O papel de oscilações beta2 e de interneurônios OLMα2 da região CA1 do hipocampo de camundongos na memória de reconhecimento de objetos

Texto

(1)Universidade Federal do Rio Grande do Norte Programa de Pós-Graduação em Neurociências. Arthur Sérgio Cavalcanti de França. O papel de oscilações beta2 e de interneurônios OLMα2 da região CA1 do hipocampo de camundongos na memória de reconhecimento de objetos. Natal 2016.

(2) Universidade Federal do Rio Grande do Norte Programa de Pós-Graduação em Neurociências. O papel de oscilações beta2 e de interneurônios OLMα2 da região CA1 do hipocampo de camundongos na memória de reconhecimento de objetos. Tese apresentada como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Neurociências, do Programa de. Pós-Graduação. em. Neurociências,. da. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.. Orientador: Prof. Dr. Adriano B. L. Tort Co-orientador: Prof. Dr. Richardson N. Leão Aluno: Arthur S. C. França. Natal 2016.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Instituto do Cérebro - ICE. França, Arthur Sérgio Cavalcanti de. O papel de oscilações beta2 e de interneurônios OLMa2 da região CA1 do hipocampo de camundongos na memória de reconhecimento de objetos / Arthur Sérgio Cavalcanti de França. Natal, 2016. 146 f.: il. Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Instituto do Cérebro, Programa de Pós-Graduação em Neurociências Orientador: Adriano Bretanha Lopes Tort. Coorientador: Richardson Naves Leão. 1. Hipocampo. 2. CA1. 3. OLMa2. 4. Memórias. 5. Reconhecimento de Objeto. I. Tort, Adriano Bretanha Lopes. II. Leão, Richardson Naves. III. Título. RN/UF/Biblioteca Setorial Árvore do Conhecimento - Instituto do Cérebro CDU 159.953.

(4) Dedico este trabalho aos meus pais, que são minha fonte diária de exemplos e que me inspiram a ser um ser humano melhor.

(5) Agradecimentos. Antes de qualquer coisa, gostaria de agradecer à minha família. Nela encontro todo apoio e incentivo necessários para enfrentar qualquer caminho que eu escolha trilhar. Sou uma pessoa que gosta de se embebedar de exemplos e sou felizardo de ter tido a chance de conviver com pessoas que me dão inúmeros exemplos, em todos os aspectos da vida. Gostaria de agradecer à minha mãe, meu exemplo de compaixão e da sede por conhecimento. Ao meu pai, meu exemplo de dedicação e otimismo. Ter sido criado por vocês foi a maior felicidade que poderia ter sonhado, amo vocês de forma imensurável. Agradeço de coração às minhas irmãs e minhas queridas avós, seus cuidados e amor são sentidos mesmo de longe, amo muito vocês. Gostaria de agradecer à minha namorada Mayara Medeiros, minha companheira na dança da vida. Gostaria de agradecer aos meus pais científicos e a todos que contribuíram ao longo dessa jornada. Primeiramente à minha primeira orientadora, Juliana Espada, que me inspirou a seguir o caminho da pesquisa. A Bruno Lobão e Sidarta Ribeiro com quem construí e trilhei meus primeiros passos na neurociência. Ao meu co-orientador Richardson Leão, o maior experimentalista com quem já tive oportunidade de trabalhar. Agradeço também ao meu supervisor no exterior Klas Kullander por todo suporte dado durante a minha estadia na Suécia, e por sua confiança depositada em mim. Quero fazer um agradecimento especial ao meu orientador Adriano Tort. Ele foi e é o maior exemplo que já tive no meio científico. Ao longo desses 4,5 anos só aumentou minha admiração pelo seu jeito de fazer ciência, pela sua integridade e seriedade. Nunca trabalhei em um ambiente tão bom e produtivo, com tanto compartilhamento de informação e pessoas se ajudando. Não acredito em sorte, então acredito que você é o maior fomentador desse ambiente. Não é à toa que todas as pessoas que saem desse laboratório querem continuar o vínculo com você. Parabéns!.

(6) Gostaria de agradecer aos professores Marcos Costa, Katarina Leão, Olavo Amaral e Diego Laplagne pelas discussões que geraram impacto direto na construção do meu trabalho. Agradeço aos meus colegas do laboratório sueco, Julia, Sanja, Samer, Stefano e Fábio. Vocês tornaram minha estadia muito mais prazerosa e produtiva do que eu poderia imaginar. Sem vocês tudo teria sido mais difícil. Gostaria de agradecer aos meus colegas de laboratório, Bryan, Pavão, André, Zé, Alan e Hindiael. Obrigado pelas inúmeras discussões científicas e não científicas, pelas festinhas e pelo bullying diário. Vocês tornaram meu trabalho extremamente prazeroso e produtivo. Agradeço aos meus colegas Vitor, João, Robson e Aron. Ao Neuro Revolución! O grupo de pessoas que mais desenvolvi afinidade científica. Vocês são exemplos não só de integridade científica, mas também de aspiração por uma sociedade melhor. A todos os meus amigos que fizeram parte diretamente ou não da minha construção científica, dando suporte pessoal ou científico, Daniela Moura, Marina Siqueira, Annie Souza, Thawann Malfatti, Annara Soares, Eduardo Queiroz, Eduardo Leite, Stefano Marlon, Felipe Farias, Dyêgo Siqueira e Aderson Stanrley. Gostaria de agradecer à Alexandra Elbakyan, graças a ela tive acesso aos artigos necessários para embasar boa parte da minha investigação científica. Parabéns por sua contribuição para divulgação científica no mundo. Por último, agradeço ao governo brasileiro por ter pago meu salário nesses últimos 12 anos, da graduação ao doutorado. Graças a isso, tive oportunidade de me qualificar e espero retornar esse investimento para a sociedade..

(7) Resumo O hipocampo é relacionado com a formação de memórias explicitas e com a capacidade de reconhecer novos objetos. No presente trabalho visamos contribuir para uma maior compreensão do papel da região CA1 do hipocampo nestes processos. Através da aplicação de técnicas de eletrofisiologia, comportamento animal, psicofarmacologia e optogenética em camundongos transgênicos e selvagens, encontramos que células OLMα2 do CA1 atuam na codificação da representação de objetos em uma tarefa de reconhecimento de objetos, e também influenciam a codificação de memórias aversivas em uma tarefa associativa de medo ao contexto. Além disso, descrevemos uma nova atividade oscilatória no potencial de campo local do CA1 na frequência beta 2 (23-30 Hz), que é caracteristicamente transitória e ligada à detecção de novos objetos durante uma tarefa de reconhecimento de objetos. Estes resultados sugerem potenciais mecanismos celulares e de rede neuronal na região CA1 subjacentes ao seu papel na formação de memórias e na detecção de novidade..

(8) Abstract The hippocampus is associated to novelty detection and formation of explicit memories. The present work aims at better understanding the role of the CA1 region of the hippocampus in these processes. By employing electrophysiology, animal behavior, psychopharmacology and optogenetic techniques in transgenic and wild-type mice, we found that CA1 OLMα2 cells influence the formation of new object representations in an object recognition task, as well as the encoding of aversive memories in a contextual fear memory task. Furthermore, we characterized a new oscillatory activity in the local field potential of CA1 at beta 2 frequency (23-30 Hz), which was typically transient and linked to the amount of novelty in an object recognition task. These results suggest potential cellular and network mechanisms that underlie the role of CA1 in memory formation and novelty detection..

