Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Ciências VeterináriasEstudo epidemiológico de factores associados ao
diagnóstico laboratorial de dermatofitoses em
Oryctolagus cuniculus no Norte e Centro de Portugal
Fernando Alberto Brandão Campos Lopes Moreia
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2009
Orientador:
Professora Doutora Ana Cláudia Coelho Co-orientador:
Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Ciências VeterináriasEstudo epidemiológico de factores associados ao
diagnóstico laboratorial de dermatofitoses em
Oryctolagus cuniculus no Norte e Centro de Portugal
Fernando Alberto Brandão Campos Lopes Moreira
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2009
Orientador:
Professora Doutora Ana Cláudia Coelho Co-orientador:
iii
Resumo
A dermatofitose ou tinha é uma infecção cutânea superficial causada por fungos queratinofílicos dos géneros Microsporum, Trichophyton, ou Epidermophyton sendo uma zoonose com grande impacto em Saúde Pública. Neste estudo isolaram-se e identificaram-se dermatófitos a partir de amostras de pêlos e escamas de coelhos com lesões compatíveis, submetidas a exame micológico no laboratório de Microbiologia da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. Isolaram-se e identificaram-se dermatófitos em 172 das 208 amostras (82,7%). Os dermatófitos isolados foram Trichophyton
mentagrophytes var. mentagrophytes (91,9%) e Microsporum canis (8.1%). Foram
observadas diferenças estatisticamente significativas relativamente à idade, mês de colheita, configuração das lesões e presença de infecções concomitantes nas cuniculturas industriais. Efectuou-se uma análise através de um modelo de regressão logística a multivariável para a identificação de factores de risco associados ao isolamento de dermatófitos em cultura. Cinco variáveis foram associadas ao isolamento de dermatófitos na análise univariada. Após a aplicação do modelo de análise multivariada encontraram-se dois factores com significância estatística: configuração das lesões (OR=3,15; 95% CI: 1,39-7,15%) e infecções concomitantes nas explorações cunículas (OR=2,71; 95% CI: 1,03-7,12%). O potencial zoonótico dos dermatófitos isolados deve ser tomado em consideração na epidemiologia das dermatofitoses humanas no Norte e Centro de Portugal.
Abstract
Dermatophyte infection or ringworm is a superficial cutaneous infection with one or more of the fungal species of the keratinophilic genera Microsporum, Trichophyton, or
Epidermophyton and is a zoonosis with a great impact on Public Health. In this study,
dermatophytes were identified from rabbit samples submitted to mycological examination in the Laboratory of Microbiology of the University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal. All samples were collected from suspected clinical cases. Dermatophytes were cultured from 172 of the 208 specimens (82.7%). The dermatophytes isolated were
Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes (91.9%) and Microsporum canis
(8.1%). Statistically significant differences between age, month of sample collection, configuration of lesions and concomitant infections were observed. The effects on prevalence of several variables such as breed, age, month of sample collection, configuration of the lesions and presence of concomitant infections were evaluated. This information was then used in a multivariable logistic regression model in order to identify
iv
risk factors for dermatophytes isolation in culture. Univariable analysis was used to screen the variables used in the logistic regression model. Variables that showed p values of <0.10 were retained for the multivariable analysis. Five variables were associated with dermatophytosis isolation in univariable analysis. The multivariable logistic regression model identified configuration of lesions (OR=3.15; 95% CI: 1.39-7.15%) and the presence of concomitant infections (OR=2.71; 95% CI: 1.03-7.12%) in the rabbitries as risk factors for isolation of dermatophytes in culture. Zoonotic potential of these isolates needs to be considered in the epidemiology of human dermatophytosis in the North and Center of Portugal.
v
Índice Geral
Páginas:
I . Revisão Bibliográfica 1
1. O coelho e a cunicultura 1 2. Breve nota histórica dos dermatófitos 1
3. Dermatófitos 2 3.1. Classificação 3 3.2. Etiologia 5 3.2.1. Tricophyton mentagrophytes 6 3.2.3. Microsporum canis 6 4. Epidemiologia 7
5. Potencial zoonótico das dermatofitoses dos coelhos de produção 9
6. Patogenia 10
7. Quadro clínico e lesional 13
8. Diagnóstico 14
8.1. Diagnóstico epidemiológico 14
8.2. Diagnóstico clínico 14
8.3. Diagnóstico laboratorial 15 8.3.1. Exame sob a Lâmpada de Wood 15 8.3.2. Exame microscópico directo 16
8.3.3. Culturas 16
8.3.4. Diagnóstico histopatológico 18 8.4. Outros meios de diagnóstico 19 9. Profilaxia, tratamento e controlo 19
II. Material e métodos 23
1. Animais e amostras 23
2. Colheita e envio do material ao laboratório 23 3. Diagnóstico laboratorial 24 3.1 Isolamento e identificação de dermatófitos 24 4. Dados clínico-epidemiológicos 25
vi
Páginas:
III. Resultados 27
1. Caracterização da população 27 2. Diagnóstico laboratorial: isolamento e identificação de
dermatófitos em cultura 27
3. Estudo da prevalência 28
4. Rastreio epidemiológico 30
4.1. Análise univariada 30
4.2. Análise multivariada por regressão logística 31
IV. Discussão 34
1.1. Considerações finais 39
V. Bibliografia 41
vii
Índice de Figuras
Páginas:
Figura 1. Coelhos utilizados na cunicultura industrial 1
Figura 2. Dermatófitos 3
Figura 3. T. mentagrophytes 6
Figura 4. Fêmea reprodutora com lesão compatível com dermatofitose
na região mamária 9
Figuras 5 e 6. Lesões superficiais causadas por dermatófitos 10
Figuras 7 e 8. Colonização endotrix e ectotrix em pêlos 11
Figuras 9 e 10. Coelhos com lesões compatíveis com dermatofitose 13
Figuras 11 e 12. Coelhos com lesões compatíveis com dermatofitose 14
Figura 13. Localização das explorações de coelhos 49
Figura 14. Inquérito epidemiológico 50
Figuras 15 e 16. Microconídeas e macroconídeas compatíveis
com T. mentagrophytes 51
Figuras 17 e 18. Microconídeas e macroconídeas compatíveis
com M. canis 51
Índice de Tabelas
Páginas:
Tabela 1. Filogenia dos dermatófitos 5
Tabela 2. Dados relativos às explorações e colheita de amostras 47
Tabela 3. Prevalência do isolamento e identificação de dermatófitos
em relação às características dos animais 29
Tabela 4. Prevalência do isolamento e identificação de dermatófitos
em relação ao maneio e às características das explorações 30
Tabela 5. Factores associados com resultado positivo no diagnóstico
laboratorial (isolamento e identificação de dermatófitos) na análise
univariada (p<0,10) (OR: razão de risco; a: intervalo de confiança). 32
Tabela 6. Factores associados com o resultado positivo no diagnóstico
laboratorial (isolamento e identificação de dermatófitos) na regressão logística (β: coeficiente de regressão logística; S.E.β: erro-padrão;
viii
Lista de Abreviaturas
A - Arthroderma
BHIA - Agar Infusão de
Coração-Cérebro
CE - Comunidade Europeia CI - Intervalo de confiança DDO - Doença de Declaração
Obrigatória
DIM® - Dermatophyte Identification Medium
DNA - Ácido desoxirribonucleico DTM® - Dermatophyte Test Medium
GMS - Grocott methenamine silver HES - Hematoxilina-eosina
Hy - Híbrido
IC - Índice de conversão Kg - Quilograma
KHO - Hidróxido de potássio l - litros
M. - Microsporum
ml - mililitros
N. - Nannizia
nm - nanómetros
OIE – Organização Internacional de
Epizootias
OR - Odds ratios; Razão de risco PAS - Ácido periódico-Schiff
PCR - Reacção em cadeia da polimerase PDA - Batata Dextrose Agar
ppm - partes por milhão S - sequência
SABHI - Agar Sabouraud-Infusão de
Coração-Cerebro
SDA - Agar Mycosel ou Micobiótico S.E. - Erro padrão
séc. - Século
T. - Tricophyton
X - Vezes
β - Beta; Coeficiente de regressão
logística
p - Probabilidade
λ - Lambda; Comprimento de onda χ2
- Qui-quadrado
ºC - Graus Celsius % - Percentagem ® - Marca registrada
ix
Agradecimentos
Nenhum trabalho é uma obra única e singular, fruto de uma só pessoa ou indivíduo, por isso gostaria de agradecer a todas as pessoas que directa ou indirectamente contribuíram para a realização deste meu objectivo, em especial:
Aos meus pais que sempre me acompanharam, desde o meu primeiro passo... À Professora Doutora Ana Cláudia Coelho por ter orientado este Mestrado Integrado e tão bem ter cuidado de mim.
