UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
AGRONOMIA
DIVERSIDADE DA HETEROCROMATINA NA SUBTRIBO LAELIINAE (EPIDENDROIDEAE: ORCHIDACEAE), COM ÊNFASE NO GÊNERO Cattleya
Lindl.
BRUNO CÉSAR QUERINO DE SOUZA
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
AGRONOMIA
DIVERSIDADE DA HETEROCROMATINA NA SUBTRIBO LAELIINAE (EPIDENDROIDEAE: ORCHIDACEAE), COM ÊNFASE NO GÊNERO Cattleya
Lindl.
BRUNO CÉSAR QUERINO DE SOUZA
Orientador: Leonardo Pessoa Felix
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento às exigências para obtenção do grau de Doutor em Agronomia. Área de Concentração: Ecologia, Manejo e Conservação de Recursos Naturais.
Ficha Catalográfica Elaborada na Seção de Processos Técnicos da
Biblioteca Setorial do CCA, UFPB, campus II, Areia - PB
S729d Souza, Bruno César Querino de.
Diversidade da heterocromatina na subtribo Laeliinae (Epidendroideae: Orchidaceae) com ênfase no gênero Cattleya Lindl. / Bruno César Querino de Souza. - Areia: UFPB/CCA, 2015.
77 f. : il.
Tese (Doutorado em Agronomia) - Centro de Ciências Agrárias. Universidade Federal da Paraíba, Areia, 2015.
Bibliografia.
Orientador: Leonardo Pessoa Felix.
– –
AGRADECIMENTOS
Acima de tudo a Deus, por sempre guiar meus passos pelo caminho correto.
Ao Prof. Leonardo Pessoa Felix, pela orientação, paciência, confiança e por ser um exemplo de profissional que vou seguir pelo resta da vida.
Ao Prof. Luiz Gustavo, pela colaboração e pela grande ajuda em todas as fases de elaboração desse trabalho. Sempre estava disposto a ajudar.
A Profa. Ana Emília, pela colaboração em várias etapas desse trabalho.
Ao Prof. Marcelo Guerra, pela disponibilidade do laboratório de Citogenética Vegetal da UFPE.
A profa. Dilma trovão, pelas correções que são cruciais para a conclusão desse trabalho. A Maria Lucia, um exemplo de mãe, dedicação e amor. Foi sempre ela a quem recorri nas horas de incertezas.
A meu pai Antonio Querino, pelos bons conselhos e um exemplo de caráter e honestidade. A meus irmãos Djane e Geandson, pelo amor, carinho e compreensão.
A Luana Ferreira, pelo apoio, carinho e ajuda durante a realização desse trabalho. Em vários momentos foi com quem podia contar.
A minha grande amiga Sarah do Nascimento, pela amizade sincera e pela força nos momentos difíceis.
A minha mais recente amiga Carol, pela colaboração e ajuda na reta final da realização desse trabalho.
Aos meus queridos amigos e colegas do Laboratório Angeline, Enoque, Joel, Maria Clara, Amanda, Laís, Achilles, Cláudio, Nalvinha, Erton, Helen e Saulo, pela convivência e momentos de descontração.
Aos amigos Iago, Helton, Fábio e Jeferson, pois mesmo sem entender, aceitavam, compreendiam e apoiavam.
Ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, pela oportunidade de doutoramento.
À Coordenação do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq, pela concessão de bolsa.
SUMÁRIO
Resumo... 1
Abstract... 2
1 Introdução... 3
2 Fundamentação Teórica... 4
2.1 A família Orchidaceae... 4
2.1.1 Morfologia, taxonomia e filogenia da família Orchidaceae... 4
2.1.2 Citogenética da família Orchidaceae... 6
2.1.3 Distribuição da heterocromatina na família Orchidaeceae... 6
2.2 Aspectos gerais sobre Laeliinae... 7
2.2.1 Taxonomia e filogenia de Laeliinae... 8
2.2.2 Citgenética da subtribo Laeliinae... 9
2.3 O gênero Cattleya Lindl... 10
2.4 Quantificação do conteúdo de DNA nuclear em Orchidaceae... 11
3 Referências bibliográficas... 14
4 Capítulo 1: Diversidade da Heterocromatina e conteúdo de DNA nuclear em espécies do gênero Cattleya Lindl. (Epidendroidae, Orchidaceae)... 24
5 Capítulo 2: Tendências evolutivas de sequências repetitivas em representantes da subtribo Laeliinae (Epidendroidae, Orchidaceae)... 49
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1
Fig. 1 – Relações evolutivas entre os principais clados do gênero Cattleya (Epidendroideae, Orchidaceae). Em A, C. grandis; B, C. sincorana; C, C. rupestris;
D, C. cernua; E, C. labiata; F, C. granulosa. Proposta de classificação e topologia da árvore filogenética baseada em van den Berg (2014)... 29
Fig. 2 - Principais padrões de distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI
(azul) em espécies do gênero Cattleya, correspondente aos clados Crispae (A), Cattleya (B) e Intermediae (C). Metáfases mitóticas de C. crispata (A, A’ e A’’), C. labiata (B,
B’ e B’’) e C. tenuis (C, C’ e C’’). Imagens em A’’, B’’ e C’’ correspondem à sobreposição. Setas indicam as principais bandas CMA+/DAPI- no grupo. Barra em
C’’ corresponde a 5µm...
37
Fig. 3 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies
gênero Cattleya dos subclados Cattleya e Crispae. Metáfases mitóticas de C. grandis (A), C. pfisterii (B), C. rupestris (C), C. sincorana (D), C. cernua (E), C. triane (F) e C. warnei (G). Setas indicam bandas CMA+/DAPI– pericentroméricas. Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em G corresponde a 5µm... 38
Fig. 4 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies
do gênero Cattleya do clado Intermediae. Metáfases mitóticas de C. aclandiae (A); C. amethytoglossa (B); C. elongata (C), C. granulosa (D), C. guttata (E), C. intermedia
(F), C. loddigesii (G), C. nobillior (H) e C. walqueriana (I). Cabeças de setas indicam
bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em I corresponde a
5µm...
39
Fig. 5 – Relações filogenéticas das espécies do gênero Cattleya e reconstrução ancestral de caracteres para bandas DAPI+. O modelo de reconstrução utilizado foi
Fig. 6 – Histograma mostrando o tamanho do genoma de Cattleya trianae com múltiplos derivados de endopoliploidia (2C, 4C e 8C)... 41
Capítulo 2
Fig. 1 – Relações evolutivas entre os clados estudados da subtribo Laeliinae (Epidendroideae, Orchidaceae) com base na proposta de classificação e topologia da árvore filogenética baseada em van den Berg et al. (2009). Em A, Cattleya intermedia;
B, Brassavola nodosa; C, Guarianthe skinneri; D, Laelia gouldiana; E, Scaphyglottis fusiformis; F, Prosthechea fragrans; G, Encyclia alboxantina... 54
Fig. 2 - Principais padrões de distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI
(azul) em espécies da subtribo Laeliinae. Metáfases mitóticas de Brassavola ceboletta (A), B. nodosa (B), B. tuberculata (C), Cattleya labiata (D), C. trianae (E), C. intermedia (F), Prosthechea faresiana (G), P. fragrans (H), Guarianthe skinneri (I), Scaphyglottis fusiformis (J), S. sickii (K), Laelia marginata (L) e L. gouldiana (M).
