento do tipo I está relacionado com a exposição a uma elevada quantidade de estrogénios. Em contraste, existe uma minoria de adenocarcinoma do endométrio que parece não estar relacionada com as elevadas concentrações hormonais (Sherman, 2000).

Na bibliografia consultada é referido que as neoplasias uterinas são raras em gatas, correspondendo apenas a 0,29% das neoplasias observadas nesta espécie animal. Destas os leiomiomas e os adenocarcinomas são os mais frequentemente encontrados. Os tumores uterinos estão descritos principalmente em gatas com idades compreendidas entre os 4 e os 16 anos (Anderson & Pratschke, 2011, Miller et al., 2003).

O adenocarcinoma do endométrio é mais comum em vacas e coelhas. As coelhas apresentam uma incidência de 79% de adenocarcinomas uterinos a partir dos 5 anos de idade (Preiser, 1964, Kurotaki et al., 2007). Esta elevada incidência pode ser explicada pelo facto destes animais apresentarem uma ovulação induzida e, na maioria das vezes estão alojados individualmente (Elsinghorst et al., 1984), podendo este fenómeno explicar também os adenocarcinomas nas gatas.

Nos ratos o adenocarcinoma do endométrio espontâneo é comum nalgumas estirpes de ratos (por exemplo a estirpe Donryu), em indivíduos velhos. O mecanismo de desenvolvimento dos

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35 adenocarcinomas uterinos nesta espécie ainda não é perfeitamente conhecido, embora seja aceite que os estrogénios tenham um papel fundamental na evolução desta doença nos roedores, tal como o desenvolvimento de adenocarcinomas do endométrio nos humanos (Yoshida et al., 2012).

Normalmente nos adenocarcinomas do endométrio, as citocinas induzem o crescimento dos tumores mediando a angiogénese e a proliferação. O TNFα ativa as vias de sinalização cruciais para a invasão celular do adenocarcinoma do endométrio (Gori et al., 2011), encontrando-se nestes tumores em valores bastante superiores relativamente aos presentes no endométrio não neoplásico (Shaarawy & Abdel-Aziz, 1992, Dossus et al., 2011). Alguns autores propõem que os valores de TNF são mais altos quanto mais avançada estiver a doença (Shaarawy & Abdel-Aziz, 1992).

Segundo Chopra et al. (1997) o TNFα em baixas concentrações, tem poder angiogénico e a adição do anticorpo purificado anti TNFα inibe o crescimento dos vasos endoteliais (Chopra

et al., 1997). Os resultados obtidos no trabalho deste autor são contrários aos descritos

noutros estudos, como o de Dossus et al. (2011), assim como aqueles por nós obtidos, em que não verificámos um grande aumento do TNFα nos tumores, quando comparada com os tecidos normais. Também verificámos um ligeiro aumento desta citocina nos tumores em relação à fase progestagénica, podendo assim inferir-se que, ou o TNFα não é um fator determinante na tumorigenese nestes tumores em gata, ou estes casos por nós avaliados poderão ainda estar numa fase precoce de desenvolvimento. Outra explicação possível prende-se com o carácter clinico benigno da maior parte das lesões de adenocarcinoma utilizados neste estudo, em que não se registou, nas amostras usadas, indícios de efração vascular e invasão dos vasos sanguíneos por células neoplásicas No entanto, dado a nossa série não ser muito grande, e por falta de follow-up clinico, não poderemos tirar grandes conclusões a este respeito.

O endométrio está também sujeito ao mecanismo de regulação celular através da apoptose, para que possa ocorrer o desenvolvimento e regressão das suas glândulas ao logo do ciclo éstrico. A apoptose elimina seletivamente células danificada, com danos mínimos para as células vizinhas. Ocorre tanto no estado fisiológico como estados patológicos, incluindo a carcinogénese, onde a inibição da apoptose resulta no prolongamento da vida das células com alterações graves, permitindo a sua perpetuação e o possível desenvolvimento de tumores (Paola et al., 2005).

Imagem

Figura 1. Representação esquemática do útero de gata. 1-ovário, 2-ovidutos, 3-corno uterino,   4 - corpo do útero, 5-cervix , 6-bexiga (http://curiosidades-felinas.blogspot.pt, consultado em  5/05/2013)
Figura 2. A-Morfologia do útero normal na fase Estrogénica (HE. Estalão= 300µm);
Figura 3 A - Adenocarcinoma papilar seroso (Estalão= 100µm)
Figura 3 B - Adenocarcinoma de células claras (Estalão= 100µm)
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Referências

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