UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MANOELA DE OLIVEIRA REBOUÇAS
EFEITO ANTIDEPRESSIVO DO (-)-α-BISABOLOL EM CAMUNDONGOS C57BL/6 SUBMETIDOS A UM MODELO DE ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL
FORTALEZA 2019
MANOELA DE OLIVEIRA REBOUÇAS
EFEITO ANTIDEPRESSIVO DO (-)-α-BISABOLOL EM CAMUNDONGOS C57BL/6 SUBMETIDOS A UM MODELO DE ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito à obtenção do título de mestre em Farmacologia. Área de Concentração: Neurofarmacologia
Orientador(a): Francisca Cléa Florenço de Sousa
FORTALEZA 2019
MANOELA DE OLIVEIRA REBOUÇAS
EFEITO ANTIDEPRESSIVO DO (-)-α-BISABOLOL EM CAMUNDONGOS C57BL/6 SUBMETIDOS A UM MODELO DE ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito à obtenção do título de mestre em Farmacologia. Área de Concentração: Neurofarmacologia
Aprovada em: ___/___/______
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Alyne Mara Rodrigues de Carvalho
UNINASSAU
_________________________________________ Prof. Dra Roberta Jeane Bezerra Jorge
AGRADECIMENTOS
Não dá para mensurar em palavras toda minha gratidão por tudo e por todos que contribuíram para que este trabalho fosse possível. Agradeço primeiramente à Deus, por fazer eu acreditar no meu potencial, e me dá forças para não desistir nos momentos mais difíceis dessa caminhada, e acima de tudo, por ter colocado anjos em formas de pessoas na minha vida. Agradeço aos meus pais, Didi e Norma, que apesar das dificuldades, sempre fizeram de tudo para que meus sonhos fossem possíveis, obrigada por todo amor depositado, pela dedicação, por compreender todas as minhas escolhas e apoiar todas elas mesmo sem entender, vocês são minha maior inspiração e motivo pra estar aqui.
À minha irmã Rafaela, minha amiga para todas as horas, que acata todas minhas decisões, que me ajuda em tudo e está sempre ao meu lado. À toda minha família, por confiarem em mim e estarem sempre torcendo pelas minhas conquistas. Agradeço em especial à minha tia/madrinha Socorro, que é meu maior exemplo de fé e superação, obrigada por tudo que faz por mim. E à minha prima Hilda, pessoa que foi muito importante nesses dois anos. Obrigada pelo apoio incondicional, por todos os conselhos e conversas diárias, e por me aguentar todos os dias.
Ao meu namorado Natanael, por me acompanhar em toda essa trajetória e compreender as minhas ausências, mudanças bruscas de humor, por acreditar no meu potencial, por escutar os meus dramas e por ter feito às figuras dos blacks. Obrigada!
À minha orientadora maravilhosa, professora Cléa. À ela devo toda minha gratidão, por ter me recebido de braços abertos sem hesitar, por ser essa pessoa iluminada que traz calmaria na nossa vida e que faz a gente acreditar que tudo vai dar certo. Foi Deus quem colocou a senhora na minha vida, obrigada por tudo.
À banca de defesa do exame de qualificação: Professoras Patrícia, Jamile e Renata, por terem feito ótimas considerações para a melhora deste trabalho.
À banca de dissertação, professora Roberta e Alyne. Obrigada pela disponibilidade e por gentilmente aceitarem o convite para participar deste momento tão importante.
À Evelline, minha amiga-irmã que está comigo desde criança, acompanhando todas minhas conquistas e torcendo por elas. Obrigada pela presença constante, pelo apoio diário e por está comigo sempre quando preciso.
À Natália e ao Danúsio, que além de amigos da neuro, são também família. Me ajudaram desde do início, obrigada por serem luz o tempo inteiro, pela disponibilidade desde sempre, por serem meu exemplo de paz e positividade. Obrigada também por trazer a Júlia para minha vida, ela com certeza é uma das pessoas que faz eu esquecer de todos os problemas.
Ao meu amigo Daniel, que hoje se tornou um irmão para mim, que possui um potencial ansiogênico, mas me ajudou no momento em que eu mais precisei. Obrigada por compartilhar comigo tanta sabedoria, pelas conversas de apoio e por me ajudar à amar a neuro.
À minha amiga Mirella, sempre doce e incentivadora. Obrigada por, mesmo com a distância física, está sempre ao meu lado.
À Ingrid, que sempre escuta todos os meus dramas, que mesmo sem entender nada sobre neuro, acha super legal tudo o que eu falo. Aos meus outros amigos de vida: Abdias, Jovilma, Lorena, Sarah e Cintia, que sempre estão acompanhando e torcendo pelo meu sucesso. À minha amiga Larice, que em tão pouco tempo tornou-se alguém tão especial. Obrigada por estar comigo em todos os experimentos, pelas conversas de apoio, por compartilhar comigo todos os problemas e por todas as vezes que eu precisei e você sempre esteve presente.
Aos amigos que o estresse crônico imprevisível e o labneuro me deu: Tiago, Andressa, Ingridy, Victor, Dilailson, Layla, Lorena, Bia e Bárbara, Auri, Dulce e Iardja. Obrigada por me ajudarem a surtar menos, por fazer esse trabalho ser mais leve, pois sem vocês eu não conseguiria executar esse trabalho tão árduo.
Às duas pós-docs e amigas, Alyne e Raquell por terem me ajudado no trabalho escrito e por tentarem me manter calma. Sem vocês eu ainda estaria sofrendo com a discussão.
À Gabi e ao Augusto, dois anjos que o biotério me deu. Sem vocês eu não teria conseguido vencer o medo de trabalhar com os animais. Obrigada por deixar essa caminhada mais leve, obrigada por tantas conversas agradáveis e por me aguentarem por tanto tempo.
Aos camundongos blacks, que me ensinaram muito, e que doaram suas vidas para que esse trabalho fosse possível.
Ao CNPq e à CAPES, pelo apoio financeiro e por viabilizar esse estudo. A todos que me ajudaram de uma forma direta ou indireta, a minha gratidão.
“Mantenha a fé na crença Se a ciência não curar Pois se não tem remédio Então remediado está Já é um vencedor Quem sabe a dor de uma derrota enfrentar E a quem Deus prometeu, nunca faltou Na hora certa, o bom Deus dará.” (Padre Fábio de Melo)
RESUMO
EFEITO ANTIDEPRESSIVO DO (-)-α-BISABOLOL EM CAMUNDONGOS C57BL/6 SUBMETIDOS A UM MODELO DE ESTRESSE CRÔNICO IMPREVISÍVEL
A depressão é uma doença incapacitante que acomete cerca de 300 milhões de pessoas no mundo. É caracterizada por sintomas de humor deprimido, sentimento de isolamento e culpa, e pode levar o indivíduo ao suicídio. A sua causa não está completamente elucidada, entretanto, existem algumas hipóteses que justificam seus sintomas, como por exemplo a neuroendócrina e a inflamatória. Existe um modelo, já caracterizado, denominado estresse crônico imprevisível (ECI), que é utilizado para a indução ao comportamento depressivo, em animais, através de estressores ambientais. O tratamento mais utilizado para a depressão consiste na farmacoterapia com antidepressivos. Porém, ainda existe resistência a adesão devido aos efeitos adversos, assim como o longo período de latência para o efeito terapêutico. Dessa forma, torna-se interessante a investigação de novos compostos com potencial antidepressivo. O (-)-α-bisabolol (BIS) é um álcool sesquiterpênico, que apresenta caráter lipofílico e atividades biológicas elucidadas como anti-inflamatória, antiespasmódica e neuroprotetora. A fim de reduzir as limitações da terapia convencional, busca-se verificar a atividade antidepressiva de muitos compostos isolados, como o BIS. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito antidepressivo do (-)-α-bisabolol em camundongos C57BL/6 submetidos a um modelo de estresse crônico imprevisível (ECI). Para tanto, o modelo consistiu em um protocolo experimental de 28 dias, no qual os animais (n=6-8), exceto grupo controle, foram submetidos a estressores ambientais, de forma aleatória, para garantia da imprevisibilidade. A partir do 15º dia, os grupos experimentais receberam por via oral: veículo (salina + Tween 80® a 3%), (-)-α-bisabolol nas doses de 25 ou 50 mg/kg, ou Fluoxetina 10 mg/kg, como droga de referência. Ao término do protocolo de tratamento, os animais foram submetidos aos testes comportamentais: para avaliar a atividade locomotora (Teste do Campo Aberto), para o efeito antidepressivo (Teste do Nado Forçado – TNF), Teste da Suspensão da Cauda – TSC) e Teste de preferência pela solução de sacarose), para verificar o efeito ansiolítico (Teste de Placa Perfurada – PP), Teste do Labirinto em cruz elevado – LCE) e para avaliar a memória de curto prazo (Teste do labirinto em Y). Após 60 minutos dos testes comportamentais, os animais foram eutanasiados por decapitação, e as áreas cerebrais (hipocampo e córtex pré-frontal) foram dissecadas e investigada a ação do BIS quanto ao estresse oxidativo, e quanto à parâmetros inflamatórios. Os resultados mostraram que o BIS possui efeito antidepressivo, ansiolítico e na memória de curto prazo nas doses de 25mg/kg e 50mg/kg, sem alterar a atividade locomotora, portanto, nestas doses, não apresenta efeito relaxante nem psicoestimulante. Na dose de 50mg/kg, o BIS foi capaz de reduzir os níveis de malondialdeído (MDA) no hipocampo e reduzir os níveis de nitrato/nitrito no córtex pré-frontal, demonstrando seu efeito antioxidante. O modelo do ECI aumentou os níveis das citocinas inflamatórias testadas (IL-1β e TNF-α), entretanto, o bisabolol não reduziu. Os resultados inéditos demonstram que o (-)-α-bisabolol possui efeito antidepressivo, ansiolítico e de proteção à memória de curto prazo. É interessante que posteriormente sejam investigados outros mecanismos de ação para o efeito antidepressivo do (-)-α-bisabolol.
