UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE EDUCAÇÃO FÍSICA E ESPORTE
JOSÉ BIANCO NASCIMENTO MOREIRA
Efeitos do treinamento físico aeróbio em alta intensidade na musculatura esquelética de ratos infartados
SÃO PAULO 2012
JOSÉ BIANCO NASCIMENTO MOREIRA
Efeitos do treinamento físico aeróbio em alta intensidade na musculatura esquelética de ratos infartados
Dissertação apresentada à Comissão de Pós-Graduação da Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Educação Física.
Área de concentração: Biodinâmica do Movimento Humano.
Orientadora: Profª. Drª. Patricia Chakur Brum
SÃO PAULO 2012
Nome: MOREIRA, José Bianco Nascimento
Título: Efeitos do treinamento físico aeróbio em alta intensidade na musculatura esquelética de ratos infartados
Dissertação apresentada à Comissão de Pós-Graduação da Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Educação Física.
Aprovado em: Banca Examinadora Prof. Dr. Instituição: Julgamento: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Julgamento: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Julgamento: Assinatura:
Dedico este trabalho a três pessoas fundamentais em todos os meus passos:
À Camila, minha esposa e companheira de todas as horas, por todo amor e carinho. Agradeço pela compreensão nos finais de semana que passei trabalhando e pelas madrugadas com a luz acesa. Tenha a certeza de que tudo isso valerá a pena e que todos os nossos planos se concretizarão num futuro muito breve. Eu te amo!
Aos meus pais, José Maria e Maria Célia, pelo amor, carinho e incentivo desde o primeiro dia de minha vida.
AGRADECIMENTOS
À Patricia Brum, por seu papel essencial no meu crescimento profissional, por seu profissionalismo e pelas conversas que tivemos, científicas ou não. Agradeço também pelo suco com uvas dentro, oferecido durante as reuniões.
Aos meus irmãos Marcelo e Matheus.
Aos meus grandes amigos José Braga, Fabiola, Arthur e Bernardo.
À minha avó Juracy e aos meus padrinhos Ilza e Sirley pelo amor e suporte incondicionais.
A todos os meus tios, tias e primos pela torcida por meu sucesso e pelo apoio de todas as horas.
À minha segunda família, Elza, Dimas e Carol pelo carinho e consideração.
Aos meus colegas de laboratório, Luiz Bozi, Luiz Bechara, Vanessa, Aline, Paulo, Dani, Telma, Nathalie, Chris, Julio, Juliane, Katia, Max e Fabi, pela colaboração, pelas piadas, pelos finais de semana e madrugadas trabalhando.
Aos professores Paulo Ramires, Edilamar e seus alunos.
Aos técnicos Alex, Ney, Marcele, Katt, Luciano e Glória, pelo trabalho essencial no desenvolvimento de todos os projetos do laboratório.
À secretaria de Pós-Graduação da Escola de Educação Física e Esporte da USP, especialmente à Ilza, ao Marcio e ao Paulo, pela eficiência e prontidão nos esclarecimentos relacionados ao Programa de Mestrado.
Aos meus mais novos amigos e colegas de trabalho, Natale e Gustavo, por todo suporte e conselhos.
“You can be wrong on your hypothesis, but you cannot be wrong on your data. And I was not wrong on data”
Eduardo Moacyr Krieger, em palestra proferida na reunião anual da Federação das Sociedades Brasileiras de Biologia Experimental (FeSBE, Águas de Lindóia - 2010)
RESUMO
MOREIRA, J.B.N. Efeitos do treinamento físico aeróbio em alta intensidade na musculatura esquelética de ratos infartados. 2012. 128 f. Dissertação (Mestrado) – Escola de Educação Física e Esporte, Universidade de São Paulo, São Paulo.
A miopatia esquelética em doenças sistêmicas é um importante preditor de mortalidade e prognóstico em diversas síndromes, incluindo a insuficiência cardíaca. Os danos músculo-esqueléticos em situações de comprometimento cardíaco são descritos pela literatura há décadas, entretanto, nenhum recurso farmacológico proposto até o momento mostrou-se eficiente em reverter esses prejuízos, ressaltando o papel do treinamento físico aeróbio. Apesar dos inegáveis benefícios desta terapia adjuvante no tratamento da insuficiência cardíaca, muito pouco se sabe sobre a intensidade de exercício capaz de otimizar os ganhos promovidos por esta intervenção. Dado isso, nesse estudo avaliamos a eficácia do treinamento físico aeróbio em alta intensidade na musculatura esquelética em ratos submetidos ao infarto do miocárdio, comparando-a com protocolo isocalórico realizado em intensidade moderada. Observamos que os animais infartados apresentaram alterações patológicas na musculatura esquelética, similarmente ao observado em pacientes com IC, como prejuízos em enzimas metabólicas fundamentais, atrofia muscular, perturbação da homeostase redox e ativação do complexo proteassomal 26S. Ambos os protocolos de treinamento físico aeróbio foram capazes de aprimorar substancialmente a capacidade funcional e potência aeróbia máxima nos animais infartados, prevenindo a queda da atividade máxima das enzimas hexoquinase e citrato sintase, restaurando a morfologia da musculatura esquelética e aumentando a distribuição de fibras musculares do tipo I, o que foi acompanhado por melhora do balanço redox e redução da atividade do complexo proteassomal 26S. Apesar do treinamento físico aeróbio em alta intensidade ter proporcionado resultados superiores ao protocolo de intensidade moderada em relação a capacidade funcional dos animais, as adaptações músculo-esqueléticas às diferentes intensidades de TFA apresentaram-se muito semelhantes.
Palavras-chave: infarto do miocárdio, músculo esquelético, treinamento físico, atrofia muscular
ABSTRACT
MOREIRA, J.B.N. Effects of high-intensity aerobic interval training on skeletal muscle of infarcted rats. 2012. 128 f. Dissertação (Mestrado) – Escola de Educação Física e Esporte, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Impaired skeletal muscle performance in systemic diseases is shown to strongly predict mortality and long-term prognosis in a wide variety of syndromes, including heart failure. The clinical picture of skeletal muscle damage in cardiac situations has been described for decades. However, no pharmacological strategy proposed so far was shown to effectively prevent the onset of skeletal myopathy, reinforcing the role of aerobic exercise training in counteracting such phenomenon. Despite the well-known benefits of exercise training in sets of cardiac dysfunction, very little is known about the optimal exercise intensity to elicit maximal outcomes. Therefore, in the present study we compared the effects of high-intensity aerobic exercise training with those of an isocaloric moderate-intensity protocol on skeletal muscle adaptations in infarcted rats. Our data suggest that infarcted rats presented signs of skeletal myopathy resembling those observed in HF patients, such as metabolic enzymes impairment, skeletal muscle atrophy, disrupted redox balance and proteasomal overactivation. Here we show that both high- and moderate-intensity aerobic exercise training were able to substantially increase aerobic capacity in infarcted rats, preventing the decay of citrate synthase and hexokinase maximal activities, reestablishing normal skeletal muscle morphology to a healthy profile and increasing the number of type I muscle fibers. Such outcomes were accompanied by an improved redox balance and reduced proteasomal activity in skeletal muscle. Even though high-intensity aerobic interval training was superior to moderate-intensity in improving functional capacity, the observed adaptations in skeletal muscle were remarkably similar between the protocols. Therefore, our data allow us to conclude that high-intensity and moderate-intensity aerobic exercise training equally prevent skeletal myopathy induced by myocardial infarction in rats.