(9) Sumário 1.0 – Introdução .................................................................................................... 2 1.1 – Neuroanatomia e citoarquitetura da formação hipocampal ..................... 2 1.2 – Formação hipocampal e memória .......................................................... 12 1.2.1 – Mecanismos eletrofisiológicos e plásticos da memória ...................... 12 1.2.2 – Formação hipocampal e a memória reconhecimento ......................... 20 1.3 – Modulação da codificação de memória de reconhecimento pelas células OLMα2 (Artigo 1). ..................................................................................................... 22 1.3.1 – Sistema Cre-loxp, optogenética e o controle das células OLMα2. ..... 23 1.3.2 – Células OLMα2 e o controle das entradas do córtex entorrinal ......... 26 1.4 – Oscilações hipocampais e detecção de novidade (Artigo 2) ................. 29 2.0 – Artigo 1 ...................................................................................................... 34 3.0 – Artigo 2 ...................................................................................................... 65 4.0 – Discussão ................................................................................................... 76 4.1 – Artigo 1 .................................................................................................. 76 4.2 – Artigo 2 .................................................................................................. 80 4.3 – Discussão geral ...................................................................................... 81 5.0 – Referências ................................................................................................ 85 6.0 – Anexos ....................................................................................................... 96. 1.

(10) 1.0 – Introdução Os artigos que serão apresentados aqui visam aumentar nosso entendimento acerca dos mecanismos que permitem ao hipocampo desempenhar seus papeis cognitivos, em particular a capacidade de reconhecimento de novidade. Para melhor situar nossa contribuição ao campo, a seção de introdução é dividida em diferentes subseções. Será feita inicialmente uma breve descrição sobre a neuroanatomia e citoarquitetura da formação hipocampal, bem como sobre as principais conexões entre as estruturas que a compõem. Iremos trazer também um breve histórico sobre o estudo da memória e os correlatos eletrofisiológicos, plásticos e comportamentais que tangem esse campo de estudo. Posteriormente, iremos introduzir os assuntos tratados nos dois artigos científicos que constituem o corpo de resultados desta tese. Finda a introdução, apresentaremos os artigos na íntegra nas seções intuladas “Artigo 1” e “Artigo 2”, e finalizaremos a tese com uma discussão geral sobre os resultados apresentados e como estes se inserem na literatura atual. Por fim, como anexo desta tese fornecemos a título de registro três outros artigos científicos também elaborados durante o período de doutoramento.. 1.1 – Neuroanatomia e citoarquitetura da formação hipocampal O hipocampo é uma das estruturas chave ligadas a memórias declarativas (Scoville and Milner, 1957), bem como a funções de orientação espacial (O’Keefe & Dostrovsky, 1971), em conjunto a outras áreas da formação hipocampal como o córtex entorrinal (Hafting et al., 2005). A estrutura anatômica da formação hipocampal começou a ser detalhadamente investigada a partir do final do século XIX, se destacando nesse período os trabalhos de Camilo Golgi, Luigi Sala, Karl Schaffer e Santiago Ramón y Cajal (Bentivoglio & Swanson, 2001; López-Muñoz et al., 2006; Szirmai et al., 2012). No trabalho intitulado “On the fine structure of the pes Hippocampi major, 1886” Camilo Golgi, utilizando a técnica criada por ele de coloração por nitrato de prata em 1873 (Figura 1), descreveu as camadas que formam o hipocampo, bem como fez a descoberta do giro denteado como uma estrutura separada do Corno de Amon (CA; Bentivoglio & Swanson, 2001). Posteriormente, trabalhos como o de Karl Schaffer (Szirmai et al., 2012) 2.

(11) e Santiago Ramón y Cajal (López-Muñoz et al., 2006) descreveram a conectividade entre as áreas do hipocampo. Santiago Ramón y Cajal e em seguida Lorente de Nó, proponente das subdivisões do corno de Amon em CA1, CA2 e CA3 (Lorente De Nó, 1934), montaram um esquema de conexão entre as áreas do hipocampo e das vias de entrada e saída de informação que é muito próximo ao modelo aceito atualmente (López-Muñoz et al., 2006). Figura 1. Exemplos de neurônios da formação hipocampal de coelho corados através da técnica de nitrato de prata, desenvolvida por Camilo Golgi. (Lâmina XIV, Golgi 1886).. Atualmente o hipocampo é dividido em três subáreas distintas: CA1, CA2 e CA3. Além deste, compõem a formação hipocampal o córtex entorrinal, o parasubículo, o présubículo, o subículo e o giro denteado (Amaral & Witter, 1989; Schultz & Engelhardt, 2014). O conjunto de conexões entre essas áreas formam uma unidade funcional associada a várias capacidades cognitivas (Amaral & Witter, 1989; Hafting et al., 2005; O’Keefe & Dostrovsky, 1971; Szirmai et al., 2012), entre elas a formação de memórias declarativas (Scoville & Milner, 1957). Para exercer tal função, a formação hipocampal. 3.

(12) recebe informação sensorial e multimodal de diversas áreas do encéfalo, bem como envia informação processada para diferentes regiões (Figura 2; Andersen et al., 2006) Figura 2. Esquema de vias de projeções de informações sensoriais e multimodais que chegam à formação hipocampal de um roedor (Brown & Aggleton, 2001).. Das estruturas mencionadas, o córtex entorrinal é o principal componente de entrada e saída de informação de outras áreas do cérebro para a formação hipocampal (Dolorfo & Amaral, 1998; Insausti et al., 1997). O córtex entorrinal é dividido nos domínios lateral e medial; sua parte lateral recebe projeções multimodais do córtex perirrinal, olfatório, insular e da amígdala, enquanto a parte medial recebe projeções do córtex occipital, pósrinal e pressubículo (van Groen et al., 2003). No que tange sua citoarquitetura, o córtex entorrinal é formado por 6 camadas. As camadas II e III enviam projeções para o hipocampo e giro denteado e a camada V e VI recebem projeções do hipocampo (Dolorfo & Amaral, 1998; Insausti et al., 1997; van Groen et al., 2003). Neurônios piramidais glutamatérgicos compõem os principais neurônios excitatórios do córtex entorrinal, e os interneurônios GABAérgicos os principais neurônios inibitórios (Andersen et al., 2006; Dolorfo & Amaral, 1998; Insausti et al., 1997). Os neurônios piramidais do córtex entorrinal da camada II projetam seus axônios para o giro denteado através de um feixe de axônios denominado de via perforante, e seus terminais acabam principalmente nas espinhas dendríticas das células granulares (Amaral et al., 2007; Dolorfo & Amaral, 1998), enquanto os neurônios e interneurônios da camada III projetam bilateralmente para a região CA1 (Basu et al., 2016; van Groen et al., 2003) através de uma subdivisão da via perforante nomeada via têmporo-amônica (Remondes & Schuman,. 4.

(13) 2004). Um esquema detalhado com entradas para o córtex entorrinal e saídas para o hipocampo pode ser visto na Figura 3.. Figura 3. Representações esquemáticas de neurônios e conexões do córtex entorrinal lateral e medial. Setas indicam entrada e saída de projeções para as várias camadas do córtex entorrinal. Abreviaturas: ACC: córtex cingulado anterior; Amygd: Amígdala; CA1-CA3: subáreas do hipocampo; DG: giro denteado; IL: córtex infralímbico; INC: córtex insular; OB: bulbo olfatório; OLFC: córtex olfatório; AP: parasubículo; PER: córtex perirrinal; PL: córtex prelímbico; POR: córtex posrinal; PPC: córtex parietal posterior; PRS presubiculum; prox: proximal; RSC: córtex retroesplenial; sub: subículo; subcort: estruturas subcorticais tais como prosencéfalo basal, amígdala; superf: superficial. (Grillner, 2010).. Como dito anteriormente, o giro denteado é um dos principais alvos de projeções do córtex entorrinal, recebendo através da via perforante axônios da camada II (Amaral et al., 2007; Dolorfo & Amaral, 1998). O giro denteado recebe estas projeções na camada molecular, que, junto com as camadas granular e polimórfica, formam sua estrutura 5.