ABSTRACT
ANTIDEPRESSIVE EFFECT OF (-) - α-BISABOLOL IN C57BL/6 MICES SUBMITTED A MODEL OF CHRONIC STRESS UNPREVISIBLE
Depression is a crippling disease that affects about 300 million people worldwide. It is characterized by symptoms of depressed mood, guilt and guilt, and can lead the individual to suicide. Its cause is not completely elucidated, however, there have been some hypotheses that justify its symptoms, such as a neuroendocrine and an infliction. There is a model, already characterized, called chronic unpredictable stress (CUS), which is used to induce depressive behavior in animals through environmental stressors. The most used treatment for evolution consists of pharmacotherapy with antidepressants. However, there is still resistance due to adverse effects, as well as the long latency period for the therapeutic effect. Thus, it is interesting to investigate new compounds with antidepressant potential. O (-)- α-bisabolol (BIS) is a sesquiterpene alcohol, which presents lipophilic and bioactive to the activities elucidated as anti-inflammatory, antispasmodic and neuroprotective. In order to reduce the pressure of conventional therapy, an antidepressant activity such as resistance of therapy, such as BIS, is sought. The objective of this work was to evaluate the antidepressant effect of (-)- α-bisabolol in C57BL / 6 mice with an unpredictable chronic stress model (ECI). The standard consisted in the experimental protocol of 28 days, for non-animals (n = 6-8), has been a rare environmental form, and the random species, for Guarness of unpredictability. From the 15th day oral groups: vehicle (saline + 3% Tween 80®), (-)-α-bisabolol at doses of 25 or 50 mg / kg, or Fluoxetine 10 mg / kg, as reference drug. To evaluate the locomotor activity, Forced Swim Test (TNF), TSC Suspension Test and Precision Test for sucrose solution), to perform the performance check anxiolytic (Labyrinth in Motion Test - LCE) and to evaluate pleasure memory (Y-labyrinth test). After 60 minutes of behavioral tests, the animals were euthanized by decapitation, and as brain areas (hippocampus and prefrontal cortex) were dissected and investigated the action of BIS on oxidative stress, and on the inflammatory senses. The results obtained with BIS have an antidepressant, anxiolytic and short-term effect in the dosages of 25mg / kg and 50mg / kg, and they weren’t submitted to locomotor activity, therefore, they presented doses, but not having a relaxing effect nor psychostimulant. At 50 mg / kg, BIS was able to reduce the levels of malondialdehyde (MDA) and hippocampus and reduce nitrate/nitrite levels in the prefrontal cortex, demonstrating its antioxidant effect. The ECI model increased the levels of the untested cytokines (IL-1β and TNF-α), however, (-) - α-bisabolol did not reduce. The results show that (-) - α-bisabolol has an antidepressant, anxiolytic and short-term memory protection effect. Other mechanisms of action for the antidepressant effect of (-) - α-bisabolol are of interest.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ativação do Eixo Hipotalâmico-Hipofisário-Adrenal e Feedback hormonal... 18
Figura 2: Estereoisômeros do (-)-α-bisabolol ... 24
Figura 3: Grupos Experimentais ... 29
Figura 4: Fluxograma do protocolo experimental ... 31
Figura 5: Teste do Campo Aberto ... 32
Figura 6: Teste do nado forçado ... 32
Figura 7: Teste de Suspensão da Cauda ... 33
Figura 8: Teste de preferência pela solução de sacarose ... 34
Figura 9: Teste do Labirinto em cruz elevado ... 35
Figura 10: Teste da placa perfurada ... 36
Figura 11: Teste do labirinto em Y ou Y-maze ... 37
Figura 12: Efeito do (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) na atividade locomotora e exploratória de camundongos submetidos ao modelo de ECI no teste do Campo Aberto. ... 40
Figura 13: Efeito do modelo de Estresse Crônico Imprevisível de 14 dias e 28 dias, sobre o tempo de imobilidade no teste do Nado Forçado ... 41
Figura 14: Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o tempo de imobilidade no teste do Nado Forçado. ... 42
Figura 15: Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o tempo de imobilidade no teste da Suspensão da Cauda. ... 43
Figura 16: Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) no teste da preferência pela solução de sacarose. ... 44
Figura 17: Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) no teste da Placa Perfurada. ... 45
Figura 18: Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a percentagem do número de entradas nos Braços Abertos (A), e a percentagem do Tempo de Permanência nos Braços Abertos (B), no teste do Labirinto de Cruz Elevado. ... 46
Figura 19: Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a memória de trabalho em camundongos submetidos ao modelo de Estresse Crônico imprevisível. ... 47
Figura 20: Efeitos do (-)-α-bisabolol sobre a dosagem de nitrito/nitrato (NO2/NO3) no Hipocampo e no Córtex pré-frontal ... 48
Figura 21: Efeitos do (-)-α-bisabolol sobre a dosagem de malondialdeído (MDA) no Hipocampo e no Córtex pré-frontal. ... 49 Figura 22: Efeitos do (-)-α-bisabolol sobre a dosagem de GSH no Hipocampo e no Córtex pré-frontal. ... 50 Figura 23: Efeitos do (-)-α-bisabolol sobre a dosagem de IL-1β no Hipocampo e no Córtex pré-frontal. ... 51 Figura 24: Efeitos do (-)-α-bisabolol sobre a dosagem de TNF-α no Hipocampo e no Córtex pré-frontal ... 52
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Estímulos estressores para indução do comportamento depressivo por estresse
crônico imprevisível 29
Quadro 2 Cálculo dos parâmetros: Percentual de entrada os braços abertos (PEBA) e Percentual do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) no teste do
Labirinto em cruz elevado (LCE) 36
Quadro 3 Resumo dos dados comportamentais, estresse oxidativo e parâmetros inflamatórios após a administração crônica de (-)-α-bisabolol em animais
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µg Micrograma µM Micromolar
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico BIS (-)-α-bisabolol
CPF Córtex pré-frontal
CRH Hormônio liberador de corticotrofina DAMP Padrões moleculares associados a danos ECI Estresse crônico imprevisível
ERN Espécie reativa de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigênio FLU Fluoxetina
g Grama
GSH Glutationa reduzida
HHA Hipotalâmico Hipofisário Adrenal
HP Hipocampo
IL-1β Interleucina-1β IL-6 Interleucina-6
IMAO Inibidor da monoamina oxidase
ISRN Inibidor seletivo da receptação de serotonina LCE Labirinto em cruz elevado
MDA Malondialdeído
nm Nanômetro
NO Óxido nítrico
OMS Organização Mundial da Saúde
PAMP Padrões moleculares associados à patógenos PEBA Percentual de entrada nos braços abertos
pg Picograma
PTBA Percentual do tempo de permanência nos braços abertos SNC Sistema Nervoso Central
TDM Transtorno depressivo maior TNF Teste do Nado Forçado
TNF-α Fator de Necrose Tumoral TPP Teste da Placa Perfurada TSC Teste de Suspensão da Cauda
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16
1.1 Considerações sobre a depressão ... 16