Ao Dr. José Manuel Monteiro por ter orientado o meu estágio e ser o meu Mestre e Pai de Profissão.
À minha irmã Rolanda, a minha flor única, por me ter dado um sentido à vida!.. À minha irmã Frederica por me aturar, me massacrar e por me acompanhar ao longo da vida.
À Dani que me ensinou a olhar o mundo, amar a vida e ultrapassar precipícios... A toda a minha família, Brandão, Campos, Lopes e Moreira por me apoiarem e incentivarem ao longo de toda a minha caminhada.
À macaca e ao miúdo, meus companheiros, meus amigos e meus irmãos. A todos os amigos da Vila que me acompanharam ao longo destes 5 anos. Aos mosqueteiros e todos os meus amigos de Braga.
À Alice por me ter ajudado ao longo deste trabalho.
A todos aqueles que, de uma forma ou de outra, influenciaram a minha vida…
“Uma velha tinha tinha, tinha tinha na cabeça. Dava tudo quanto tinha para tirar aquela tinha, que ela tinha na cabeça” - Provérbio Português
1
I. Revisão Bibliográfica 1. O coelho e a cunicultura
O coelho doméstico é um mamífero herbívoro da Ordem Lagomorpha e da Família
Leporidae que tem origem na Península Ibérica. Existem várias raças, mas é do coelho
silvestre (Oryctolagus cuniculus) que derivam as múltiplas variedades utilizadas na cunicultura industrial (Rosell, 2000a; Meredith et al., 2002; Venâncio et al., 2007).
O seu interesse zootécnico é crescente, pois, para além de ser uma verdadeira “máquina” de produção, a sua carne tem elevado valor proteico (superior à carne de bovino, ovino e suíno) e menos gordura. O coelho consome pouco alimento, estando o seu índice de conversão (IC) por volta dos 25% (Ramos, 1993).
Esta espécie tem uma grande importância para o Homem, pois o consumo da carne tem vindo a aumentar ao longo dos anos em diversos países, nomeadamente, nos mediterrâneos como Portugal, Espanha, França e Itália (Venâncio et al., 2007).
Figura 1 - Coelhos utilizados na cunicultura industrial (Fonte: imagem gentilmente cedida
pela COREN®, 2008).
2. Breve nota histórica dos dermatófitos
Os fungos são tão antigos como a própria humanidade. Hoje em dia são conhecidas espécies zoofílicas e antropofílicas datadas do período mesozóico (Gomes, 2004). O pioneiro dos estudos das micoses nos animais foi o italiano Agostino Bassi, que no ano de 1807 estudou a infecção nos bichos-da-seda, o “mal de segno”, conhecido actualmente por muscardina (Britannica, 2008).
No entanto, só em 1839, Robert Remark, Professor Polaco da Faculdade de Medicina da Universidade de Berlim, iniciou o estudo das dermatofitoses propriamente
2
dito (Gomes, 2004). A micologia médica desenvolveu-se durante o séc.XIX, paralelamente ao aumento do uso de animais de laboratório (Baker, 1998; Sidrim e Rocha, 2004).
Raymond Jacques Andrien Sabourand, considerado por todos a figura mais importante no desenvolvimento da micologia moderna, estabeleceu no ínicio do séc. XX o tratado denominado Les teignes, em que os dermatófitos eram enquadrados em quatro géneros: Achorion, Tricophyton, Epidermophyton e Microsporum. Emmons, baseado nas culturas e no aspecto morfológico dos fungos extingue o primeiro género, Achorion, em 1934 (Gomes, 2004). Conant, em 1954, propõe uma nova classificação baseada nos estudos de Benham, que é considerado o fundador da micologia médica moderna, agrupando os dermatófitos por semelhanças morfológicas das colónias, partindo dos mesmos três géneros anteriores (Ramos, 1993). Existem opiniões e critérios díspares consoante as escolas representadas. O debate acerca da classificação dos dermatófitos já ocorre há mais de meio século e, prolonga-se até aos dias de hoje, agora com referências a nível molecular (Gräser et al., 2006).
Actualmente, estima-se que existam mais de 1,5 milhões de espécies de fungos, sendo que apenas 150 são patogénicos para os mamíferos (Casadevall, 2005).
A denominação dermatófito, é apenas atribuída aos três géneros taxonómicos que são queratinófilos e capazes de causar doença em homens e animais (Gomes, 2004; Simdrim et
al., 2004).
3. Dermatófitos
Os dermatófitos são fungos queratinofílicos e queratinolíticos, que pertencem aos géneros Epidermophyton, Microsporum e Tricophyton (Figura 2). Estes causam infecções das camadas superficiais e queratinizadas da pele e seus apêndices (pêlos, unhas, penas e cornos) (Rosser, 1995; Moriello, 1996; Hungerford et al., 1998; Cabañes, 2000; Donelli et
al., 2000; Simpanya 2000; OIE, 2005).
A dermatofitose ou tinha, é uma zoonose disseminada por todo o mundo. Está normalmente associada a locais de grande densidade animal (canis, gatis, biotérios, explorações de bovinos e cuniculturas), assumindo um carácter epizoótico com elevada incidência (Takashio, 1975; Rosell, 2000b; Boucher e Nouaille, 2002).
São infecções raramente letais, causando, no entanto, grandes perdas económicas, em tratamentos, aumento dos índices de conversão e perda da qualidade dos produtos finais, principalmente a nível da comercialização de peles (Zrimsek, 1999; Rosell, 2000b; Zrimsek, 2003; Coelho et al., 2008a).
3
Nas cuniculturas com este problema, os prejuízos podem ser bastante elevados. É uma doença com larga distribuição nas explorações, que compromete o ganho de peso e a consequente transformação do alimento. Têm elevado interesse técnico pela sua capacidade de contágio e poder de disseminação (Rosell, 2000b).
Em Portugal, assim como no resto do mundo, existem poucos estudos sobre a frequência de dermatófitos em coelhos explorados de forma intensiva (Van Rooij et al., 2006).
Para quem trabalha ou contacta directamente com animais infectados, além dos custos associados ao tratamento e à redução das horas de trabalho, podem surgir custos inaparentes, paralelos, associados ao stress das pessoas infectadas, medo inerente da contracção da infeção e às repressões sociais, especialmente quando apresentam lesões cutâneas bastante evidentes e repugnantes. As dermatofitoses humanas, fruto do contacto com animais infectados, estão a ganhar cada vez mais importância, tendo-se verificado um aumento da vigilância epidemiológica e sanitária nesta área (Bernardo et al., 1989; Rosell, 2000b).
Nos últimos anos, demonstrou-se através de muitos estudos epidemiológicos, que as dermatofitoses nos animais são muito comuns, principalmente em animais de produção intensiva (Bernardo et al., 1989; Cabañes, 2000; Rosell, 2000b).
Nos coelhos de produção, os dermatófitos mais comuns são Tricophyton
mentagrophytes e M. canis (Baker, 1998; Cabañes, 2000; Rosell, 2000b).
Figura 2 - Dermatófitos (Fonte: adaptado de Sidrim e Rocha, 2004). 3.1. Classificação
Os organismos que pretencem ao Reino Mycota são de difícil classificação devido à sua grande diversidade e à constante descoberta de novas espécies (Deboer e Moriello, 1993; Ramos, 1993).