(14) citoarquitetônica (Amaral et al., 2007; Andersen et al., 2006). A camada molecular é caracterizada pelos dendritos oriundos dos corpos celulares das células granulares do giro denteado (Figura 4), bem como pela presença dos axônios oriundos do córtex entorrinal e um pequeno número de interneurônios (Amaral et al., 2007). A camada de células granulares, como o nome sugere, é onde os corpos celulares das células granulares se localizam, formando uma camada densa de neurônios (Amaral et al., 2007). Por último, a camada polimórfica é composta principalmente por interneurônios, entre eles as células musgosas (Amaral et al., 2007; Kobayashi, 2010). As células musgosas possuem dendritos na região hilar, enquanto seus axônios projetam para a camada molecular tanto ipsilateral como contralateral do giro denteado, e têm como principal alvo as células granulares (Freund & Buzsáki, 1996). O giro denteado também pode ser caracterizado através de seu formato, em “V” ou “U”, sendo a porção voltada para a região CA1 chamada de suprapiramidal, a região abaixo do CA3 é chamada de infrapiramidal, e a interseção é chamada de crista (Amaral et al., 2007; Schultz & Engelhardt, 2014). A principal saída do giro denteado se dá através das fibras musgosas para a região CA3 do hipocampo; os axônios oriundos do giro denteado são particularmente grossos, e capazes de desencadear potenciais de ação na região CA3 com um único disparo pré-sináptico (Kobayashi, 2010).. 6.

(15) Figura 4. Ilustração original de Karl Schaffer (1892) do giro denteado e região CA3 e CA1 da formação hipocampal do coelho. Em destaque a entrada para o giro denteado oriundo do córtex entorrinal através da via perforante; a projeção de axônios das células granulares do giro denteado formando as fibras musgosas para as os neurônios piramidais da região CA3; as conexões intra CA3 através das colaterais recorrentes; e as conexões de CA3 para CA1 via as colaterais de Schaffer (Szirmai et al., 2012).. A região CA3 recebe entradas do giro denteado e entradas diretas do córtex entorrinal em suas diferentes camadas (Amaral & Witter, 1989; Dolorfo & Amaral, 1998). A região CA3 possui em sua citoarquitetura 5 camadas ou estratos, que são similares às outras áreas do hipocampo (Andersen et al., 2006): (1) stratum oriens é a camada localizada entre o stratum pyramidale e alveus; o stratum oriens é caracterizado por possuir os dendritos basais dos neurônios piramidais, e é a região onde há saídas axonais (Figura 4). Nessa região também se localiza uma diversidade de interneurônios. (2) Stratum pyramidale é a camada em que se localiza os corpos celulares dos neurônios 7.

(16) piramidais. (3) Stratum lucidum é uma camada que ocorre exclusivamente na região CA3. Essa camada localizada abaixo do stratum pyramidale é caracterizada por projeções das fibras musgosas oriundas do giro denteado. (4) Stratum radiatum, camada em que na região CA3 é localizada abaixo do stratum lucidum, é caracterizada pela chegada de projeções oriundas do próprio CA3 (colaterais recorrentes; Figura 4) e por possuir uma variedade de interneurônios. (5) Stratum lacunosum-moleculare, camada localizada infra stratum radiatum, é caracterizada por possuir os terminais das conexões oriundas da camada II do córtex entorrinal e por possuir uma variedade de interneurônios (Andersen et al., 2006; Cherubini & Miles, 2015). Subsequente a região CA3, se localiza a região CA2 no hipocampo. O CA2 é uma pequena região de transição entre as regiões CA3 e CA1, cuja área total é significativamente menor que estas. Porém, possui características singulares como o padrão de projeções em relação às outras áreas (Shinohara et al., 2012). A região CA2, diferentemente da região CA3, possui somente 4 camadas: (1) stratum oriens; (2) stratum pyramidale; (3) stratum radiatum; (4) stratum lacunosum-moleculare (Amaral & Witter, 1989; Andersen et al., 2006). A região CA1 possui as mesmas camadas que a região CA2, porém com diversas características próprias. O stratum pyramidale é formado por neurônios piramidais com formato mais homogêneos e em geral menores quando comparados com a região CA3 (Andersen et al., 2006). A região CA1 recebe inputs da região CA3, através das colaterais de Schaffer, no stratum radiatum (Amaral et al., 2007). Recebe também inputs da camada III do córtex entorrinal, através da via perforante e têmporo-amônica, no stratum lacunosum-moleculare (Brun et al., 2008). Na Figura 5 podemos ver um esquema de neurônios piramidais que povoam as três regiões do hipocampo.. 8.

(17) Figura 5. Representação esquemática dos neurônios piramidais e das camadas encontradas nas três regiões do hipocampo (CA1, CA2 e CA3). Podem ser observadas as principais conexões de entrada do córtex entorrinal (CE) e giro denteado (GD) para o hipocampo (linhas verde musgo, rosa e magenta) e saída (linha verde) entre das regiões hipocampais, bem como as conexões intra-hipocampais (linhas azul e laranja).. A atividade dos neurônios piramidais do hipocampo é modulada por vários tipos de interneurônios GABAérgicos (Freund & Buzsáki, 1996; Klausberger & Somogyi, 2008). Da diversidade de interneurônios presentes no hipocampo, podemos citar alguns que se diferenciam pela localização, velocidade de atividade neuronal e projeções: (1) Células em candelabro (Freund & Buzsáki, 1996) ou células axo-axônicas (Woodruff et al., 2010) são um conjunto de interneurônios que possuem seu corpo celular no stratum pyramidale, dendritos no stratum radiatum e lacunosum-moleculare (Freund & Buzsáki, 1996), e projeções axonais que inibem o segmento inicial do axônio das células piramidais (Wang et al., 2016; Woodruff et al., 2010). (2) Células em cesto correspondem a um grupo diverso de interneurônios, que possuem seus corpos celulares em estratos diferentes como o pyramidale e o radiatum, e são caracterizadas por projetarem axônios 9.

(18) que inibem a região perisomatica dos neurônios piramidais, e também por dispararem rapidamente (fast-spiking) (Freund & Buzsáki, 1996; Klausberger & Somogyi, 2008). (3) As células biestratificadas possuem seus corpos celulares no stratum pyramidale, e inibem os dendritos basais das células piramidais no stratum oriens, e os dendritos apicais no stratum radiatum; possuem ainda disparo regular (regular-spiking) (Ferrante & Ascoli, 2015; Klausberger & Somogyi, 2008; Wheeler et al., 2015). (4) As células oriens lacunosum-moleculare (OLM) possuem corpos celulares no stratum oriens e enviam projeções axonais para o stratum lacunosum-moleculare, inervando os dendritos apicais distais das células piramidais, bem como outros interneurônios no stratum radiatum (Klausberger & Somogyi, 2008; Leão et al., 2012); elas regulam a atividade oscilatória dos neurônios piramidais (Forro et al., 2015). Um esquema da variedade de interneurônios e projeções recebidas e enviadas pode ser visto na Figura 6.. 10.

(19) Figura 6. Esquema mostrando diferentes interneurônios e suas projeções. Podemos ver em azul uma representação de neurônios piramidais e suas projeções. Em amarelo e verde podemos ver uma variedade de células em cesto. Em marrom é representado a célula biestratificada. Em vermelho a célula em candelabro ou axo-axônica. Por último, em magenta vemos a célula OLM e sua projeção para os dendritos apicais distais (Klausberger & Somogyi, 2008). O subículo, área da formação hipocampal localizada entre o córtex entorrinal e o hipocampo, possui três principais camadas: (1) molecular, (2) piramidal e (3) camada polimórfica (Ding, 2013). A camada piramidal possui grandes neurônios piramidais que têm dendritos apicais na camada molecular e os dendritos basais nas porções mais profundas da camada piramidal (O’Mara, 2005). O subículo é uma das estruturas que mais recebe saídas do hipocampo, especificamente da região CA1 que projeta para todas. 11.