LISTA DE FIGURAS
Página Figura 1 - Representação esquemática do sistema ubiquitina
proteassoma………. 26 Figura 2 - Representação gráfica dos protocolos de TFA realizados no
presente estudo……… 34 Figura 3 - Linearidade do método de mensuração da atividade máxima da
enzima citrato sintase em homogenato citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B)………. 36 Figura 4 - Linearidade do método de mensuração da atividade máxima da
enzima hexoquinase em homogenato citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B)………. 37 Figura 5 - Linearidade do método de mensuração de glicogênio
intramuscular. Curva padrão de glicose (A), e conteúdo de glicogênio em diferentes quantidades dos músculos sóleo (B) e plantar (C)………... 38 Figura 6 - Inibição da redução de citocromo C pela enzima SOD presente
em lisado citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B)…………..………. 40 Figura 7 - Linearidade do método de mensuração da atividade da enzima
catalase em lisado citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B)………...………. 41 Figura 8 - Fração de encurtamento do ventrículo esquerdo avaliada por
ecocardiograma antes (pré-protocolo) e após (pós-protocolo) oito semanas de protocolo experimental……… 49 Figura 9 - Massa cardíaca (A) e massa cardíaca corrigida pela massa
corporal (B)………. 50 Figura 10 - Distância total percorrida em teste de esforço com cargas
incrementais até a exaustão em esteira rolante antes (pré-protocolo) e após (pós-(pré-protocolo) oito semanas de protocolo experimental……… 52 Figura 11 - Potência aeróbia máxima (A) (VO2máx) e intensidade de
corrida na qual o VO2máx foi atingido (B) (IVO2máx), avaliados por teste de esforço com cargas incrementais até a exaustão em esteira rolante antes (pré-protocolo) e após (pós-protocolo) oito semanas de protocolo experimental…………... 54 Figura 12 - Atividade máxima da enzima citrato sintase nos músculos
Figura 13 - Atividade máxima da enzima hexoquinase nos músculos sóleo
(A) e plantar (B)………... 56
Figura 14 - Conteúdo de glicogênio nos músculos sóleo (A) e plantar (B).. 57 Figura 15 - Massa dos músculos sóleo (A) e plantar (B)……….. 58 Figura 16 - Massa dos músculos sóleo (A) e plantar (B) relativa à massa
corporal………... 59 Figura 17 - Área de secção transversa (AST) das fibras musculares dos
músculos sóleo (A e C) e plantar (B e D)………... 60 Figura 18 - Distribuição dos tipos de fibras musculares nos músculos sóleo
(A) e plantar (B)………... 61 Figura 19 - Atividade máxima da enzima SOD nos músculos sóleo (A) e
plantar (B)……… 62 Figura 20 - Atividade máxima da enzima catalase nos músculos sóleo (A)
e plantar (B)……… 63 Figura 21 - Estado redox da glutationa nos músculos sóleo e
plantar………. 65 Figura 22 - Atividade máxima do complexo proteassomal 26S nos
músculos sóleo (A) e plantar (B)……… 66 Figura 23 - Proteínas ubiquitinadas e oxidadas em lisado citosólico dos
LISTA DE TABELAS
Página Tabela 1 - Parâmetros ecocardiográficos... 47 Tabela 2 - Massa tecidual (pulmões e fígado)... 51
LISTA DE APÊNDICES
Página APÊNDICE A - Distância total percorrida em teste de esforço com cargas
incrementais até a exaustão em esteira rolante em animais saudáveis SHAM ou infartados que apresentaram edema pulmonar 12 semanas após os procedimentos cirúrgicos………... 89 APÊNDICE B - Correlação entre a fração de encurtamento do ventrículo
esquerdo e distância total percorrida em teste de corrida em esteira com carga incremental até a exaustão, quatro (A) e 12 (B) semanas após os procedimentos cirúrgicos………... 90 APÊNDICE C - Correlação entre atividade máxima da enzima citrato
sintase no músculo plantar e distância total percorrida em teste de corrida em esteira com carga incremental………. 91 APÊNDICE D - Correlação entre atividade do complexo proteassomal
26S e massa do músculo
LISTA DE ANEXOS
Página ANEXO A - Dados numéricos referentes à fração de encurtamento
ventricular... 93
ANEXO B - Dados numéricos referentes à tolerância ao esforço físico... 94
ANEXO C - Dados numéricos referentes à massa do músculo sóleo... 95
ANEXO D - Dados numéricos referentes à massa do músculo plantar... 96
ANEXO E - Dados numéricos referentes à massa cardíaca corrigida pela massa corporal... 97
ANEXO F - Dados numéricos referentes à razão massa úmida : massa seca dos pulmões... 98
ANEXO G - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima citrato sintase no músculo sóleo... 99
ANEXO H - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima citrato sintase no músculo plantar... 100
ANEXO I - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima hexoquinase no músculo sóleo... 101
ANEXO J - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima hexoquinase no músculo plantar... 102
ANEXO L - Dados numéricos referentes ao conteúdo de glicogênio no músculo sóleo... 103
ANEXO M - Dados numéricos referentes ao conteúdo de glicogênio no músculo plantar... 104
ANEXO N - Dados numéricos referentes à porcentagem de fibras do tipo I no músculo sóleo... 105
ANEXO O - Dados numéricos referentes à porcentagem de fibras do tipo II no músculo sóleo... 106
ANEXO P - Dados numéricos referentes à porcentagem de fibras do tipo I no músculo plantar... 107
ANEXO Q - Dados numéricos referentes à porcentagem de fibras do tipo II no músculo plantar... 108
ANEXO R - Dados numéricos referentes à área de secção transversa das fibras do tipo I no músculo sóleo... 109
ANEXO S - Dados numéricos referentes à área de secção transversa das fibras do tipo II no músculo sóleo... 110 ANEXO T - Dados numéricos referentes à área de secção transversa das
fibras do tipo I no músculo plantar... 111 ANEXO U - Dados numéricos referentes à área de secção transversa das
fibras do tipo II no músculo plantar... 112 ANEXO V - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima
superóxido dismutase no músculo sóleo... 113 ANEXO X - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima
superóxido dismutase no músculo plantar... 114 ANEXO Z - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima
catalase no músculo sóleo... 115 ANEXO AA - Dados numéricos referentes à atividade máxima da enzima
catalase no músculo plantar... 116 ANEXO AB - Dados numéricos referentes ao conteúdo de glutationa
reduzida no músculo sóleo... 117 ANEXO AC - Dados numéricos referentes ao conteúdo de glutationa oxidada
no músculo sóleo... 118 ANEXO AD - Dados numéricos referentes ao conteúdo de glutationa
reduzida no músculo plantar... 119 ANEXO AE - Dados numéricos referentes ao conteúdo de glutationa oxidada
no músculo plantar... 120 ANEXO AF - Dados numéricos referentes à atividade máxima do complexo
proteassomal 26S no músculo sóleo... 121 ANEXO AG - Dados numéricos referentes à atividade máxima do complexo
proteassomal 26S no músculo plantar... 122 ANEXO AH - Dados numéricos referentes ao conteúdo de proteínas
ubiquitinadas no músculo sóleo... 123 ANEXO AI - Dados numéricos referentes ao conteúdo de proteínas
ubiquitinadas no músculo plantar... 124 ANEXO AJ - Dados numéricos referentes ao conteúdo de proteínas oxidadas
no músculo sóleo... 125 ANEXO AL - Dados numéricos referentes ao conteúdo de proteínas oxidadas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Acetil-CoA Acetil Coenzima A
AMC 7-Amino-4-Methylcoumarina AMP Monofosfato de adenosina
AMPK Proteína cinase ativada por AMP ANOVA Análise de variância
ATP Trifosfato de adenosina
CoA Coenzima A
DC Débito cardíaco
DDFVE Diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo DSFVE Diâmetro sistólico final do ventrículo esquerdo DTNB 5,5’ditio-bis 2 nitrobenzóico
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético FC Frequência cardíaca
FE Fração de encurtamento do ventrículo esquerdo G6PDH Glicose-6 fosfato desidrogenase
GSH Glutationa
GSSG Dissulfeto de glutationa (ou glutationa oxidada) HCl Ácido clorídrico
HRP Horseradish peroxidase IC Insuficiência cardíaca IM Infarto do miocárdio
INF-SED Grupo de animais infartados sedentários
INF-TC Grupo de animais infartados submetidos ao treinamento físico aeróbio contínuo em intensidade moderada INF-TI Grupo de animais infartados submetidos ao treinamento
físico aeróbio intervalado em alta intensidade LLVY Leucina-Leucina-Valina-Tirosina
