UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

EFEITO ANTITROMBÓTICO DE UMA FUCANA NÃO ANTICOAGULANTE EXTRAÍDA DA ALGA SPATOGLOSSUM SCHRÖEDERI

EDJANE MARIA DE AZEVEDO BARROSO

Natal/RN 2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Natal/RN 2008

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Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha

Natal/RN 2008

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CATALOGAÇÃO NA FONTE

Edjane Maria de Azevedo Barroso B277 Barroso, Edjane Maria de Azevedo.

Efeito antitrombótico de uma fucana não anticoagulante extraída da alga Spatoglossum Schröederi / Edjane Maria de Azevedo Barroso. __ Natal-RN, 2008.

24 p. : il.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. Fucana - Dissertação. 2. Polissacarídeos Sulfatados - Dissertação 3. Alga Marron - Dissertação. 4. Spatoglossum Schröederi - Dissertação. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II. Título.

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Coordenador do Programa de Pós-graduação: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros

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Presidente da Banca (orientador): Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha (UFRN)

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Laura Marina Pinotti (UFES)

Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales (UFRN)

Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Junior (Suplente – UFRN)

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Dedico aos meus pais, César (in memorian) e Eunice. Aos meus filhos Álison Wagner e Allan Mark. Ao meu esposo Mário Barroso.

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Dedico esta obra:

Ao Prof. Hugo Alexandre, um pesquisador nato, um exemplo de que se pode fazer pesquisa com ética e respeito, mostrando através de sua simplicidade, do seu carinho e experiência que sabe cativar a tudo e a todos e dessa forma além de mestre se tornou um amigo admirável.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dando força e energia para seguir sempre em frente mesmo diante das dificuldades.

A Universidade Federal do Rio Grande do Norte por fornecer as condições necessárias para realização desse trabalho;

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela oportunidade de cursar o mesmo.

Ao professor e meu orientador Dr. Hugo Alexandre, pela confiança, credibilidade e paciência para a conclusão desse trabalho e, principalmente, por sua amizade durante esses anos.

Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica e do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, pelo ótimo convívio e pelos conhecimentos passados.

A Danielli Lopes e Patrícia, secretarias do PPGCSA, pelo carinho e atenção ao longo desse período.

As amigas e farmacêuticas Cynthia e Patrícia, pela amizade e apoio durante as minhas ausências ao trabalho.

A amiga e farmacêutica Luana Cristina pela amizade e apresentação ao Prof. Hugo Alexandre.

Aos amigos antigos e novos do BIOPOL, Ivan, Eduardo, Ana Karinne, Diego, Leonardo, Leandro, Jailma, Dayanne, Sara, Mariana, Gabriel, Sayonara, Nayssandra, Rafael, Ruth, Nednaldo, Ranieri, e Cynthia pela convivência, amizade, apoio e participação direta e indireta na realização deste trabalho.

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Sumário

Dedicatória... v

Agradecimentos ... vii

Lista de Abreviaturas e Siglas ... ix

Resumo ... x

1 INTRODUÇÃO ... 1

2 REVISÃO DA LITERATURA ... 5

3 ANEXAÇÃO DO ARTIGO ... 10

4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES ... 17

5 REFERÊNCIAS ... 19 Abstract

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Lista de abreviaturas e siglas

μg micrograma

g grama

APTT tempo de tromboplastina parcial ativado

Da daltons

HC-II cofator II da heparina

Hep heparina kDa quilodaltons

TFPI inibidor da via do fator tecidual (“tissue factor pathway inhibitor“)

U.I unidade internacional

v/v volume/volume

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RESUMO

Fucanas é um termo utilizado para denominar a família de polissacarídeos

sulfatados que apresentam em sua constituição α-L-fucose sulfatada. A alga marrom

Spatoglossum schröederi da família Dictyotaceae, apresenta três heterofucanas

denominadas de fucana A, B, e C. A fucana A (21kDa) é composta por um núcleo

central formado por ácido glucurônico, β 1→3 ligado, substituídos em C4 por L-fucoses

α (1→3) ligados. A fucose ainda é substituída no C4 por grupos sulfatos e no C2 por

cadeias de β (1→4) xilose. Esta fucana não apresentou atividade anticoagulante entre

0,1 e 100μg/mL e nenhuma atividade hemorrágica entre 50 e 800μg /mL. Os testes antitrombótico “in vivo” mostraram que a fucana A não apresentou atividade nas

concentrações (0,2 a 20μg/g) testadas 1 hora após a administração do polissacarídeo.