(20) as camadas do subículo, e posteriormente projeta para o córtex entorrinal e outras diversas áreas corticais (Amaral et al., 1991; Ding, 2013; O’Mara, 2005).. 1.2 – Formação hipocampal e memória A unidade funcional que compõe a formação hipocampal descrita na seção 1.1 possui um papel fundamental no processo de formação de memórias declarativas. Apesar das primeiras evidências encontradas nos anos 30 (McGaugh, 2000), o indício mais forte da participação da formação hipocampal no processo de formação de memórias declarativas foi visto duas décadas mais tarde no artigo intitulado “Loss of recent memory after bilateral hipocampal lesions” de William Scoville e Brenda Milner (1957). Nesse trabalho, os autores descreveram as cirurgias realizadas em 10 pacientes, onde o paciente H.M. (caso 1), que teve remoção bilateral da formação hipocampal, se tornou a principal evidência da estreita relação entre os processos relacionados à memória e a formação hipocampal (Scoville & Milner, 1957). Esse mesmo paciente sofreu de amnésia anterógrada, e retrógrada parcial, de memórias declarativas e episódicas (Scoville & Milner, 1957), porém manteve a capacidade de aprender e reter habilidades motoras (Milner et al., 1968; Scoville & Milner, 1957). Após os achados desse artigo, várias descobertas foram feitas ao longo das décadas seguintes no que concerne o papel de cada região da formação hipocampal no processo de formação e consolidação de memórias, da anatomia funcional de conexões entre as regiões hipocampais, passando pelos mecanismos moleculares até a codificação específica de informações (Amaral & Witter, 1989; Bliss & Lomo, 1973; Kandel, 2001; O’Keefe & Dostrovsky, 1971).. 1.2.1 – Mecanismos eletrofisiológicos e plásticos da memória As investigações sobre o processo de formação de memórias ao longo do século XX parecem ter seguido os preceitos propostos por Donald Hebb no livro intitulado “The Organization of Behavior” (Hebb, 1949). Nesse livro, Hebb propõe que a formação de 12.

(21) traços de memória se daria por conexões funcionais que guardariam informações em rede. Através da facilitação de conexões entre os neurônios, esses formariam conjuntamente unidades de informação; essas unidades foram intituladas por Hebb de “assembleias neuronais”. Pela ativação sequencial de múltiplas assembleias neuronais, intitulada de “sequência de fase”, teríamos a codificação de informações mais complexas (Hebb, 1949). As ideias propostas por Hebb levaram ao início de uma variedade de investigações em diversas áreas das neurociências, incluindo o campo da aprendizagem e memória (Brown & Milner, 2003). A posteriori, tais investigações desencadearam a descoberta de características das bases bioquímicas e eletrofisiológicas subjacentes à formação dos traços de memória (Brown & Milner, 2003). O postulado sobre a aprendizagem hebbiana, onde a eficiência da conexão funcional entre neurônios seria proporcional ao grau de atividade entre os neurônios pré e pós-sináptico, obteve o primeiro correlato biológico na década de 70. O mecanismo denominado de potenciação de longa duração (LTP, do inglês long term potentiation) foi descrito por Bliss e Lomo em 1973 em um trabalho de estimulação elétrica em coelhos anestesiados. Os animais, dentre alguns experimentos realizados, foram estimulados com eletrodos de forma rítmica e rápida (estímulos tetânicos de 15 Hz por 10 segundos) na via perforante e registrados em duas localizações: na região da camada molecular conectada monossinapticamente à região de registro (via experimental), e na camada molecular alguns milímetros distantes da região da via experimental (via controle). A estimulação na via experimental resultou no aumento de amplitude no potencial pós-sináptico excitatório populacional na camada granular do giro denteado, que pôde ser visto horas depois do protocolo de estimulação. Porém, a estimulação registrada na via controle não resultou no mesmo aumento de amplitude do potencial pós-sináptico (Figura 7; Bliss e Lomo, 1973).. 13.

(22) Figura 7. Experimento realizado por Bliss e Lomo em coelhos anestesiados. (A,B) Traçados de potenciais de campo registrados na via experimental e controle antes do protocolo de estimulação (A) e depois do protocolo de estimulação (B). (C) Amplitude dos potenciais póssinápticos excitatórios populacionais registrados na região da via controle (círculos brancos) e na região da via experimental (círculos pretos). Os valores representam a porcentagem de quanto a amplitude variou em relação aos registros anteriores ao procedimento de estimulação. Podemos ver o fenômeno de potenciação de longa duração no grupo experimental (Bliss & Lomo, 1973).. Ao longo das quatro décadas seguintes, houve vários avanços sobre a relação entre o LTP e mecanismos de plasticidade celular; porém, somente em 2006 foi mostrado que o processo de aprendizagem era capaz de gerar LTP no hipocampo de animais (Whitlock et al., 2006). Após um protocolo de aprendizagem com a tarefa de esquiva inibitória em ratos, Whitlock e colaboradores demonstraram que a região CA1 do hipocampo responde de forma diferenciada, onde pode ser observado aumento, diminuição ou manutenção nos potenciais de campo pós-sinápticos excitatórios populacionais (Whitlock et al., 2006). 14.

(23) Estes achados puderam ser vistos mesmo horas após a aprendizagem (Figura 8; Whitlock et al., 2006). Uma das características vistas neste estudo, em que neurônios diminuem a responsividade a outros, é chamada de depressão de longa duração (LTD, do inglês long term depression). O LTD foi posteriormente evidenciado como tão importante quanto o LTP para a plasticidade de conexões funcionais entre neurônios (Feldman, 2012), apesar de não contemplado por Hebb em sua teoria. Para Hebb, o mecanismo de enfraquecimento de conexões não era um fenômeno ativo e sim uma resposta passiva ao fortalecimento de outras conexões (Hebb, 1949). O fenômeno de LTD foi visto pela primeira vez nas fibras musgosas das células de Purkinje do cerebelo (Ito et al., 1982).. Figura 8. Experimento com esquiva inibitória realizado por Whitlock et al. (2006). (A) Localização dos eletrodos de registro no hipocampo. (B) Exemplo de traçados registrados por dois eletrodos distintos no painel de cima. O painel debaixo mostra a porcentagem de variação das inclinações das respostas evocadas nos potenciais de campo em relação aos registros antes da tarefa comportamental. As cores quentes mostram registros de eletrodos que exibiram aumento das respostas evocadas e as cores frias eletrodos que exibiram a diminuição ou manutenção das respostas evocadas.. Além da ausência de postulados sobre o enfraquecimento de conexões, outra característica pouco explorada por Hebb foi a questão do tempo entre disparos como variável chave na plasticidade das conexões entre neurônios. Apesar de apresentar uma ideia de causalidade temporal ao postular que as assembleias seriam formadas por 15.

(24) sequência de ativação de um neurônio após outro, nenhuma ideia nesse sentido foi aprofundada. Desta forma, a teoria de aprendizagem hebbiana clássica vem sendo atualizada desde sua formulação; podemos enumerar alguns postulados que a teoria mais atual trata: (1) a atividade conjunta entre um neurônio pré e pós sináptico; (2) a participação de moduladores nesse processo (Frémaux & Gerstner, 2015); (3) a relação de tempo entre os potenciais de ação pré e pós sináptico como indutor de plasticidade (Figura 9; STDP, do inglês spike-timing-dependent plasticity; Feldman, 2012); (4) o enfraquecimento de conexões como mecanismo importante na plasticidade (Caporale & Dan, 2008; Feldman, 2012; Frémaux & Gerstner, 2015). Figura 9. Mecanismo de plasticidade dependente do tempo de disparo. Painel de cima mostra dois esquemas de pareamento pré-pós sinaptico, onde o neurônio póssináptico dispara depois (esquerda) ou antes (direita) do neurônio pré-sináptico. Painel abaixo mostra que quando há pareamento entre os disparos dos neurônios pré e pós há indução de LTP ou LTD, a depender do tempo relativo de disparo entre eles. A ativação não pareada do neurônio pré- ou pós-sináptico não induz LTP ou LTD. Painel debaixo mostra que a magnitude da plasticidade (em %) é inversamente proporcional ao tempo entre os disparos dos neurônios pré e pós sinápticos (Feldman, 2012).. 16.