MgCl2 Cloreto de magnésio
NaCl Cloreto de Sódio
NADP+ Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Reduzido
NYHA New York Heart Association O2- Ânion superóxido
PBS Phosphate buffered saline PCr Fosfato de creatina
PPVED Parede posterior do ventrículo esquerdo em diástole PPVES Parede posterior do ventrículo esquerdo em sístole SHAM Grupo de animais com cirugia fícticia
SIVD Septo inter-ventricular em diástole SIVS Septo inter-ventricular em sístole SOD Superóxido dismutase
SUP Sistema ubiquitina-proteassoma TFA Treinamento físico aeróbio VO2máx Consumo máximo de oxigênio
SUMÁRIO RESUMO ... 7 ABSTRACT ... 8 LISTA DE FIGURAS ... 9 LISTA DE TABELAS ... 11 LISTA DE APÊNDICES ... 12 LISTA DE ANEXOS ... 13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 15
1 INTRODUÇÃO ... 18
2 OBJETIVOS ... 20
2.1 Geral ... 20
2.2 Específicos ... 20
3 REVISÃO DE LITERATURA ... 22
3.1 Prejuízos da musculatura esquelética na insuficiência cardíaca ... 22
3.2 Papel do estresse oxidativo na regulação da estrutura e função musculares ... 23
3.3 Sistema ubiquitina-proteassoma e atrofia muscular ... 25
3.4 Treinamento físico aeróbio na insuficiência cardíaca ... 27
3.5 Treinamento físico aeróbio em alta intensidade na insuficiência cardíaca ... 29
5 MÉTODOS ... 31
5.1 Desenho experimental ... 31
5.2 Modelo animal ... 31
5.3 Função cardíaca ... 32
5.4 Tolerância ao esforço físico ... 32
5.5 Potência aeróbia máxima (VO2máx) ... 33
5.6 Protocolos de treinamento físico aeróbio ... 33
5.7 Coleta dos tecidos ... 34
5.8 Estrutura da musculatura esquelética ... 34
5.9 Avaliação metabólica da musculatura esquelética ... 35
5.9.1 Citrato sintase (EC 2.3.3.1) ... 35
5.9.2 Hexoquinase (EC 2.7.1.1) ... 36
5.10 Balanço redox na musculatura esquelética ... 39
5.10.1 Superóxido dismutase (EC 1.15.1.1) ... 39
5.10.2 Catalase (EC 1.11.1.6) ... 40
5.10.3 Estado redox da glutationa ... 41
5.11 Sistema ubiquitina-proteassoma ... 42
5.11.1 Conteúdo de proteínas oxidadas ... 42
5.11.2 Conteúdo de proteínas ubiquitinadas ... 42
5.11.3 Atividade do complexo proteassomal 26S ... 43
5.12 Análise estatística ... 44 6 RESULTADOS ... 45 6.1 Medidas ecocardiográficas ... 45 6.2 Parâmetros fisiológicos ... 49 6.2.1 Massa corporal ... 49 6.2.2 Massa cardíaca ... 49 6.2.3 Pulmões e fígado ... 50
6.3 Tolerância ao esforço físico ... 51
6.4 Potência aeróbia máxima ... 53
6.5 Avaliação metabólica da musculatura esquelética ... 54
6.5.1 Citrato sintase ... 54
6.5.2 Hexoquinase ... 55
6.5.3 Conteúdo de glicogênio intramuscular ... 56
6.6 Morfologia da musculatura esquelética ... 57
6.6.1 Massa muscular ... 57
6.6.2 Área de secção transversa e distribuição de fibras musculares ... 59
6.7 Estado redox da musculatura esquelética ... 62
6.7.1 Superóxido dismutase ... 62
6.7.2 Catalase ... 63
6.7.3 Estado redox da glutationa ... 63
6.8 Sistema ubiquitina-proteassoma ... 66
7 DISCUSSÃO ... 69
7.1 Variáveis fisiológicas, parâmetros cardiovasculares e capacidade funcional ... 69
8 CONCLUSÃO ... 79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 80
APÊNDICES ... 89
1 INTRODUÇÃO
A crescente incidência de doenças cardiovasculares nas últimas décadas atraiu grande atenção da comunidade científica, dado o grande impacto gerado aos sistemas de saúde pública por estas que são a principal causa de morte na espécie humana (LOPEZ-JARAMILLO, 2008; YAZDANYAR e NEWMAN, 2009). Dentre as principais causas de doenças cardiovasculares destaca-se o infarto do miocárdio (IM), que é caracterizado pelo suprimento insuficiente de sangue ao músculo cardíaco, causando elevação da pressão de enchimento ventricular, morte tecidual e severa disfunção cardíaca, o que pode culminar na instalação do quadro de insuficiência cardíaca (IC) (AMERICA, 2006; ZANNAD et al., 2008).
A repercussão sistêmica da disfunção cardíaca induzida pelo IM pode incidir sobre vários tecidos do organismo, incluindo pulmões, fígado, rins e a musculatura esquelética (SIMKO e SIMKO, 1996; GORDON e VOIPIO-PULKKI, 1997), sendo este último objeto de estudo do presente estudo. A redução crônica do débito cardíaco (DC) observada em situação de isquemia miocárdica compromete a perfusão sanguínea da musculatura apendicular, podendo assim promover importantes alterações morfofuncionais capazes de agravar o prognóstico da doença, uma vez a capacidade funcional dos pacientes depende em grande parte do bom funcionamento do sistema muscular esquelético (CLARK, POOLE-WILSON e COATS, 1996). De fato, foi demonstrado que apesar da respeitável disfunção cardíaca observada em pacientes com IC, os prejuízos sofridos pela musculatura esquelética nesses pacientes apresentam correlação ainda mais forte com a capacidade de realização dos mesmos (LANG et al., 1997).
Considerando tal contexto, ressaltamos o importante papel do treinamento físico aeróbio (TFA) na prevenção e terapêutica dos prejuízos provocados pela IC na musculatura esquelética, uma vez que recursos farmacológicos atualmente disponíveis se mostram incapazes de aprimorar a capacidade de realização de esforço e a potência aeróbia máxima (VO2máx) de pacientes, apesar de melhorarem significativamente a função cardíaca dos mesmos. Já o TFA, embora promova efeitos cardiovasculares em menor magnitude em comparação ao tratamento farmacológico, é altamente eficaz em aprimorar a capacidade funcional e a potência aeróbia máxima em pacientes com IC (FRAGA et al., 2007), sendo
estes os principais indicadores do prognóstico da IC, segundo a New York Heart Association (NYHA).
Apesar de os benefícios cardiovasculares e músculo-esqueléticos do TFA em intensidade moderada estarem bem descritos na literatura, inclusive em trabalhos de nosso grupo (BACURAU et al., 2009; BUENO et al., 2010), relatos recentes sugerem que o TFA em alta intensidade seja capaz de promover efeitos cardiovasculares superiores aos protocolos em intensidade moderada (WISLOFF et al., 2007). Dadas estas considerações, testamos no presente estudo a hipótese de que o TFA em alta intensidade promoveria benefícios superiores na musculatura esquelética em ratos infartados, quando comparado com um protocolo isocalórico realizado em intensidade moderada.
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar os efeitos do TFA em alta intensidade na musculatura de ratos infartados, comparando-os com aqueles promovidos por protocolo isocalórico em intensidade moderada.
2.2 Específicos
Avaliar em ratos saudáveis submetidos a cirurgia fictícia (SHAM) ou infartados (INF), sedentários ou treinados em protocolo de TFA em alta intensidade ou intensidade moderada:
• A função e a estrutura cardíacas; • A tolerância ao esforço físico;
• A potência aeróbia máxima (VO2máx); • A massa dos músculos sóleo e plantar;
• A área de secção transversa das fibras musculares dos músculos sóleo e plantar; • A distribuição dos tipos de fibras musculares nos músculos sóleo e plantar;
• A atividade máxima de enzimas relacionadas aos metabolismos aeróbio e anaeróbio, nos músculos sóleo e plantar;
• O conteúdo de glicogênio intramuscular nos músculos sóleo e plantar; • A atividade máxima de enzimas antioxidantes nos músculos sóleo e plantar; • O estado redox da glutationa nos músculos sóleo e plantar
• A marcação de proteínas para degradação (ubiquitinação) em lisado citosólico dos músculos sóleo e plantar;
• A atividade máxima do complexo proteassomal 26S em lisado citosólico dos músculos sóleo e plantar;
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Prejuízos da musculatura esquelética na insuficiência cardíaca
Apesar de sua origem cardiovascular, a IC pode desencadear um quadro de falência energética em diversos tecidos do organismo, incluindo a musculatura esquelética. Diversos estudos demonstraram que os prejuízos apresentados por este tecido na IC apresentam grande relevância clínica, uma vez que a capacidade funcional de pacientes com IC encontra-se significantemente correlacionada com parâmetros funcionais e morfológicos da musculatura esquelética, sendo esta correlação mais alta do que aquela apresentada entre a função cardíaca e a tolerância ao esforço físico dos mesmos pacientes (HARRINGTON et al., 1997).