1.2 Fisiopatologia da depressão ... 17
1.2.1 Hipótese do Estresse e ativação do Eixo Hipotalâmico-Hipofisário-Adrenal... 17
1.2.2 Estresses oxidativo e nitrosativo envolvidos na depressão ... 19
1.2.3 A hipótese da inflamação como causa da depressão ... 20
1.3 Modelo de depressão induzida pelo Estresse Crônico imprevisível – ECI ... 21
1.4 Tratamento da depressão ... 23 2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ... 26 3 OBJETIVOS ... 27 3.1 Objetivo Geral ... 27 3.2 Objetivos Específicos ... 27 4 METODOLOGIA ... 28 4.1 Animais ... 28 4.2 Drogas ... 28 4.2.1 (-)-α-bisabolol ... 28 4.2.2 Fluoxetina ... 28
4.3 Indução de depressão por estresse crônico imprevisível ... 28
4.4 Desenho experimental ... 29
4.5 Testes comportamentais ... 31
4.5.1 Avaliação da Atividade Exploratória e Locomoção ... 31
4.5.1.1 Teste do Campo Aberto ... 31
4.5.2 Avaliação do Fenótipo Depressivo ... 32
4.5.2.1 Teste do Nado Forçado ... 32
4.5.2.2 Teste da Suspensão de Cauda ... 33
4.5.2.3 Teste de Preferência pela solução de sacarose ... 33
4.5.3 Avaliação da Atividade Ansiolítica ... 34
4.5.3.1 Teste do Labirinto em Cruz Elevado ... 34
4.5.3.2 Teste da Placa Perfurada ... 36
4.5.4 Avaliação da memória de curto prazo ... 36
4.6 Testes Neuroquímicos ... 37
4.6.1 Determinação de Parâmetros de Estresse Oxidativo ... 37
4.6.1.2 Determinação das concentrações de Nitrito/Nitrato ... 38
4.6.1.3 Determinação das concentrações de Glutationa Reduzida (GSH) ... 38
4.6.2 Mensuração das concentrações de IL-1β e TNF-α ... 38
4.7 Análise estatística ... 39
5 RESULTADOS ... 40
5.1 Avaliação Comportamental ... 40
5.1.1 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a atividade locomotora e exploratória (Teste do Campo Aberto) em camundongos submetidos a um modelo de ECI. ... 40
5.1.2 Efeito do modelo de Estresse Crônico Imprevisível sobre o tempo de imobilidade (Teste do Nado Forçado) ... 41
5.1.3 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o tempo de imobilidade no teste do nado forçado em camundongos submetidos a um modelo de ECI. ... 42
5.1.4 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o tempo de imobilidade no teste da suspensão da cauda em camundongos submetidos a um modelo de ECI. ... 43
5.1.5 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o comportamento anedônico em camundongos submetidos ao teste de preferência pela solução de sacarose 44 5.1.6 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o comportamento ansioso em camundongos submetidos ao teste de placa perfurada ... 45
5.1.7 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o comportamento ansioso em camundongos submetidos ao teste do Labirinto em cruz elevado (LCE)... 46
5.1.8 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre o déficit de memória no labirinto em Y em camundongos submetidos ao ECI ... 47
5.2 Avaliação Neuroquímica ... 48
5.2.1 Determinação dos parâmetros de estresse oxidativo ... 48
5.2.1.2 Efeito da administração do (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a concentração de Malondialdeído (MDA) no hipocampo e córtex pré-frontal ... 49
5.2.1.3 Efeito da administração do (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a concentração de Glutationa reduzida (GSH) no hipocampo e córtex pré-frontal ... 50
5.2.2 Determinação dos parâmetros inflamatórios ... 51
5.2.2.1 Efeito da administração do (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a concentração de Interleucina 1β no hipocampo e córtex pré-frontal ... 51
5.2.2.2 Efeito da administração do (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a concentração TNFα no hipocampo e córtex pré-frontal ... 52
6 DISCUSSÃO ... 53
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 58
8 CONCLUSÃO ... 60
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações sobre a depressão
O Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-5) define a depressão como perda de interesse por inúmeras atividades, humor deprimido, alterações no sono e apetite, sentimento de culpa e inutilidade, dificuldade para tomada de decisões pela dificuldade de concentração, e em muitos casos, o pensamento sobre o suicídio. Para estabelecimento do diagnóstico, é necessário que alguns desses sintomas estejam presentes de forma crônica e persistente por, no mínimo, duas semanas (PEREZ-CABALLERO et al., 2019).
A depressão tem sido considerada como a principal causa de incapacidade em todo o mundo (OPAS, 2018), pois afeta mais de 300 milhões de pessoas, sendo que 800.000 delas morrem por suicídio. Esses dados demonstram a necessidade de se voltar a atenção para esta doença, uma vez que a mesma está inserida como um dos grandes problemas de saúde pública (LIM et al., 2018).
Inicialmente, os sintomas da depressão desenvolvem-se gradativamente, o que dificulta o reconhecimento da doença, fazendo com que a busca por ajuda ocorra quando os sintomas já estão avançados. Além disso, distúrbios depressivos ainda são bastante estigmatizados, e isso causa uma relutância em procurar ajuda psiquiátrica, ou até mesmo a resistência ao tratamento. Ademais, a demora para o diagnóstico pode acarretar no agravamento dos sintomas e impactos negativos em outras doenças. (BARTKIENE et al., 2018; CRAVEN; BLAND, 2013; YOUNG et al., 2016).
Foi evidenciado a coexistência da depressão com muitas outras doenças, entre elas, a ansiedade. Esta, caracteriza-se como um distúrbio que apresenta alguns sintomas similares ao da depressão. Na combinação das duas doenças, os sintomas são mais sérios, pois há uma maior ocorrência de suicídio, torna-se maior a incapacidade nos pacientes, além de serem mais resistentes ao tratamento e os aspectos de caráter psicológico, físicos e sociais tornam-se mais agravados (TILLER, 2012).
Outra morbidade relacionada à depressão é o prejuízo à memória. Alguns estudos mostraram a existência de anormalidades estruturais e funcionais em regiões cerebrais, como o hipocampo, amígdala e o córtex pré-frontal, relacionadas com a memória emocional, além de outro tipo de memória, denominada autobiográfica, foi demonstrada em pacientes com depressão (XU et al., 2017).
Além da ansiedade e prejuízos na memória, outras doenças podem estar relacionadas com a depressão, como por exemplo, doenças cardíacas (SELIGMAN; NEMEROFF, 2015),
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Diabetes mellitus tipo 2 (JOSEPH; GOLDEN, 2017), obesidade (JANTARATNOTAI et al., 2017), dentre outras doenças crônicas, o que reforça a necessidade de compreender melhor a fisiopatologia da depressão.
1.2 Fisiopatologia da depressão
Apesar de ser uma doença bastante disseminada, ainda é inexistente um mecanismo bem estabelecido que possa explicar a causa da depressão. Entretanto, existem alguns fatores que, por meio de hipóteses, buscam justificar a fisiopatologia da doença. Estes incluem: fatores genéticos (GENOVESE et al., 2014; LIFELINES COHORT STUDY et al., 2016), ambientais, (LI; D’ARCY; MENG, 2016), neuroendócrino, inflamatório, neuroplasticidade e monoaminérgicos (MCKAY; ZAKZANIS, 2010; MOLENDIJK et al., 2014).
