Rizelle de Oliveira Barros1 Viviane Bomfim Bezerra2
Ana Leticia Vidal Madeiro de Lucena3 Vanessa Dantas Leite4
Jessica Horrana Fernandes Feitosa5 Carlos Everton Alves Mangueira6 Cicero Gonçalves Calixto7
Maria Karollyna Nascimento da Silva8 Edinardo Fagner Ferreira Matias9*
RESUMO
Cordia verbenacea, conhecida como “erva-baleera”, é utilizada popularmente no combate a doenças infecciosas e inflamatórias. Opresente estudo tem por objetivo verificar o potencial da atividade antifúngica e moduladora do óleo essencial das folhas de Cordia
verbenacea DC. (OECv) e sua função biológica após exposição a irradiação micro-ondas. Trata-se de um estudo experimental, de caráter
qualitativo e quantitativo, onde os resultados foram submetidos à análise estatística. As linhagens utilizadas foram padrões e resistentes de C. albicans, C. tropicalis e C. krusei e o antifúngico utilizado foi o cetoconazol. Os testes antifúngicos e modulatórios foram realizados pelo método de microdiluição em placas e o efeito da irradiação ondas através da exposição ao forno micro-ondas em diferente período de tempos pré-estabelecidos na potência máxima. Os testes foram realizados em triplicadas e submetidos à análise estatística 2way ANOVA e com testes de significância através de posttests Bonferroni. Após realização dos testes, os resultados em relação à ação antifúngica e efeito modulador da resistência fúngica quando realizado a exposição do óleo essencial de
Cordia verbenacea DC. a irradiação micro-ondas, demonstraram que OECv apresentou efeito fungistático nas diferentes combinações
do óleo testado. Quanto ao efeito modulador se observou que OECv sem exposição ao micro-ondas apresentou melhor resposta antifúngica. Portanto, os dados obtidos apresentaram informações relevantes sobre o potencial antifúngico e sugerem-se novos estudos e testes para melhor compreensão dos mecanismos de ação e assim, uma alternativa de utilização associada de produtos naturais. Palavras-chave: Infecções fúngicas. Micro-ondas. Modulação. Plantas medicinais.
ORIGINAL
POTENCIAL ANTIFÚNGICO E MODULADOR DA
RESISTÊNCIA FÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Cordia verbenacea DC. EXPOSTO A IRRADIAÇÃO DE
MICRO-ONDAS.
ANTIFUNGAL POTENTIAL AND MODULATOR OF
FUNGAL RESISTANCE FROM ESSENTIAL OIL FROM
Cordia verbenacea DC. EXPOSED TO
ABSTRACT
Cordia verbenacea, known as “whiting”, is popularly applied in the fight against infectious and inflammatory diseases. The present studyaims to verify the potential of the antifungal and modulatory activity of the essential oil of the leaves of Cordia verbenacea DC. (OECv) and its biological function in exposure to microwave irradiation. This is an experimental, qualitative and quantitative study, where the results were analyzed by statistical analysis. For example, the patterns and strengths of C. albicans, C. tropicalis and C. krusei and the antifungal were ketoconazole. The antifungal and modulable tests were performed by the method of microdilution in plates, and the effect of the microwave radiation through exposure to the microwave oven in different time periods pre-established in the maximum condition. The testes were performed in triplicates and submitted to the 2way ANOVA statistical analysis and with significance tests through Bonferroni post-tests. After completion of the tests, the results in relation to the antifungal action and the fungal resistance modulator effect, when held the exhibition the essential oil of Cordia verbenacea DC. to the microwave irradiation, showed that OECv presented fungistatic effect in different combinations of tested oil. In place of the modulator effect, noted that without exposure to microwave OECv presented best antifungal response. Therefore, the data presented relevant information about the potential antifungal and suggest new studies and tests to better understand the mechanisms of action and thus an alternative use of natural products. Key words: fungal infections, microwaves, modulation, medicinal plants.