Considerando, portanto, a importante contribuição da musculatura apendicular para a capacidade funcional de pacientes com IC, diversos grupos de pesquisa se propuseram a investigar mais afundo os prejuízos promovidos pela IC ao tecido muscular esquelético. Com isso, alterações morfológicas, metabólicas e funcionais foram identificadas em pacientes e/ou modelos experimentais de IC, de forma que nem sempre se manifestam em conjunto.
Do ponto de vista estrutural, foi observada rarefação capilar, redução da porcentagem de fibras do tipo I (lentas e mais resistentes à fadiga) e atrofia muscular, alterações que ocorrem em boa parte de pacientes com IC (CLARK, POOLE-WILSON e COATS, 1996). Considerando esses achados, parte importante do presente estudo consistiu na avaliação morfológica da musculatura esquelética dos animais incluídos no estudo.
Quando nos voltamos ao metabolismo da célula muscular esquelética, encontramos que a IC pode promover prejuízos na capacidade de geração de energia tanto pelo metabolismo aeróbio quanto anaeróbio (METTAUER et al., 2006). Nesse sentido, foi demonstrado que a reserva de fosfato de creatina (PCr) é mais rapidamente utilizada em pacientes com IC do que em indivíduos saudáveis (MASSIE et al., 1987), indicando diminuição da capacidade oxidativa da musculatura esquelética na síndrome, o que é corroborado por outros estudos (MIDDLEKAUFF, 2010). Dado isso, avaliamos também no
presente estudo, indicadores da capacidade metabólica da musculatura esquelética, sendo eles: a atividade máxima da enzima citrato sintase, que é uma das principais enzimas do metabolismo aeróbio; o conteúdo de glicogênio intramuscular, por ser um importante substrato energético durante o exercício aeróbio; a atividade máxima da enzima hexoquinase, enzima-chave do metabolismo anaeróbio.
Em princípio acreditava-se que tais anormalidades fenotípicas apresentadas pela musculatura esquelética na IC deviam-se a baixa perfusão periférica, resultante do baixo DC gerado pelo coração insuficiente. Estudos então demonstraram que aumento do DC durante o esforço por agentes farmacológicos não é suficiente para melhorar a capacidade de realização de exercício físico em pacientes com IC (MASKIN et al., 1983; DREXLER et al., 1989), ao passo que Wiener e colaboradores (WIENER et al., 1986) verificaram baixa atividade de enzimas oxidativas na musculatura esquelética de pacientes com IC com perfusão muscular preservada. Com isso, foi sugerido que a musculatura esquelética de pacientes com IC sofria alterações em mecanismos intrínsecos ao tecido, e não relacionados diretamente ao baixo fluxo sanguíneo (METTAUER et al., 2006). Além disso, a perda de massa magra foi identificada como um importante preditor de mortalidade em pacientes com IC (ANKER et al., 1997). Tais particularidades dos efeitos deletérios da IC na musculatura esquelética reforçam a importância de melhor entender o fenômeno aqui apresentado e desenvolver estratégias terapêuticas que contribuam para prevenção de sua ocorrência.
3.2 Papel do estresse oxidativo na regulação da estrutura e função musculares
Além da estrutura e metabolismo energético, mecanismos intracelulares mostram-se de grande importância para o bom funcionamento contrátil da musculatura esquelética, destacando-se o estresse oxidativo. A alteração do balanço redox na musculatura esquelética no sentido pró-oxidante induz disfunção dos miofilamentos contráteis (ANDRADE et al., 1998) e antecipação da fadiga (KUWAHARA et al., 2010), além de acelerar o processo de atrofia muscular observado no envelhecimento e outras patologias (MULLER et al., 2006). Confirmando esta relação, outros estudos demonstraram que o tratamento com antioxidantes pode atenuar a atrofia e/ou disfunção musculares em diferentes modelos (HAIDARA et al., 2003; MCCLUNG et al., 2007; GUARNIER et al., 2010). Sabe-se também que a disfunção
cardíaca pode induzir alteração do balanço redox na musculatura esquelética em humanos (LINKE et al., 2005) e modelos animais (COIRAULT et al., 2007; KOBA, GAO e SINOWAY, 2009; OHTA et al., 2011), o que pode contribuir para a atrofia e disfunção musculares.
Nesse sentido, grande atenção é voltada à carbonilação/oxidação protéica, dada sua natureza irreversível (NYSTROM, 2005). Acúmulo de proteínas oxidadas foi constatado em diferentes tecidos, incluindo a musculatura esquelética, de modelos animais e humanos com doenças crônico-degenerativas (LEVINE, 2002; COIRAULT et al., 2007; DALLA LIBERA et al., 2010). Sistemas intracelulares de degradação protéica identificam e eliminam proteínas carboniladas (BREUSING et al., 2009), entretanto, caso o acúmulo desses compostos supere a capacidade da célula em degradá-los, agregados citotóxicos são formados induzindo uma série de efeitos deletérios à célula, incluindo a disfunção contrátil em miócitos esqueléticos (COIRAULT et al., 2007).
Uma vez que o balanço redox é determinado pelo equilíbrio entre vias pró- e anti-oxidantes, atenção deve ser dada também aos mecanismos responsáveis pela defesa antioxidante intracelular, que conta com importante ação das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase.
A classe de enzimas superóxido dismutase atua na catalisação da reação de dismutação de ânions superóxido (O2–) em oxigênio e peróxido de hidrogênio, competindo com reações entre O2– e outros alvos intracelulares, promovendo, portanto, importante defesa antioxidante (HASSAN e FRIDOVICH, 1978). Dado isso, sua ausência promove elevação substancial do estresse oxidativo, responsável por efeitos deletérios severos em diversos tecidos (GRZELAK et al., 2009; MAKINO et al., 2011; TREIBER et al., 2011). Na musculatura esquelética, a inativação gênica global de uma das isoformas da enzima SOD acelera a perda de massa muscular ocorrida com o envelhecimento e diminui a atividade locomotora espontânea de camundongos (MULLER et al., 2006). Além disso, a ablação gênica da enzima apenas no músculo esquelético é capaz de reduzir dramaticamente a capacidade de esforço físico dos animais, mesmo sem causar atrofia muscular (KUWAHARA et al., 2010). Resultados semelhantes foram observados em camundongos com inativação condicional de SOD apenas nas fibras musculares do tipo IIB (LUSTGARTEN et al., 2009), confirmando o importante papel da enzima no tecido e sua relação com a capacidade de realização de esforço físico.
Presente em todas as células eucarióticas, a enzima catalase atua na conversão de peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, apresentando, portanto, importante papel antioxidante (LOEW, 1900). A importância sistêmica da enzima é evidenciada pelo aumento da sobrevida de diferentes espécies em que a atividade da catalase foi artificialmente aumentada (MELOV et al., 2000). Foi demonstrado também que a hiper-expressão de catalase mitocondrial atenua os efeitos deletérios do envelhecimento na função e estrutura cardíacas (DAI et al., 2009). A ação protetora da catalase também foi demonstrada no músculo esquelético, uma vez que a injeção de catalase recombinante melhora significantemente a função muscular em modelo animal de distrofia de Duchenne (SELSBY, 2011). Além disso, a administração de catalase exógena promove atenuação dos efeitos deletérios causados pela isquemia seguida de reperfusão da musculatura esquelética (LEE et al., 1987).
Assim, uma vez que o balanço redox da célula muscular esquelética parece possuir papel importante também na miopatia esquelética desencadeada pela IC (OHTA et al., 2011), avaliamos no presente estudo também o perfil do estresse oxidativo na musculatura esquelética de nosso modelo animal.
3.3 Sistema ubiquitina-proteassoma e atrofia muscular
A degradação de proteínas intracelulares possui papel importante para a manutenção da homeostase do organismo, participando em uma série de processos essenciais para o bom funcionamento celular, como, por exemplo, o controle da diferenciação celular, regulação das concentrações enzimáticas e fornecimento de aminoácidos para a gliconeogênese (LECKER et al., 1999). O controle fino desses processos só é possível devido a existência de sistemas proteolíticos altamente conservados nos organismos eucarióticos, sendo eles o sistema lisossomal, o sistema proteolítico dependente de cálcio e o sistema ubiquitina-proteassoma (SUP). Apesar da inegável importância dos dois primeiros sistemas, grande atenção é dada ao último, uma vez que o SUP é responsável por mais de 80% da degradação de proteínas intracelulares (GLICKMAN e CIECHANOVER, 2002).