A teoria monoaminérgica, que relaciona a depleção das monoaminas (serotonina, noradrenalina e dopamina) à causa da depressão, ainda é a teoria mais forte, visto que a farmacoterapia existente volta-se para mecanismos de ação das monoaminas. Entretanto, WONG & LICINIO (2001) demonstraram que o tratamento contínuo com essas drogas causavam alterações na expressão gênica do cérebro, e isto poderia estar relacionado ao efeito terapêutico, tornando a hipótese monoaminérgica simplista. Dessa forma, torna-se necessário aprofundar-se nos estudos de outras hipóteses relacionadas à causa depressão, entre elas, a participação do eixo Hipotalâmico Hipofisário Adrenal (HHA).
1.2.1 Hipótese do Estresse e ativação do Eixo Hipotalâmico-Hipofisário-Adrenal
O termo estresse pode ser definido como uma interrupção da homeostase fisiológica que pode ser recorrente de situações adversas. Inúmeros eventos estressantes na vida de uma pessoa, mostraram-se fortemente relacionados à depressão, como por exemplo: a perda de alguém da família, o término de um relacionamento, situações envolvendo a saúde, o trabalho, dentre outros acontecimentos que possam causar um transtorno cognitivo. A perda interpessoal e a rejeição social são os estressores mais envolvidos com a depressão, pois estão fortemente associados ao tipo de sofrimento emocional que é característico da doença (SLAVICH; IRWIN, 2014).
A resposta à traumas precoces ou situações de extremo estresse possui alguns efeitos, e o principal deles é a ativação do eixo HHA (WONG; LICINIO, 2001). Essa ativação dá início à uma cascata de eventos. Inicialmente ocorre a secreção do hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que estimula a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), pela hipófise. O
ACTH, por sua vez, induz a liberação do cortisol, hormônio glicocorticoide, que tem como função manter o equilíbrio em resposta ao estresse (Figura 1). O cortisol liberado pelas glândulas suprarrenais, liga-se a dois tipos de receptores no cérebro, os mineralocorticoides e os glicocorticoides. Foi demonstrado, em alguns estudos, que a depressão pode ser reflexo da desregulação desses receptores, causada pela hiperatividade do eixo HHA (JURUENA et al., 2018; KELLER et al., 2017; MCKAY; ZAKZANIS, 2010).
Figura 1: Ativação do Eixo Hipotalâmico-Hipofisário-Adrenal e Feedback hormonal
Fonte: Mccarty (2016).
CRH: hormônio liberador de corticotrofina, ACTH: hormônio adrenocorticotrófico
Pacientes depressivos exibem um maior feedback negativo do eixo HHA, devido aos níveis excessivos de cortisol. Além disso, notou-se que o número ou a função de receptores de glicocorticoides são reduzidos em pacientes com depressão (MCKAY; ZAKZANIS, 2010). Além disso, foi demonstrado que a hiperatividade do eixo HHA, poderia reduzir a síntese de neurotransmissores monoaminérgicos como a serotonina e a noradrenalina, além de danificar os neurônios do hipocampo, região cerebral com alta densidade de receptores de glicocorticoides (ZHAO et al., 2018).
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Os glicocorticoides são responsáveis por inúmeras atividades metabólicas, como por exemplo, a regulação da gordura corporal. A exposição aguda ou crônica ao estresse pode gerar obesidade ou anorexia, dependendo do ambiente alimentar e emocional. Estudos mostram que esses distúrbios alimentares provocados pelo estresse e que causam desequilíbrio hormonal, podem estar intrinsecamente ligados à depressão. Além do envolvimento dos glicocorticoides no estresse, também é possível a liberação de radicais livres ocasionados pelo desequilíbrio dos sistemas antioxidantes do corpo, devido à presença constante do fator estressante (JANTARATNOTAI et al., 2017; ULRICH-LAI et al., 2015., CHAVES et al., 2019).
1.2.2 Estresses oxidativo e nitrosativo envolvidos na depressão
Radicais livres, também denominados espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs), são produzidos por um processo natural do metabolismo, e são responsáveis pela sinalização celular e defesa contra patógenos. Entretanto, em níveis elevados, causam danos aos lipídios, proteínas e DNA, ocasionando morte celular. O estresse oxidativo, conceituado como um desequilíbrio entre as defesas antioxidantes e a produção de EROs e/ou ERNs, é um mecanismo envolvido no envelhecimento e em algumas doenças, como as neurodegenerativas. Além disso, nos últimos anos surgiram evidências de que o estresse oxidativo pode estar ocasionando o aumento no número de doenças neuropsiquiátricas, como a depressão (BLACK et al., 2015).
O estresse emocional, que está intrinsecamente relacionado à depressão, induz uma resposta inflamatória juntamente com a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Estas estimulam a produção de espécies de oxigênio e nitrogênio reativos, e isso ocasiona a peroxidação lipídica e a redução do sistema antioxidante (SIVOŇOVÁ et al., 2004).
O óxido nítrico (NO) é uma molécula importante que desempenha função na regulação de muitos processos comportamentais, emocionais e cognitivos. Além disso, ele também é um radical livre e, em níveis excessivos, contribui para o estresse oxidativo causado pela neuroinflamação (GAŁECKI et al., 2011).
Durante os processos oxidativo e a redução do NO, formam-se espécies reativas de nitrogênio, as quais são tóxicas e podem causar danos às células. Existem três isoformas responsável pela síntese do NO, sendo a sintase induzida do óxido nítrico (iNOS) uma delas. A expressão dessa enzima pode ser induzida por citocinas pró-inflamatórias, estresse crônico, e fatores intrinsecamente relacionados ao transtorno depressivo maior. Além disso, a iNOS foi
relatada como um dos principais contribuintes para as condições inflamatórias e neurodegenerativas (FRODL et al., 2002; GAŁECKI et al., 2010; OLIVENZA et al., 2001).
O malondialdeído (MDA), por sua vez, é produto da peroxidação lipídica e também indica a danos à membrana celular, predizendo a eficácia do sistema de defesa antioxidante e atuando como um biomarcador de danos oxidativo causados por EROs. Altos níveis de MDA foram encontrados em alguns estudos com pacientes depressivos (BEHR; MOREIRA; FREY, 2012; TALAROWSKA et al., 2012; TEYSSIER et al., 2011).
Os prejuízos ocasionados pelo estresse oxidativo pode também ser devido à redução da defesa antioxidante. A glutationa reduzida (GSH) atua como um dos principais sistemas antioxidantes do cérebro, confere proteção contra a hidrólise de proteases celulares, protege as células contra os danos oxidativo, é essencial para a proliferação celular, e mostra-se como um marcador confiável do estresse oxidativo. Alguns estudos demonstram que a redução de GSH pode estar relacionada à depressão (FREED et al., 2017; STEENKAMP et al., 2017). Como dito anteriormente, a resposta inflamatória recorrente de um estresse emocional, associado à elevação de vários indicadores biológicos derivados do dano oxidativo celular, como a lipoperoxidação, direcionam muitos estudos a fim de avaliar o papel da inflamação no agravo à depressão.
1.2.3 A hipótese da inflamação como causa da depressão
Entender como o Sistema Nervoso Central e o sistema imunológico comunicam-se, é fundamental para entender as interações entre o cérebro, comportamento e imunidade (QUAN; BANKS, 2007), pois a inflamação é um mecanismo responsável pela homeostase do corpo. A resposta inflamatória pode ser favorável quando for na presença de uma infecção, dano celular ou estresse, porém, quando age de forma desequilibrada a um determinado estímulo, torna-se desfavorável (ROSENBLAT et al., 2014).
Em um estudo de 2018, foi demonstrado que, tanto o estresse físico quanto o psicológico, aumentam a ocorrência de comportamentos depressivos, devido aos inúmeros mecanismos hormonais e bioquímicos. Dessa forma, evidências crescentes indicam uma forte relação entre depressão e inflamação (GAŁECKI; TALAROWSKA, 2018).
Uma típica resposta inflamatória consiste em quatro componentes principais: 1 - indutores inflamatórios, representados pelos padrões moleculares associados a danos (DAMP) ou associados à patógenos (PAMP), 2 – sensores que detectam os DAMPs ou PAMPs, 3 –
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mediadores inflamatórios induzidos pelos sensores, como é o caso das citocinas, quimiocinas e prostaglandinas, e 4 – tecido alvo afetado pelos mediadores inflamatórios. O fenômeno inflamatório observado em doenças neuropsiquiátricas, como a depressão, é compatível com uma inflamação estéril, ocasionada após estressores físicos ou psicológicos (BAUER; TEIXEIRA, 2019).