Setas em A, L, N, indicam bandas CMA+/DAPI– pericentroméricas, em M, cromossomo supranumerário. Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em N corresponde a 5µm... 62 Fig. 3 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies do
gênero Encyclia. Metáfases mitóticas de E. advena pop. União dos Palmares (A), E. advena pop. Brejo da Madre de Deus (B), E. andrichii (C), E. flava (D), E. alboxantina
(E), E. ionosma (F), E. aff. osmanta, (G), E. jeneschiana (H), E. oncidioides (I), E. seidelii (J). Setas em E, F, indicam bandas CMA–/DAPI+, em H, bandas CMA+/DAPI– pericentroméricas. Cabeças de setas indicam bandas terminais CMA+/DAPI–. Barra em
J corresponde a 5µm... 63
Fig. 4 – Relações filogenetéticas das espécies da subtribo Laeliinae e reconstrução
ancentral de caracteres para ‘bandas DAPI+. O modelo de reconstrução utilizado foi
Fig. 5 – Evolução das bandas CMA (amarelo), DAPI (azul), número cromossômico e relações filogenéticas nas espécies no gênero Encyclia. Proposta de topologia da árvore
filogenética baseada em Bastos
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1. Lista de táxons analisados, números de coletor, locais de coleta, números
cromossômicos, tamanho do genoma em 2C e tipos de bandas fluorescentes mais evidentes. T= terminais, I= intersticiais, P= proximais, PG = pictogramas e ca.= cerda de. * Jones et al., 1998... 32
Capítulo 2
Tabela 1. Lista de táxons analisados da subtribo Laeliinae, Voucher, locais de coleta,
1 Diversidade da Heterocromatina na subtribo Laeliinae (Epidendroideae: Orchidaceae), com ênfase no gênero Cattleya Lindl.
Resumo
A subtribo Laeliinae compreende cerca de 2000 espécies distribuídas em 38 gêneros, exclusivamente neotropical, sendo considerada a terceira maior subtribo da família. Citologicamente apresenta a maioria das espécies com número cromossômico básico x = 20 e evolução cariotípica principalmente associada a poliploidia. O presente trabalho objetivou realizada uma análise citogenética comparativa em 42 espécies da subtribo Laeliinae com base em bandeamento com fluorocromos, CMA/DAPI, além de estimar o conteúdo de DNA nuclear de várias dessas espécies através de citometria de fluxo. Todas as espécies apresentaram 2n = 40, exceto Cattleya nobilior com 2n = 42 e os poliploides C. elongata, C. crispata, Encyclia alboxanthina, E. jenischiana, E. seidelii, Laelia gouldiana e Prosthechea faresiana (2n = 80). Foram observados pelo menos dois blocos CMA+/DAPIterminais em todas as espécies, além de bandas DAPI+/CMA– proximais ou terminais em várias outras espécies. O conteúdo de DNA das espécies variou de 2C = 3,45 pg em Brassavola nodosa até 2C = 7,96 pg em C. guttata, com ciclos de endoreduplicação na maioria das espécies. Nossos dados sugerem que embora ocorra uma aparente estabilidade cariotípica macroestrutural (2n = 40) nas espécies da subtribo Laeliinae e no gênero Cattleya como um todo, em geral, o padrão de diversificação da heterocromatina foi compatível com os agrupamentos filogenéticos, identificando possíveis sinapomorfias que permitem um melhor entendimento de espécies taxonomicamente complexas.
2 Diversity of heterochromatin in subtribe Laeliinae (Epidendroideae: Orchidaceae), with emphasis on genus Cattleya Lindl.
Abstract
The subtribe Laeliinae comprises about 2000 species in 38 genera, exclusively neotropical and is considered the third largest family of subtribe. Cytological features most species with basic chromosome number x = 20 and karyotype evolution mainly associated with polyploidy. This study aimed performed a comparative cytogenetic analysis in 42 species of Laeliinae subtribe based on banding fluorochromes with CMA/DAPI, and estimate the nuclear DNA content of many of these species through citmetria of flow. All species presented 2n = 40 except Cattleya nobilior with 2n = 42 and the polyploid C. elongata, C. crispata, Encyclia alboxanthina, E. jenischiana, E. seidelii, Laelia gouldiana and Prosthechea faresiana (2n = 80). We observed two blocks CMA+/DAPI terminals in all species. The DNA content of species ranged from 2C = 3.45 pg in Brassavola nodosa to 2C = 7.96 pg in C. guttata. The leaf tissues of the analyzed representatives presented endoreduplication cycles in most species. Our data suggest that although it occurs an apparent macrostructural stable karyotype (2n = 40) in the species of the subtribe Laeliinae as well as the genus Cattleya studied, they present a pattern of diversification of heterochromatin consistent with the phylogenetic clusters and identify possible sinapomorphies that allow better understanding of taxonomically complex species.
3 1 INTRODUÇÃO
A subtribo Laeliinae pertence à família Orchidaceae, e está inserida na subfamília Epidendroidae, tribo Epidendreae, composta por cerca de 2000 espécies distribuídas em 38 gêneros (Chase et al., 2015). É exclusivamente neotropical com seus representantes espalhados pelos trópicos e subtrópicos das Américas e Caribe (Dressler, 1981; 1993). Alguns gêneros como Brassavola R.Br, Cattleya Lindl, Guarianthe Dressler & WE.Higgins e Laelia Lindl. apresentam elevado valor ornamental (van den Berg et al., 2009). Caracteriza-se por apresentar flores ressupinadas, raramente não-ressupinadas, com labelo livre ou aderido à coluna (Pridgeon et al., 2005), um número variável de polínias (dois, quatro, seis ou oito), em geral achatadas lateralmente (Dressler, 1993), com espécies epífitas, rupícolas ou terrestres.
A subtribo Laeliinae tem passado por importantes alterações nomenclaturais nos últimos anos a partir de filogenia molecular (Chase et al., 2015; van den Berg, 2000; 2008; van den Berg & Chase, 2000; van den Berg et al., 2009). Foi verificado que os gêneros Ponera Lindl., Isochilus R.Br. e Helleriella A.D.Hawkes deveriam ser transferidos para a subtribo Ponerinae. Outra alteração importante na subtribo foi a inclusão de todas as espécies brasileiras de Laelia, juntamente com Sophronitis Lindl. para Cattleya (van den Berg et al., 2000; van den Berg et al., 2009), que atualmente são considerados séries dentro do gênero (van den Berg, 2014).