(25) As modificações vistas no LTP só são possíveis através de mudanças em cadeias bioquímicas que alteram a estrutura funcional do neurônio, indo das variações de níveis de cátions e ânions em botões sinápticos, até alterações de transcrições de DNA (Caporale & Dan, 2008). Essas diferenciações de mecanismos bioquímicos, genéticos e celulares, necessárias para codificação e manutenção dos traços de memória, são denominadas de plasticidade sináptica, termo cunhado por Jerzy Konorski (Konorski, 1948). Posteriormente, a plasticidade sináptica foi postulada por Hebb como o mecanismo responsável para guardar informação no cérebro (Hebb, 1949). Um grande número de cascatas bioquímicas (Giese & Mizuno, 2013), modificações de expressão de genes (Bliim et al., 2016) até alterações estruturais (Leal et al., 2015) relacionadas a codificação e manutenção de traços de memória foram descritas ao longo do século XX e XXI (Andersen et al., 2006). As alterações mencionadas parecem estar ligadas a modulação do funcionamento de receptores glutamatérgicos do tipo AMPA e NMDA, e seus segundos mensageiros, cujas mudanças são induzidas por proteínas cinases (Izquierdo & Medina, 1997). Bastante resumidamente, após a ativação de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, há aumento nos níveis de cálcio intracelular que por sua vez se liga a calmodulinas (Izquierdo & Medina, 1997). Essas calmodulinas ativam cinases, sendo CAMKII uma das principais cinases envolvidas. Por conseguinte, CAMKII é capaz de afetar a atividade de outras proteínas que participam do remodelamento sináptico (Okamoto et al., 2009), e na modulação de expressão de genes imediatos (Okuno et al., 2012). Seus níveis são aumentados durante o aprendizado (Cammarota et al., 1998), e sua inativação resulta em prejuízos na formação da memória (Lisman et al., 2002). Outras cinases como a família de PKA, C e G, MAPK, ou vias dependentes de segundo mensageiros como cAMP (do inglês, cyclic adenosine monophosphate), são igualmente importantes no processo de modificação sináptica e regulação de expressão gênica (Bernabeu et al., 1997; Giese & Mizuno, 2013). Uma das funções apresentadas pelas cinases envolve a modulação da expressão de genes imediatos que são capazes de regular a expressão de outros genes, bem como se autorregular (Minatohara et al., 2015). O Zif268 e o Arc são dois genes imediatos com papeis conhecidos na indução de plasticidade 17.

(26) sináptica relacionada a formação e manutenção de memórias (Izquierdo & Cammarota, 2004; Minatohara et al., 2015), e tanto a indução de LTP como novas experiências resultam no aumento de expressão de Zif-268 (Ribeiro et al., 2007, 2002; Ribeiro & Nicolelis, 2004). Outro componente na cadeia de plasticidade sináptica que possui grande importância no processo de formação e manutenção de memórias é o fator trófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor) (Bekinschtein et al., 2014; Leal et al., 2015). Podemos ver um esquema da relação das cinases, genes imediatos e fatores neurotróficos na Figura 10.. Figura 10. Figura exemplificando, numa conexão entre CA3 e CA1, mecanismos plásticos relacionados ao LTP. É mostrada uma sequência de modificações que vai do botão sináptico (PK e CAMKII), passando por alterações de expressão gênicas (CREB) até efetores que induzem modificação estrutural (BDNF).. 18.

(27) Tão importante quanto o funcionamento de receptores glutamatérgicos, são as ações de sistemas de neurotransmissores moduladores, seja através da modulação da atividade dos receptores glutamatérgicos como também das cascatas bioquímicas e de expressão gênica tratadas acima (Blake et al., 2014; Hansen & Manahan-Vaughan, 2012; Knox, 2016; Rossato et al., 2009; Zhang & Stackman, 2015). Sistemas como o colinérgico, noradrenérgico, serotonérgico e dopaminérgico possuem projeções para formação hipocampal (Andersen et al., 2006), e modulam a atividade de cinases, genes imediatos e fatores neurotróficos relacionados a aprendizagem, aquisição e consolidação de memórias (Cammarota et al., 2008; Hansen & Manahan-Vaughan, 2012; Rossato et al., 2009). O sistema dopaminérgico, por exemplo, é implicado tanto na aquisição como na manutenção da memória (França et al., 2016, 2015; Rossato et al., 2009). Já foi visto que a modulação da atividade de receptores dopaminérgicos da família D1 no hipocampo leva a persistência de memórias de longo prazo (Rossato et al., 2009). Essa persistência da memória é relacionada à plasticidade induzida por BDNF, na janela de tempo de 12 horas após a aquisição da memória (Rossato et al., 2009). Mais especificamente, é relacionada à indução de plasticidade nos dendritos apicais de neurônios piramidais da região CA1 (Navakkode et al., 2012) e à plasticidade induzida em interneurônios parvalbumina positivos da região CA1 (Karunakaran et al., 2016). A modulação de receptores dopaminérgicos do tipo D2 também é relacionada ao processo de aquisição e consolidação das memórias (França et al., 2016, 2015). A injeção de antagonista de receptores D2 leva à diminuição em cadeia da cinase dependente de cálcio ao longo de 3, 6 e 12 horas após a injeção; a diminuição da expressão do gene imediato Zif-268 é vista 6 horas após a injeção e, por último, a diminuição de BDNF é vista 12 horas após a injeção (França et al., 2015). Estes resultados estão de acordo com a janela de tempo da ação de BDNF (Navakkode et al., 2012; Rossato et al., 2009). Possivelmente, a ação de receptores D2 se dá através do controle do sono REM (França et al., 2015), que é relacionado aos processos plásticos da consolidação das memórias (Ribeiro et al., 2007; Ribeiro & Nicolelis, 2004).. 19.

(28) O sistema colinérgico também é relacionado ao processo de aprendizagem (Martí Barros et al., 2004) e sua ação é estreitamente ligada ao sistema dopaminérgico, ocorrendo através de inputs colinérgicos em núcleos dopaminérgicos (de Kloet et al., 2015; Subramaniyan & Dani, 2015). Diferentes receptores colinérgicos do tipo nicotínico participam de diferentes processos cognitivos (Levin, 2002), e a transmissão colinérgica modula a potenciação de longa duração na região CA1 (Al-Onaizi et al., 2016). Os anexos 1, 2 e 3 desta tese discutem o papel dos sistemas dopaminérgicos e acetilcolinérgicos, trazendo evidências comportamentais, moleculares e eletrofisiológicas em intervenções psicofarmacológicas em camundongos submetidos a tarefas cognitivas hipocampodependentes.. 1.2.2 – Formação hipocampal e a memória reconhecimento Em geral, as investigações sobre memória envolvem a manipulação farmacológica (sistêmica ou localizada). ou lesões específicas de estruturas ou vias da formação hipocampal (descrita na seção 1.1). Tais manipulações são acompanhadas da verificação do comportamento do animal em alguma tarefa e/ou a verificação dos níveis de moléculas relacionadas à memória (descritas na seção 1.2). Dentro desse contexto, testes de reconhecimento de objetos foram propostos em 1988, sendo mostrado a tendência natural do roedor de explorar a novidade em detrimento da familiaridade (Ennaceur & Delacour, 1988). Posteriormente, esses testes foram empregados para investigar a função de regiões, circuitos, células e moléculas na formação, consolidação e evocação de memória (Antunes & Biala, 2012; Blaser & Heyser, 2015). Vale citar que a utilização do paradigma de reconhecimento de objetos também é aplicado para o estudo de doenças relacionadas ao sistema nervoso central, como esquizofrenia (Rajagopal et al., 2014), Alzheimer (Bengoetxea et al., 2015), Parkinson e autismo (Grayson et al., 2015). A capacidade de reconhecimento de padrões, objetos, lugares e contextos está ligada à formação hipocampal (Brun et al., 2002a; Daumas et al., 2005; Dere et al., 2007; Nakazawa et al., 2002; Suzuki et al., 1997). Como explicitado na seção 1.2.1, o 20.