As citocinas são moléculas capazes de modular uma resposta celular no desencadeamento das respostas imunes. Por exemplo, a exposição a estressores repetidos ou a estressores envolvendo conflito social, ameaça, rejeição e isolamento, aumentam os marcadores inflamatórios (ASCHBACHER et al., 2012; DENSON; SPANOVIC; MILLER, 2009). Além disso, as citocinas possuem algumas peculiaridades, dentre elas, sua natureza pleitrópica. Elas desempenham um papel importante na formação da organização celular do SNC servindo como fatores de crescimento para as células residentes no mesmo, e são capazes de desencadear inúmeras respostas (DEVERMAN; PATTERSON, 2009).
Embora haja uma infinidade de citocinas existentes, tem-se visto que a interleucina 1β (IL-1β) e o fator de necrose tumoral α (TNF-α), estão em níveis elevados em pacientes depressivos, sendo vistos como biomarcadores confiáveis da inflamação relacionados com a doença (CASSANO et al., 2017).
Em um estudo verificou-se que a presença das citocinas IL-1β e TNF-α,, foram relacionadas a sintomas como anedonia, fadiga, comprometimento psicomotor e aumento da sensibilidade à ameaça (ansiedade). Além disso, a inflamação tem sido associada à não responsividade ao tratamento com antidepressivos, no qual 45% dos pacientes que não respondiam aos antidepressivos apresentaram proteína C reativa acima dos níveis amplamente aceitos (MILLER; RAISON, 2016; RAISON et al., 2013). Na tentativa de evidenciar os mecanismos anteriormente descritos, propomos um modelo de depressão por estresse físico.
1.3 Modelo de depressão induzida pelo Estresse Crônico imprevisível – ECI
O estresse de forma crônica, e exagerada, é visto como um fator de risco para o desenvolvimento de inúmeras psicopatologias. Viver o estresse de maneira repetitiva e intensa, ocasiona a perturbação do funcionamento fisiológico e psicológico de um indivíduo e acaba por afetar seu comportamentos nos papeis afetivos, sociais e cognitivos (FINSTERWALD; ALBERINI, 2014; VAN BOXELAERE et al., 2017).
Dentre outros, os distúrbios sociais e cognitivos são os principais contribuintes para as doenças neuropsiquiátricas em pacientes que sofrem de distúrbios relacionados ao estresse,
como a depressão, a ansiedade, o transtorno pós traumático, memória e aprendizagem e insônia (MEHTA; PARASHAR; UDAYABANU, 2017; NORMANDEAU et al., 2018).
Diferentes modelos animais foram estabelecidos e utilizados para investigar os distúrbios neuropsiquiátricos, como a depressão, induzida pelo estresse. Buscando mimetizar uma situação semelhante ao que ocorre no ser humano, na década de 80, foi proposto um modelo para verificar o comportamento dos animais submetidos a diversos estressores físicos, e verificaram que o período de estresse prolongado gera a redução do consumo de líquidos doces, característica de um comportamento anedônico (WILLNER 2016).
Willner (2017) propôs avaliar a validade, confiabilidade e utilidade do modelo de depressão induzida pelo estresse crônico imprevisível – (ECI). Tal modelo constitui-se em simular a anedonia, caracterizada perda da capacidade de prazer ou de responder a eventos agradáveis, que é um dos sintomas característicos da depressão em humanos.
No modelo não existe uma padronização, entretanto, todos os protocolos consistem em submeter os animais à inúmeros fatores estressantes, de forma aleatória e imprevisível, durante várias semanas, a fim de induzir o comportamento depressivo símile, verificar a anedonia, reduzindo as chances de habituação e observar as alterações bioquímicas e morfológicas do cérebro (WILLNER, 2017).
Já foi demonstrado em diversos estudos, que a aplicação deste modelo pode gerar alteração no tempo de imobilidade no Teste do Nado Forçado – TNF (DING et al., 2014), redução da preferência pelo consumo da solução de sacarose (HE et al., 2016), aumentar a atividade das enzimas catalase e superóxido dismutase – SOD (FARIA et al., 2014), diminuição do peso corporal (GUPTA; RADHAKRISHNAN; KURHE, 2014), aumento da peroxidação lipídica (RINWA; KUMAR, 2012) representada pelo aumento da concentração de malondialdeído, aumento de nitrito e aumento da concentração de corticosterona sérica (XU et al., 2017). Desta forma, foi utilizado este modelo para investigar o potencial terapêutico de compostos isolados, sobre a depressão.
23
1.4 Tratamento da depressão
A terapia farmacológica atualmente utilizada para o tratamento da depressão é por meio de antidepressivos. Estes são divididos em inúmeras classes, como: Antidepressivos Tricíclicos (ATC), Inibidores de monoaminoxidase (IMAO), Inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS) e Inibidores da recaptação de serotonina e noradrenalina (IRSN), e os antidepressivos atípicos (KATZUNG, 2010).
O mecanismo de ação dos fármacos atualmente utilizados, baseia-se no aumento da disponibilidade de monoaminas. Essa regulação pode ocorrer através de três mecanismos de ação: (1) bloqueio de proteínas pré-sinápticas transportadoras de monoaminas, que removem os transmissores liberados no espaço extracelular, (2) inibição da enzima monoamina oxidase, que degrada os neurotransmissores monoaminas ou (3) interação com receptores pré ou pós-sinápticos que regulam a liberação das monoaminas e/ou a taxa de disparo neuronal (NEMEROFF; OWENS, 2002).
A terapêutica baseada em antidepressivos, apesar de amenizar os sintomas da depressão, possui algumas limitações. Dentre estas, destaca-se a resistência por parte dos pacientes devido a muitos efeitos adversos como sedação, incapacidade física para determinadas atividades, náusea, insônia e perda de peso. Outra restrição quanto ao uso dos antidepressivos, refere-se ao longo período de latência, ou seja, o efeito clínico que o fármaco irá proporcionar ao organismo demora entre duas a quatro semanas. Deste modo, há a necessidade da busca por alternativas para o tratamento da depressão de forma mais rápida e seletiva (CIPRIANI et al., 2009; OTTE et al., 2016).
Nesse intuito, nosso grupo de pesquisa busca evidências de possíveis benefícios terapêuticos de substâncias químicas isoladas, como o (-)-α-bisabolol.
1.5 (-)-α-bisabolol
O (-)-α-bisabolol, também chamado de levomenol, é um álcool sesquiterpênico monocíclico, que foi isolado pela primeira vez em 1951, das flores de Matricaria chamomilla
asteraceae, conhecida popularmente como camomila alemã. Desde então, tem-se estabelecido
que esta substância possui quatro isômeros, como demonstrado na (Figura 2) (KAMATOU; VILJOEN, 2010).
Figura 2: Estereoisômeros do α-bisabolol
Fonte: Kamatou; Viljoen (2010)
Além da Matricaria chamomilla, o (-)-α-bisabolol pode ser isolado, por hidrodestilação, a partir de outras plantas, como Salvia runcinata, uma planta presente no sul da África, a Salvia
stenophylla, Vanillosmopsis sp e Myoporum grassifolium. Outra fonte menos explorada, mas
que contém cerca de 85% da substância, é a Eremanthus erythropappus (DE SOUZA et al., 2008).
O (-)-α-bisabolol, o isômero que possui mais atividade biológica, é uma substância de baixo peso molecular, bastante lipofílica e propenso à oxidação, sendo seus produtos de oxidação: o bisabolol óxido A e óxido B (WALECZEK et al., 2003). Devido a sua baixa toxicidade, a Food and Drug Administration (FDA) concedeu segurança a esse composto, promovendo sua utilização como ingrediente ativo em vários produtos (KAMATOU; VILJOEN, 2010).
A utilização do (-)-α-bisabolol é bastante explorada na indústria de cosméticos, como princípio ativo em loções de corpo, desodorantes, produtos para bebês e outros produtos de higiene pessoal. As principais aplicações no setor farmacêutico têm sido relacionada às suas propriedades anti-inflamatórias, não alergênicas, antibacterianas e anti-irritantes (KAMATOU; VILJOEN, 2010; SEKI et al., 2011).