No entanto, quando a fucana A foi administrada endovenosamente, 24h antes da ligadura da veia cava, observou-se um efeito dose-dependente, alcançando a sua

saturação em torno de 20μg/g de massa do animal. Além disso, o efeito se mostrou

tempo-dependente, atingindo saturação em 16h após a administração da fucana. Em todas as vias em que foi administratada (SC, IM, IP, e IV), a fucana A demonstrou ação antitrombótica. Exceção apenas para a via oral. A importância dos resultados obtidos foi o fato da fucana A estimular a síntese de um heparam sulfato com características antitrombótica semelhante à heparina pelas células endoteliais. Esta descoberta levou a hipótese de que a atividade antitrombótica da fucana A está relacionada com o aumento na produção deste heparam sulfato. Devido as suas características e por ser um composto praticamente desprovido de atividade anticoagulante e hemorrágico sugere-se que a fucana A possa vir a ser um agente antitrombótico “in vivo”. A realização deste estudo teve caráter multidisciplinar, envolvendo pesquisadores da Bioquímica, Morfologia, Hematologia, Botânica e Veterinária. Este aspecto preencheu os requisitos da multidisciplinaridade do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

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1 INTRODUÇÃO

As principais causas de mortes nos Estados Unidos estão relacionadas às doenças do coração e dos vasos sanguíneos, e estão intimamente ligadas as

ocorrências de trombose (1) . Este fato também ocorre nos demais paises ocidentais,

onde a incidência de mortes devido às doenças cardiovasculares em 2003 ocupou o primeiro lugar em ordem de classificação de óbitos, seguido por aqueles causados por

neoplasias malignas e doenças cerebrovasculares, respectivamente (2).

Este elevado número de óbitos poderia ser muito maior, se não tivesse ocorrido a introdução de agentes antitrombóticos, particularmente a heparina, polissacarídeo sulfatado extraído de intestino de suínos e pulmões bovinos, que ocorreu na década de

40 do século vinte, e posteriormente de seus derivados, esses na década de 90 (1).

A heparina é atualmente um dos principais fármacos utilizados como anticoagulantes e antitrombóticos, entretanto esse polissacarídeo pode provocar várias

reações adversas, dentre elas, hemorragia e trombocitopenia (3). Portanto, a limitação

do uso irrestrito da heparina tem estimulado a busca de outros polissacarídeos com ação antitrombótica, mas que não apresentem os mesmos efeitos colaterais da heparina (4).

Com o objetivo de se descobrir novos compostos com atividade anticoagulante, as algas marinhas tem se apresentado como ótimas opções devido essas serem ricas

em polissacarídeos sulfatados, além de serem recursos naturais renováveis (5-8). Há

três classes de algas marinhas, as marrons (Phaeophyceas), as verdes (Chlorophyceas) e as vermelhas (Rodhophyceas). As algas marrons, classe em que está incluída a alga deste estudo, sintetizam as fucanas (homo e heterofucanas) que

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sulfatada (9). O crescente interesse por esses compostos é devido eles apresentarem

características estruturais e efeitos semelhantes à heparina.

A atividade anticoagulante relacionada a polissacarídeos de algas foi

inicialmente descrita por Chargafft(10) na década de 30 e o efeito anticoagulante “in

vitro” de frações purificadas da alga marrom Fucus vesiculosus foi publicada em 1957

(11).

A ação das fucanas como anticoagulante ocorre principalmente por sua ação potencializadora dos anticoagulantes naturais cofator II da heparina e, principalmente, da antitrombina, esta ação estaria diretamente relacionada com o seu grau de

sulfatação e massa molecular(12). Contudo, há fucanas anticoagulantes que agem por

outros mecanismos, como por exemplo: estimular a liberação do Inibidor do fator

tecidual (TFPI) (13) ou a síntese de um heparam sulfato antitrombótico por células

endoteliais (9, 14), fato observado também para a heparina e compostos antitrombóticos

sem atividade anticoagulante (15-18).