(29) funcionamento de receptores NMDA como indutor de plasticidade, seja por mecanismo de LTP ou LTD, está ligado ao processo de manutenção de memória. Foi observado por Kem e Manahan-Vaughan (2004) que a exploração de objetos novos facilita o mecanismo de LTD e dificulta o mecanismo de LTP no stratum radiatum da região CA1 (Kemp & Manahan-Vaughan, 2004). O uso de drogas antagonistas à ação de AMPA ou NMDA, aplicadas sistemicamente ou intra-hipocampal, prejudica a aquisição e a consolidação de memórias ligadas ao reconhecimento de objetos (Dere et al., 2007). Mais especificamente, camundongos knock-out para a subunidade 1 do receptor NMDA (que inviabiliza a função do receptor) na região CA1 do hipocampo possuem prejuízo no reconhecimento de objetos e na tarefa de associação de medo ao contexto; no entanto, a capacidade de reconhecimento é recuperada ao induzir plasticidade na região CA1 através de exposição a ambientes enriquecidos (Rampon et al., 2000). Já animais knock-out para os receptores NMDA na região CA3 possuem capacidade de reconhecimento e reativação de memória espacial; porém, estes animais exibem prejuízo da memória quando há diminuição das pistas espaciais no momento da reativação, o que revela o envolvimento de CA3 em memórias associativas ao contexto (Nakazawa et al., 2002). A modulação de receptores dopaminérgicos influencia na discriminação de objetos e contextos (França et al., 2016, 2015; Melichercik et al., 2012; Puma et al., 1999; Tian et al., 2015). Animais knock-out total ou parcial para o transportador de recaptação da dopamina da fenda sináptica (modelos de hiperdopaminergia) apresentam mudança no padrão da procura e interação com objetos novos (Pogorelov et al., 2005), déficit em reconhecimento de objetos (França et al., 2016) e no completamento de padrões (Li et al., 2010). Estes resultados mostram a importância da dopamina balanceada no momento da codificação de memórias. A capacidade de discriminação de objetos é recuperada ao utilizar antagonista de receptores D2 (haloperidol 0.05 mg/Kg) na fase de codificação da memória nos camundongos com knock-out parcial para o transportador dopaminérgico (França et al., 2016). Quando o antagonista de receptores D2 (haloperidol 0.3 mg/Kg) é utilizado em camundongos selvagens na fase posterior à codificação dos objetos, pode ser observado o prejuízo na discriminação de objetos junto a uma diminuição de cascatas moleculares relacionadas a traços de memória (França et al., 2015). Drogas que modulam 21.

(30) receptores D1/D5 também interferem na discriminação de objetos; por exemplo, um agonista D1/D5 injetado pós-treino (SKF 10 mg/Kg) prejudica a discriminação de objetos novos (de Lima et al., 2011). A modulação da atividade de receptores colinérgicos também pode causar prejuízo ou aumentar a discriminação de objetos novos e contextos (Anexo 3; Gould & Lommock, 2003; Kutlu & Gould, 2015; Puma et al., 1999; Tian et al., 2015). A nicotina, que atua em receptores colinérgicos, leva a um aumento na discriminação de objetos e contextos em baixas doses (0.1 – 0.4 mg/Kg) (Gould & Lommock, 2003; Puma et al., 1999; Rezvani & Levin, 2001), mas em altas doses (1.5 mg/Kg) prejudica a discriminação de objetos e espaços (Anexo 3). Camundongos submetidos à dose de 1.5 mg/Kg prétreino passam a preferir o objeto familiar em detrimento do objeto novo (Anexo 3). A mesma dose injetada após a fase de codificação de memória reverte o padrão de exploração (Anexo 3). A exploração de contextos novos leva a uma assinatura eletrofisiológica na atividade de campo local nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo (Berke et al., 2008), enquanto a associação contextual leva a um aumento no acoplamento entre a atividade oscilatória de teta e gama na região CA3 (Tort et al., 2009). A conexão entre o córtex entorrinal e CA1 parece ter papel chave para localização e reconhecimento espacial, já que a ausência de CA3 não afeta o reconhecimento de novos ambientes; a conexão entre o córtex entorrinal e CA1 parece ser suficiente para manter a codificação de espaço por células de lugar em CA1, e a capacidade de reconhecimento de lugar (Brun et al., 2002). Tais características relacionadas a atividades oscilatórias serão discutidas na seção 1.4.. 1.3 – Modulação da codificação de memória de reconhecimento pelas células OLMα2 (Artigo 1). Como dito seção 1.1, o hipocampo apresenta uma variedade de interneurônios GABAérgicos em diferentes camadas que modulam a atividade das células piramidais (Freund & Buzsáki, 1996). As projeções axonais perisomáticas tendem a inibir as saídas dos neurônios piramidais, enquanto que as dendríticas inibem as entradas (Klausberger 22.

(31) & Somogyi, 2008). Os interneurônios na região CA1 que possuem corpos celulares no stratum oriens e projeções axonais enviadas para o stratum lacunosum-moleculare são denominadas de células OLM (Figura 5 e 11). As células OLM modulam a atividade dos neurônios piramidais através da inibição de seus dendritos apicais distais (Amaral & Witter, 1989). As células OLM recebem projeções diretas de neurônios colinérgicos, que por sua vez são relacionados a aprendizagem e consolidação de memórias (Bunce et al., 2004; Easton et al., 2012; Elvander et al., 2004).. Figura 11. Imagem de reconstrução do neurolúcida de dois interneurônios. Em preto o soma e dendritos, e em vermelho os axônios de um interneurônio IS-III que modula a atividade de células OLM. Em verde o corpo celular e os dendritos no stratum oriens, e em azul os axônios projetados no stratum lacunosummoleculare de um célula OLM (Chamberland & Topolnik, 2012).. 1.3.1 – Sistema Cre-loxp, optogenética e o controle das células OLMα2. As células OLM foram caracterizadas através de animais transgênicos, e ferramentas eletrofisiológicas e optogenéticas por Leão e colaboradores (2012). Nesse trabalho foi verificado que a subunidade α2 do receptor colinérgico (Chrnα2) é expressa, dentro do hipocampo, exclusivamente nas células OLM do CA1, o que possibilitou usála como marcador molecular desta subpopulação de células OLM (Leão et al., 2012; Mikulovic et al., 2015), aqui referida como “células OLMα2”. Para conseguir controlar a atividade dos interneurônios OLMα2 de forma específica, foi utilizado o sistema de manipulação genético Cre-loxp (Leão et al., 2012). Esse sistema foi descoberto no vírus bacteriófago P1, que o utiliza para reparação e 23.