Por ser um composto lipofílico, o (-)-α-bisabolol é pouco solúvel nos fluidos biológicos, entretanto, possui potencial de atravessar a barreira hematoencefálica (BHE), (PIOCHON et
25
al., 2009) o que justifica o trabalho de Tabahari e Tehrani (2017), no qual estudaram o potencial ansiolítico do (-)-α-bisabolol em um modelo agudo com camundongos Swiss.
Em seu estudo de 2019, Fernandes et al., utilizaram um modelo de isquemia cerebral em camundongos Swiss, e verificou que o (-)-α-bisabolol possui ação neuroprotetora, diminuindo a degeneração neuronal e melhorando os déficits de memória, além de ter evitado também astrogliose nas áreas do córtex temporal e no estriado.
Nosso grupo mostrou que o (-)-α-bisabolol foi capaz de reduzir lesões associadas à administração de etanol, demonstrando uma gastroproteção. Além disso, verificou-se que a substância foi capaz de diminuir o estresse oxidativo e o evento inflamatório causado pelo etanol (ROCHA et al., 2011).
Até o momento, nenhum trabalho foi realizado associando a atividade do (-)-α-bisabolol com o Sistema Nervoso Central em um modelo de Estresse Crônico Imprevisível, sendo o nosso estudo pioneiro nessa investigação.
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A depressão é uma doença que atinge mais de 300 milhões de pessoas no mundo e é uma das principais causas de incapacitação devido aos seus sintomas físicos e emocionais (LIM et al., 2018). Fatores genéticos, ambientais, hipóteses neuroendócrina e inflamatória, buscam justificar a causa para a depressão a fim de elucidar alternativas terapêuticas para o tratamento, melhorando a qualidade de vida dos pacientes.
Uma das hipóteses relacionados aos transtornos de ansiedade e depressão é o estresse, em que a perda de pessoas importantes, conflitos sociais, problemas de saúde e/ou no trabalho, contribuem para o estresse crônico e o desenvolvimento dessas doenças (NORMANDEAU et al., 2018). Além disso, foi evidenciado que pacientes com depressão apresentavam níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias nos fluidos séricos e cerebrais, demonstrando uma possível relação entre depressão, estresse e inflamação (BAUER; TEIXEIRA, 2019).
A utilização de modelos animais para indução ao comportamento depressivo é uma forma de explorar as causas da depressão, e o modelo do estresse crônico imprevisível (ECI) possibilita investigar se o estresse ambiental é capaz de desenvolver o comportamento da doença, assim como mimetizar o que ocorre com o ser humano.
A investigação de novos alvos farmacológicos para o tratamento da depressão baseia na visão simplista da hipótese monoaminérgica, visto que já foram demonstrados que os antidepressivos utilizados causam alto período de latência e efeitos adversos, gerando resistência ao tratamento. Assim, torna-se necessário explorar o potencial de novos compostos que apresentem outras atividades biológicas e possuam potencial para serem elencados como antidepressivos.
O (-)-α-bisabolol surge nesse cenário como um potencial composto para ser estudado no SNC, devido à sua alta natureza lipofílica e possibilidade de atravessar a BHE, por possuir propriedades farmacológicas antioxidante e anti-inflamatória, justificando o interesse na investigação da atividade antidepressiva (KAMATOU; VILJOEN, 2010). Dessa forma, as evidências cada vez mais fortes sobre o papel da inflamação na depressão sugerem a relevância do estudo de substâncias que atuem além do aumento dos níveis de monoaminas e possam apresentar efeito neuroprotetor. Assim, o presente trabalho é inédito quanto à avaliação do (-)-α-bisabolol como uma alternativa promissora para o tratamento de distúrbios depressivos.
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3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito antidepressivo do (-)-α-bisabolol em camundongos C57BL/6 submetidos a um modelo de estresse crônico imprevisível.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar o efeito do (-)-α-bisabolol em camundongos submetidos ao estresse crônico imprevisível, nos seguintes parâmetros:
Efeito antidepressivo, por meio dos testes do nado forçado, suspensão da cauda e preferência pela solução de sacarose;
Efeito ansiolítico, por meio dos testes do Labirinto em cruz elevado e placa perfurada; Efeito na memória de trabalho, por meio do teste do labirinto em Y ou Y-maze;
Atividade exploratória e locomotora por meio do teste do campo aberto;
Efeito antioxidante, por meio da mensuração de parâmetros do estresse oxidativo (malondialdeído, glutationa reduzida e nitrito/nitrato) no hipocampo e córtex pré-frontal;
Efeito anti-inflamatório, por meio da determinação dos níveis de IL-1β e TNF-α no hipocampo e córtex pré-frontal pelo método de ELISA.
4 METODOLOGIA 4.1 Animais
Foram utilizados camundongos C57BL/6 machos, com peso entre 20-25g, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e Farmacologia (DFF) da Universidade Federal do Ceará (UFC). Os mesmos foram mantidos em ambiente com temperatura controlada (22±1°C), com ciclo claro/escuro de doze horas e recebendo água e comida à vontade, exceto nos períodos de estresse para indução de comportamento depressivo.
Ao que se refere aos cuidados com os animais, todos os procedimentos realizados seguiram os princípios éticos de experimentação animal. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Ceará, sob o número de registro: 9361/15022018.
4.2 Drogas
4.2.1 (-)-α-bisabolol
A droga teste foi o (-)-α-bisabolol (BIS) (Sigma®, St. Louis, USA), sendo diluída em 3% de Tween® 80 com solução salina 0,9% e administrada por via oral, durante 14 dias consecutivos. A escolha das doses de BIS, 25mg/kg e 50 mg/kg, foram baseadas em trabalhos científicos anteriores em outros modelos (FERNANDES, 2015; BARRETO et al., 2016).
4.2.2 Fluoxetina
A droga de referência utilizada foi a Fluoxetina (FLU) (Sandoz®), sendo diluída em solução salina 0,9% e administrada por via oral, durante 14 dias consecutivos, na dose de 10mg/kg.
4.3 Indução de depressão por estresse crônico imprevisível
Os camundongos foram submetidos a fatores estressores como descrito por (HE et al., 2016) com adaptações. Cada fator estressante foi aplicado de forma aleatória a cada semana, durante 28 dias, para que o procedimento fosse de forma imprevisível. Os fatores estressores foram aplicados conforme o cronograma abaixo:
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Quadro 1. Estímulos estressores para indução do comportamento depressivo por estresse crônico imprevisível (HE et al., 2016) com adaptações
Fonte: Autoria própria.
4.4 Desenho experimental
Para estes experimentos os grupos, contendo em média 8 animais, foram divididos conforme abaixo:
Figura 3: Grupos Experimentais
Fonte: Autoria própria.
- Grupo saudável com veículo: animais foram mantidos na caixa sem nenhum fator estressante durante 4 semanas e administração de solução salina 0,9% com 3% de Tween 80 por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.
- Grupo saudável com Fluoxetina os animais foram mantidos na caixa sem nenhum fator estressante durante 4 semanas e administração de Fluoxetina (10mg/kg), por via oral (v.o.), através de gavagem, entre o 15º ao 28º dia.
ESTIMULO ESTRESSOR Tempo
Ciclo intermitente entre luzes acesas e apagadas 18 horas
Presença de maravalha molhada 18 horas
Ciclo escuro 24 horas
Ciclo claro 24 horas
Restrição do animal em tubo plástico 2 horas
Exposição do camundongo a um predador (rato) separando-os por uma
grade de ferro. 8 minutos
- Grupo saudável com alfa-bisabolol: os animais foram mantidos na caixa sem nenhum fator estressante durante 4 semanas e administração de (-)-α-bisabolol 50mg/kg, por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.
- Grupo estresse crônico imprevisível: animais foram submetidos a fatores estressores durante 28 dias e administração de solução salina 0,9% com 3% de Tween® 80 por via oral através de gavagem (v.o.) entre o 15º ao 28º dia.
- Grupos tratados com (-)-α-bisabolol: animais foram submetidos a fatores estressores durante 28 dias e administração de (-)-α-bisabolol (25 ou 50mg/kg) por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.