4
Os “fungos superiores ou verdadeiros” pertencem à divisão Eumycota e possuem uma série de características próprias. São seres eucariotas, com uma membrana a rodear o material nuclear, diferenciando um verdadeiro núcleo, contendo ribossomas do tipo 80S. Apresentam parede celular rígida sem peptidoglicases, o que os impede de exercerem fagocitose. A sua nutrição é realizada através da absorção de nutrientes solúveis, obtidos muitas vezes por acção enzimática extracelular. São seres heterotróficos, que não possuem clorofila, logo obtêm a sua energia através de compostos químicos. Necessitam de compostos orgânicos como fonte de carbono e energia (Donnelly et al., 2000; Sympania, 2000).
Podem apresentar dois tipos de reprodução, sexuada e assexuada, dando origem à formação de esporos. Os fungos perfeitos produzem esporos sexuados e os imperfeitos dão origem a esporos assexuados (Whittaker, 1969).
Morfologicamente, podem ser de dois tipos: micelial, possuindo hifas, ou do tipo leveduriforme, que são células individuais (Margullius, 1996). Os fungos queratinofilicos têm a capacidade enzimática para digerir a queratina. Esta característica confere a capacidade de produzir infecção nas zonas queratinizadas do corpo. Estes fungos denominam-se dermatófitos (Gräser et al., 2000; Cano et al., 2005). Os dermatofitos são classificados com base nas suas estruturas reprodutoras assexuais dentro do Subfilo
Deuteromycotina e na Classe Hyphomycetes (Sympania, 2000). São também classificados
vários dermatófitos com reprodução sexuada, como é o caso do Género Arthroderma. Na Tabela 1, pode-se observar um esquema de organização taxonómica dos dermatófitos.
A classificação actual inclui os géneros Epidermophyton, Microsporum e
Tricophyton (Sympania, 2000). Existem, no entanto, estudos recentes que levantam novas
possibilidades de diferentes serótipos e espécies de dermatófitos (Gräser et al., 2000; Cano
et al., 2005).
Quanto ao seu habitat e ecologia, os dermatófitos podem ser classificados em zoofílicos (dermatófitos que são, maioritariamente, encontrados em animais mas podem ser transmitidos ao homem), antropofílicos (maioritariamente encontrados no homem e, raramente, são transmitidos a animais) e geofílicos (dermatófitos que se encontram, principalmente no solo, afectando tanto animais como humanos) (Torres-Rodriguez et al., 1992; Scott et al., 1995; Kane et al., 1997; Spiewak e Szostak, 2000; OIE, 2005).
5
Os dermatófitos geofílicos são considerados a forma ancestral, de onde derivaram, filogeneticamente, os restantes dermatófitos, através de mutações e adaptações progressivas (Ramos, 1993; Spiewak e Szostak, 2000).
Actualmente, as espécies zoofilicas são as que apresentam maior prevalência. Estas conseguem sobreviver no solo e no ambiente, associadas a peles, penas e descamações cutâneas, durante meses e até anos (Torres-Rodriguez et al., 1992; Kane et al., 1997).
Utiliza-se o termo “dermatofitose” para denominar infecções produzidas pelos dermatófitos. No entanto, em alguns casos, utiliza-se a denominação “dermatomicose”, que segundo alguns autores não é correcta, pois a terminação da palavra “micose” remete-nos para invasão profunda da pele, o que não se verifica (Ramos, 1993; Bagyalashmir et al., 2008).
Tabela 1 - Filogenia dos dermatófitos; (Fonte: adaptado de Sympania, 2000).
Reino...Fungi Filo...Eumycota Subfilo...Ascomycota Classe...Ascohymenomycetes Ordem...Onygeales Família...Arthrodermataceace Género...Arthroderma Subfilo...Deuteromycotina Classe...Hyphomycetes Ordem...Hyphomycetales Família...Moniliaceae Género...Epidermophyton Microsporum Tricophyton 3.2. Etiologia
As espécies de dermatófitos com maior importância na etiologia da dermatofitose dos coelhos de produção, são: T. mentagrophytes e M. canis. No entanto, a maioria das infecções é causada por T. mentagrophytes (Cabañes et al., 1997; Saito et al., 2001; White
6
et al., 2002; López, 2003; Coelho et al., 2008a). Foram também já identificados outros
dermatófitos em cuniculturas afectadas como: M. gypseum, M. cookei, M. nanum, T.
quinokeanum, T. verrucosum, T. equinum, M. andovinii, T. rubrum, T. schoeuleinii entre
outros (Ramos, 1993). Normalmente, os animais infectados da mesma cunicultura, têm etiologia semelhante (Rosell, 2000b).
3.2.1. Tricophyton mentagrophytes
No estado teleomórfico sexuado, o complexo T. mentagrophytes representa duas espécies: Arthroderma benhamiae e A. vanbreuseghemii (Saito et al., 2001).
A sua morfologia macroscópica é típica. As colónias zoofílicas são de crescimento e coloração variável entre o creme e o amarelo, com aspecto de pó de arroz (pulvurulenta). São muito numerosas e formam variados tipos de estruturas microscópicas em forma de cachos. As formas antropofílicas apresentam um número mais reduzido de microconídeas. (Almeida, 1999; Cabañes, 2000; Simpanya, 2000).
As macroconídeas, quando presentes, assemelham-se a charutos (Green et al., 1983; Almeida, 1999).
Todas as variedades de T. mentagrophytes são capazes de perfurar o pêlo, e este não apresenta fluorescência quando examinado sob luz da lâmpada de Wood. São espécies urease positivas (Zrimsek et al., 1999).
Figura 3 - T. mentagrophytes (Fonte: adaptado de Sidrim e Rocha, 2004).
3.2.2. Microsporum canis
Apresenta no estado telomorfo as espécies Arthroderma (Nannizia) otae.
Formam colónias de crescimento rápido e cor esbranquiçada. A sua coloração vai variando desde o creme, passando pelo amarelo-brilhante e torna-se baço e, de cor alaranjada. Apresenta textura de algodão (Almeida, 1999; Sympanya, 2000).
7
A localização no pêlo é do tipo ectotrix e os esporos têm uma aparência alongada e fusiforme. Este espécie, apresenta capacidade de perfurar o pêlo in vitro e as suas hifas envolvem o pêlo (Zrimsek et al., 1999).
4. Epidemiologia
Os dermatófitos são fungos que afectam tecidos queratinizados pois possuem enzimas (queratinases e outras enzimas proteolíticas) capazes de digerir a queratina. (Sparkes et al., 1993; Nascimento, 2002; López, 2003; Zrimsek et al., 2003).
As espécies zoofílicas são, primariamente, parasitas dos animais, embora possam provocar infecção no homem. A maior parte delas tem uma distribuição cosmopolita, por vezes com variantes regionais, com localizações geográficas restritas em função do seu hospedeiro principal (Pinto, 1993; Cabañes et al., 1997; Cabañes, 2000; Pereira et al., 2006). A incidência da dermatofitose nas cuniculturas, tem vindo a diminuir nos últimos anos, continuando, no entanto, a ser bastante elevada (Rosell, 2000b). Trata-se de uma infecção sazonal, que depende do clima e das condições gerais das explorações. A transmissão ocorre por contacto directo entre animais infectados, por transmissão aerógena ou através de fómites. Na maior parte das vezes, a dermatofitose entra numa exploração, quando são introduzidos animais reprodutores com mais de três meses (Weitzman e Summerbell, 1995; Donnelly et al., 2000).
Os animais doentes constituem uma fonte importante de contágio, através da presença de esporos disseminados na sua pelagem à volta das lesões (Weitzman e Summerbell, 1995; Donnelly et al., 2000).
É uma infecção que pode ter um curso prolongado, com fases crónicas e progressivas, mas em geral são processos auto-limitantes com cura espontânea (Pinto, 1993).