O SUP atua na degradação seletiva de proteínas oxidadas ou mal-enoveladas, evitando acúmulo destas no ambiente intracelular, sendo este processo de remoção conhecido como controle de qualidade de proteínas (CQP). O sistema de reconhecimento dessas proteínas pelo SUP depende essencialmente dos seguintes componentes: as enzimas conhecidas como “ligases”, a proteína ubiquitina, o complexo proteassomal 26S e ATP (GLICKMAN e CIECHANOVER, 2002). Inicialmente, a enzima denominada E1 é responsável pela ativação da proteína ubiquitina, num processo dependente de ATP (CIECHANOVER et al., 1981). A ubiquitina então ativada é transferida para a enzima E2 (proteína carreadora), que conjuga diversas moléculas de ubiquitina umas as outras (CIECHANOVER et al., 1980). Na sequência, a enzima E3 (proteína ligase) conjuga a sequência de ubiquitinas à proteína alvo, que é reconhecida pelo complexo proteassomal proteassomal 26S e degradada em pequenos peptídeos de 8-12 aminoácidos (GLICKMAN e CIECHANOVER, 2002). Tal processo é ilustrado na figura a seguir:
Figura 1 - Representação esquemática do sistema ubiquitina proteassoma. E1 (proteína ativadora) ativa a ubiquitina (Ub) com gasto de energia. E2 (proteína carreadora) conjuga as ubiquitinas, formando uma cauda de poliubiquitinas. E3 (proteína ligase) liga as ubiquitinas conjugadas à proteína alvo (substrato), que é posteriormente, reconhecida pelo proteassoma 26S e degradada em pequenos peptídeos (liberação). Mono: apenas uma ubiquitina. Multi: cauda com poucas ubiquitinas. Poly: cauda com várias ubiquitinas (Adaptado de (KAISER e HUANG, 2005).
O complexo proteassomal 26S é composto por duas subunidades, sendo elas denominadas 19S e 20S, devido aos seus distintos coeficientes de sedimentação. A porção
19S é responsável pelo reconhecimento da cauda de ubiquitina ligada à proteína alvo, num processo que também demanda energia (ATP). Após reconhecimento e desenovelamento, a proteína passa à subunidade 20S, que conta com três sítios catalíticos que distinguem-se entre si pela especificidade de clivagem após determinados aminoácidos (BAUMEISTER et al., 1998). As características das três subunidades são descritas a seguir:
• Sítio β1 (ou peptidilglutamina): cliva ligações peptídicas após ácido glutâmico; • Sítio β2 (ou tripsina): degrada aminoácidos lisina e arginina próximos ao grupo
C-terminal;
• Sítio β5 (ou quimiotripsina): degrada tirosina, triptofano e fenilalanina próximos ao grupo C-terminal; pode clivar outros aminoácidos, como a leucina, caso permaneça ativo por um longo período;
Estudos das duas últimas décadas demonstram que o SUP é ativado na musculatura esquelética em estados catabólicos, como jejum, denervação e câncer (MITCH e GOLDBERG, 1996). Sabe-se também que a ativação do sistema é necessária para que haja atrofia muscular (BODINE et al., 2001). Acredita-se que este processo atrófico ocorre devido ao desequilíbrio entre os processos de síntese e degradação protéicas, favorecendo o último, com importante participação do SUP (LECKER et al., 2004), ao ponto da inibição deste sistema ser sugerida como terapia contra a miopatia esquelética (BEEHLER et al., 2006; JAMART et al., 2011).
Apesar de bastante estudado em diferentes estados patológicos, muito pouco se sabe sobre a ativação deste sistema na musculatura esquelética em pacientes e/ou modelos experimentais de IC, bem como os efeitos do TFA em diferentes intensidades.
3.4 Treinamento físico aeróbio na insuficiência cardíaca
Até a década de 1980, diversas diretrizes indicavam que o esforço físico deveria ser evitado por pacientes com problemas cardiovasculares (COATS, 2011). A partir de 1985, relatos científicos tratando da intervenção com exercício físico em pacientes com problemas cardíacos começaram a ser publicados, e apesar da precariedade no controle sintomático e
etiológico, bem como nos protocolos de treinamento físico, os primeiros benefícios do TFA em pacientes com IC foram identificados (KELLERMANN, 1987). Resultados como melhora da capacidade de realização de exercício físico, aumento da fração de ejeção ventricular e do fluxo sanguíneo periférico foram relatados (SULLIVAN, HIGGINBOTHAM e COBB, 1988; SULLIVAN, HIGGINBOTHAM e COBB, 1989), entretanto, estudos mais bem controlados, com respectivos grupos controle e controle de intensidade eram necessários a fim de melhor entender as adaptações promovidas pela intervenção.
Dada esta necessidade, iniciaram-se os primeiros estudos clínicos controlados e randomizados, que já consideravam diferentes etiologias de IC, classe funcional, medicamentos utilizados e a intensidade de exercício realizada pelos pacientes (COATS et al., 1990; DAVEY et al., 1992). Esses estudos confirmaram que o TFA de fato era capaz de melhorar as funções, cardíaca e pulmonar, o balanço autonômico e neuro-humoral, bem como importantes parâmetros vasculares periféricos em pacientes com IC, o que culminava na melhora de indicativos de qualidade de vida (ADAMOPOULOS et al., 1993; PIEPOLI et al., 1996; STOLEN et al., 2003). Tais estudos, apesar de apresentarem fortes evidências tratando dos benefícios dos TFA na IC, ainda eram restritos a determinados centros de pesquisa e eram realizados em pequenos grupos populacionais, carecendo, portanto, de suporte científico em relação a eventos mais raros e adversos, como morte súbita, complicações agudas ou do quadro clínico dos pacientes.
No intuito de investigar efeitos mais duradouros e em larga escala populacional, grandes estudos clínicos com recrutamento de centenas de pacientes proveram dados com forte poder epidemiológico. Além de confirmar os achados apresentados pelos estudos supracitados, como aumento do VO2máx, da capacidade de realização de esforço e melhora da função cardíaca, os estudos com grandes populações demonstraram que o TFA é capaz de diminuir o número e a duração de internações por complicações do quadro clínico, bem como reduzir a necessidade de transplantes cardíacos, além de melhorar a classe funcional e aumentar significativamente a sobrevida dos pacientes com IC (AUSTIN et al., 2005; DRACUP et al., 2007; GEROVASILI et al., 2009). Dada a consistência e a relevância clínica desses achados, o treinamento físico passou de não recomendado a componente importante no tratamento da IC.
contribuem para a melhora da capacidade funcional dos indivíduos submetidos ao TFA. Uma vez que o VO2máx é determinado tanto pela oferta sanguínea pelo DC, quanto pela capacidade da musculatura esquelética em extrair oxigênio e nutrientes do sangue ofertado (equação de Fick1), verificou-se que, além dos benefícios cardiovasculares, as adaptações da musculatura esquelética contribuem em grande parte para o aprimoramento da tolerância ao esforço em pacientes e modelos experimentais de IC submetidos ao TFA. Dentre essas adaptações destacam-se aumento da atividade de enzimas oxidativas (STRATTON et al., 1994), melhora do transiente de cálcio intracelular (BUENO et al., 2010), prevenção da atrofia muscular e aumento da porcentagem de fibras do tipo I (BACURAU et al., 2009), o que culmina em melhora do perfil metabólico e funcional do tecido muscular esquelético, contribuindo assim para aumento do VO2máx e da tolerância ao esforço físico (KEMI et al., 2007).