- Grupo tratado com Fluoxetina: animais foram submetidos a fatores estressores durante 28 dias e a uma administração diária de Fluoxetina (10mg/kg) por via oral (v.o.) através de gavagem entre o 15º ao 28º dia.
O protocolo experimental iniciou após 7 dias de adaptação dos animais ao ambiente do biotério. Em seguida, durante 28 dias os animais foram submetidos a diferentes estressores, de forma aleatória e imprevisível. No 14º dia, antes de iniciar a etapa de tratamento, os animais foram submetidos ao Teste do Nado Forçado (TNF), visto que é um teste preditivo para avaliar o comportamento depressivo nos animais, para verificar a eficácia do protocolo. No 15º dia, iniciou-se o tratamento de todos os grupos experimentais. No último dia (28º) os animais foram submetidos novamente ao TNF para verificar a reversão do comportamento após o tratamento, e 24h após o teste do nado forçado, os animais foram submetidos aos demais testes comportamentais (Figura 4).
Posteriormente, os animais foram eutanasiados por decapitação e tiveram os encéfalos rapidamente retirados e colocados sobre papel alumínio numa placa de Petri com gelo para dissecação do hipocampo (HP) e córtex pré-frontal (CPF). Ao final da dissecação, as áreas foram colocadas em microtubos de plásticos devidamente identificados, pesados e conservados a -80°C para o uso posterior. Os detalhes do delineamento experimental estão representados no fluxograma a seguir:
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Figura 4: Fluxograma do protocolo experimental
Fonte: Autoria própria.
4.5 Testes comportamentais
4.5.1 Avaliação da Atividade Exploratória e Locomoção
4.5.1.1 Teste do Campo Aberto
O campo aberto para camundongos é feito de acrílico (paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x 15 cm) dividido em 9 quadrantes iguais (Figura 5). Nesse teste é avaliado a atividade exploratória do animal registrado durante um tempo de 5 minutos, após 1 minuto de habituação. Foram avaliados os seguintes parâmetros: número de cruzamentos (crossing) e número de levantamentos verticais (rearings). O teste foi realizado em uma sala com som atenuado, temperatura e iluminação adequada (ARCHER, 1973).
Figura 5: Teste do Campo Aberto
Fonte: Autoria própria.
4.5.2 Avaliação do Fenótipo Depressivo
4.5.2.1 Teste do Nado Forçado
O procedimento experimental consiste em colocar os animais individualmente em cilindros de acrílico (altura: 35 cm; diâmetro: 24 cm), contendo 13,5 cm de água, por um período de 5 min (Figura 6). O teste do nado forçado avalia o tempo de imobilidade do animal, considerando este parâmetro quando o animal faz apenas os movimentos mínimos para manter a cabeça fora da água (PORSOLT; BERTIN; JALFRE, 1977).
Figura 6: Teste do nado forçado – TNF
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4.5.2.2 Teste da Suspensão de Cauda
O teste da Suspensão pela cauda (TSC) avalia o tempo de imobilidade do animal durante uma sessão de 5 minutos. Nesse teste os camundongos ficam suspensos a 50 cm do chão por uma fita fixada a 1 cm a partir da ponta da cauda (Figura 7) (STERU, 1985).
Figura 7: Teste de Suspensão da Cauda
Fonte: Autoria própria.
4.5.2.3 Teste de Preferência pela solução de sacarose
Para a avaliação do comportamento do tipo anedonia, foi realizado o teste de preferência por sacarose (NI et al., 2018). Os camundongos passaram inicialmente por uma fase de adaptação, que consistiu em submeter os animais à duas garrafas de solução de sacarose a 2% durante 24h, seguido pela substituição de uma das garrafas por água por mais 24h. Após a adaptação, todos os animais foram privados de água e comida por 18h. Após o período de jejum, os animais foram inseridos em gaiolas individuais e expostos à duas garrafas, uma contendo 2% de solução de sacarose e água na outra (o volume previamente mensurado). O teste durou 3h, e após esse tempo, os volumes de solução de sacarose e água consumida foram registrados (Figura 8). A preferência pela sacarose foi calculada como a quantidade de solução de sacarose consumida como uma porcentagem da quantidade total de ingestão de líquido, seguindo a seguinte fórmula:
Figura 8: Teste de preferência pela solução de sacarose
Fonte: Autoria própria.
4.5.3 Avaliação da Atividade Ansiolítica
4.5.3.1 Teste do Labirinto em Cruz Elevado
O Labirinto em Cruz Elevado (LCE) consiste em um aparato de madeira elevado a uma altura de 45 cm do nível do chão composto de dois braços abertos e fechados (30 x 5 x 25 cm) opostos entre si, em forma de cruz (Figura 9). Os braços abertos e fechados estão conectados por uma plataforma central (5 x 5 cm). A plataforma e as paredes laterais dos braços fechados são confeccionadas em acrílico transparente e o chão em acrílico preto. Neste teste os
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camundongos foram colocados no centro do aparato com a cabeça voltada para um dos braços fechados e o seu comportamento observado por 5 min (LISTER, 1987).
As medidas comportamentais registradas no LCE foram: número de entradas nos braços abertos (NEBA), tempo de permanência nos braços abertos (TPBA), número de entradas nos braços fechados (NEBF) e tempo de permanência nos braços fechados (TPBF), e a partir dessas informações, são medidos os percentuais do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) e do número de entradas nos braços abertos (PEBA), entretanto, o intuito é verificar os registros nos braços abertos, visto que está relacionado com o comportamento do tipo ansioso.
Os parâmetros de PTBA e PEBA foram analisados no teste estatístico a partir da fórmula expressa no Quadro 2. A premissa destes parâmetros demonstra que os animais que possuem comportamento do tipo ansioso irão passar menos tempo nos braços abertos, assim como haverá menos números de entrada.
Quadro 2. Cálculo dos parâmetros PEBA e PTBA no LCE
Cálculo do PEBA e PTBA
% número de entradas nos braços abertos (PEBA)
% tempo de permanência nos braços abertos (PTBA)
𝑷𝑬𝑩𝑨 = 𝑵𝑬𝑩𝑨 𝒙 𝟏𝟎𝟎
(𝑵𝑬𝑩𝑨 + 𝑵𝑬𝑩𝑭) 𝑃𝑇𝐵𝐴 =
𝑇𝑃𝐵𝐴 𝑥 100 (𝑇𝑃𝐵𝐴 + 𝑇𝑃𝐵𝐹) Fonte: Autoria própria
Figura 9: Teste do Labirinto em cruz elevado (LCE)
4.5.3.2 Teste da Placa Perfurada
O teste da placa perfurada, utilizado para avaliar o comportamento exploratório em camundongos foi o proposto por File e Wardill (1975). O aparato utilizado foi um Ugo Basile® de 20 x 20 cm com 16 orifícios espaçados uniformemente (Figura 10). O parâmetro analisado foi o número de vezes que o animal colocou a cabeça nos orifícios (head dips) durante o período de 5 minutos. Os animais, um por vez, são colocados na plataforma. A contagem do número de
head dips foi realizada por observação comportamental.
Figura 10: Teste da placa perfurada
Fonte: Autoria própria.
4.5.4 Avaliação da memória de curto prazo
4.5.4.1 Teste do labirinto em Y
Este teste avalia a memória a curto prazo, também denominada de memória de trabalho. O labirinto em Y é composto por 3 braços de madeira com 16 cm de altura, 5 cm de largura e 40 cm de comprimento (Figura 11). Neste teste, o animal foi colocado em um dos braços e foi feito a contagem de alternâncias corretas, ao entrar nos braços, durante 8 (oito) minutos (LALONDE, 2002).
Neste teste, o animal foi colocado em um dos braço e foram registradas todas as entradas. O intuito do teste é verificar se o animal, ao entrar em um dos braços, relembrar-se-á do braço previamente explorado. Os dados foram expressos como a razão entre as alternâncias
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corretas e o número de visitas realizadas durante o período de observação, sendo o resultado multiplicado por 100.
Figura 11: Teste do labirinto em Y ou Y-maze
Fonte: Autoria própria
4.6 Testes Neuroquímicos
Após os testes comportamentais, os animais foram eutanasiados por guilhotina, e o cérebro foi retirado para a dissecação das áreas cerebrais, hipocampo e córtex pré-frontal, para realizar os testes neuroquímicos.