Em termos cariológicos, a subtribo Laeliinae apresenta contagens cromossômicas para apenas cerca de 3% de seus representantes, com 2n = 40 para a maioria das contagens da subtribo, com raras ocorrências de poliploidia e disploidia. Dentro da subtribo alguns gêneros, como Cattleya e Laelia são mais estudados citologicamente, enquanto gêneros como Encyclia, com um número de espécie maior que Cattleya, apresenta apenas sete espécies com registros cromossômicos (Felix & Guerra, 2010).
4
de caracteres tem ainda auxiliado no entendimento do significado evolutivo das mudanças cromossômicas num contexto filogenético (Vaio et al., 2013).
O objetivo do presente trabalho foi analisar evolução cariotípica da subtribo Laeliinae e do gênero Cattleya através de técnicas de bandeamento CMA/DAPI, do conteúdo de DNA nuclear, buscando esclarecer aspectos das relações taxonômicas e os mecanismos de evolução cromossômica nesse grupo de plantas.
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 A família Orchidaceae
A família Orchidaceae apresenta cerca de 27.000 espécies distribuídas por aproximadamente 740 gêneros (Chase et al., 2015; Dressler, 2005; The Plant List, 2015), sendo considerada uma das duas maiores e mais diversa famílias de angiospermas (Phillips et al., 2012). Está presente em todos os continentes com exceção do Antártida, porém a maior diversidade encontra-se nas regiões tropicais (Pridgeon et al., 2005). O Brasil é considerado o terceiro país mais rico em espécies, (Pabst & Dungs 1975; Dressler, 1981), sendo reconhecidos aproximadamente 238 gêneros com 2.500 espécies, dessas, 692 espécies e 156 gêneros ocorrem na Região Nordeste (Pabst e Dungs, 1975; 1977; van den Berg et al., 2009; Barros et al., 2015) e muitas delas com elevado potencial ornamental e valor econômico.
2.1.1 Morfologia, taxonomia e filogenia da família Orchidaceae
5
e o fruto, uma cápsula deiscente com grande número de sementes minúsculas e tegumento membranáceo, com endosperma ausente (Souza & Lorenzi, 2005; Judd, et al., 2009).
Por muito tempo os aspectos morfológicos foram os únicos caracteres utilizados na reconstrução da história evolutiva dos grupos vegetais, sendo fundamentais para a descrição formal de famílias, gêneros e espécies. Com o surgimento da biologia molecular, foi possível acessar várias informações genéticas através de análises moleculares que são extremamente úteis para inferências filogenéticas. Essas análises fornecem informações adicionais que não são possíveis através das análises morfológicas. Desde então, os caracteres moleculares juntamente com os morfológicos, têm auxiliado os taxonomistas no aprimoramento das relações entres táxons (ver, por exemplo, Renner, 1999; Bremer et al., 2001; Donoghue & Doyle, 1989; Doyle & Zimmer, 1994; Doyle & Endress, 2000).
6 2.1.2 Citogenética da família Orchidaceae
A análise do número cromossômico tem sido utilizada como uma ferramenta importante na compreensão de relações taxonômicas e evolutivas em diversos grupos de angiospermas (ver, por exemplo, Shan et al., 2003; Vanzela, 2003; Weiss-Schneeweiss et al., 2003; Bernardello et al., 2008; Guerra, 2008). O número cromossômico pode
permanecer constante dentro de um gênero ou podem variar entre espécies e até mesmo entre populações de uma mesma espécie (Assis et al., 2013). Dentro da família Orchidaceae vários estudos já foram realizados com contagens de número cromossômico (Tanaka & Kamemoto, 1984; Aoyama et al., 1994; Dawson et al., 2007; Daviña et al., 2009; Felix & Guerra, 2010) e esses dados permitem inferir os mecanismos envolvidos na evolução numérica, bem como caracterizar táxons nesse grupo de plantas.
Por apresentar um número elevado de espécies, a família é relativamente pouco conhecida em termos de número cromossômico, apresentando cerca de 15% de seus representantes citologicamente estudados (Arditti, 1992; Felix & Guerra, 2001). O grupo apresenta grande variação cromossômica numérica, desde 2n = 12 em Erycina pusilla (como Psygmorchis pusilla) a 2n = 240 em Epidendrum cinnabarinum, sendo 2n = 40 considerado o número cromossômico mais comum na família (Felix & Guerra, 1999; Guerra, 2000; Conceição et al., 2006; Felix & Guerra, 2010). Na subfamília Epidendroideae os números variam de 2n = 24 em E. fulgens e Malaxis pubescens a 2n = 240 em Epidendrum cinnabarinum, que também é a maior contagem para a família (Felix & Guerra, 2010; Assis et al., 2013).
2.1.3 Distribuição da heterocromatina na família Orchidaeceae
Em termos de padrão de distribuição da heterocromatina dentro da família, alguns grupos foram mais estudados que outros. Na subfamília Orchidoideae, por exemplo, alguns trabalhos foram realizados com a heterocromatina constitutiva de algumas espécies dos gêneros Orchis L. e Serapias L., sugerindo que Serapias parece apresentar uma evolução da heterocromatina mais rapida do que Ophrys (D’Emerico et al., 2005;
7
subfamília. Para o gênero Cephalanthera Rich., C. damasonium e C. longifolium foram caracterizadas com base no padrão de bandas C e CMA/DAPI ou CMA/Quinacrina que diferiram em relação ao número, localização de bandas e composição de bases da heterocromatina constitutiva. Kao et al., (2001) estudaram os padrões de acúmulo da heterocromatina de nove espécies do gênero Phalaenopsis Blume e concluíram que o acúmulo de heterocromatina constitutiva é uma das principais causas para a variação cariótipo nesse gênero. Através do bandeamento cromossômico aplicado por Koehler et al., (2008) em 18 espécies da subtribo Maxillariinae foi possível esclarecer os
mecanismos que estavam envolvidos na evolução cariotípica desse grupo. De acordo com os resultados foi sugerido que eventos de fusão ou fissão cêntrica é a explicação mais provável para a variação da disploidia do número cromossômico para algumas espécies do gênero Christensonella Szlach., como por exemplo, em C. ferdinandiana (Barb.Rodr.) Szlachem.
Amplificação da heterocromatina tem sido observada na subtribo Maxillariinae, como em Brasiliorchis schunkeana (Campacci & Kautsky) R.B.Singer, S.Koehler & Carnevali, e é provavelmente o resultado da atividade intensiva de retrotransposons ou evolução em concerto do DNA repetitivo em tandem, especialmente após rearranjos cromossômicos e hibridação (Moraes et al., 2012). Ainda na subtribo Maxillariinae o trabalho de Cabral et al. (2006) analisaram os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva em quatro espécies do gênero Maxillaria Ruiz & Pav., observaram que os sítios de DNAr 5S e 45S co-localizam com algumas das bandas CMA+. Na subtribo Pleurothallidinae foram analisados a variação cromossômica numérica e os padrões de bandas CMA/DAPI em 48 espécies pertencentes a 12 gêneros (Oliveira et al., 2015). Foi verificado que a variação nos padrões de bandas heterocromáticas segue a classificação das secções do gênero Acianthera. Além disso, mudanças na organização da heterocromatina também desempenham um papel importante na formação dos cariótipos em Pleurothaliidinae.