3.5 Treinamento físico aeróbio em alta intensidade na insuficiência cardíaca
Apesar dos benefícios cardiovasculares e músculo-esqueléticos promovidos pelo TFA estarem bem descritos na literatura, muita discussão ainda existe em relação a intensidade de exercício capaz de desencadear os melhores resultados sem expor o paciente a grandes riscos cardiovasculares. De fato, a vasta maioria dos estudos observaram resultados muito interessantes após protocolos de TFA em intensidade moderada (50-70% do VO2máx ou FCmáx), em conjunto com baixa incidência de eventos cardiovasculares agudos desencadeados pelo exercício físico, fazendo com que a diretriz atual do Colégio Americano de Medicina do Esporte (ACSM, (1998)) proponha que tal modalidade seja a mais indicada para pacientes com IC. Apesar disso, estudos recentes demonstram resultados promissores do treinamento físico realizado em alta intensidade, em modelos animais e humanos, saudáveis ou com acometimentos cardiovasculares.
Sabe-se que a partir de certa intensidade de esforço o metabolismo anaeróbio passa a ser mais requisitado, e devido a baixa capacidade desse sistema em manter a produção
1 VO2máx=DC x dif. a-vO2. A equação de Fick representa os fatores cardiovasculares centrais e periféricos que determinam a potência aeróbia máxima (VO2máx), sendo eles: o
energética por longos períodos, atividades em altas intensidades não podem ser mantidas por muito tempo. Assim, os protocolos de TFA em alta intensidade aqui apresentados foram realizados de maneira intermitente (ou intervalada), ou seja, períodos de exercício em alta intensidade, muitas vezes em intensidade superior ao limiar de lactato, seguido de períodos de recuperação em menores intensidades, garantindo a continuidade da execução.
Gibala e colaboradores. (GIBALA et al., 2006) demonstraram que apenas seis sessões de treinamento intervalado em alta intensidade (com intervalos acima de 90% do VO2pico) foram capazes de aumentar o tempo até a exaustão de indivíduos jovens e saudáveis, em mesma intensidade absoluta, o que não foi observado após seis sessões de treinamento contínuo em intensidade moderada (65% do VO2pico), com carga total de trabalho equalizada. Não se limitando a indivíduos saudáveis, foi demonstrada a superioridade do treinamento em alta intensidade em pacientes com doença da artéria coronária, que apresentaram maior potência aeróbia quando comparados com o grupo que realizou treinamento em intensidade moderada. Além do VO2pico, parâmetros cardiovasculares também melhoraram em maior magnitude no grupo de pacientes submetidos ao protocolo de TFA em alta intensidade (ROGNMO et al., 2004). De forma semelhante, pacientes com IC foram submetidos a protocolos de TFA moderado (60-65% do VO2pico) ou em alta intensidade (picos a 85-90% do VO2pico), e os resultados foram comparados. O grupo treinado em alta intensidade apresentou maior potência aeróbia e melhor função ventricular e endotelial quando comparado com o grupo treinado em intensidade moderada (WISLOFF et al., 2007). Os achados não foram relatados apenas em pacientes com acometimentos cardiovasculares. Indivíduos com síndrome metabólica também foram submetidos a diferentes protocolos de treinamento com carga total equalizada e aqueles que realizaram TFA intervalado em alta intensidade também apresentaram resultados superiores (TJONNA et al., 2008).
Considerando esses achados, a hipótese do presente trabalho foi de que o TFA intervalado em alta intensidade promoveria efeitos superiores ao protocolo contínuo em intensidade moderada, na musculatura esquelética em ratos infartados.
5 MÉTODOS
5.1 Desenho experimental
Ratos Wistar machos com oito semanas de idade (250-300g) foram aleatoriamente divididos entre os grupos: infartado (INF) ou saudável (SHAM). Nesse momento, os animais foram submetidos à cirurgia de indução de IM ou cirurgia fictícia (SHAM). Quatros semanas após os procedimentos cirúrgicos, os ratos infartados foram alocados dentre os grupos: infartado sedentário (INF-SED), infartado submetido ao TFA contínuo em intensidade moderada TC) ou infartado submetido ao TFA intervalado em alta intensidade (INF-TI). Neste ponto temporal (4 semanas pós-cirurgia), os três grupos infartados foram divididos de forma que a função cardíaca e demais parâmetros fisiológicos fossem similares entre os mesmos. Oito semanas após o início dos protocolos de TFA, todos os animais foram sacrificados e estudados (doze semanas após os procedimentos cirúrgicos). Os animais receberam ração padrão e água ad libitum, e foram mantidos em biotério com temperatura controlada (22-25ºC) e ciclo claro-escuro invertido (12 horas). Todos os experimentos propostos para o presente estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo.
5.2 Modelo animal
Utilizamos no presente estudo modelo animal de IM induzido por ligadura da artéria coronária descendente anterior (JOHNS e OLSON, 1954). Os animais foram anestesiados com uma mistura de xilazina (10mg/kg, ip) e quetamina (50mg/kg, ip), entubados e artificialmente ventilados (70 pulsos/minuto; 2,5 mL/pulso). Na sequência foi realizada incisão torácica e ligadura da artéria coronária. Ao final do procedimento o tórax foi fechado e os gases remanescentes em seu interior retirados para reestabelecimento do diferencial pressórico de gases, permitindo a respiração natural dos animais. Os animais do grupo SHAM foram submetidos a procedimento cirúrgico de mesma duração, mimetizando o
estresse cirúrgico. As avaliações in vivo foram iniciadas quatro semanas após os procedimentos cirúrgicos. O sacrifício dos animais foi realizado 12 semanas após as cirurgias, os tecidos foram dissecados e estudados de acordo com os objetivos específicos do presente projeto.
5.3 Função cardíaca
A avaliação da função cardíaca foi avaliada por ecocardiograma em modo M, quatro e doze semanas após os procedimentos cirúrgicos. Os exames foram realizados em colaboração com o Instituto do Coração da Universidade de São Paulo. Os ratos foram anestesiados com uma mistura de xilazina (10mg/kg, ip) e quetamina (50mg/kg, ip), colocados em posição supina e submetidos a tricotomia do tórax. As dimensões cardíacas foram mensuradas por ecocardiógrafo equipado com transdutor linear de 14 Mhz. A função do ventrículo esquerdo foi determinada por meio da fração de encurtamento (FE) do ventrículo esquerdo dos animais, calculada pela fórmula: FE (%) = [(LVEDD - LVESD)/LVEDD] x 100, sendo LVEDD a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (i.e. Left Ventricular End-Diastolic Dimension) e LVESD a dimensão sistólica final do ventrículo esquerdo (i.e. Left Ventricular End-Systolic Dimension). As medidas ecocardiográficas seguiram recomendações do Comitê de Padronização do modo M da Sociedade Americana de Ecocardiografia.
5.4 Tolerância ao esforço físico
A tolerância ao esforço físico foi avaliada quatro e doze semanas após os procedimentos cirúrgicos. O teste consistiu em corrida em esteira rolante, inclinada a 20 graus, sendo iniciado na velocidade de 6m/min, com incrementos de 3 m/min a cada três minutos (FERREIRA et al., 2007), até a exaustão do animal. A velocidade máxima de corrida foi registrada e a distância total percorrida calculada. Os animais foram adaptados ao ambiente de teste durante uma semana antes das avaliações (10 min/dia).
5.5 Potência aeróbia máxima (VO2máx)
O VO2máx foi mensurado quatro e doze semanas após os procedimentos cirúrgicos, por meio de teste de corrida em esteira, como descrito acima. Os animais realizaram o teste em esteira rolante montada dentro de uma câmara metabólica conectada por tubos a um analisador de oxigênio e bomba de ar responsável pela manutenção do fluxo de gases dentro da câmara. O aparelho foi calibrado após cada avaliação e o VO2máx foi calculado pela fórmula (pO2amb-pO2máx)x3500/m, onde pO2amb representa a fração de oxigênio no ar ambiente, pO2máx a fração expirada de oxigênio, 3500 o fluxo de ar em mL/min e "m" a massa corporal em quilogramas.
5.6 Protocolos de treinamento físico aeróbio
Os animais foram submetidos a corrida em esteira com inclinação de 20 graus, cinco dias por semana, durante oito semanas. Ambos os grupos realizaram aquecimento de 10 minutos a 40% do VO2máx antes de cada sessão de treinamento. O TFA intervalado em alta intensidade consistiu em três minutos de corrida a 60% do VO2máx seguidos de quatro minutos a 85% do VO2máx, repetidos setes vezes durante cada sessão (tempo total de 49 minutos). Já o TFA contínuo em intensidade moderada foi realizado a 60% do VO2máx durante toda a sessão, e teve duração ajustada para equalizar o trabalho total realizado (protocolos isocalóricos), mensurado pela distância percorrida. A Figura 2 representa graficamente os dois protocolos. A velocidade de corrida foi ajustada ao final da quarta semana de treinamento físico, por meio dos testes acima descritos.