INTRODUÇÃO
As pesquisas farmacológicas relacionadas às plantas medicinais têm um aumento crescente devido ao conhecimento empírico das populações que as utilizam de forma contínua1. Grande número da população brasileira
aplicam as plantas como única medida terapêutica. Fatores como baixo nível de vida da população e o alto custo dos medicamentos influenciam, mantendo o costume da prática do consumo de fitoterápicos, tornando válidas determinadas informações terapêuticas que foram acumuladas durante séculos2.
Uma planta é considerada um fitoterápico pela população quando esta se demonstra eficaz no alívio de um sintoma, prevenção ou tratamento de uma doença. O que não é bem esclarecido é se seu uso é satisfatório para tratar a patologia ou mal-estar desejado ou se a planta usada como remédio terá um melhor efeito ou será mais potente que outro medicamento convencional e se há segurança o suficiente para o uso geral3
A espécie Cordia verbenacea DC. (Boraginaceae) é um arbusto ereto, bastante ramificado, com crescimento vigoroso e espontâneo, apresenta flores pequenas e brancas dispostas em inflorescências terminais, natural de quase todas as regiões do Brasil, em particular na costa brasileira4.
Popularmente conhecida como erva baleera, catinga-de-barão, catinga-de-mulata, salicilina e maria-pretinha é amplamente aplicada na medicina popular devido as suas propriedades cicatrizantes e anti-inflamatórias como também para o tratamento de artrite, tendinite, reumatismo, dores musculares e contusões5.
Estudos apontam que esta planta contém substâncias anti-inflamatórias que as classificam como uma alternativa segura e eficaz no tratamento tópico de inflamações devido seu efeito e diminuição das reações colaterais. Observa-se ainda, uma alta concentração de metabólicos secundários nas folhas de diversas plantas, como óleos essenciais e flavonóides, que apresentam atividade antioxidante e anti-inflamatória6,7.
Um crescente e importante problema de saúde pública são as infecções fúngicas que tem aumentado gradualmente e a imunossupressão ou alteração das barreiras anatômicas são fatores de risco para estas infecções por favorecer a entrada de microrganismos no hospedeiro8.
O fungo Candida albicans é normalmente encontrado na mucosa dos tratos gastrointestinal e geniturinário, em 30 a
disseminação entre os fungos, como já ocorreu com as bactérias14.
A radiação micro-ondas é um tipo de energia eletromagnética com frequência na faixa de 103 a 104MHz.
Sendo uma radiação não ionizante que causa migração de íons e rotação de dipolos, mas não provoca mudanças na estrutura molecular15.
Os princípios envolvidos no aquecimento por micro-ondas, envolve conceitos químicos, como: temperatura, capacidade calorífica, ligação química, estrutura molecular, momento de dipolo, polarização, constante dielétrica entre outros16.
Desta forma, nos deparamos com o questionamento sobre o potencial farmacológico de Cordia verbenacea DC, especificamente quanto ao efeito antifúngico e modulador com fármacos, bem com a possibilidade de indiferença as associações de produtos naturais e exposição a irradiação por micro-ondas.
Portanto, o presente estudo surgiu da necessidade de encontrar novas alternativas para o tratamento na redução ou eliminação de microrganismos, além do interesse em verificar o potencial inibitório e ação específica frente às linhagens antifúngicas, mostrando-se relevante para um possível desenvolvimento de ferramenta alternativa no combate a resistência microbiana. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial da atividade antifúngica e moduladora do óleo essencial das folhas de Cordia verbenacea DC. e sua função biológica exposta a irradiação micro-ondas.
MÉTODO
SELEÇÃO E COLETA DO MATERIAL VEGETAL
As folhas de Cordia verbenacea DC. foram coletadas em agosto de 2017, na Chapada do Araripe, município de Crato-Ceará, Brasil e uma exsicata da espécie foi depositado no herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará sob o número 044171.
EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL
A extração do óleo essencial das folhas frescas de
Cordia verbenacea DC. (OECv) foi realizada pelo método de
hidrodestilação utilizando o aparelho tipo Clevenger, onde as folhas foram trituradas e colocadas em um balão de vidro de 5,0 L juntamente com de 2,5 L de água destilada,
As linhagens foram mantidas em agar Brain Heart Infusion (BHI - Acumedia®). As linhagens antifúngicas foram ativadas e inoculadas na concentração recomendada pelo fabricante, e incubadas. Suspensões com crescimento antifúngico foram diluídas em BHI em concentração de 10% até a obtenção de 105 céls/mL18.
TESTES ANTIFÚNGICOS
Preparo da solução inicial e das soluções testes
No preparo da solução inicial, o óleo essencial foi solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO - Acumedia®), sendo observadas as seguintes proporções: 10mg de óleo solubilizados em 1mL DMSO, para obter uma concentração inicial de 10 mg/mL. Em seguida, esta solução foi diluída em água destilada atingindo concentração de 1024μg/mL e reduzindo a concentração de DMSO para 10% e a partir desta, efetuaram-se diluições seriadas 1:2, durante o teste de micro diluição, obtendo-se as concentrações de óleo variando de 512 a 8μg/mL e DMSO variando de 5-0,8% de concentração, onde DMSO nesta concentração não manifesta interferência na atividade antifúngica avaliada.
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) Os ensaios para determinação da CIM dos extratos e frações foram efetuados através do Método de Microdiluição em Caldo, com concentrações variando de 512 a 8 µg/mL. 18.
Execução e leitura dos ensaios
Este método utiliza pequenos volumes de meio e de soluções preparadas a partir do óleo essencial, distribuídos em cavidades de microplacas estéreis. As soluções de testes foram preparadas em concentração dobrada (1024 µg/mL) em relação à concentração inicial definida e volumes de 100 µL e posteriormente diluídas seriadamente 1:1 em caldo BHI 10%. Em cada cavidade com 100 µL do meio de cultura uma amostra de suspensão antifúngica foi diluída na proporção 1:10. Controles negativos com o meio de cultura, controles positivos (meio + inoculo) e controles de inibição utilizando solução em concentração de 512 a 8 µg/mL foram incluídos nos ensaios. As placas preenchidas foram incubadas a 35ºC por 24 horas18. Para evidenciar a CIM das soluções frente às
linhagens fúngicas observou a turvação em caso de crescimento através da absorbância expressada pelo ELISA. AVALIAÇÃO DA INTERFERÊNCIA DO ÓLEO ESSENCIAL SOBRE A RESISTÊNCIA A CETOCONAZOL
Para avaliar o óleo essencial como moduladores da ação antifúngica, a CIM de antifúngicos derivado do imidazol
(cetoconazol - sigma®) foi avaliada na presença e na ausência do óleo em microplacas estéreis. O cetoconazol foi avaliado nas concentrações variando de 2500 a 2,5µg/mL.
Execução e leitura dos ensaios
O óleo essencial foi misturado em caldo BHI 10% em concentrações subinibitórias, obtidas e determinadas após a realização do teste de avaliação da CIM, sendo que para o teste de modulação a concentração da solução do óleo essencial foi reduzida 8 (oito) vezes (CIM/8). A preparação da solução de antifúngico foi realizada com a adição de água destilada estéril em concentração dobrada (5000 µg/mL) em relação à concentração inicial definida e volumes de 100 µL diluídas seriadamente 1:1 em caldo BHI 10%. Em cada cavidade com 100µL do meio de cultura contem a suspensão fúngica diluída (1:10). Os mesmos controles utilizados na avaliação da CIM para o óleo foram utilizados durante a modulação19. As placas
preenchidas no sentido alfabético e incubadas a 35ºC por 24 horas e após esse período foi feita a leitura para evidenciar a CIM das soluções frente às linhagens fúngicas, observando a turvação em caso de crescimento através da absorbância expressada pelo ELISA.