Dados do nosso grupo mostraram que a alga Spatoglossum schröederi sintetiza três diferentes heterofucanas, que foram denominadas de fucanas A, B e C. A fucana A

corresponde a cerca de 80% do total das fucanas sintetizadas pela alga (9) , ela é

composta por um núcleo central β (1→3) ácido glucurônico contendo oligossacarídeos

substituintes em C4 por L-fucoses α (1→3) sulfatadas. A fucose ainda é substituída no

C4 por grupos sulfatos e no C2 por cadeias de β (1→4) xilose (9) .

Nesse trabalho mostramos que essa fucana não possui atividade anticoagulante

“in vitro” (0,1 a 100μg/mL) nem atividade hemorrágica (50 a 800μg/mL) “in vivo”. Bem

como não inibiu a agregação plaquetária. Contudo, testes antitrombóticos “in vivo” demonstraram que essa fucana apresenta atividade antitrombótica tempo e dose

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dependente, chegando ao máximo após 16h da administração e com 20μg /g de

animal.

Um dado importante demonstrado nesse trabalho para esta fucana, foi o fato de que ela foi capaz de estimular a síntese de um heparam sulfato com características antitrombótica por células endoteliais. Esta descoberta nos levou a propor a hipótese de que a atividade antitrombótica da fucana A está relacionada com a sua capacidade de estimular o aumento da produção deste heparam sulfato.

As análises estatísticas dos grupos foram realizadas através da análise de variância (ANOVA) e as diferenças dos grupos foi realizada posteriormente pelo teste de Turkey.

Os resultados parciais deste trabalho foram apresentados na forma de painel no “3RD International Symposium in Biochemistry of Macromolecules and Biotechnology - SBBq” realizado em Natal/RN no período de 6 a 8 de dezembro de 2006.

Finalmente, os resultados obtidos foram publicados em um artigo científico, intitulado: A non anticoagulant heterofucan has antithrombotic activity in vivo, aceito em março de 2008 pela Planta Medica, a International Journal of Natural Products and Medicinal Plant Research.

O desenvolvimento deste estudo proporcionou a mestranda à oportunidade de interagir com diversos ramos da pesquisa científica tais como Bioquímica, Morfologia, Hematologia, Botânica, Veterinária, o que deu um caráter interdisciplinar ao trabalho. Houve ainda a oportunidade de a mestranda criar laços científicos com o Depto. de Bioquímica da Universidade Federal de São Paulo, quando da colaboração que ocorreu durante os experimentos com cultura de células, bem como com o Depto. de Biologia Celular da Universidade Federal do Paraná, devido às análises de microscopia eletrônica.

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Como projeto para o futuro, planejamos continuar com os estudos na mesma linha de pesquisa, em um futuro doutorado.

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2 REVISÃO DA LITERATURA

As doenças cardiovasculares (DCV), doença coronária e o acidente vascular cerebral são as principais causas de óbitos em todos os países do mundo constituindo,

um dos maiores problemas de saúde pública mundial (1, 2) . No Brasil, dados estatísticos

do Ministério da Saúde demonstram que cerca de 60% dos óbitos em 2004 foram atribuídos a três grupos de causas: as doenças do aparelho circulatório (31,83%), neoplasias (14,69%), e causas externas (14,21%). Quando se observa a tabela I, se

verifica que esses valores não mudaram muito nos últimos anos (19) .

Tabela I

Mortalidade proporcional por grupos de causas definidas (%). Brasil - 1991, 1998 e 2004

Grupos de causas 1991 1998 2004

Doenças infecciosas e parasitárias 5,8 6,2 5,13

Neoplasias 13,1 14,0 15,69

Doenças do aparelho circulatório 34,0 32,4 31,83

Doenças do aparelho respiratório 9,7 11,6 11,39

Afecções perinatais 5,7 4,6 3,46

Causas externas 15,1 14,9 14,21

Demais causas definidas 16,6 16,3 18,29

Total 100,0 100,0 100,0

Fonte: Ministério da Saúde/SVS - Sistema de Informações sobre Mortalidade (SIM) (www.datasus.gov.br)