Figura 2 – Representação gráfica dos protocolos de TFA realizados no presente estudo.
5.7 Coleta dos tecidos
Quarenta e oito horas após as reavaliações pós-treinamento físico (12 semanas após procedimentos cirúrgicos), os animais foram sacrificados por decapitação e os músculos sóleo e plantar, bem como coração, pulmões e fígado foram cuidadosamente dissecados, pesados e congelados em nitrogênio líquido ou em freezer (-80ºC), dependendo do experimento a que seriam destinados. Pulmões e fígado foram submetidos a secagem em estufa (37ºC) e pesados a cada 24 horas até que não houvesse mais alteração de massa, permitindo o cálculo da razão massa úmida:massa seca como um índice de edema pulmonar e hepático, respectivamente, indicando presença ou não de sinais de IC.
5.8 Estrutura da musculatura esquelética
Parte dos músculos sóleo e plantar foi congelada em isopentano resfriado em nitrogênio líquido, para avaliação histológica da estrutura da musculatura esquelética. Tais músculos foram usados devido a distinção na distribuição dos tipos de fibras musculares, uma vez que o músculo sóleo apresenta características predominantemente oxidativas, ao passo que o músculo plantar demonstra predomínio de fibras do tipo II, cujo metabolismo predominante é o glicolítico. Os músculos foram ulteriormente cortados em criostato em secções transversais de 10 µm para processamento posterior. A avaliação da área de secção transversa e dos tipos de fibras musculares foi realizada por meio da reação para miosina
ATPase (BROOKE e KAISER, 1970). As fibras do tipo I (lentas e oxidativas) reagem fortemente na solução ácida, podendo ser identificadas em aquisições microscópicas como as fibras mais escuras, enquanto as fibras do tipo II (rápidas e glicolíticas) podem ser identificadas como sendo as mais claras. O inverso ocorre na solução básica. A área de cada fibra muscular foi mensurada e a média calculada. A proporção dos diferentes tipos de fibras foi calculada. As imagens foram registradas em computador acoplado ao microscópio óptico e conectado a um sistema fotográfico (magnificação de 100x) (Leica Qwin)
5.9 Avaliação metabólica da musculatura esquelética
Os ensaios foram realizados nos músculos sóleo e plantar dos animais incluídos no presente estudo. A metodologia utilizada, bem como padronizações e adaptações dos protocolos estão descritas abaixo.
5.9.1 Citrato sintase (EC 2.3.3.1)
O bom funcionamento de enzimas relacionadas ao metabolismo de ácidos graxos, como as enzimas mitocondriais envolvidas no ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs), é um importante indicativo da capacidade de geração de energia pelo metabolismo aeróbio. A enzima citrato sintase catalisa a primeira reação do ciclo de Krebs, quando acetil-coenzima A (acetil-CoA) é condensada com oxaloacetato, formando citrato e coenzima A (CoA). Tal reação é um passo determinante da velocidade de todo o ciclo de Krebs e, consequentemente, da formação de energia pelo metabolismo aeróbio.
A atividade máxima da enzima citrato sintase foi determinada por método fotométrico, por meio da quantificação do complexo formado entre CoA com ácido 5,5’ditio-bis 2 nitrobenzóico (DTNB), adicionado ao meio. Os músculos foram homogeneizados em tampão fosfato (50mM PBS, pH 7,4 + 1mM EDTA) e centrifugados à 12000g durante 15 minutos (4°C). A mistura de ensaio foi constituída por Tris-Base (100mM), EDTA (1mM), DTNB (0,2mM), acetil-CoA (0,1mM), Triton X-100 (1%, v:v) e
amostra. A reação foi iniciada pela adição de oxaloacetato (0,5mM) e a leitura de absorbância em 412nm é acompanhada por 10 minutos a 25°C (ALP, NEWSHOLME e ZAMMIT, 1976). A atividade é dada em nmol de substrato consumido por minuto e os resultados foram corrigidos pela quantidade de proteína citosólica utilizada no ensaio.
O método aqui descrito foi testado em amostras de músculo esquelético de ratos Wistar, apresentando excelente correlação (R2) e confiabilidade (valor de p) dos dados, como ilustrado na Figura 3, que representa média ± erro padrão de três mensurações distintas.
Figura 3 – Linearidade do método de mensuração da atividade máxima da enzima citrato sintase em homogenato citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B).
5.9.2 Hexoquinase (EC 2.7.1.1)
A enzima hexoquinase catalisa a fosforilação da glicose na primeira reação da via glicolítica. Sua atividade máxima foi mensurada por método baseado na formação de glicose-6-fosdato à partir da glicose e sua conversão em 6-fosfogliconato, em reação catalisada pela enzima glicose-6 fosfato desidrogenase (G6PDH), adicionada ao meio de ensaio. Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADPH) reduzida é formada pela
reação em quantidade proporcional à atividade da enzima hexoquinase e foi avaliada por absorbância em 340nm, durante 10 minutos (25°C) (ZAMMIT e NEWSHOLME, 1976). O meio de ensaio foi composto por Tris-HCl (75mM), cloreto de magnésio (7,5mM), EDTA (0,8mM), cloreto de potássio (1,5mM), mercaptoetanol (4mM), Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADP+) (0,4mM), ATP (2,5mM), glicose (1mM), creatina-fosfato (1,4 U/mL), Triton X-100 (0,05%; v:v) e a amostra. A reação foi iniciada pela adição de D-glicose ao meio em concentração final de 1mM. A atividade é dada em unidades de absorbância (UA) por minuto e os resultados foram corrigidos pela quantidade de proteína citosólica utilizada no ensaio.
Testamos também a confiabilidade desde método, avaliando a atividade da enzima hexoquinase em diferentes quantidades de lisado citosólico dos músculos sóleo e plantar (Figura 4). As amostras foram analisadas em triplicatas. Observamos ótima sensibilidade do ensaio para o músculo plantar com a utilização de 25 a 400 µg de proteínas citosólicas (Figura 4B). Entretanto, para o músculo sóleo, observamos linearidade a partir de 150 µg de proteínas citosólicas (Figura 4A). Devido a isso, utilizamos 250 µg de proteínas para esse músculo a fim de garantir boa comparação dos dados entre os diferentes grupos experimentais.
Figura 4 – Linearidade do método de mensuração da atividade máxima da enzima hexoquinase em homogenato citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B).
5.9.3 Glicogênio intramuscular
Para dosagem do conteúdo de glicogênio intramuscular, parte da peça muscular foi digerida em solução contendo hidróxido de potássio (5,5 M) durante 30 minutos em banho fervente (100°C), seguido de precipitação com etanol (centrifugação a 1000g por 20 minutos). Na sequência a fração peletizada foi ressuspendida em ácido sulfúrico para hidrólise do glicogênio em glicose. Feito isso, a reação de antrona (1 M) com a amostra forma uma solução esverdeada que pode ser detectada por leitura de absorbância em 650 nm. O valor de absorbância foi ajustado dentro de uma curva construída com concentrações conhecidas de glicose e os resultados estão apresentados em µg de glicogênio por 1g de tecido.
O método em questão foi avaliado e os dados são apresentados na Figura 5. As amostras foram avaliadas em triplicatas. Detectamos excelente correlação e confiabilidade dos dados para a curva padrão de glicose e diferentes quantidades dos músculos sóleo e plantar. Utilizamos 50mg de tecido para as mensurações, dado que tal valor é intermediário quando consideramos a sensibilidade do método, ilustrada na Figura 5.
Figura 5 – Linearidade do método de mensuração de glicogênio intramuscular. Curva padrão de glicose (A), e conteúdo de glicogênio em diferentes quantidades dos músculos sóleo (B) e plantar (C).
5.10 Balanço redox na musculatura esquelética
5.10.1 Superóxido dismutase (EC 1.15.1.1)
A atividade da enzima em questão foi avaliada por um método que consiste na inibição da redução de citocromo C por radicais superóxidos gerados pelo sistema xantina-xantina oxidase, proporcionada pela SOD presente na amostra testada, que compete com citocromo C pelos radicais gerados. (MCCORD e FRIDOVICH, 1969).