TESTES DE IRRADIAÇÃO MICRO-ONDAS
Para os testes de irradiação micro-ondas foram utilizados concentração da solução inicial (10mg de óleo solubilizados em 1mL DMSO, diluído em água destilada e atingindo concentração de 1024μg/mL) obtendo-se as concentrações de óleo variando de 512 a 8μg/mL, alíquotas dessa solução foram submetidas a um forno micro-ondas por períodos de tempos diferentes (20, 40, 60 segundos) ao final da exposição foram repetidos os testes de microdiluição, havendo diferença dos resultados da CIM quando comparados com a CIM que não foi exposta ao micro-ondas foi feito também a modulação.
MODELO E ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados da CIM obtidos em triplicata nos testes de modulação foram tabulados em planilha utilizando software Microsoft Excel 2010, e aplicando a fórmula de média geométrica e aritmética, além de cálculo do desvio obtendo dados paramétricos e possíveis de submissão à análise estatística e teste de significância.
Para a análise estatística os dados expressos pela média geométrica e aritmética, além do desvio padrão foram submetidos à análise de variância (2way ANOVA), seguida pelo teste de significância Bonferroni, considerando diferença significativa para quando p < 0,001, utilizando o software GraphPad Prisma 5.0.
RESULTADOS
No presente estudo, comparando com os controles, os testes de avaliação da atividade antifúngica com o OECv exposto a radiação micro-ondas foi identificado uma interação que resultou no aumento da morte celular fúngica, como demonstram os gráficos a seguir.
No gráfico 1 quando se compara a atividade antifúngica do OECv exposto e não exposto a irradiação micro-ondas frente a Candida albicans resistente e padrão, houve com o aumento da concentração- OECv, uma diminuição da absorbância, prevalecendo um melhor resultado para a linhagem resistente quando exposto ao OECv 40s e 60s.
Gráfico 1: Representação da curva de morte celular fúngica de Candida albicans
No gráfico 2 demonstra a atividade antifúngica do OECv com Candida tropicalis, quando comparado a morte celular fúngica entre as linhagens padrão e resistente, no qual
observou uma melhor resposta para linhagem resistente, quando exposto a ação do óleo a 40s e 60s.
Gráfico 3: Representação da curva de morte celular fúngica de Candida krusei
No gráfico 4 comparando as diferentes combinações de exposição do OECv nos testes de modulação frente à
Candida albicans, observa-se ação antagonista quando
exposto o OECv por 20s, 40s e 60s, porém o óleo sem exposição demonstrou uma interação que resultou em sinergismo.
Gráfico4: Representação da curva de morte celular fúngica de Candida albicans
Em relação à modulação frente à Candida krusei demonstrado no gráfico 5, observou sinergismo para o OECv
não exposto e exposto por 60s a irradiação micro-ondas, a ação antagonista foi observada no OECv exposto por 20s e 40s.
Gráfico 5: Representação da curva de morte celular fúngica de Candida krusei
No gráfico 6 referente aos testes de modulação frente à Candida tropicalis, houve um efeito antagonista para todas as combinações com o OECv, demonstrando que a interação
com a irradiação micro-ondas não foi suficiente para promover uma ação sinérgica.
informações moleculares e funcionais, pois inibe a ativação de NF-κB induzida por LPS e a migração de neutrófilos, embora apenas o a-humuleno tenha a capacidade de prevenir a produção de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β22.
A atividade biológica dos óleos essenciais e de seus constituintes podem atuar como agentes fungistáticos e/ou fungicida, chamada de atividade antifúngica, dependendo das concentrações utilizadas, a atividade antifúngica advém, provavelmente, do resultado da penetração de quitina na parede das hifas, prejudicando a lipoproteína da membrana citoplasmática, levando a este extravasamento do citoplasma, bem como ao esvaziamento e murchamento das hifas, e presença de filamentos23.