2.2 Aspectos gerais sobre Laeliinae
8
Cattleya e Laelia apresentam grande valor horticultural, outros como Encyclia e
Prosthechea são gêneros representativos na florística dos neotrópicos. A grande
diversidade presente na subtribo provavelmente deve estar relacionada à especialização em particular dos polinizadores bem como adaptações aos diferentes hábitats (van der Pijl e Dodson, 1966). A ocorrência de híbridos natural é um evento recorrente na família Orchidaceae (Dressler, 1993; Azevedo et al., 2006) e vários intergenéricos e interespecíficos já foram descritos para o grupo (ver, por exemplo, Pabst e Dungs 1975; 1977; Borba & Semir, 1998). A subtribo constitui um grupo de interesse em relação aos padrões de diversificação, devido justamente a grande variação das características morfológicas e ao grande número de espécies e grupos genéricos e infragenéricos, (van den Berg et al., 2009).
2.2.1 Taxonomia e filogenia de Laeliinae
A subtribo Laeliinae foi descrita por Bentham (1881) com dois grupos, "Laelieae" e "Stenoglosseae", que continham gêneros agora colocados em Laeliinae. Já em 1889 Pfitzer uniu "Laeliae" e "Stenoglosseae" numa única subtribo, estabelecendo o conceito de Laeliinae. Dressler (1971) removeu o gênero Meiracyllium Rchb. f. à sua própria subtribo monogenérica Meiracylliinae. Em 1981 o mesmo autor posiciona 43 gêneros em Laeliinae e propõe seis alianças baseadas em Baker (1972), o gênero Meiracyllium é mantido em sua própria subtribo e Arpophyllum La Llave & Lex. é considerado parte da Sobraliinae e Basiphyllaea Schltr. é inserido em Laeliinae. Dressler (1990) descreve uma nova subtribo monogenérica Arpophyllinae, para o gênero Arpophyllum. No ano seguinte Szlachetko (1991) publicou uma nova subtribo Isochilinae baseado em Isochilus R. Br. e, posteriormente, Dressler (1993) apresentou três subtribos: Meiracylliinae, Arpophyllinae e Laeliinae, enquanto Szlachetko (1995) posicionou os gêneros de Laeliinae sensu Dressler (1993) em três subtribos diferentes: Laeliinae, Epidendrinae e Ponerinae, sendo Isochilus reintroduzida em Laeliinae.
A partir de análises moleculares van den Berg et al., (2000), reposicionaram os gêneros Ponera, Isochilus e Helleriella que anteriormente eram incluídos em Laeliinae, para a subtribo Ponerinae.
9
os gêneros: Basiphyllaea Schltr. para Bletiinae, Helleriella A.D. Hawkes, Isochilus R.Br. e Ponera Lindl. para Ponerinae, e Dilomilis Raf. e Neocogniauxia Schltr. para Pleurothallidinae (van den Berg et al., 2005). A subtribo ocorre em todas as áreas tropicais e subtropicais das Américas e do Caribe e, na América do Sul, a distribuição de algumas espécies de Cattleya e Epidendrum estende-se desde a Colômbia até o Uruguai e norte da Argentina (van den Berg et al., 2009).
A subtribo pode ser facilmente identificada por apresentar hábito epifítico, rupícola ou terrícola, pseudobulbos recobertos por várias bainhas, folhas apicais caules delgados e alongados e folhas dísticas articuladas com as bainhas adpressas. Apresenta inflorescência terminal, às vezes coberta por bráctea (espata), flores geralmente vistosas, ressupinadas ou não, com labelo livre ou adnado em diversos graus à coluna e polínias em número de dois, quatro, seis ou oito, geralmente achatadas lateralmente, raramente clavadas (Dressler 1981; van den Berg & Chase, 2005).
2.2.2 Citgenética da subtribo Laeliinae
Citologicamente a subtribo é caracterizada por possuir número básico x = 20 e evolução principalmente por poliploidia (Felix & Guerra, 2010) que pode ser observada para os gêneros Cattleya, Laelia e Prosthechea Knowles & Westc. (Tanaka & Kamemoto 1974, 1984; Felix & Guerra, 2000), que algumas vezes parece associada a hibridização interespecífica (Yamagishi-Costa & Forni-Martins, 2009).
10 2.3 O gênero Cattleya Lindl.
O gênero Cattleya foi proposto em 1822 por Lindley, que descreveu Cattleya labiata Lindl. que é reconhecida como espécie tipo do gênero, embora algumas espécies
já tenham sido descritas para outros gêneros, como por exemplo, C. forbesii Lindl. descrita com Epidendrum pauper Vell., C. guttata Lindl., como Epidendrum eleganse Vell. e C. loddigesii Lindl. como Epidendrum canaliculatum Vell. que na "Flora Fluminensis" de Vellozo em 1790 (publicada em 1829) e C. violacea como Cymbidium violaceum em 1815 por Kunth, na obra "Nova Genera et Species Plantarum" publicada
em 1815. (Braem 1994; van den Berg, 1996). O gênero é caracterizado por possuir flores grandes e labelo não fundido com a coluna, por apresentar rizomas fortes e semi-lenhosos, ligeiramente reptantes, com uma nova brotação a cada estação de crescimento. Existem dois grupos de espécies dentro do gênero: um com pseudobulbos fusiformes, lateralmente comprimidos, com uma folha apical (unifoliada), e outro com pseudobulbos cilíndricos com duas folhas apicais (bifoliadas), eventualmente três. Os botões florais estão rodeados por uma bráctea, a espata. (Braem, 1994). A inflorescência é terminal, embora em algumas espécies as flores sejam produzidas sobre pseudobulbos especiais, desprovidos de folhas, o que dá a impressão de saírem do rizoma (Withner, 1988). Suas flores são compostas por três sépalas e três pétalas, sendo uma modificada e bem mais elaborada, o labelo que envolve a coluna (formada pela fusão dos estames e estigma). Existe apenas uma antera funcional, e ainda uma estrutura modificada chamada rostelo, que evita a autofecundação por ocasião da visita de um polinizador. Embora haja poucas publicações, a polinização da maioria das espécies ocorre por melitofilia, e mais raramente, por ornitofilia (van der Pijl e Dodson, 1966; Withner, 1988; Dressler, 1993).