Os músculos foram homogeneizados em tampão fosfato (50mM PBS, pH 7,4 + 1mM EDTA + inibidor de protease [1:100, v:v]) e centrifugados em 12000g durante 15 minutos (4°C). Inicialmente, a taxa de redução de citocromo C foi avaliada na ausência de amostra, pela leitura da taxa de alteração de absorbância em 550nm durante 5 minutos, em solução contendo citocromo C (19mM), xantina (1,18mM) e xantina oxidase diluídos em tampão fosfato (0,05 M, pH 7,8). A concentração de xantina oxidase foi ajustada para uma velocidade de redução de citocromo C de 0,025 unidades de absorbância por minuto (UA/min). Na sequência a taxa de redução de citocromo C foi acompanhada durante 5 minutos na presença da amostra diluída na solução supracitada. A atividade de SOD da amostra foi então calculada pela diferença entre a taxa de oxidação de citocromo C na ausência e na presença de amostra.
O presente método foi testado em nosso laboratório e os dados estão apresentados na Figura 6. Diferentes quantidades de proteínas citosólicas dos músculos sóleo e plantar foram testadas e verificamos que para o músculo sóleo, a sensibilidade do método encontra-se entre 0 e 80 µg de proteínas citosólicas da amostra testada (Figura 6A). No músculo plantar, mesmo 160 µg não foram capazes de inibir completamente a redução de citocromo C (Figura 6B). Utilizamos, portanto, 40 µg de proteínas citosólicas para ambos os músculos, por se tratar de uma concentração que se enquadra dentro da sensibilidade apresentada pelo método nas condições de nosso laboratório.
Figura 6. Inibição da redução de citocromo C pela enzima SOD presente em lisado citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B).
5.10.2 Catalase (EC 1.11.1.6)
A atividade da catalase foi avaliada pelo acompanhamento da decomposição de peróxido de hidrogênio adicionado às amostras dos músculos sóleo e plantar, por meio de leitura de absorbância em 240nm. Os músculos foram homogeneizados em tampão fosfato (50mM PBS, pH 7,4 + 1mM EDTA + inibidor de protease [1:100, v:v]) e centrifugados a 12000g durante 15 minutos (4°C). A fração sobrenadante corresponde ao lisado citosólico das amostras e foi utilizada no ensaio. Peróxido de hidrogênio foi adicionado ao lisado na concentração final de 10mM e a absorbância em 240nm foi acompanhada durante 4 minutos. A taxa de decaimento da absorbância corresponde à atividade de catalase presente na amostra testada.
A Figura 7 ilustra a linearidade apresentada pelo método, testado em nosso laboratório. Utilizamos 75 µg de proteínas citosólicas, valor intermediário dentro da sensibilidade do método, possibilitando a detecção de variações positivas ou negativas na atividade da enzima catalase.
Figura 7 – Linearidade do método de mensuração da atividade da enzima catalase em lisado citosólico dos músculos sóleo (A) e plantar (B).
5.10.3 Estado redox da glutationa
Aproximadamente 15mg dos músculos sóleo e plantar foram homogeneizados em tampão fosfato (100mM, pH 7,0) e centrifugados a 14000rpm por 10min a 4ºC. As proteínas do sobrenadante foram precipitadas com ácido sulfosalicílico (concentração final de 2,5%). Utilizamos o Glutathione Fluorescent Detection Kit (Arbor Assays) para dosagem do estado redox da glutationa. O ensaio é baseado no reconhecimento do grupo tiol presente em moléculas de glutationa da amostra pelo composto ThioStar®. A ligação deste composto à molécula de glutationa forma uma substância altamente fluorescente (λexc 390 nm, λem 510 nm), que é detectada em placas de 96 poços por um fluorímetro. Inicialmente, o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) foi mensurado. Na sequência a mesma amostra foi incubada com composto que converte todo o conteúdo de glutationa oxidada (GSSG) em GSH, promovendo nova reação com o composto ThioStar®, gerando o sinal fluorescente que representa o conteúdo total de glutationa. Uma curva com concentrações conhecidas de GSH foi utilizada como padrão. Estes resultados nos permitem calcular também o conteúdo de GSSG, utilizando a seguinte fórmula: GSSG = (GSH Total – GSH Reduzida) / 2.
5.11 Sistema ubiquitina-proteassoma
5.11.1 Conteúdo de proteínas oxidadas
Os músculos foram homogeneizados em tampão fosfato (50mM PBS, pH 7,4 + 1mM EDTA + inibidor de protease [1:100, v:v]), na proporção 1:5 (massa:volume) e centrifugados (12000g, 4° C, 15 minutos) para obtenção da fração citosólica. Na sequência o lisado (50 µg) foi incubado com 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) durante 15 minutos, promovendo a reação de DNPH com grupos carbonila presentes nas proteínas, formando uma ligação covalente. As amostras foram então submetidas a eletroferese em gel (10% acrilamida) e transferidas para membranas de nitrocelulose. Após bloqueio das ligações inespecíficas do anticorpo por incubação com albumina (BSA, 5%, m:v), as membranas foram incubadas com anticorpo primário contra dinitrofenil (DNP) (1 hora, temperatura ambiente, em solução contendo 5% BSA, 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,6), que foi posteriormente reconhecido por anticorpo secundário conjugado à enzima HRP (horseradish peroxidase), permitindo sua detecção (ChemiDoc, BioRad) e quantificação após reação quimioluminescente com luminol e peróxido de hidrogênio. Os resultados foram corrigidos pelos valores de uma amostra controle presente em todos os géis, bem como pela coloração da membrana com 0,5% Ponceau S, garantindo comparação fidedigna entre amostras corridas em diferentes géis e minimizando possíveis erros de pipetagem, respectivamente. Os dados estão apresentados como porcentagem do grupo SHAM.
5.11.2 Conteúdo de proteínas ubiquitinadas
Os músculos foram homogeneizados em tampão fosfato (50mM PBS, pH 7,4 + 1mM EDTA + inibidor de protease [1:100, v:v]), na proporção 1:5 (massa:volume) e centrifugados (12000g, 4° C, 15 minutos) para obtenção da fração citosólica. Na sequência o lisado foi preparado com SDS (0,8%, m:v), β- mercaptoetanol (200mM), azul de bromofenol (0,02%, m:v) e glicerol (40%, m:v). As amostras foram então submetidas a eletroferese em gel (10%
acrilamida) e transferidas para membranas de nitrocelulose. Após bloqueio das ligações inespecíficas do anticorpo por incubação com albumina (BSA, 5%, m:v), as membranas foram incubadas com anticorpo primário contra ubiquitina (1 hora, temperatura ambiente, em solução contendo 5% BSA, 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,6), que foi posteriormente reconhecido por anticorpo secundário conjugado à enzima HRP (horseradish peroxidase), permitindo sua detecção quimioluminescente (ChemiDoc, BioRad) após reação quimioluminescente com luminol e peróxido de hidrogênio. Os resultados foram corrigidos pelos valores de uma amostra controle presente em todos os géis, bem como pela coloração da membrana com 0,5% Ponceau S, garantindo comparação fidedigna entre amostras corridas em diferentes géis e minimizando possíveis erros de pipetagem, respectivamente. Os dados estão apresentados como porcentagem do grupo SHAM.
5.11.3 Atividade do complexo proteassomal 26S
O ensaio de atividade do complexo proteassomal 26S é baseado na clivagem de um peptídeo (sequência: Leu-Leu-Val-Tyr [LLVY]), substrato do sítio catalítico quimiotripsina. O peptídeo é comercializado conjugado à sonda fluorescente 7-Amino-4-Methylcoumarina (AMC), e quando clivado pelo complexo proteassomal emite fluorescência. Portanto, o ensaio foi realizado na presença de Tris (25mM), MgCl2 (5mM), ATP (25µM) e o substrato
(25µM) (pH 7,4, 200µL volume final). Utilizamos 25µg de proteínas citosólicas no ensaio (preparação da amostra como descrito acima, sem adição de inibidores de protease). A fluorescência da amostra foi acompanhada a 37°C, sendo 350nm e 440nm as frequências de excitação e emissão, respectivamente. O ensaio foi realizado na presença e na ausência do inibidor específico do proteassoma, epoxomicina (20µM), e a diferença entre as duas taxas de emissão de fluorescência foi atribuída ao complexo proteassomal 26S presente na amostra.