4.6.1 Determinação de Parâmetros de Estresse Oxidativo
4.6.1.1 Avaliação do grau de lipoperoxidação
O grau de lipoperoxidação nas áreas cerebrais foi medido através da determinação dos níveis de malonldialdeído (MDA) (DRAPER, 1990) seguindo o protocolo a seguir. Foram preparados os homogenatos das áreas cerebrais a 10% em tampão fosfato de potássio monobásico, 50 mM, pH 7,4 e 63μL destes foram adicionados a 100 μL de ácido perclórico 35% em tubos eppendorf, que foram centrifugados a 10000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Em seguida 150 μL do sobrenadante foram adicionados a 50 μL de ácido tiobarbitúrico 1,2%, que
ficaram em banho-maria a 95ºC por 30 minutos. Por fim, 150 μL da mistura foram adicionados aos poços da placa de ELISA e, posteriormente, foi feita a leitura a 535nm. Os resultados foram expressos em μg de MDA/g de tecido.
4.6.1.2 Determinação das concentrações de Nitrito/Nitrato
Para a dosagem dos níveis de nitrito/nitrato, 100 μL do Reagente de Griess (ácido fosfórico 5%, sulfonilamida 1% em ácido fosfórico 5%, NEED 0,1% e água destilada) foram adicionados a 100 μL do sobrenadante do homogenato e incubados a temperatura ambiente por 10 min (GREEN et al., 1982) A curva padrão foi elaborada com várias concentrações de NaNO2
(variando de 0,75 a 100 mM) sob as mesmas condições. Os brancos foram preparados pela adição de 100 μL do Reagente de Griess a 100 μL do tampão usado para o homogenato (fosfato de potássio monobásico 50 mM, pH 7,4). A absorbância foi medida em leitor de microplacas em 540 nm, e o resultado expresso em μmol de nitrito/g de tecido.
4.6.1.3 Determinação das concentrações de Glutationa Reduzida (GSH)
Os níveis de GSH foram avaliados para estimar defesas endógenas contra o estresse oxidativo. O método é baseado na reação de reagente de Ellman (DTNB), com grupos tiol livres. As áreas do cérebro foram diluídas em tampão de 0,02 M de EDTA (10% p/v) e adicionadas a uma solução de ácido tricloroacético a 50%. Após centrifugação (3000 rpm/15 min), o sobrenadante foi recolhido. As amostras foram misturadas com 0,4 M de tampão tris-HCl, pH 8,9 e 0,01 M de DTNB. Níveis de GSH foram determinados por espectrofotometria a 412 nm, calculada com base numa curva padrão de glutationa e expressos como µg de GSH/g de tecido úmido (SEDLAK; LINDSAY, 1968).
4.6.2 Mensuração das concentrações de IL-1β e TNF-α
As áreas cerebrais dissecadas foram homogeneizadas em 8 volumes de tampão PBS com protease (EMD Biosciences®), fosfatase (Sigma®-Aldrich), para posteriormente serem centrifugadas (10000 rpm, 5 min) e utilizando sobrenadante da diluição. A concentração das citocinas, em 50 μL de amostras, foi determinada por ELISA (R&D® Systems, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante e expressa em pg/g de tecido.
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4.7 Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada através do software GraphPad Prism versão 6.0 para Windows (GraphPad Software®, San Diego Califórnia EUA). Inicialmente, os resultados foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk, para verificar a normalidade da amostra.
Para a comparação entre duas variáveis, foi utilizado o teste T de Student (resultados paramétricos) ou teste de Mann-Whitney (não paramétricos). Para os testes com mais de três grupos, foi utilizado o teste de análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey (post
hoc) para resultados paramétricos ou Kruskall-Walis seguido do teste de Dunn’s (post hoc) para
os não paramétricos.
Em todas as análises estatísticas, os valores foram representados pela Média ± Erro Padrão da Média (EPM) com valores significativos quando p<0,05.
5 RESULTADOS
5.1 Avaliação Comportamental
5.1.1 Efeito da administração de (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) sobre a atividade locomotora e exploratória (Teste do Campo Aberto) em camundongos submetidos a um modelo de ECI.
Os resultados obtidos no teste do campo aberto, mostraram que não houve nenhuma diferença significativa entre os grupos tratados com BIS 25, BIS 50 ou FLU, nem no grupo ECI quando comparados ao grupo controle nos parâmetros avaliados: número de cruzamentos ou
crossing (CONTROLE: 52,63 ± 6,279; ECI: 59,00 ± 7,119; ECI + BIS25: 60,50 ± 6,092; ECI
+ BIS50: 67,75 ± 5,845; ECI + FLU: 59,75 ± 4,589, P<0,05) (Figura 12A) e número de rearings (CONTROLE: 8,857 ± 1,682. ECI: 3,750 ± 0,7962; ECI + BIS25: 3,500 ± 0,9820; ECI + BIS50: 6,50 ± 1,899; ECI + FLU: 4,00 ± 0,9636) (Figura 12B).
Figura 12: Efeito do (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) na atividade locomotora e exploratória de camundongos submetidos ao modelo de ECI no teste do Campo Aberto.
Os animais (n=6-8 animais/grupo) foram tratados com (-)-α-bisabolol (25 e 50mg/kg) ou Fluoxetina (10mg/kg) durante 14 dias, sendo o número de cruzamentos (A), e rearings (B) avaliados por 5 minutos, 28 dias dias após o modelo de Estresse Crônico Imprevisível. Os valores estão representados como média ± EPM. O teste utilizado foi o Kruskal-Wallis, seguido do teste post hoc de Dunn’s para comparações múltiplas. Abreviações: CONT: Controle, ECI: Estresse Crônico Imprevisível, BIS 25: (-)-α-bisabolol 25mg/kg, BIS 50: (-(-)-α-bisabolol 50mg/kg, FLU: Fluoxetina 10mg/kg.
N ú m e r o d e C r u z a m e n t o s CO NT RO LE CO NT + B IS5 0 CO NT + F LU EC I EC I + BIS 25 EC I + BIS 50 EC I + FL U 0 2 0 4 0 6 0 8 0 A N ú m e r o d e R e a r in g s CO NT RO LE CO NT + B IS5 0 CO NT + F LU EC I EC I + B IS2 5 EC I + BIS 50 EC I + FL U 0 5 1 0 1 5 B
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5.1.2 Efeito do modelo de Estresse Crônico Imprevisível sobre o tempo de imobilidade (Teste do Nado Forçado)
Para verificar o tempo de imobilidade dos animais submetidos ao modelo de ECI, foi realizado o teste do nado forçado no 14º e no 28º dia, para comprovação do modelo quanto à indução do comportamento depressivo-símile. No 14º dia, como demonstrado na Figura 13A o grupo ECI apresentou um aumento significativo no tempo de imobilidade em relação ao controle. (ECI: 71,67 ± 13,25; CONTROLE: 14,00 ± 7,759, P<0,05). E no 28º dia, o grupo ECI também apresentou um aumento significativo em relação ao controle (ECI: 130,4 ± 12,06; CONTROLE: 48,88 ± 12,15, P < 0,05) (Figura 13).
Figura 13: Efeito do modelo de Estresse Crônico Imprevisível de 14 dias e 28 dias, sobre o tempo de imobilidade no teste do Nado Forçado
Os animais (n=6-8 animais/grupo) foram submetidos a diversos estressores imprevisíveis durante 14 dias (A), e 28 dias (B). No 14º e 28º dias foram submetidos ao teste do Nado Forçado para verificar o tempo de imobilidade (s) durante 5 minutos. Os valores estão representados como média ± EPM.
#p<0,05 vs CONTROLE (Teste Mann-Whitney). ###p<0,001 vs CONTROLE (Teste T). Abreviações:
CONT: Controle, ECI: Estresse Crônico Imprevisível, BIS 25: bisabolol 25mg/kg, BIS 50: (-)-α-bisabolol 50mg/kg, FLU: Fluoxetina 10mg/kg.
1 4 d ia s t e m p o d e i m o b il id a d e ( s ) CO NT RO LE EC I 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 # A 2 8 d ia s t e m p o d e i m o b il id a d e ( s ) CO NT RO LE EC I 0 5 0 1 0 0 1 5 0 # # # B