Os distúrbios vasculares podem provocar doença clínica por meio de dois mecanismos principais: o estreitamento ou obstrução total do lúmen vascular, podendo ser progressivo, no caso da aterosclerose, ou repentino através da trombose ou embolia; outro mecanismo é o enfraquecimento das paredes dos vasos sanguíneos, com sua conseqüente dilatação ou ruptura, que pode levar a hemorragia. Quando ocorre em uma grande artéria ou veia, esse evento está quase sempre associado a lesões vasculares provocados por trauma, aterosclerose, ou erosão inflamatória ou

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6

A hemostasia é uma série de processos fisiológicos que efetuam importantes funções como a manutenção do sangue em um estado líquido e livre de coágulos no interior dos vasos sanguíneos, estas funções devem ser balanceadas com o objetivo de induzir a formação de um tampão hemostático rápido e localizado no local da lesão vascular (21) .

A trombose é uma disfunção patológica nos processos hemostáticos culminando com a formação de um coágulo sanguíneo (trombo) no interior de um vaso

não lesionado ou oclusão trombótica na vasculatura após pequena lesão (20, 22) .

Quando a coagulação ocorre no interior de uma veia é chamada de trombose venosa, podendo ser superficial ou profunda dependendo da localização anatômica do vaso, se superficial ou profundo. Além do que, poderá provocar inflamação e uma possível obstrução no vaso lesado de modo que o quadro clínico dependerá destes fatores. A fluidez do sangue depende do equilíbrio de fatores procoagulantes e de anticoagulantes, ambos são sintetizados pelo organismo e estão presentes no sangue, se um desequilíbrio favorecendo os fatores procoagulantes ocorrer será formado o

trombo (21) . São três as principais influências que predispõem à formação do trombo,

denominada de tríade de Virchow, que são lesão endotelial, estase venosa e

hipercoagulabilidade sanguínea (23, 24) e os fatores de risco que mais favorecem o

desenvolvimento de trombose. São: indivíduos com idade superior a 40 anos, Imobilização prolongada, câncer, grandes cirurgias, politraumatismo e insuficiência

cardíaca crônica (24) . Como opção de tratamento farmacológico deve ser utilizada os

anticoagulantes.

No grupo dos anticoagulantes a heparina é o medicamento mais firmemente

estabelecido como agente antitrombótico desde 1960 (25) . A heparina é um

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constituído principalmente de resíduos alternados de ácido idurônico e glucosamina. A

principal característica da heparina é a capacidade de retardar a coagulação sangüínea. As preparações comerciais da heparina são extraídas de pulmão ou

mucosa intestinal de bovinos ou da mucosa intestinal de suínos (1) .

Esse composto é usado principalmente na prevenção de trombose venosa profunda, em pós-cirurgias e pós-partos, em pacientes com estado de hipercoagulopatia, ou sujeitos a trombose causada por diferentes etiologias. Entretanto, a heparina pode apresentar algumas reações adversas graves, como hemorragias e

trombocitopenia em alguns pacientes (26, 27) , além do risco existente de contaminações

virais, uma vez que é obtida de tecidos animais. Outro problema observado é o efeito hemorrágico residual da heparina, apresentado mesmo por fragmentos de heparina

que não possuem atividade anticoagulante (1) .

Devido a esses aspectos inerentes ao uso da heparina, uma busca por compostos que possam substituí-la vem se tornando cada vez mais intensas. Nesse

contexto destacam-se os polissacarídeos sulfatados de algas marrons (28) e de algas

verdes (29) .

As algas compreendem vários grupos de seres vivos aquáticos e autotróficos e que estão inseridos no reino Protista. As macroalgas marinhas são organismos que não possuem diferenciação de tecidos e apresentam uma gama de pigmentos fotossintéticos entre eles a clorofila a, além de outros pigmentos acessórios, que são

características importantes na classificação desse grupo (30). Essas algas se dividem

em três grupos caracterizados principalmente pelos seus pigmentos acessórios e substâncias de reserva: Phaeophycea (algas marrons), Rodhophycea (algas vermelhas) e Chlorophycea (algas verdes).