T. mentagrophytes é o principal causador de infecção nas cuniculturas, afectando uma grande variedade de raças. Quanto a M. gypseum encontra-se, normalmente, em solos animalizados ou com elevadas concentrações de matéria orgânica. O solo é portanto considerado um reservatório de M. gypseum, onde em condições óptimas de temperatura e humidade, a multiplicação do fungo é favorecida. (Prochnau et al., 2004; Iorio et al., 2007; Coelho et al., 2008b).
As explorações onde tenham existido animais infectados podem ser fontes potenciais de contágio sendo que as dermatofitoses são extremamente contagiosas e, facilmente transmissíveis aos humanos (Van Rooij et al., 2005).
8
Os esporos (artrósporos) estão presentes no ambiente e em materiais contaminados que, ao infectarem os tecidos, provocam a destruição dos pêlos, originando um quadro de dermatofitose. A infecção é consequência da reacção do hospedeiro aos produtos metabólicos do fungo e da invasão do tecido pelo organismo vivo. Os esporos podem sobreviver no ambiente por largos períodos de tempo (meses ou anos), quando se encontram no interior de segmentos capilares ou de descamações epidérmicas (Zagnoli et
al., 2004; OIE, 2005).
O animal sem sinais clínicos, não sendo detectado, funciona como contaminante ambiental, complicando o tratamento e a erradicação da doença. Em muitos casos, a fêmea apresenta lesões na região mamária e os machos na zona pélvica junto aos testículos (Rosell, 2000b; Boucher e Nouaille, 2002).
O aparecimento de dermatofitose numa ninhada ou na engorda é, com frequência, indicativo de que a mãe é portadora, passando-a directamente de uma geração para a seguinte. Normalmente, as lesões da mãe encontram-se ao nível do abdómen, junto aos tetos, e os láparos, ao contactarem com estes na mamada, tornam-se portadores (Figura 4) (Rosell, 2000b; Boucher e Nouaille, 2002).
Existem diversos factores predisponentes como a idade, as condições de alojamento, o estado imunitário e a genética (raça), entre outros (Ramos, 1993).
As dermatofitoses afectam principalmente láparos entre os 30 e os 60 dias de vida. As condições de alojamento durante a fase de engorda são mais precárias, a densidade animal é maior, verificam-se mais lutas e existe mais humidade e calor (Rosell, 2000a; Boucher e Nouaille, 2002).
O estatuto imunitário determina a susceptibilidade dos animais. Animais jovens, velhos ou imunodepremidos (doença, gestação, etc.) são mais vulneráveis (Ramos, 1993).
A genética está bastante relacionada com o estatuto imunitário. Assim, animais com derterminada raça genética, são mais susceptíveis à dermatofitose do que outros (Baker, 1998; Morisse et al., 1997; Morisse et al., 1999; Rosell, 2000b; López, 2003).
Existem também factores favorecedores da infecção. De acordo com alguns autores, as estações do ano mais propícias ao seu aparecimento são as mais frias e humidas. São épocas de maior prevalência, pois coincidem com condições de temperatura e humidade apropriadas (Ramos, 1993).
Os processos intercorrentes, como, por exemplo, a lactação, afectam a prevalência destas infecções, uma vez que as coelhas lactantes apresentam, muitas vezes, lesões junto à
9
região mamária devidas à alopecia fisiológica e aos arranhões ocasionados pela remoção de pêlo (Figura 4) (Boucher e Nouaille, 2002).
Os tratamentos prévios com antibióticos também favorecem o processo (Rosell, 2000b; Gomes, 2004).
A dermatofitose nos coelhos é, normalmente, auto-limitante. A diminuição do stress e a melhoria das condições de alojamento e ambiente são considerações importantes na regressão das lesões (Rosell 2000b; OIE, 2005; Van Rooij et al., 2006).
O ciclo do pêlo, que ocorre mais rapidamente nos animais, pode ser uma das causas da remissão das dermatofitoses mais rapidamente nos animais.
Figura 4 - Fêmea reprodutora com lesão compatível com dermatofitose na região
mamária (Imagem gentilmente cedida pela COREN®).
5. Potencial zoonótico das dermatofitoses dos coelhos de produção
O homem é susceptível à infecção pelos dermatófitos. Os cães e os gatos são a principal fonte de contágio em meios urbanos, enquanto, no meio rural, são os coelhos, os cavalos e o gado bovino (Ramos, 1993; Spiewak e Szostak, 2000; Coelho et al., 2008a).
A dermatofitose por M. canis é, provavelmente, a zoonose adquirida com maior frrequência, no contacto com animais de companhia. No caso das cuniculturas afectadas com dermatofitose, e visto que a sua maioria está contaminada com T. mentagrophytes, é também de suspeitar a presença de infecção nos tratadores, cunicultores e médicos veterinários por esta espécie (Benenson, 1987; Tizzani et al., 2007).
A percentagem de tratadores infectados com dermatofitose é muito elevada, podendo ascender aos 90%. A transmissão efectua-se por contacto directo ou indirecto
10
com animais infectados e, pelo contacto com objectos contaminados com pelagem e descamações cutâneas de coelhos infectados (Biberstein, 1994; Rosell, 2000b).
A maior parte das pessoas afectadas são assintomáticas, verificando-se cura espontânea, não necessitando do auxílio médico (Benenson, 1987; Pinard e Chermette, 1987).
A infecção não põe em risco directo a vida humana, mas provoca um aspecto externo repugnante, com lesões cutâneas que podem evoluir para dermatomicoses mais profundas, provocando cicatrizes, com todas as repercurssões a nível pessoal (auto-estima) e social (integração num grupo). A evolução é lenta e os tratamentos prolongados (Ramos, 1993).
Embora cause baixa mortalidade, tem elevada morbilidade, podendo permanecer em indivíduos imunodeprimidos durante longos períodos (OIE, 2005).
A nível de matadouro, os animais que apresentarem lesões compatíveis com dermatofitose são alvo de rejeição total (Rosell, 2000b).
Figuras 5 e 6 - Lesões superficiais causadas por dermatófitos (Fonte: adaptado de Sidrim e
Rocha, 2004).
6. Patogenia
As dermatofitoses são infecções dos tecidos queratinizados superficiais, da epiderme, pêlos, unhas, cornos e penas, causadas por fungos queratinolíticos e queratinofílicos. Os pêlos são, normalmente, a parte mais afectada, resultando numa alopécia prematura (Connole, 1967; Soltys e Sumner-Smith, 1969; Rosser, 1995; Donnelly
et al., 2000; Hainer, 2003).
Para que ocorra o estabelecimento de uma infecção, os esporos viáveis ou as conídias, penetram a pele e, através de estímulos químicos, germinam e produzem hifas artrospóricas, que proliferam através do estrato córneo e invadem a queratina do pêlo. Este processo pode desencadear-se relativamente rápido (6 horas) e os esporos podem
11
encontrar-se viáveis no ambiente entre 6 e 12 meses. Existem casos em que, consoante as condições, permanecem mais tempo. Quando um fungo estabelece residência podem ocorrer duas situações: ou não produz lesões detectáveis (portadores assintomáticos), ou causa lesões clinicamente compatíveis (Biberstein, 1994; Sparkes et al., 1994; Moriello, 1996; OIE, 2005). Mas nem sempre ocorre infecção. Os fungos podem ser eliminados por via mecânica, ou simplesmente não estabelecer qualquer resistência, por incapacidade de competir com a flora residente. (Connole, 1967; Moriello, 1996).
A cutícula do pêlo, por não conter queratina, não é vulnerável à acção das enzimas queratolíticas dos dermatófitos, funcionando como barreira (Donnelly et al., 2000).
Através da actividade enzimática e mecânica, os dermatófitos penetram ao longo do pêlo, destruindo a queratina. O pêlo vai ficando cada vez mais fragilizado, fracturando-se (Baker, 1998).
A produção de artrósporos ocorre no interior do pêlo, quer por infecções do tipo endotrix, quer do tipo ectotrix. Apenas na invasão ectotrix, há produção de massas de artrósporos em redor do pêlo (Deboer e Moriello, 1993; Moriello, 1996) (Figura 7 e 8).