Algumas características morfológicas separam as Cattleya dos demais grupos relacionados. Por exemplo, o labelo não fundido à coluna, separa o grupo das espécies de Epidendrum, enquanto coluna não protrusa dorsalmente, o separa de Encyclia. A
11
Para solucionar o problema os autores propuseram transferir todas as espécies de Laelia registradas para o Brasil, para o gênero Sophronitis (van den Berg et al., 2000; van den Berg & Chase 2000). Chiron & Castro (2002) subdividiram as antigas espécies de Laelia brasileiras em diversos gêneros menores, Hadrolaclia (Schlechter) Chiron & V. P. Castro, Dungsia Chiron & V. P. Castro, Microlaelia (Schlechter) Chiron & V. P. Castro Hadrolaelia (Schlechter) Chiron & V. P. Castro e Hoffmannseggella H. G. Jones, geralmente correspondentes aos antigos subgêneros ou secções de Laelia. Mais recentemente, estudos mostraram que todas as espécies do gênero Sophronitis mais as Laelia brasileiras se agrupavam dentro de Cattleya (van den Berg, 2008; van den Berg et al., 2009), uma forma a manter a monofilia de Cattleya e de evitar a criação de vários
nomes para gêneros menores.
Com a atual circunscrição, Cattleya abrange aproximadamente 114 espécies, distribuídas pela América latina (Govaerts et al., 2015; van den Berg, 2014), são plantas usualmente epífitas e, mais raramente, rupícolas ou terrestres (Pabst e Dungs 1975; Chase et al. 2003; van den Berg 2008). Para o Brasil, são referidas 90 espécies sensu van den
Berg et al. (2009), a maior parte do Planalto Brasileiro, nas porções leste, sul e central do Brasil (Barros et al., 2015).
2.4 Quantificação do conteúdo de DNA nuclear
A técnica de quantificação de DNA tem sido reconhecida como um relevante parâmetro para caracterização genômica, com aplicabilidade em estudos evolutivos, biologia celular, ecologia, filogeografia e sistemática (Knight & Beaulieu, 2008; Jones et al., 1998; Suda et al., 2006). A técnica de quantificação de DNA auxilia na compreensão
sobre a variação cromossômica numérica, nível de ploidia, estimativa do tamanho do genoma de diferentes espécies, detecção de híbridos interespecíficos (Mizuhiro et al., 2001; Suda et al., 2006; Leitch et al., 2009; ) e mecanismos de evolução cariotípica que atuam em um determinado grupo vegetal (Suda et al., 2006).
12
duas espécies (Dolezel & Bartos, 2005), sendo uma espécie em estudo e outra, uma espécie de conteúdo de DNA nuclear conhecido (padrão de referência). Em plantas, alguns autores (calibraram o tamanho do genoma de algumas cultivares) sugeriram assim alguns genomas de cultivares, como padrões internos de referência [Raphanus sativus L. (2C = 1,11 pg), Lycopersicon esculentum Mill. (2C = 1,96 pg), Glycine max L. (2C = 2,50 pg), Zea mays L. (2C = 5,72 pg), Pisum sativum L. (2C = 9,09 pg), Vicia faba L. (2C = 26,90 pg), e Allium cepa L. (2C = 34,89 pg)] (Dolezel et al., 1992). O histograma resultante apresenta dois picos, um representa os núcleos em G1 e o segundo os núcleos em G2. A estimativa do tamanho do genoma é dada em picogramas (pg) de DNA ou em milhões de pares de bases (Mpb), sendo que 1pg=0,960Mpb (Price, et al., 2000; Doležel
& Bartoš 2005).
Atualmente já se conhece o conteúdo de DNA nuclear de um grande número de espécies. Nas angiospermas, a quantidade de DNA nuclear varia até 2.500 vezes, com os menores conteúdo de DNA nuclear nas plantas carnívoras Genlisea aurea A.St.-Hil. e G. margaretae Hutch. (Lentibulariaceae), com 1C = 0,065 pg (Greilhuber et al. 2006) e o
maior valor em Paris japonica (Franch. & Sav.) Franch. (Melanthiaceae), com 1C=152.23 pg (Pellicer et al., 2010). Dentro de uma mesma família a quantidade de DNA também pode variar. Em Orchidaceae a variação é de 168 vezes em termos de conteúdo de DNA, com valores bastante distintos, que variam de 1C = 0.33 pg em Oncidium maduroi (como Trichocentrum maduroi) à 1C = 55.4pg em Pogonia ophioglossoides
(Leitch et al., 2009). A família apresenta apenas 223 entre as mais de 27.000 espécies com estimativas para o valor C de DNA (Bennett & Leitch, 2015). Porém alguns gêneros dentro da família não apresentam sequer estimativas de conteúdo de DNA nuclear para nenhuma de suas espécies, como para os gêneros Brassavola R. Br., Encyclia Hook. e Guarianthe entre inúmeros outros. Para outros gêneros, como Epidendrum L. e Laelia
Lindl., as estimativas são mínimas. No gênero Cattleya, por exemplo, das 114 espécies descritas, apenas três apresentam quantificação do conteúdo DNA nuclear registrado na literatura (Bennett & Leitch, 2015).
13
Em plantas, as diferenças no tamanho do genoma entre espécies podem estar a milhares de ordens de grandeza, mesmo entre espécies intimamente relacionadas (Bennet e Leitch, 2005; Gregory, 2005).
Entre as principais causas do aumento no tamanho do genoma estão os eventos de poliploidização (Bennet & Leitch, 2005). Esse fenômeno aumenta o nível de ploidia, em algumas espécies e consiste na duplicação de todo o complemento cromossômico (Wendel, 2000; Guerra, 2008). Acredita-se que cerca de 80% de todas as angiospermas tenham passado por um ou mais episódios de poliploidização (Ramsey & Schemske, 2002; Adams & Wendel, 2005), porém se forem considerados os eventos antigos de duplicação, a polipliodia teria ocorrido em todas as angiospermas (Adams & Wendel, 2005; Soltis & Soltis, 2009).
A endoreduplicação é essencialmente a replicação de um genoma, sem a posterior divisão celular e é tipicamente encontrado em células diferenciadas em tecidos especializados (Masonbrink et al., 2013). A endopoliploidia em plantas já foi observada em vários tecidos diferentes (Emshwiller, 2002; Loureiro et al., 2007). Em plantas superiores sua ocorrência é uma característica comum, sendo observada na maior parte das espécies, tecidos e órgãos (Barow & Jovtchev, 2007). Em cotilédones de Arabidopsis thaliana, por exemplo, foram constatadas células com quantidade de DNA de até 256C
14 3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adams KL, Wendel JF. 2005. Polyploidy and genome evolution in plants. Current Opinion in Plant Biology. 8:135-141.
Aoyama, M, Tanaka, R, Hashimoto K. 1994. Karyomorphological studies on some
orchids belonging to subtribe Zygopetalinae. Kromosomo 73:2504-2524.
APG III, 2009. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the
orders and families of the flowering plants. Botanical Journal of the Linnean Society 161: 105-12.
Arditti J. 1992. Fundamentals of orchid biology. New York: J. Wiley, 691 p.