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Das algas marrons, objeto deste estudo extrai-se polissacarídeos que

apresentam α-L-fucose sulfatada na sua composição (28, 31-33) . Os polissacarídeos que

apresentam mais de 90% de α-L-fucose sulfatada na sua estrutura são chamados de

fucanas e os demais são denominados de fucoidans (28, 34) . Contudo, vários autores

empregam esses termos como sinônimos. Às vezes são empregados os termos heterofucanas e homofucanas.

As algas marrons são uma fonte abundante de novos polissacarídeos anticoagulantes. Elas têm uma variedade de homo ou heterofucanas sulfatadas com

esta atividade (5, 28) . Além da atividade anticoagulante, algumas fucanas de algas

possuem outras atividades farmacológicas importantes como: atividades antiinflamatórias, anti-adesiva, antiproliferativa, antiviral, e contraceptiva (34) . Nas algas as fucanas localizam-se principalmente na matriz mucilagenosa e por serem altamente higroscópica tem a função de protegê-la da desidratação quando essa se encontra

exposta a longos períodos de exposição solar nas marés baixas (35) . Além das algas

marrons, esses polissacarídeos sulfatados também são encontrados em equinodermos (ouriços e pepinos do mar) (36) .

A estrutura desses polímeros varia de acordo com a espécie de alga parda e às

vezes nas diferentes partes da mesma alga (37-39) . Dessa forma, cada nova fucana

extraída e purificada é um composto estruturalmente único e conseqüentemente, apresenta um potencial farmacológico e biotecnológico único.

Há poucos trabalhos sobre o mecanismo anticoagulante de homofucanas. Em geral a ação proposta é predominantemente sobre a antitrombina e sendo observado

como menor atividade sobre o cofator II da heparina (40) . Sua atividade anticoagulante

depende de seu conteúdo de sulfato e de sua massa molecular (33, 41) . Por outro lado,

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Alguns estudos desenvolvidos por nosso grupo mostram que a alga

Spatoglossum schröederi contém três principais fucanas com mobilidades

eletroforéticas distintas (9) . Elas foram chamadas de fucana A, B e C, de acordo com

as suas migrações relativas em gel de eletroforese. As análises químicas mostraram

que a fucana A é uma xilofucuglucuronana (9) , enquanto as outras duas fucanas são

xilogalactofucanas (7) com diferentes graus de sulfatação. A fucana A corresponde à

cerca de 80% das fucanas encontrada nessa alga, enquanto as fucanas B e c

correspondem a 16 e 4% (7). Essas fucanas não possuem atividade anticoagulante.

Porém, elas são capazes de estimular a síntese de um proteoglicano de heparam

sulfato com atividade antitrombótica produzido por células endoteliais (6, 7, 9) .

Recentemente, foi demonstrado que a fucana B possui atividade antitrombótica “in

vivo” sem apresentar atividade anticoagulante “in vitro” (7). Contudo não existem

estudos com relação à ação antitrombótica das fucanas A e C de Spatoglossum

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4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES

Em meados da década de 90, o nosso grupo adaptou uma metodologia para

extração e purificação de polissacarídeos de algas (38). Utilizando essa metodologia foi

possível extrair e purificar um polissacarídeo sulfatado da alga Spatoglossum

schroederi que foi denominado de fucana A. Análises químicas (Tabela I) confirmaram

que essa fucana A é a mesma fucana descrita por Leite (9). Esses dados atestam que a

metodologia desenvolvida pelo nosso grupo é eficaz e bastante reproduzível.

A fucana A não apresentou atividade anticoagulante, mesmo com a presença de grupos sulfatos ligados aos monossacarídeos. Essa ausência de atividade pode ser explicada pela presença de xiloses nos terminais não redutores, o que deve impedir a interação da fucana com componentes da coagulação sanguínea. Por outro lado, quando administrada “in vivo” essa fucana apresentou atividade antitrombótica de forma dose e tempo dependente (Fig. 1), sendo essa atividade observada quando os animais foram submetidos a fucana A por diferentes vias de administração (Tabela III). A necessidade de um intervalo de tempo para que se observe à atividade antitrombótica da fucana no animal foi indício que esse composto possuía uma atividade indireta e que provavelmente a fucana A estava estimulando a síntese de algum composto com essa atividade.