Figuras 7 e 8 - Colonização endotrix e ectotrix em pêlos (Fonte: adaptado de Sidrim e
Rocha, 2004).
Estudos recentes apontam para diferenças na especificidade das enzimas queratinases, responsáveis pela digestão da queratina. Estas enzimas são intracelulares e podem induzir fenómenos de hipersensibilidade. Esta especificidade pode condicionar o leque de hospedeiros destes agentes, consoante o dermatófito de onde foi isolada (Zrimsek, 1999; Zrimsek et al., 2003).
Experimentalmente, a infecção por dermatófitos pode ser dividida em quatro fases: uma inicial, onde ocorre a incubação (a partir do momento da inoculação até ao 4º-6º dia), seguido da fase de disseminação, que dura aproximadamente 7-10 dias e que culmina na fase inflamatória (12 a 15 dias depois da inoculação). A última fase, a de cura, é variável (Weitzman e Summerbell, 1995).
12
Normalmente, ocorre uma resolução espontânea da infecção, na fase telógenica do ciclo do pêlo, ou quando ocorre uma resposta inflamatória eficaz (Donnelly et al., 2000).
A imunidade mediada pelas células do tipo T está associada à resistência à infecção. Não parece, no entanto, haver qualquer relação entre o título de anticorpos circulantes e o grau de resistência à infecção por dermatófitos. O ambiente, os factores locais, a integridade da pele e do pêlo e a actividade antifúngica do sebo e do suor, são barreiras importantes à invasão e desenvolvimento do fungo (Jones, 1986; Rosser, 1995; Moriello, 1996).
Apesar da imunidade celular ser crucial para a recuperação da dermatofitose, os anticorpos têm um papel fundamental na recuperação da infecção. Alguns antigénios fúngicos têm sido estudados e, são hoje considerados bastante importantes na patogénese da dermatofitose. A opsonização e a activação do complemento, devido a anticorpos específicos induzidos pelos antigénios, contribuem em grande parte, para a inactivação e eliminação dos elementos fúngicos (Sparks et al., 1994).
As reacções exacerbadas, desencadeadas pela infecção dos dermatófitos, devem-se à excreção de substâncias tóxicas e antigénicas para as células vivas dos tecidos. Esta reacção inflamatória e o seu consequente desenvolvimento, é também influenciada pela espécie de fungo presente (Lunder, 1992; Moriello, 1996).
A manutenção da infecção e a sobrevivência dos dermatófitos depende, em grande parte, da sua capacidade de evitar a resposta inflamatória. Ao longo de todo o processo os fungos vão-se adaptando às condições adversas que cada hospedeiro lhe proporciona, através da libertação de quantidades mínimas de toxinas e alérgenos (Moriello, 1996; Sympanya, 2000).
No caso das infecções por T. mentagrophytes, as mais comuns nas cuniculturas, a reacção inflamatória é mais acentuada, provocando lesões mais intensas, que se podem caracterizar por eritema, edema, exsudação, formação de crostas e alopecia (White et al., 2002) (Figura 9 e 10).
A receptividade individual está relacionada com a condição imunitária (exposição anterior), condição geral do animal (doenças, estado nutricional), stress (gestação, lactação) e quantidade de tecido lipídico subcutâneo. Animais jovens são mais susceptíveis, o que pode estar associado ao seu estado imunitário e ao facto de não terem estado previamente expostos, sem terem adquirido imunidade (Soltys e Sumner-Smith, 1969; Rosser, 1995; López, 2003).
13
Figura 9 e 10 - Coelhos com lesões compatíveis com dermatofitose (Fonte: imagens
gentilmente cedidas pela COREN®).
7. Quadro clínico e lesional
Os animais infectados apresentam, normalmente, descamação difusa, principalmente, na zona da cabeça, orelhas e extremidades dos membros, envolvendo, por vezes, extensas áreas corporais. Esta situação observa-se, com mais frequência, em ninhadas numerosas, em amamentação ou recentemente desmamadas (Foil, 1994; Rosell, 2000b; OIE, 2005) (Figura 11 e 12).
As lesões podem ser circulares ou alopécicas, focais ou multifocais, solitárias ou generalizadas e a sua localização varia muito consoante a intensidade da infecção. Podem estar presentes na cabeça (orelhas, nuca e focinho), dorso, abdómen, zona pélvica, cauda e membros (Moriello, 1996; OIE, 2005).
A área afectada torna-se depilada, mais ou menos vasta e de contorno regular, podendo ou não ser circular. A maioria dos casos de dermatofitose surgem associados a lesões de foliculite e na zona lesionada e peri-lesional, a depilação é fácil através de uma ligeira tracção (Rosser, 1995; Guillot, 1999).
As infecções não estão directamente ligadas a prurido, mas podem ocorrer com frequência e intensidade variável, nunca esquecendo os animais assintomáticos (Pereira et
al., 2006).
As dermatofitoses causadas por T. mentagrophytes, são normalmente inflamatórias e originam com frequência lesões tipo quérion, que podem atingir grande parte da superfície corporal (Guillot, 1999).
14
Na maioria das vezes não causam mortalidade, mas o prejuízo económico é muito elevado, devido a atrasos no crescimento e ao aumento do índice de conversão (IC) (Rosell, 2000b).
Figura 11 e 12 - Coelhos com lesões compatíveis com dermatofitose (Imagens gentilmente
cedidas pela COREN®).
8. Diagnóstico
8.1. Diagnóstico epidemiológico
A dermatofitose é uma infecção muito contagiosa que afecta grande número de espécies animais. No caso dos coelhos, o facto de existirem mães portadoras numa cunicultura é um factor primordial para a infecção geral da exploração, atingindo animais de todos os sexos e de todas as idades (Pinard e Chermette, 1987; Rosell, 2000b).
As variações verificadas no isolamento de dermatófitos, relacionadas com a idade e raça, não são conclusivas. É, no entanto, necessário estabelecer as circunstâncias que podem favorecer uma possível contaminação, tais como a densidade animal, presença de animais assintomáticos, condições da exploração, condições climáticas, etc. (Moriello, 2001).
Os diagnósticos diferenciais da dermatofitose em coelhos incluem a sarna sarcóptica e a hipertricose por excesso de enxofre (Rosell, 2000b).
8.2. Diagnóstico clínico
As dermatofitoses nos coelhos de alta produção são um problema para todos os cunicultores a nível de tratamento e controlo. O seu diagnóstico clínico é muitas vezes
15
efectuado com alguma facilidade, através da visualização do aspecto das lesões, e pelo facto de um elevado número de animais estar infectado (Pinard e Chermette, 1987).
O diagnóstico só apresenta dificuldades quando o número de animais infectados é
reduzido e a infecção está numa fase inicial. A aparência clínica e a localização das lesões são o primeiro passo para uma suspeita de dermatofitose (Pinard e Chermette, 1987; Rosser, 1995).
8.3. Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial é baseado na observação directa e na cultura de pêlos e descamações cutâneas. O aspecto e a abundância de lesões possibilitam as complicações bacterianas, dificultando este tipo de diagnóstico. É recomendado colher amostras da zona da cabeça e orelhas, uma vez que são os potenciais locais mais afectados (Pinard e Chermette, 1987; Medleau et al., 1992; Sparkes et al., 1993; Dominique et al., 2003).
A técnica de colheita das amostras na exploração é extremamente importante. Deve- -se efectuar todos os passos com paciência e, o pêlo nunca deve ser cortado com tesoura, mas sim arrancado ou raspado. A desinfecção do local com álcool a 70ºC é importante para reduzir o número de contaminantes sendo a colheita executada em vários locais, onde existam lesões suspeitas. Se possível, os pêlos partidos, as porções intrafoliculares e as descamações cutâneas devem também ser recolhidos (Noxon, 1995; Curtis, 2001; Mueller, 2006).
A colheita é feita com pinça, lâmina de bisturi ou fita adesiva e a amostra deve ser enviada para o laboratório, a seco, num envelope com algodão e colocada num recipiente estéril e fechado (Weitzman e Summerbell, 1995; Curtis, 2001).