Assis FNM, Souza BCQ, Medeiros NE, Pinheiro F, Silva AEB, Felix LP. 2013.
Karyology of the genus Epidendrum (Orchidaceae: Laeliinae) with emphasis on subgenus Amphiglottium and chromosome number variability in Epidendrum secundum. Botanical
Journal of the Linnean Society 172: 329–344.
Assis FNM. 2013. Mecanismos de Evolução Cariotípica em Epidendrum L. (Orchidaceae: Epidendroideae). Tese, Universidade Federal da Paraíba, Areia, 121p.
Atwood JT. 1986. The size of the Orchidaceae and systematic distribution of epiphytic
orchids. Selbyana 9: 171-186.
Azevedo CO, Borba EL, van den Berg C. 2006. Evidence of natural hybridization and
introgression in Bulbophyllum involutum Borba, Semir & Barros and B. weddellii (Lindl.) Rchb.f. (Orchidaceae) in the Chapada Diamantina, Brazil, by using allozyme markers. Rev. Bras. Bot. 29: 415-421.
Baker RK. 1972. Foliar anatomy of the Laeliinae (Orchidaceae). PhD Thesis, Washington University, St Louis.
Barow M, Jovtchev G. 2007. Endopolyploidy in Plants and its Analysis by Flow
Cytometry.In: Doležel J, Greilhuber J, Suda J, editors. Flow Cytometry with Plant Cells
15 Barros F, Vinhos F, Rodrigues VT, Barberena FFVA, Fraga C.N, Pessoa E.M, Forster W, Menini Neto L, Furtado S.G, Nardy C, Azevedo C.O, Guimarães L.R.S. 2015. Orchidaceae in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de
Janeiro. (acesso em: 22 Jun. 2015).
http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB11498.
Bennett MD Leitch IJ. 2015. Plant DNA C-values database. (acesso em: 08 Jun. de
2015). http://www.kew.org/cvalues/.
Bennett MD Leitch IJ. 2005. Nuclear DNA amounts in Angiosperms: progress problems and prospects. Annals of Botany 95: 45-90.
Bentham G. 1881. Notes on Orchideae. Journal of the Linnaean Society 18: 281 – 360.
Bernardello G, Stiefkens L, Las Penas ML. 2008. Karyotype studies in Grabowskia and Phrodus (Solanaceae). Pl Syst Evol 275:265–269.
Borba EL, Semir J. 1998. Bulbophyllum cipoense (Orchidaceae), a new natural hybrid
from the Brazilian ‘campos rupestres’: description and biology. Lindleyana 13: 113 – 120.
Braem G. J. 1994. William Cattley e o gênero Cattleya. pp. 27-31 In L.C. Menezes. Cattleya warneri. Naturalia Publications, Turriers, France.
Bremer K. A. Backlund B. Sennblad U. Swenson K. Andreasen M. Hjertson J. Lundberg M. Backlund and B. Bremer. 2001. A phylogenetic analysis of 100+ genera
and 50+ families of euasterids based on morphological and molecular data with notes on possible higher level morphological synapomorphies. Plant Systematics and Evolution
229: 137-169
Cabral J. S Felix L. P. and Guerra M. 2006. Heterochromatin diversity and its
co-localization with 5S and 45S rDNA sites in chromosomes of four Maxillaria species (Orchidaceae). Genetics and Molecular Biology, 29: 659-664.
16 Chase MW, Cameron KM, Barrett RL, Freudenstein JV. 2003. DNA data and
Orchidaceae systematics: A new phylogenetic classification. In: Dixon KW, Kell SP, Barrett RL, Cribb PJ, eds. Orchid conservation. Natural History Publications Borneo: 69-89.
Chiron GR, Castro VP. 2002. Révision dês espèces brésiliènnes du genre Laelia
Lindley. Richardiana 2:4-28.
Conceição LP, Oliveira ALPC, Barbosa LV. 2006. Characterization of the Epidendrum cinnabarium Salzm. (Epidendroideae: Orchidaceae) Occurring in Dunas Do
Abaeté-Salvador, BA-Brasil. Japão: Cytologia, 71: 125-129.
Cribb PJ, Chase MW. 2005. Distribution. In: Pridgeon AM, Cribb PJ, Chase, MW, Rasmussen FN, eds. Genera Orchidacearum. Oxford: Oxford University Press, 3.
D’emericoS,PignoneD,BartoloG,PulvirentiS,TerrasiC,StutoS,ScrugliA. 2005.
Karyomorphology, heterochromatin patterns and evolution in the genus Ophrys (Orchidaceae). Botanical Journal of the Linnean Society 148: 87-99.
D’Emerico S, Cozzolino S, Pellegrino G, Pignone D, Scrugli A. 2002. Heterochromatin distribution in selected taxa of the 42-chromosomes Orchis s.l. (Orchidaceae). Caryologia 55: 55–62.
D’Emerico S, Pignone D, Scrugli A. 2000. Giemsa C-banded karyotypes in Serapias L. (Orchidaceae). Botanical Journal of the Linnean Society 133: 485–492.
Daviña JR, Grabiele M, Cerutti JC, Hojsgaard DH, Almada RD, Insaurralde ISE, Honfi AI. 2009. Chromosome studies in Orchidaceae from Argentina. Genetics and Molecular Biology 32: 811-821.
Dawson MI, Molloy BPJE, Beuzenberg EJ. 2007. Contributions to a chromosome atlas
of the New Zealand flora—39. Orchidaceae. New Zealand Journal of Botany 45: 611-684.
Dolezel J, Bartos J. 2005. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome
17 Doležel J, Sgorbati S, Lucretti S. 1992. Comparison of three DNA fluorochromes for flow cytometric estimation of nuclear DNA content in plants. Physiologia Plantarum 85: 625–631.
Donoghue MJ, Doyle JA. 1989. Phylogenetic studies of seed plants and angiosperms based on morphological characters. In K. Bremer and H. Jörnvall [eds.], The hierarchy
of life: molecules and morphology in phylogenetic studies, 181-193. Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands.
Doyle JA, Endress PK. 2000. Morphological phylogenetic analyses of basal
angiosperms: comparison and combination with molecular data. International Journal of Plant Sciences 161: S121-S153.
Doyle JA, Donoghue MJ, Zimmer EA. 1994. Integration of morphological and rRNA
data on the origin of angiosperms. Annals of the Missouri Botanical Garden 81:419-450.
Dressler RL. 2005. How many orchid species? Selbyana 26: 155-158.
Dressier RL. 1993. Phylogeny and Classification of the Orchid Family. Timber Press, Portland, Oregon.
Dressler RL. 1990. The major clades of the Orchidaceae-Epidendroideae. Lindleyana 5: 117–125.
Dressler RL. 1981. The orchids: natural history and classification. Harvard University Press, Cambridge, Massachusetts, USA.
Dressler RL. 1971. Nomenclatural notes on the Orchidaceae. V. Phytologia 21: 440–3.