Ensaios com células endoteliais em cultura demonstraram que a fucana A era

capaz de estimular essas células a sintetizar e liberarem para o meio de cultura um heparam sulfato antitrombótico (Fig 2). Esse efeito foi dose -dependente (Fig 3). Esses dados levam a proposta de que a atividade antitrombótica da fucana A “in vivo” se dá devido a sua capacidade de estimular as células endoteliais a sintetizarem e liberarem para a luz do vaso sanguíneo um heparam sulfato antitrombótico.

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O resultado de maior impacto desse trabalho foi demonstrar que compostos que não apresentam atividade anticoagulante “in vitro” podem apresentar atividade antitrombótica “in vivo”, o que corrobora com trabalhos anteriores do nosso grupo e que anteriormente era considerado como impossível e, portanto, tido como um dogma. Os resultados aqui descritos podem gerar uma reavaliação de várias moléculas que foram descartadas como possíveis fármacos que poderiam ser utilizados no tratamento de doenças cardiovasculares por não terem atividade anticoagulante “in vitro”. Bem como nortear novas pesquisas para a descoberta de compostos anticoagulantes.

O cronograma de atividades seguiu dentro dos padrões esperados, todas as dificuldades encontradas ao longo da realização deste trabalho foram superadas.

A realização deste estudo envolveu intercâmbio entre a UFRN, UNIFESP e UFPR, desenvolvendo uma abordagem multidisciplinar e interdisciplinar preconizada pelo programa de Pós-Graduação do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Este trabalho contou com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-graduação da UFRN.

Como projeto para o futuro, planejamos continuar com os estudos na mesma linha de pesquisa, em um futuro doutorado.

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5 REFERÊNCIAS

1. Nader HB, Lopes CC, Rocha HAO, Santos EA, Dietrich CP. Heparins and

heparinoids: Occurrence, structure and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic

activities.Curr. pharm. des.. 2004;10(9):951-66.

2. Heron PM, Smith BL. Deaths: leading causes for 2003.Natl. vital stat. rep..2007;

55(10):2-96.

3. Weitz J. New anticoagulant strategies - current status and future potential. Drugs.

1994;48(4):485-97.

4. Nader HB, Pinhal MAS, Bau EC, Castro RAB, Medeiros GF, Chavante SF, et al.

Development of new heparin-like compounds and other antithrombotic drugs and their interaction with vascular endothelial cells. Braz J Med Biol Res. 2001;34(6):699-709.

5. Albuquerque IRL, Queiroz KCS, Alves LG, Santos EA, Leite EL, Rocha HAO.

Heterofucans from Dictyota menstrualis have anticoagulant activity. Braz J Med Biol Res. 2004 Feb; 37(2):167-71.

6. Rocha HA, Bezerra LC, de Albuquerque IR, Costa LS, Guerra CM, de Abreu LD,

et al. A xylogalactofucan from the brown seaweed Spatoglossum schroederi stimulates the synthesis of an antithrombotic heparan sulfate from endothelial cells. Planta Med. 2005 Apr;71(4):379-81.

7. Rocha HAO, Moraes FA, Trindade ES, Franco CRC, Torquato RJS, Veiga SS, et

al. Structural and hemostatic activities of a sulfated galactofucan from the brown alga Spatoglossum schroederi - An ideal antithrombotic agent? J Biol Chem. 2005 Dec 16;280(50):41278-88.

8. Silva TMA, Alves LG, Queiroz KCS, Santos MGL, Marques CT, Chavante SF, et

al. Partial characterization and anticoagulant activity of a heterofucan from the brown seaweed Padina gymnospora. Braz J Med Biol Res. 2005;38(4):523-33.

9. Leite EL, Medeiros MGL, Rocha HAO, Farias GGM, da Silva LF, Chavante SF, et

al. Structure and pharmacological activities of a sulfated xylofucoglucuronan from the alga Spatoglossum schroederi. Plant Sci. 1998 Mar;132(2):215-28.

10. Chargaff E, Brancroft FW, Stanley-Brown M. Studies on the chemistry of blood

coagulation II. On the inhibition of blood clotting by substances of high molecular weight J. biol. chem.. 1936;115:155-61.