8.3.1. Exame sob a Lâmpada de Wood
Os pêlos, infectados por algumas espécies de dermatófitos, emitem uma fluorescência verde, quando expostos à Lâmpada de Wood (luz ultra-violeta filtrada através de um vidro que contém cobalto ou óxido de níquel, com λ=396 nm), devido a um metabolito do triptófano (Benenson, 1987; Pinard e Chermette, 1987; Medleau et al., 1992; Biberstein, 1994).
O exame pode ser executado sobre uma amostra de pêlos da região lesionada ou peri-lesional (Pinard e Chermette, 1987; Medleau et al., 1992).
16
A observação sob a Lâmpada de Wood apenas é positiva para infecções causadas pela espécie Microsporum, pelo que não é utilizada em exames de cuniculturas (Soltys e Sumner-Smith, 1969; Scarff, 2002).
8.3.2. Exame microscópico directo
A observação directa dos pêlos e descamações através da microscopia permite o diagnóstico em alguns minutos ou horas e é mais económico. Este tipo de exame é usado como diagnóstico presuntivo do agente micótico e as preparações são feitas com diversos líquidos de montagem (preparações clarificantes), dependendo do material e da espécie de fungo envolvida (Neufeld, 1998).
Na análise com o hidróxido de potássio (KHO), a 30% ou 40%, os pêlos colhidos são colocados em lâminas ou lamelas e visualizados em microscópio óptico em objectivas de 10X, 40X até 400X. A função do KHO é dissolver as estruturas dos tecidos e clarear os pigmentos sem afectar as estruturas fúngicas (Neufeld, 1998; Gomes, 2004; Grupta e Linh, 2006; Coelho et al., 2008b).
O exame microscópico pode ser potenciado com o uso de lactofenol-azul de algodão (Willemse, 1999; Gomes, 2004; Coelho et al., 2008b).
A única evidência inequívoca é a visualização da hifa artrospórica, invadindo a queratina do estrato córneo ou pêlo. A base do pêlo é envolvida por artrósporos, mas esta situação varia também consoante a espécie. No caso de Microporum, os esporos rodeiam a base do pêlo em mosaico irregular, mas no caso de Tricophyton os esporos estão dispostos em grupos (Benenson, 1987; Pinard e Chermette, 1987; Foil, 1994; Moriello, 1996; Zagnoli et al., 2004).
Neste tipo de exame ocorrem muitos falsos negativos, mesmo quando efectuado por micologistas ou dermatologistas experientes (Foil, 1994; Guillot, 1999).
8.3.3. Culturas
A cultura de fungos é a base para a identificação definitiva do agente causal. Podem ser utilizados dois tipos de meios de cultura: os não-selectivos e os selectivos (Grupta e Linh, 2006).
Os meios não-selectivos permitem o crescimento virtual de todas as espécies fúngicas. São exemplos, o Agar Sabouraud (SDA), o Agar Sabouraud-Infusão de Coração-Cérebro (SABHI), SABHI com sangue, Agar Infusão de Coração-Coração-Cérebro (BHIA), BHIA
17
com sangue, BHIA bifásico e o Agar Sabouraud com Dextrose (Salkin et al., 1997; Neufeld, 1998).
Os meios selectivos são muito úteis, pois muitas vezes o material enviado para laboratório é recolhido em ambiente não esterilizado, e torna-se necessário usar meios que contenham inibidores de bactérias e fungos contaminantes. Existe um vasto número de antimicrobianos que podem ser empregues: cloranfenicol, gentamicina, penicilina, estreptomicina, ciclohexomida, etc. São exemplos de meios selectivos: SAD com cloranfenicol, SABHI com cloranfenicol e gentamicina, SABHI com cloranfenicol, gentamicina e cicloheximida, BHIA com cloranfenicol e gentamicina, BHIA com cloranfenicol, gentamicina e cicloheximida, meios comerciais como o Agar Mycosel ou Micobiótico e o Dermatophyte Test Medium® (DTM®) (Salkin et al., 1997; Neufeld, 1998).
O meio tradicionalmente mais utilizado era o Agar Sabouraud, com 1% de peptona e 4% de glicose. O seu pH ácido de 5,6 evita o crescimento bacteriano (Biberstein, 1994).
O DTM® é hoje o meio de eleição. Este contém nutrientes, gentamicina, clortetraciclina e cicloheximida, que inibe o crescimento de bactérias e outros fungos saprófitas, que podem estar presentes em amostras contaminadas. A composição deste meio facilita a visualização, pois em caso de crescimento de dermatófitos, o meio muda de cor (amarelo para vermelho), devido à produção de substratos alcalinos (Pinard e Chermette, 1987; Weitzman e Summerbell, 1995). A alteração da cor do meio não pode ser encarada como prova inequívoca da presença de dermatófitos, mas apenas como um indicador (Weitzman e Summerbell, 1995).
Os dermatófitos são aeróbios não fermentativos, cuja temperatura óptima de crescimento varia entre os 25ºC e 30ºC. Depois de 7 a 10 dias de crescimento, a maioria das colónias começam a produzir esporos, que vão permitir a sua identificação específica (Foil, 1994).
O número de colónias formadas em cultura pode fornecer uma orientação importante para o diagnóstico. É de salientar o facto de amostras colhidas de animais com sinais clínicos necessitarem de um período de incubação menor (Weitzman e Summerbell, 1995).
As diferentes espécies dermatófitas são identificadas com base na sua morfologia macroscópica das suas colónias e características microscópicas. Os critérios utilizados são vários, como: taxa de crescimento, textura, topografia, cor, produção de pigmento e alguns elementos da reprodução (Neufeld, 1998; Gomes, 2004; Coelho et al., 2008b).
18
Por vezes é necessário sujeitar os dermatófitos a meios específicos (culturas “slide”), que promovem a esporulação e, só assim, é possível a identificação correcta dos dermatófitos. São exemplos de meios específicos: Agar Sabouraud Dextrose e Batata Dextrose Agar (PDA) (Neufeld, 1998; Gomes, 2004; Coelho et al., 2008a).
O uso de chaves de identificação também é utilizado, como é o exemplo da chave de identificação do Laboratory Handbook of Dermathophytes (Kane et al., 1997; Gomes, 2004).
O inconveniente das culturas de fungos é, para além do elevado número de amostras originarem resultados falsos negativos, a leitura só poder ser efectuada com êxito 14 a 15 dias após a incubação (Curtis, 2001; Coelho et al., 2008a).
Existem outros meios que, não tendo tido muito sucesso, foram introduzidos, como é o caso do Dermatophyte Identification Medium® (DIM®), na tentativa de eliminar falsos negativos associados a meios muito comerciais, como o DTM® (Salkin et al., 1997).
O exame microscópico é a base do diagnóstico da maioria dos fungos. A visualização das estruturas reprodutivas e os esporos, assim como as suas respectivas diferenças morfológicas, são o ponto de partida para o processo de identificação. Um fragmento da cultura primária, ou da subcultura, é retirado e colocado sobre a lâmina e lamela ou uma fita adesiva, com um líquido de montagem apropriado, como o lactofenol com azul de algodão. Os dermatófitos, sendo fungos hialinos, não possuem pigmentos, devendo por isso ser examinados com o lactofenol-azul de algodão, que cora as estruturas de azul (Neufeld, 1998).
8.3.4. Diagnóstico histopatológico
Este tipo de diagnóstico permite pôr em evidência os elementos fúngicos presentes nos tecidos. Podem ser utilizadas três tipos de coloração, hematoxilina-eosina (HES), ácido periódico-Schiff (PAS) e Grocott (GMS) (Guillot, 1999; Chabasse e Contet-Audonneau, 2003; Arruda et al., 2007).
Existem diversas alterações histológicas compatíveis com dermatofitose, nomeadamente a presença de neutrófilos, ortoqueratose maciça, perifoliculite, foliculite, furunculose, dermatite perivascular e dermatite intraepidérmica vesicular/pustular (Curtis, 2001).