Emshwiller E. 2002. Ploidy Levels among Species in the “Oxalis tuberosa Alliance” as
Inferred by Flow Cytometry. Annals of Botany 89: 741-753.
Felix LP, Guerra M. 2010. Variation in chromosome number and the basic number of
subfamily Epidendroideae (Orchidaceae). Botanical Journal of the Linnean Society 163: 234–278.
18 Felix LP, Guerra M. 2000. Cytogenetics and cytotaxonomy of some Brazilian species
of Cymbidioid orchids. Genetics and Molecular Biology 23:957-978.
Felix LP, Guerra 1999. M. Chromosome analysis in Psygmorchis pusilla (L.) Dodson e
Dressler: the smallest chromosome number known in Orchidaceae. Caryologia 52: 165– 168.
Freudenstein JV, Chase MW. 2015. Phylogenetic rela-tion-ships in Epidendroideae
(Orchidaceae), one of the great flower-ing plant radi-ations. Annals of Botany, January 11, 2015 doi: 10.1093/aob/mcu253.
Freudenstein JV, Rasmussen FN. 1999. What does morphology tell us about orchid
relationships? - A cladistic analysis. American Journal of Botany 86: 225-248.
Fukai S, Hasegawa A, Goi M. 2002. Polysomaty in Cymbidium. Hortscience 7:
1088-1091.
Garcia S, Garnatje T, Twibell JD, Valles J. 2006. Genome size variation in the Artemisia arborescenscomplex (Asteraceae, Anthemideae) and its cultivars. Genome. 49: 244.
Govaerts R, Bernet P, Kratochvil K, Gerlach G, Carr G, Alrich P. Pridgeon AM, Pfahl J, Campacci MA, Baptista H.Tigges H, Shaw J, Cribb J, George A, Kreuz K, Wood J. 2013. World checklist of Orchidaceae. Kew, UK: Board of Trustees of the Royal Botanic Gardens. Available at: http://www.kew.org/wcsp/monocots/ (06 de Jun de 2015).
Gravendeel B, Smithson A, Slik FJW, Schuitema A. 2004. Epiphytism and pollinator
specialization: drivers for orchid diversity? Philosophical Transitions of the Royal Society of London. Biological Sciences 359: 1523-1535.
Greilhuber J, Borsch T, Muller K, Worberg A, Porembski S, Barthlott W. 2006.
Smallest Angiosperm Genomes Found in Lentibulariaceae, with Chromosomes of Bacterial Size. Plant Biology 8: 770-777.
19 Guerra M. 2000. Chromosome number variation and evolution in monocots. In: Wilson KL, Morrison DA, eds. Monocots II: systematics and evolution. Melbourne: CSIRO, 127–136.
JonesWE,KuehnleAR,ArumuganathanK.1998. Nuclear DNA content of 26 orchid (Orchidaceae) genera with emphasis on Dendrobium. Annals of Botany 82:189-194.
Judd, WS, Campbell, CS, Kellogg, EA, Stevens, PF, Donoghue MJ. 2009. Sistemática Vegetal: Um enfoque filogenético. 3ed. Porto Alegre: Artemed, 612 p.
Kao YY, Chang SB, Lin TY, Hsieh CH, Chenk YH, ChenkWH, Chen CC. 2001.
Differential accumulation of heterochromatin as a cause for karyotype variation in Phalaenopsis Orchids. Annals of Botany 87:387-395.
Knight CA, Beaulieu JM. 2008. Genome size scaling through phenotype space. Annals of Botany 101: 759–766
Koehler S, Cabral JS, Whitten WM, Williams NH, Singer RB, Neubig KM, Guerra M, Souza AP, Amaral M. C. 2008. Molecular Phylogeny of the Neotropical Genus
Christensonella (Orchidaceae, Maxillariinae): Species Delimitation and Insights into
Chromosome Evolution. Annals of Botany 102: 491–507.
Leitch IJ, Kahandawala I, Suda J, Hanson L, Ingrouille MJ, Chase MW, Fay MF. 2009. Genome size diversity in orchids: consequences andevolution. Annals of Botany.104: 469-481.
Lepers-Andrzejewski S, Siljak-Yakovlev S, Brown SC, Wong M, Dron M. 2011.
Diversity and dynamics of plant genome size: an example of polysomaty from a cytogenetic study of Tahitian Vanilla (Vanilla × tahitensis, Orchidaceae). American Journal of Botany. 98: 986-997.
Lim WL, Loh CS. 2002. Endopolyploidy in Vanda Miss Joaquim (Orchidaceae). New Phytologist 159: 279–287.
20 Loureiro J, Santos C. 2004. Aplicação da citometria de fluxo ao estudo do genoma vegetal. Boletim de Biotecnologia. 77: 18-29.
Loureiro J, Rodriguez E, Dolezel J, Santos C. 2007. Comparison of four nuclear
isolation buffers for plant DNA flow cytometry. Annals of botany 98: 679-89.
Masonbrink RE, Fu S, Han F, Birchler JA. 2013. Heritable loss of replication control
of a minichromosome derived from the B chromosome of maize. Genetics 193: 77-84.
Mizuhiro M, Ito K, Mii M. 2001. Production and characterization of interspecific
somatic hybrids between Primula malacoides and P. obconica. Plant Science 161: 489-496.
Moraes AP, Leitch Ilia J, Leitch AR. 2012. Chromosome studies in Orchidaceae:
karyotype divergence in Neotropical genera in subtribe Maxillariinae. Botanical Journal of the Linnean Society 170: 29-39.
Oliveira IG, Moraes AP, Almeida EM, Assis FNM, Cabral JS, Barros F, Felix LP. 2015. Chromosomal evolution in Pleurothallidinae (Orchidaceae: Epidendroideae) with
an emphasis on the genusAcianthera: chromosome numbers and heterochromatin. Botanical Journal of the Linnean Society 178: 102–120.
Pabst GFJ, Dungs F. 1975. Orchidaceae Brasiliensis. Band 1. Hildesheim: Brücke-Verlag Kurt Schmersow, 408p.
Pabst GFJ, Dungs F. 1977. Orchidaceae Brasiliensis. Band 2. Hildesheim: Brücke-Verlag Kurt Schmersow, 418p.
Pfitzer E. 1889. Orchidaceae. In: Engler, A. e Prantl, K. (eds.) Die Natürlichen Pflanzenfamilien Ergänzungsheft. p. 52-222
Phillips RD, Dixon KW, Peakall R. 2012. Low population genetic differentiation in the
Orchidaceae: implications for the diversification of the family. Molecular Ecology. 21: 5208-5220.
21
Neotropical orchids Epidendrum fulgens and E. puniceoluteum (Orchidaceae). Molecular Ecology 19: 3981–3994.
Price HJ, Hodnett GE Johnston JS. 2000. Sunfl ower (Helianthus annuus) leaves contain compounds that reduce nuclear propidium iodide fluorescence. Annals of Botany
86: 929-934.