11. Springer GF, Wurzel HA, McNeal GM, Ansell NJ, Doughty MF. Isolation of

anticoagulant fractions from crude fucoidin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.. 1957;94(2):404-9.

12. Nishino T, Aizu Y, Nagumo T. The influence of sulfate content and

molecular-weight of a fucan sulfate from the brown seaweed ecklonia-kurome on its antithrombin activity. Thromb res. 1991;64(6):723-31.

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20

13. Giraux JL, Matou S, Bros A, Tapon-Bretaudiere J, Letourneur D, Fischer AM.

Modulation of human endothelial coil proliferation and migration by fucoidan and heparin.Eur. j. cell biol. Suppl.. 1998;77(4):352-9.

14. Leite EL. Estrutura e atividade farmacológica de uma nova fucana da alga

marinha Spatoglossu schröederi [Tese]. São Paulo: Universidade Federal de São Paulo; 1995.

15. Nader HB, Dietrich CP, Buonassisi V, Colburn P. Heparin Sequences in the

Heparan-Sulfate Chains of an Endothelial-Cell Proteoglycan. Proc Natl Acad Sci U S A

1987 Jun;84(11):3565-9.

16. Nader HB, Buonassisi V, Colburn P, Dietrich CP. Heparin Stimulates the Synthesis and Modifies the Sulfation Pattern of Heparan-Sulfate Proteoglycan from Endothelial-Cells. J. cell. physiol. suppl. 1989;140(2):305-10.

17. Nader HB, Toma L, Pinhal MAS, Buonassisi V, Colburn P, Dietrich CP. Effect of

Heparin and Dextran Sulfate on the Synthesis and Structure of Heparan-Sulfate from Cultured Endothelial-Cells. Semin. thromb. hemost.. 1991;17:47-56.

18. Pinhal MAS, Walenga JM, Jeske W, Hoppensteadt D, Dietrich CP, Fareed J, et

al. Antithrombotic Agents Stimulate the Synthesis and Modify the Sulfation Pattern of a Heparan-Sulfate Proteoglycan from Endothelial-Cells. Thromb res. 1994;74(2):143-53. 19. Ministério da Saúde. Indicadores e dados básicos para a saúde (IDB) [Internet]. [Citado 2008 maio 9]. Disponível em: http://www.datasus.gov.br/idb.

20. Schoen FJ. Os vasos sanguíneos. In: Kumar V, Abbas AK, Nelson F, Robbins

SL, Cotran RS. Patologia: bases patológicas das doenças. 7 ed. Rio de Janeiro: Elsevier; 2005. cap. 11, p. 537-581.

21. Kenneth Segers BD, Gerry AF, Nicolaes. Coagulation factor V and thrombophilia:

Background and mechanisms. Thromb Haemost 2007;98:530-42.

22. Franco CRC, Rocha HAO, Trindade ES, Santos IAN, Leite EL, Veiga SS, et al.

Heparan sulfate and control of cell division: adhesion and proliferation of mutant CHO-745 cells lacking xylosyl transferase. Brazilian J Med Biol Res. 2001 Aug;34(8):971-5. 23. Malone PC, Agutter PS. The aetiology of deep venous thrombosis. QJM. 2006;99(9):581-93.

24. Anderson FA, Spencer FA. Risk factors for venous thromboembolism. Circulation. 2003;107:I9-I16.

25. Silver D, Kapsch DN, Tsoi EKM. Heparin-induced thrombocytopenia, thrombosis,

and hemorrhage. Ann Surg. 1983;198(3):301-6.

26. Fabris F, Luzzatto G, Stefani PM, Girolami B, Cella G, Girolami A.

(26)

21

27. Levine MN, Raskob G, Beyth RJ, Kearon C, Schulman S. Hemorrhagic complications of anticoagulant treatment. Chest. 2004;126(3):287S-310S.

28. Berteau O, Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions,

and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide. Glycobiology. 2003 Jun;13(6):29R-40R.

29. Matsubara K. Recent advances in marine algal anticoagulants. Curr Med Chem

Cardiovasc Hematol Agents. 2004;2(1):13-9.

30. Raven PH. Protistas:algas e protistas heterotróficos (heterótrofos). In: Raven PH,

Evert RF, Eichhorn SE. Biologia vegetal. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. cap. 15, p. 315.