Observam-se hifas septadas e artroconídeas no estrato córneo, folículos pilosos no interior ou à volta dos pêlos (Guillot, 1999; Chabasse e Contet-Audonneau, 2003). Este
19
tipo de exame permite orientar um resultado, quando positivo, quase imediatamente, diferenciando o tipo de dermatófitos implicado (Chabasse e Contet-Audonneau, 2003).
8.4. Outros meios de diagnóstico
Outros meios de diagnóstico podem ser utilizados, com maior ou menor sucesso. É o caso do teste da urease, prova de requerimentos vitamínicos ou o diagnóstico terapêutico. O diagnóstico terapêutico, como o próprio nome refere, é feito através da acção anti-inflamatória de antifúngicos, e da resposta, ou não do animal ao tratamento. O teste da urease é baseado num meio específico, o meio de Christensen, que detecta a presença ou não da enzima urease produzida pelo fungo (Chabasse e Contet-Audonneau, 2003; Gomes, 2004).
No passado, foram também utilizadas técnicas serológicas para o diagnóstico de dermatofitose, mas sem eficácia devido à falta de sensibilidade com seropositividade persistente (Prélaud, 2008).
Outros meios de diagnóstico têm sido utilizados ainda em fase de experimentação. É o caso da utilização de métodos moleculares, reconhecendo espécies através de operações com o DNA e espécies clonadas (Gräser et al., 2006; Bagyalashmir et al., 2008). Em Medicina Humana têm se verificado grandes avanços na reacção em cadeia da polimerase e identificação de dermatófitos com o auxílio de novas técnicas, como PCR ou outras técnicas de biologia molecular (Zagnoli et al., 2004; Cano et al., 2005; Gräser et al., 2006).
9. Profilaxia, tratamento e controlo
O número de cuniculturas afectadas com dermatofitose é muito elevado. Um dos principais meios de contágio entre explorações é a movimentação de coelhos reprodutores infectados, daí que as medidas de prevenção nas migrações devem ser feitas de forma exaustiva (Rosell, 2000b).
As lesões causadas pelos dermatófitos apresentam elevada quantidade de material infeccioso, o que pode contaminar as instalações e todas as superfícies de contacto com o animal durante longos períodos de tempo (1 a 3 anos). Os vectores, os tratadores, os animais domésticos, os roedores e os pássaros são factores também apontados como fontes de contágio (Ramos, 1993).
De uma perspectiva hígio-sanitária, o maneio deve ter em conta diversos aspectos, principalmente, durante o pré-desmame, onde as fêmeas permanecem com as crias na
20
engorda, que é uma fase crítica de maior infecção. A palha ou feno deve ser retirada nesta fase, ou no caso de se apresentarem animais infectados, uma vez que podem conter material contaminado (Ramos, 1993; Rosell, 2000b).
Os elementos fúngicos de resistência presentes na pelagem e eliminados nas descamações cutâneas permanecem viáveis como fontes de infecção, sendo por isso necessário eliminar. Um programa importante de prevenção da dermatofitose inclui o uso de calor seco seguido da aplicação de desinfectantes e antissépticos. O objectivo é a destruição do pêlo e dos esporos que se encontrem nas jaulas, com o auxílio de maçaricos ou outros meios de calor, nunca esquecendo zonas também frequentemente afectadas, como o tecto das explorações, janelas e os ventiladores. A descontaminação do ambiente é um elemento importante no controlo destas infecções (Rosell, 2000b).
A desinfecção é fulcral na profilaxia. O uso de desinfectantes como o formol, gluteraldeídos ou clorados e antissépticos como a lixívia e, os ionóforos devem ser aplicados com frequência. O formol é usado muitas vezes em caso de vazio sanitário e a lixívia é um bom antifúngico, mas tem de ser usado com precaução, uma vez que é muito agressivo para a pele (Ramos, 1993; Rosell, 2000b).
Quanto à quimioprevenção, são utilizados principalmente dois compostos, o enilconazol, Imaverol® 20ml/L (Veterinaria Esteve®) ou Actifucín® 10ml/L (Veterinaria Esteve®) e o enxofre. O enilconazol é o fármaco de eleição, mas o enxofre é o mais utilizado devido à sua relação qualidade/preço. É um bom antifúngico, não tão específico e eficaz como o enilconazol, e tendo o inconveniente de ser queratinolítico. Quando usado excessivamente ou de forma errada, queima o pêlo e as orelhas dos animais, ficando estes com um aspecto grumoso. O abuso de enxofre pode provocar a morte dos animais, principalmente os láparos lactantes. O uso por via oral deve ser feito com muitas precauções, sendo recomendado pulverizar levemente o ninho e a ração em cada jaula (Van Cutsen et al., 1985; Rosell, 2000b).
A imunoprofilaxia não se encontra ainda disponível em Portugal, mas em alguns países da Europa, já existem vacinas contra os dermatofitos usadas com bastante êxito. A vacinação parece ser um meio muito útil de controlo da infecção nas explorações que estão frequentemente expostas a este problema, principalmente, as explorações de reprodutores.
Para que o tratamento médico seja eficaz, é necessário controlar primeiro o desenvolvimento da infecção e destruir os agentes infecciosos. A aplicação de um tratamento depende da prevalência e do interesse do proprietário. O tratamento tópico com
21
enilconazol diluído, três vezes por semana, durante os dez dias seguintes ao desmame é o mais recomendado. Nas fêmeas é aconselhável aplicar o tratamento três vezes em dez dias, na região mamária, com o auxílio de uma esponja (Van Cutsen et al., 1985; Rosell, 2000b). As dermatofitoses são auto-limitantes, num período relativamente curto de tempo, no entanto os coelhos de engorda são abatidos, aproximadamente aos 70 dias, pelo que não há tempo para a regressão da patologia (Boucher e Nouaille, 2002).
A griseofulvina é o antibiótico de eleição para o tratamento da dermatofitose nas reprodutoras e futuras reprodutoras. Na maioria das explorações, não é utilizado tratamento sistémico devido à toxicidade das moléculas disponíveis, que podem comprometer fatalmente os animais, principalmente pelas repercursões que tem a nível renal. Esta substância é teratogénica, não devendo ser administrada a fêmeas gestantes. A sua utilização está associada à ração com doses que variam de 200-250 ppm, durante dez dias, ou 100-125 ppm durante vinte dias. No entanto, é de salientar que o emprego de griseofulvina só está actualmente autorizado em cavalos (Barnes e Boothroyd, 1961; Rosell, 2000b; Scraff, 2002).
O quetoconazol pode também ser empregue na terapêutica, tendo os mesmos inconvenientes da griseofulvina que, como todos os antifúngicos sistémicos, podem causar infertilidade (Weitzman e Summerbell, 1995; Legendre, 2007).
Em relação à Saúde Pública, o controlo, a prevenção e o tratamento desta infecção é de extrema importância. A dermatofitose é a principal zoonose nas explorações de coelhos, onde 90% dos tratadores que trabalham em explorações afectadas também já foram afectados. O controlo desta patologia só é possível se existir uma colaboração entre todos os intervenientes neste mercado, que estando informados e conscientes dos riscos inerentes e dos elevados custos associados à erradicação da dermatofitose, tomam precauções para evitar introduzir a infecção em locais não contaminados (Rosell, 2000b; Boucher e Nouaille, 2002).
Em suma, as explorações que trabalham com animais reprodutores devem ter um programa específico de prevenção. Na maternidade é fundamental o uso de enxofre nos ninhos e o tratamento com o enilconazol é por vezes necessário. Os animais, o material e a nave devem ser pulverizados, semanalmente, pelo menos uma vez (Ramos, 1993; Rosell, 2000b).
Muitas vezes as dermatofitoses são de difícil erradicação, podendo ser necessários meses para a sua remissão (Greene et al., 1998). O sucesso terapêutico de uma
22
dermatofitose não garante a eliminação da infecção, podendo permanecer portadores assintomáticos. Apenas o desaparecimento das lesões, associado à negatividade dos exames de cultura, constituem critério de remissão. É importante, no entanto, destacar que muitas explorações que tiveram graves problemas com dermatófitos, conseguiram erradicar completamente esta infecção.