(32) estabilização de ADN durante a infecção da bactéria alvo (Sauer, 1998). O Cre-loxp utiliza duas variáveis importantes: (1) Cre recombinase, uma enzima que identifica pares de sequências específicas de ADN e inverte sua sequência (por exemplo, 3’-5’ para 5’3’); e (2) loxp, que é uma sequência de 13-bp invertida identificada pela Cre recombinase (Brault et al., 2007; Fenno et al., 2011; Sauer, 1998). O uso desse sistema de identificação e inversão da sequência de ADN pode ser associado a uma grande variedade de manipulações genéticas (Brault et al., 2007). Por exemplo, através da inserção de genes de interesse flanqueados pela sequência de loxp, e pela interação com a Cre recombinase, é possível estabelecer o knock-out e o knock-in de genes específicos, ou a expressão de genes em células específicas (Brault et al., 2007). A optogenética é uma técnica experimental moderna que utiliza rodopsinas para manipular a atividade de subtipos específicos de neurônios (Fenno et al., 2011). As rodopsinas são estruturas proteicas que incluem canais ou bombas iônicas, cuja conformação tridimensional é modificada na presença de luz em faixas comprimento de onda específicos (Deisseroth, 2011). Existem diversos canais ou bombas iônicas sensíveis à luz; por exemplo, o canal de cátions ChR2 (channelrodopsin-2) é oriundo de uma espécie de alga verde, e a bomba de prótons Arch (archaerhodopsin) oriunda de archaea bactérias (Madisen et al., 2012; Schneider et al., 2015). O canal de cátions ChR2 é sensível ao comprimento de onda de ~473 nm, que corresponde ao azul. Na presença da luz azul, sua conformação é modificada e o canal permite a passagem de cátions (principalmente sódio) para dentro da célula, provocando a despolarização da membrana e facilitando a atividade neuronal (Schneider et al., 2015). Já a bomba de prótons Arch é sensível à luz de comprimento de onda 532 nm; na presença de luz verde, Arch retira prótons de dentro para fora da célula, provocando hiperpolarização da membrana (Madisen et al., 2012). Leão e colaboradores (2012) associaram o sistema de Cre-loxp à optogenética para manipular especificamente as células OLMα2. Um animal transgênico foi desenvolvido utilizando Chrnα2 (a proteína que é expressa no hipocampo exclusivamente nas células OLM) como promotor da expressão de Cre recombinase e de um marcador bioluminescente vermelho (tomato) para identificar as células Cre+. Dessa forma, 24.

(33) somente os neurônios OLM se tornaram Cre+ (Leão et al., 2012). Posteriormente, utilizando a estratégia doublefloxed inverted open-reading-frame (DIO; Figura 12), foram injetados nos animais Chrnα2-Cre/Tomato vetores virais duplamente flanqueados por lox contendo o gene de ChR2. Dessa maneira, o canal ChR2 foi exclusivamente expresso em células Chrnα2-Cre/Tomato infectadas (Leão et al., 2012). Um esquema da associação entre as ferramentas Cre-loxp e optogenética pode ser visto na Figura 12.. Figura 12. Esquema do funcionamento do sistema Cre-loxp utilizando a estratégia de doublefloxed inverted open-reading-frame (DIO). Podemos observar em (a) o esquema da injeção viral, que infecta tanto células Cre+ (onde o Cre é expresso) e Cre- (onde não há expressão de Cre). A inversão da sequência específica de ADN só ocorre nas células Cre+. (b) Esquema do conteúdo da injeção viral. A primeira sequência gênica possui 5 genes: EF1α corresponde ao promotor; loxp corresponde à sequência a ser identificada e invertida por Cre; lox2722 é a sequência de parada; eYFP é o gene que codifica uma proteína bioluminescente; ChR2 é o gene que codifica o canal sensível à luz. Note que a sequência de eYFP e ChR2 está invertida. Ao final do processo, Cre identifica o loxp e inverte a sequência de eYFP e ChR2, que passam a ser expressas exclusivamente nas células Cre+ (Fenno et al., 2011).. 25.

(34) 1.3.2 – Células OLMα2 e o controle das entradas do córtex entorrinal Leão e colaboradores (2012) verificaram que as células OLMα2 modulam a atividade dos neurônios piramidais inibindo os dendritos apicais distais no stratum lacunosum-moleculare, e tal modulação diminui entradas do córtex entorrinal (Figura 13; Leão et al., 2012). Essa evidência foi obtida através de protocolos de indução de LTP em fatias de hipocampo. Em particular, os autores estimularam eletricamente a via têmporoamônica (via de comunicação entre o córtex entorrinal com a região CA1) e registraram respostas de potencial de campo no stratum lacunosum-moleculare. Foram investigados dois animais transgênicos: (1) animal Chrna2-cre, e (2) animal Chrna2-cre/Viaatloxp/loxp, que não possuem transportadores vesiculares GABAérgicos nas células OLMα2, inviabilizando a função inibitória destes interneurônios. Ambos animais foram sujeitos à injeção hipocampal de vírus contendo o gene de ChR2 flanqueado por lox; portanto, em ambos animais as células OLMα2 tornaram-se sensíveis à luz azul. Ao estimular a via têmporo-amônica e registrar nas fatias dos animais Chrna2-cre sem incidência concomitante de luz, houve um aumento das respostas em relação à linha de base, indicando um aumento de excitabilidade característica do fenômeno de LTP (Leão et al., 2012). Entretanto, ao associar a estimulação elétrica da via têmporo-amônica com a incidência da luz azul, a potenciação da resposta pós-sináptica foi significativamente menor, indicando que as células OLMα2 – estimuladas optogeniticamente – inibiram a indução de LTP (Leão et al., 2012). Por último, ao utilizar animais Chrna2cre/Viaatloxp/loxp, pôde-se verificar uma potenciação ainda maior que nas duas condições anteriores, corroborando a função inibitória das células OLMα2 sobre a via têmporoamônica (Leão et al., 2012). Esse trabalho também mostrou que as células OLMα2 inibem interneurônios localizados no stratum radiatum que modulam as entradas de CA3 pela via colateral de Schaffer, facilitando assim a conexão CA3-CA1 (Leão et al., 2012). Por último, foi verificado que as células OLMα2 se conectam entre si por sinapses elétricas e recebem projeções colinérgicas diretas (Leão et al., 2012). Um esquema da conectividade apresentada pelas OLM pode ser visto na Figura 14.. 26.

(35) Figura 13. Experimento de estimulação da via temporoamônica em três condições experimentais: (1) Fatias de hipocampo de animais Chrna2cre que expressam canais de sódio sensíveis à luz (ChR2) mas. na. ausência. de. luz. (branco). (2) Como em (1) mas na presença de luz azul (preto). (3) Fatias de animais Chrna2cre que expressam ChR2 mas não expressam transportador vesicular de GABA nas células OLMα2 (vermelho). Nesse experimento, a via têmporo-amônica é estimulada e o registro ocorre no stratum lacunosum-moleculare. As fatias da condição 2 exibem menor LTP, mostrando que as células OLMα2 modulam sinapses do córtex entorrinal para a região CA1.. Figura 14 Esquema de conexões entre as células OLMα2 (laranja) e neurônios piramidais (preto) da região CA1. Pode ser visto as conexões elétricas entre as células OLMα2, a conexão inibitória entre células OLMα2 e interneurônios do stratum radiatum, e conexão inibitória entre células OLMα2 e neurônio piramidal no stratum lacunosum-moleculare. Pode ser visto também o input oriundo de neurônios colinérgicos (verde) a células OLMα2 (Leão et al., 2012).. A região CA1 do hipocampo está implicada em aprendizagem e consolidação de memórias (Tsien et al., 1996), bem como na codificação de informações do ambiente 27.