31. Boisson-Vidal C H, Ellouali M, Blondin C, Fischer AM, Agostini A, Jozefonvicz. J.

Biological activities of polysaccharides from marine algae. Drugs future. 1995; 20:1237-1249.

32. Durig J, Bruhn T, Zurborn KH, Gutensohn K, Bruhn HD, Beress L. Anticoagulant

fucoidan fractions from Fucus vesiculosus induce platelet activation in vitro. Thromb. res. 1997;85(6):479-91.

33. Haroun-Bouhedja F ME, Sinquin C, Boisson-Vidal C. . Relation between

sulfato groups and biological activities of fucans. Thromb res. 2000;100:453-9.

34. Rocha HAO LE, Medeiros VP, Lopes CC, Nascimento FD, Tersariol ILS, Sampaio LO et al. Natural sulfated polysaccharides as antithrombotic compounds. Structural characteristics and effects on the coagulation cascade. In: Verli H, editor. Carbohydrate Structure and Biological Function. Kerala: Transworld reserch network; 2006. p. 51-67.

35. Percival EGV, McDowell RH. Chemistry and enzymology of marine algal

polysaccharides. London: Academic Press, 1967.

36. Alves AP, Mulloy B, Diniz JA, Mourao PAS. Sulfated polysaccharides from the

egg jelly layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins. J Biol Chem. 1997;272(11):6965-71.

37. Farias GGM. Uma nova abordagem para o estudo comparativo dos polissacarídeos de algas: classe Phaeophycea [Dissertação]. São Paulo: Universidade Federal de São Paulo; 1993.

38. Dietrich CP, Farias GGM, Deabreu LRD, Leite EL, Dasilva LF, Nader HB. A New

Approach For The Characterization Of Polysaccharides From Algae - Presence Of 4 Main Acidic Polysaccharides In 3 Species Of The Class Phaeophycea. Plant Sci. 1995 Jun 30;108(2):143-53.

39. Alves LG. Polissacarídeos ácidos presentes no folíolo, talo e flutuador da alga

marinha Sargassum vulgare [Dissertação]. Natal: Universidade Federal do Rio Grande do Norte; 2000.

(27)

22

40. Shanmugam M, Mody KH. Heparinoid-active sulphated polysaccharides from

marine algae as potential blood anticoagulant agents. Curr Sci. 2000 Dec 25;79(12):1672-83.

41. Chevolot L, Foucault A, Chaubet F, Kervarec N, Sinquin C, Fisher AM, et al.

Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity. Carbohydr Res. 1999 Jun 30;319(1-4):154-65.

(28)

6. ABSTRACT

Fucan is a term used to denominate a family of sulfated L-fucose-rich

polysaccharides. The brown alga Spatoglossum schröederi (Dictyotaceae) has three heterofucans namely fucan A, B and C. The 21 kDa fucan A is composed of

a core of β (1-3) glucuronic acid-containing oligosaccharide of 4.5 kDa with

branches at C4 of fucose chains α (1-3) linked. The fucose is mostly substituted at

C4 with a sulfate group and at C2 with chains of β (1-4) xylose. This fucan has

neither anticoagulant (from from 0.1 to 100μg) nor hemorrhagic activities (from 50 to 800 μg/mL). The antithrombotic test in vivo showed the fucan A has no activity in any of the concentrations (from 0.2 to 20μg/g/day) tested 1h after polysaccharide administration. However, when fucan A was injected endovenously 24h before the ligature of the venae cavae, we observed a dose-dependent effect, reaching

saturation at around 20αg/g of rat weight. In addition, this effect is also

time-dependent, reaching saturation around 16h after fucan administration. In addition, regardless of administration pathway, fucan A displayed antithrombotic action. The exception was the oral pathway. Of particular importance was the finding that fucan A stimulates the synthesis of an antithrombotic heparan sulfate from endothelial cells like heparin. The hypothesis has been raised that in vivo antithrombotic activity of fucan A is related to the increased production this heparan. Taken together with the fact that the compound is practically devoid of anticoagulant and hemorrhagic activity suggests that it may be an ideal antithrombotic agent in vivo.