23
II. Material e métodos 1. Animais e amostras
Durante esta investigação foram visitadas 18 cuniculturas sem sinais clínicos de dermatofitose e 22 com sinais clínicos compatíveis com dermatofitose.
O tamanho da amostra foi calculado com base nos seguintes pressupostos: a população de coelhos de produção da área em estudo, 21550 fêmeas, tinha dimensões suficientes para ser considerada de grandes dimensões, a proporção de coelhos de produção portadores de dermatófitos, nas explorações do Centro e Norte de Portugal, não seria inferior ao valor mais baixo obtido por diferentes autores, em outras regiões da Europa. Para o cálculo do tamanho da amostra foi utilizado o programa WinEpiscope 2.0®, dado o número de 22 explorações em que se efectuou o diagnóstico clínico de dermatofitose com uma prevalência esperada de 10%, para um nível de confiança de 95%. O número de animais rastreados foi de 208.
Nestas explorações em que se efectuou o diagnóstico clínico de dermatofitose foi estabelecido o número médio de animais com sinais clínicos compatíveis com dermatofitose, e deste grupo de animais foram retiradas um número médio de amostras.
As explorações foram visitadas aleatoriamente, durante o período compreendido entre Agosto e Outubro de 2008, conjugando um interesse mútuo entre mim e o médico veterinário que me acompanhava durante o decorrer deste trabalho no estudo da patologia. A área estudada incluiu explorações localizadas do Norte e Centro de Portugal.
As amostras foram recolhidas nos animais que apresentavam sinais clínicos compatíveis com dermatofitose. As análises micológicas foram realizadas no laboratório de Microbiologia do Departamento de Ciências Veterinárias da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Na Tabela 2 (Anexo) e na Figura 13 (Anexo) encontram-se os dados relativos às explorações visitadas e respectivas recolhas.
Foram analisadas as amostras de pêlos e descamações de pele de coelhos de produção industrial com suspeita clínica de dermatofitose. Os dados relativos a esses mesmos animais foram anotados através de um inquérito epidemiológico.
2. Colheita e envio do material ao laboratorio
Para a colheita das amostras foram utilizadas lâminas de bisturi esterilizadas,
pinças, envelopes, algodão, álcool a 70ºC, luvas, suporte para o material e caixas para acondicionamento das amostras.
24
As zonas anatómicas de colheita foram previamente seleccionadas e desinfectadas com algodão embebido em álcool a 70ºC. Foram colhidos pêlos e descamações do bordo das lesões com o auxílio da pinça ou de lâminas de bisturi. O material colhido em cada animal foi colocado em algodão seco e introduzido num primeiro envelope que, posteriormente, foi inserido num invólucro com fecho autocolante, devidamente identificado. O material foi acondicionado em recipientes próprios até ao envio para o laboratório. No caso de recolha de descamações cutâneas, foram utilizadas lâminas de bisturi que eram acondicionadas juntamente com a amostra. Estas foram sempre identificadas com o número do animal em causa e acondicionados num recipiente. A recolha das amostras foi efectuada sempre por mim com o auxílio dos cunicultores e do meu co-orientador.
3. Diagnóstico laboratorial
3.1 Isolamento e identificação de dermatófitos
As amostras de pêlos e descamações foram colocadas numa gota de hidróxido de potássio, entre lâmina e lamela e deixada esclarecer por um período de 30 minutos. Após o esclarecimento procedeu-se à observação microscópica. Os resultados foram classificados em Positivos quando era visível uma cadeia de artrósporos, em redor ou no interior dos pêlos. Algumas lâminas apresentavam estruturas, semelhantes a artrósporos, em reduzido número, em redor dos pêlos e descamações, essas foram classificadas de Suspeitas. Nas Negativas não se observaram estruturas fúngicas características.
As 208 amostras foram inoculadas em meios próprios para o crescimento de dermatófitos, com o auxílio de pinça que foi passada à chama entre duas amostras consecutivas. A inoculação foi feita em meio de Dermatophyte Test Medium® (DTM®; Merck®), Mycobiotic agar médium e Sabouraud Dextrose agar medium (Oxoid®) suplementado com cicloheximida (Sigma®) para evitar o crescimento de fungos não dermatófitos. O material foi incubado à temperatura de 25ºC, observado diariamente, por um período de 4 semanas. De cada cultura primária foi efectuada uma subcultura em Potato Dextrose Agar (PDA) para a manutenção da mesma. Efectuou-se o exame de lactofenol com azul de algodão a todas as colónias e, o teste da urease às colónias compatíveis com Tricophyton mentagrophytes. Os fungos foram identificados através da sua morfologia microscópica e macroscópica e por testes bioquímicos (prova da urease). A identificação dos dermatófitos foi baseada nas características morfológicas, macroscópicas
25
e microscópicas das colónias como cor, relevo, textura, pigmentação do reverso e tipo e características dos elementos de multiplicação através da chave de identificação do Veterinary Mycology Laboratory Manual (Hungerford et al., 1998) e do Laboratory Handbook of Dermatophytes (Kane et al., 1997).
4. Dados clínico-epidemiológicos
Em todas as explorações visitadas a informação referente aos animais intervencionados, características das explorações e práticas de maneio foram registadas através de um um inquérito para recolher os dados clínico-epidemiológicos sobre a amostra de coelhos de produção (Figura 14, Anexo). Este foi desenvolvido em parceria com o Departamento de Ciências Veterinárias da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, e o médico veterinário da empresa COREN®. Todos os animais examinados apresentavam sinais clínicos compatíveis com dermatofitose como: escamas, crostas, foliculite, áreas de alopecia com diferentes graus de inflamação.
O objectivo desta intervenção foi o de obter informações sobre a presença de características dos animais, factores e práticas de maneio supostamente associadas ao diagnóstico laboratorial de dermatofitose, através do isolamento e identificação de dermatófitos em cultura e que, na sua maioria, tinham sido previamente identificados por diversos autores como Ramos (1993), Cabañes (1997) e (2000), Gomes (2004) e Tizzani (2007), entre outros. O preenchimento deste questionário permitiu estratificar a amostra em função da raça, género, cor da pelagem e idade dos animais, incluindo também dados sobre a situação clínica de cada um, relativamente à configuração das lesões e sanidade animal. Procedeu-se à validação do inquérito através de um pré-teste. Anteriormente à sua utilização, o inquérito foi ensaiado, durante o mês de Julho de 2008, em 5 explorações (cerca de 18% das explorações amostradas) que não apresentavam sinais clínicos de dermatofitose.
5. Análise de dados
Os valores de prevalência de isolamento e identificação de dermatófitos em cultura relativos ao sexo, raça, cor da pelagem, localização das lesões, classificação sanitária das explorações, número de fêmeas por exploração e localização da exploração foram comparados pelo teste estatístico do Qui-quadrado (χ2). A análise foi feita com recurso ao programa SPSS 11.5® para Windows XP, com um nível de probabilidade (p) <0,05 como estatisticamente significativo.
26
A identificação das principais variáveis associadas com o isolamento e identificação de dermatófitos em cultura foi efectuada em duas fases. Na primeira, todas as variáveis do inquérito, com uma plausível relação com o resultado positivo, foram estudadas através de associação estatística. Fez-se então, uma análise comparativa univariada. Assim, a variável dependente era o resultado do diagnóstico laboratorial (positivo ou negativo) e, as variáveis independentes eram obtidas a partir do inquérito ou registo individual da característica dos animais.
Todas as variáveis, que apresentaram moderada significância na análise estatística univariada (p<0,10), foram seleccionadas (Hosmer e Lemeshow, 1989) e introduzidas, numa segunda fase, num modelo multivariável de regressão logística. Neste modelo foi também efectuada a estimação de parâmetros através do cálculo do coeficiente de regressão (β) e o erro-padrão (S.E.β) obtidos para o cálculo da razão de risco (OR - “Odds ratios”) com correcção e o correspondente intervalo de confiança.