(36) (Lenck-Santini et al., 2005), reconhecimento de objetos (Rampon et al., 2000), e condicionamento ao medo (Ji & Maren, 2008; Lee & Kesner, 2004). Levando em conta que (1) lesão da camada do córtex entorrinal que projeta para a região CA1 prejudica a localização espacial e a atividade das células de lugar (Brun et al., 2008; Van Cauter et al., 2008), e que (2) as células OLM atuam na organização temporal de oscilações na frequência de teta (Forro et al., 2015) relacionadas a processos cognitivos hipocampodependentes (Tort et al., 2009), nós hipotetisamos que as células OLMα2 podem controlar a formação de memórias hipocampo-dependentes. Para testar nossa hipótese, o artigo 1 desta tese investigou a participação das células OLMα2 na modulação da codificação da memória de objetos explorados em um campo aberto, e também na formação de uma nova memória associativa de medo a um contexto. Utilizando camundongos Chrna2-cre e ferramentas optogenética, fomos capazes de modular especificamente a atividade das células OLMα2 nas tarefas de reconhecimento de objetos (NOR, do inglês novel object recognition) e numa tarefa de esquiva contextual passiva. Descobrimos que a ativação optogenética de células OLMα2 pareada ao momento em que os animais exploram um objeto específico ("objeto iluminado") prejudica o seu reconhecimento subsequente, mas não afeta o reconhecimento de um segundo objeto que não teve pareamento com a ativação de células OLMα2 ("objeto não iluminado"). Por outro lado, a inibição de células OLMα2 aumenta seletivamente a memória de reconhecimento para o “objeto iluminado". A estimulação de células OLMα2 enquanto os animais não estavam engajados na exploração dos objetos não afetou a memória de reconhecimento. Finalmente, descobrimos que a ativação de células OLMα2 durante o treino na tarefa de esquiva contextual passiva também prejudica a aquisição desta memória associativa. Concluímos que as células OLMα2 possuem papel chave no controle da codificação das memórias hipocampo-dependentes, seja de objeto ou contextual. Provavelmente esse resultado é devido à capacidade das células OLMα2 de filtrar informação multimodal transmitida do córtex entorrinal para o hipocampo.. 28.

(37) 1.4 – Oscilações hipocampais e detecção de novidade (Artigo 2) Como dito na seção 1.2, o processo de aprendizagem, aquisição e consolidação de memórias leva a algumas assinaturas eletrofisiológicas (Berke et al., 2008; Hafting et al., 2005; O’Keefe & Dostrovsky, 1971; Tort et al., 2009). O estudo de oscilações em potenciais de campo local (LFPs, do inglês local field potential) é uma abordagem importante para o entendimento do funcionamento do sistema nervoso central. A compreensão dos ritmos cerebrais pode elucidar diversas características fisiológicas, desde atividades sinápticas até os circuitos envolvidos na formação de memórias e na transferência de informações entre regiões do cérebro. Diversos estudos ao longo das últimas décadas visaram relacionar a atividade oscilatória neuronal com a expressão de comportamentos (Brankack et al., 1993; Buzsáki et al., 2012; Buzsáki & Draguhn, 2004; Buzsáki & Watson, 2012). As oscilações corticais resultam de atividades eletroquímicas das membranas excitáveis; há participação de neurônios excitatórios e inibitórios com diferentes pesos na formação das oscilações (Buzsáki et al., 2012). As oscilações podem ser detectadas em neurônios individuais (Kamondi et al., 1998), mas são comumente investigadas na escala mesoscópica do potencial de campo local (Buzsáki & Draguhn, 2004), que representa a atividade de um conjunto de neurônios (Figura 15). Entre as funções atribuídas à atividade oscilatória, estão a modulação da excitabilidade de neurônios, sincronia de atividade neuronal, transferência de informações entre áreas do cérebro e combinação de informações (Buzsáki & Draguhn, 2004).. 29.

(38) Figura 15 Exemplo de registros de atividade de neurônio individual e de populações neuronais (LFP) (Buzsáki et al., 2012).. No hipocampo, muitos estudos têm centrado no papel das oscilações teta (5-12 Hz; Buzsáki, 2002; Vanderwolf, 1969; Winson, 1978), oscilações gama (30-100 Hz; Colgin et al., 2009; Csicsvari et al., 2003; Montgomery & Buzsáki, 2007), oscilações de alta-frequência (110-160 Hz; Scheffer-Teixeira et al., 2013, 2012; Tort et al., 2013), e oscilações ripples (150-250 Hz; Buzsáki et al., 1992; Ego-Stengel & Wilson, 2010; Girardeau et al., 2009) em diferentes comportamentos e estados cognitivos (Figura 16). Estas oscilações neuronais também variam de acordo com o estágio do ciclo sono e vigília (Gervasoni et al., 2004). Entre resultados recentes que relacionaram oscilações neuronais com funções cerebrais, citamos a modulação de oscilações de altas frequências por oscilações de baixas frequências durante tomada de decisão (Tort et al., 2008); o aumento de acoplamento entre teta e gama durante uma tarefa de distinção de contextos (Tort et al., 2009); e o déficit de memória espacial em ratos através de supressão da atividade de ondas ripples do hipocampo (Ego-Stengel & Wilson, 2010; Girardeau et al., 2009).. 30.

(39) Figura 16. Exemplos de traçados de sinais brutos de potenciais de campo local do hipocampo. Cores dos traçados correspondem a faixa de frequência indicada na escala de cor abaixo, em preto o sinal de potencial de campo local filtrado nas frequências indicadas.. De relevância para a presente tese, o trabalho de Berke e colaboradores (2008) mostrou uma associação entre o aumento de potência da oscilações beta2 (23 -30 Hz) e a exploração de ambientes novos. Esse trabalho mostrou que o beta2 aumenta de forma transiente no início da exploração de um ambiente novo, e que os neurônios da região CA1 e CA3 do hipocampo são acoplados a esta oscilação (Figura 17; Berke et al., 2008). Nesse trabalho é colocada a hipótese de que a oscilação beta2 constitui um estado funcional discreto do hipocampo que permite a plasticidade durante a aprendizagem de novos contextos (Berke et al., 2008). Beta2 seria dependente de transmissão de receptores NMDA (Berke et al., 2008), que por sua vez é envolvido com aprendizagem rápida (Nakazawa et al., 2003).. 31.

(40) Figura 17 Espectros de potência onde pode ser visto o aumento transitório de potência na faixa 23-30 Hz em um ambiente novo, mas não em um familiar (Berke et al., 2008).. De toda forma, se torna curioso o porquê de uma oscilação que é sugerida como componente do processo de aprendizagem de novos contextos não ter sido descrita anteriormente na literatura, principalmente levando-se em conta que o hipocampo é uma estrutura bastante estudada e que, segundo os achados de Berke e colaboradores (2008), a oscilações beta2 possuiriam magnitude similar às bem descritas oscilações teta. O artigo 2 desta tese investiga o aparecimento de oscilações beta2 na detecção de novidade. Através de registros com múltiplos eletrodos isolados no hipocampo, córtex motor primário e córtex somato-sensorial primário, caracterizamos as oscilações beta2 em camundongos durante o teste de reconhecimento de objetos. Encontramos que beta2 aparece de forma transiente durante a exploração de novos objetos. Verificamos também que esta oscilação não está presente no córtex motor primário nem no córtex somatosensorial, mas somente no hipocampo. Consistente com esse achado, somente neurônios hipocampais são modulados pela fase de beta2, mas não neurônios neocorticais. Verificamos também que uma intervenção farmacológica que prejudica a consolidação 32.

(41) da memória de reconhecimento é capaz de modificar o padrão de aparecimento das oscilações beta2. Estes resultados dão suporte à hipótese de que as oscilações beta2 participam no processo de detecção de novidade, provavelmente sinalizando períodos para a ocorrência de plasticidade na rede.. 33.

(42) 2.0 – Artigo 1 Submetido para Neuron como Report OLMα2 cells control encoding of recognition and avoidance memory Arthur S. C. França1#,, Samer Siwani2#, Amilcar Reis2, Sanja Mikulovic2, Markus M. Hilscher1,2, Steven J. Edwards2, Richardson N. Leão1,2, Adriano B. L. Tort1, Klas Kullander2* # The. first two authors contributed equally to this work.. Running title: OLMα2 cells control memory encoding 1Brain. Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, Brazil.. 2Developmental. Genetics, Department of Neuroscience, Uppsala University,. Uppsala, Sweden. *Corresponding author: Klas Kullander: klas.kullander@neuro.uu.se. Keywords: OLM cells; Object Recognition; Passive Inhibitory Avoidance; Memory.. 34.