Outros estudos relatam que a propriedade antimicrobiana dos óleos essenciais deve-se a sua característica lipofílica. A hidrofobicidade do óleo essencial permite uma interação entre o óleo e os lipídeos da membrana celular, interferindo na sua permeabilidade e causando alterações em sua estrutura24,25.
As bactérias apresentam maior susceptibilidade ao produto natural que os fungos, devido a complexidade nas células eucarióticas dos fungos e a dificuldade na pesquisa de um constituinte químico eficaz que por muitas vezes atuam como agentes fungistáticos ao invés de fungicida26.
A atividade antifúngica do óleo essencial Thapsia
villosa contra espécies fúngicas também testadas nesse
estudo C. albicans, C. tropicalis e C. krusei confirmando seu potencial como agente antifúngico associado à baixa toxicidade, resultado semelhante com esse estudo realizado com o óleo essencial de Cordia verbenacea, no entanto quando associado com o fluconazol não demostrou efeito sinérgico assim como os testes de modulação realizados com o cetoconazol27. Em outro estudo realizado com óleo essencial
de Helichrysum italicum (Roth) G frente a. fungos filamentosos e Candida albicans indicou também que o óleo é fungistático, e nenhum crescimento indicou que o efeito é fungicida assim como demostrado com as diferentes combinações testadas do óleo essencial de Cordia verbenacea28.
Atividades antibacterianas e antifúngicas do óleo essencial de Cordia verbenacea DC demonstrando que o óleo essencial possui atividade fungistática contra Candida
albicans e Candida krusei (CIM 512 μg / ml), porém
prevalecendo uma melhor atividade do óleo nas cepas bacterianas, evidenciando a necessidade do desenvolvimento de estratégias alternativas que venham a potencializar o efeito dos óleos essenciais levando a redução ou eliminação dos fungos29.
A irradiação por micro-ondas tem sido utilizada como método alternativo para a inativação de microrganismos presentes em alimentos, instrumentos médicos, laboratoriais, lentes de contato, objetos de uso doméstico, cosméticos, roupas íntimas, lixo hospitalar e biosólidos. Entretanto, a interação direta entre a energia das micro- ondas e os materiais biológicos, em instâncias moleculares e celulares, é pouco conhecida30. Dessa forma, este estudo investigou como
essa energia eletromagnética pode influenciar na integridade e na atividade microbiológica do OECv, promovendo a inativação da C. albicans, C. tropicalis e C. krusei28.
Os mecanismos pelos quais a energia de micro-ondas atua sobre os microrganismos ainda não estão completamente
esclarecidos. As micro-ondas não são suficientemente potentes para alterar diretamente as ligações químicas, e, portanto, seus efeitos poderiam ser produzidos via mecanismos como relaxamento dielétrico, condutividade iônica e alteração dos biopolímeros31.
Os fornos de micro-ondas domésticos utilizam uma frequência de 2.450 MHz que fornece comprimento de ondas rotacionais de aproximadamente 12 mm. Consequentemente, numerosas colisões intermoleculares ocorrem, e a energia rotacional é convertida em energia térmica, provocando, um rápido aquecimento, causando desnaturação das proteínas e dos ácidos nucléicos celulares, uma vez que a desnaturação das moléculas de DNA é maior quando realizada por meio de micro-ondas do que por outra fonte térmica32.
COSIDERAÇÕES FINAIS
Desta forma, ficou estabelecido que a ação antifúngica e moduladora do óleo essencial de Cordia verbenacea exposto à irradiação micro-ondas variou significativamente em função do tempo de exposição e resistência fúngica, demostrando que o OECv possui atividade fungistática contra Candida albicans,
Candida tropicalis e Candida krusei. Portanto a combinação de
produtos naturais de origem vegetal com a exposição a irradiação micro-ondas e combinado com antifúngicos apresenta-se como uma ferramenta alternativa no combate à fungos patogênicos.
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