Pridgeon AM, Cribb PJ, Chase MW, Rasmussen FN. 2005. (eds). Genera Orchidacearum. v 4. Epidendroideae (Part one). Oxford University Press, New York,
672p.
RamseyJ,SchemskeDW.2002.Neopolyploidy in flowering plants. Annual Review of Ecology System 33: 589-639.
Renner, SS. 1999. Circumscription and phylogeny of the Laurales: evidence from
molecular and morphological data. American Journal of Botany 86: 1301-1315.
Rupp B, Samuel R, Russell A, Temsch EM, Chase MW, Leitch I. 2010. Genome size
in Polystachya (Orchidaceae) and its relationships to epidermal characters. Botanical Journal of the Linnean Society 163: 223-233.
Schlechter R. 1926. Das System der Orchidaceae. Notizbla tt des Botanischen Gartens
und Museums zu Berlin. Dahlem 9: 563-591.
Shan F, Yan G, Plummer JA. 2003. Karyotype evolution in the genus Boronia
(Rutaceae). Bot J Linn Soc 142:309–320.
Soltis DE, Soltis PS. 2009. Polyploidy: recurrent formation and genome evolution. Tree
14: 348-352.
Souza V. C, Lorenzi H. 2005. Botânica sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias de Angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. Nova Odessa, SP:
Instituto Plantarum, 640p.
22 Schwarzacher T, Schweizer D. 1982. Karyotype Analysis and Heterochromatin
Differentiation with Giemsa (]-Banding and Fluorescent Counterstaining in Cephalanthera ( Orchidaceae). Plant Systematics and Evolution 141: 91–113.
Szlachetko DL. 1995. Systema Orchidalium. Fragmenta Floristica. ET Geobotanica Suppl. 3: 1-152.
Szlachetko DL. 1991. New taxa within the order Orchidales. Folia Geobotanica et Phytotaxonomica 26: 315-329.
Tanaka R, Kamemoto H. 1984. Chromosomes in orchids: counting and numbers. In: J. Arditti, (eds.). Orchid Biology Reviews and Perspective III. Ithaca: Coenell University Press, p. 324-410.
Tanaka R, Kamemoto H. 1974. Chromosomes in orchids: counting numbers. In: Whithers, ed. Orchid biology, reäiews and perspectiäes. Vol. I. Ithaca: Cornell University Press, 323±412.
The Plant List. 2015. Available at: www.theplantlist.org. [accessed on 14 April 2015] van den Berg C. 2009. Phylogeny and systematics of Cattleya and Sophronitis. Pages 31 9–323 In: R.P. Sauleda; L.A. Sandow. (Org.). The 19th World Orchid Conference. Miami: American Printing Arts.
van den Berg C. 2008. New combinations in the genus Cattleya (Orchidaceae).
Neodiversity, Feira de Santana 3: 3-12.
van den Berg C. 1996. Estudo dos padrões de variabilidade intra e interespecífica em espécies brasileiras de Cattleya Lindley (Orchidaceae-Laeliinae). M. Sc. Thesis, 129
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brazil.
van den Berg C, Chase MW. 2005. Nomenclatural notes on Laeliinae. IV. New
combinations in Laelia and Sophronitis. Kew Bulletin 59: 565–567.
van den Berg C, Chase M. W. 2000. Nomenclatural notes on Laeliinae—II. Lindleyana
23 van den Berg C, Higgins WE, Dressler R.L, Whitten WM, Sotoarenas MA, Chase MW. 2009. A phylogenetic study of Laeliinae (Orchidaceae) based on combined nuclear
and plastid DNA sequences. Annals of Botany 104: 417-430.
van den Berg C, Goldman DH, Freudenstein JV, Pridgeon AM, Cameron KM, Chase MW. 2005. An overview of the phylogenetic relationships within Epidendroideae
(Orchidaceae) inferred from multiple DNA regions and recircumscription of Epidendreae and Arethuseae (Orchidaceae). American Journal of Botany 92:613–624.
van den Berg C, Higgins WE, Dressler RL, Whitten WM, Soto Arenas A, Culham A, Chase MW. 2000. A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on
sequence data from internal transcribed spacers (ITS) of Nuclear Ribosomal DNA. Lindleyana, 15: 96 – 114.
van der Pijl L, Dodson CH. 1966. Orchid flowers: Their pollination and evolution. University of Miami, Coral Gables.
Vanzela ALL. 2003. Localization of 45S rDNA and telomeric sites on holocentric
chromosomes of Rhynchospora tenuis Link (Cyperaceae). Genetic and Molecular Biologic 26:199-201.
Weiss-Schneeweiss H, Stuessy TF, Siljak-Yakovlev S, Baeza CM, Parker J. 2003.
Karyotype evolution in South American species of Hypochaeris (Asteraceae, Lactuceae). Pl. Syst. Evol. 241:171–184.
Wendel JF. 2000. Genome evolution in plyploids. Plant Molecular Biology 42: 225-249.
Withner CL. 1988. The Cattleyas and their relatives, 1: The Cattleyas. Timber Press, Portland, 136 pp.
Yamagishi-Costa J. and Forni-Martins E. 2009. Hybridization and polyploidy:
cytogenetic indications for Hoffamnnseggella (Orchidaceae) species evolution. – Int. J. Bot. 5: 93 – 99.
24
Capítulo 1
Relação entre diversidade da heterocromatina e conteúdo de DNA em
25
Relação entre diversidade da heterocromatina e conteúdo de DNA em
espécies do gênero
Cattleya
Lindl. (Epidendroidae, Orchidaceae)
Bruno Querino1,3, Gustavo Souza2, Ana C. M. de Sousa1, Leonardo P. Felix1
1 Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal da Paraíba, Campus III, 58.397.000, Areia, PB, Brasil.
2 Laboratório de Citogenética e Evolução Vegetal, Departamento de Botânica, CCB, Universidade Federal
de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil
3 Autor para correspondência - e-mail: brunocesares@yahoo.com.br
Resumo Cattleya é um gênero exclusivamente neotropical e apresenta em torno de 114 espécies, distribuídas pela região neotropical. O gênero apresenta uma taxonomia complexa, estando dividido em quatro grandes clados, correspondentes a subgêneros, dos quais se destacam o clado Intermedia e os subclados Crispae e Cattleya e por apresentar a maior diversidade. O gênero apresenta poucas espécies estudadas cariologicamente, com números cromossômicos variando de 2n = 40, em C. labiata a 2n = 80 em C. elongata. O presente trabalho tem por objetivo inferir os mecanismos de evolução
cariotípica no gênero Cattleya com base em análises filogenéticas comparativas. Para isso, foram analisado número e morfologia cromossômica, distribuição de heterocromatina CMA e DAPI e estimativa do tamanho genômico por citometria de fluxo. O padrão de bandas CMA/DAPI foi bastante variável, porém todas as espécies analisadas apresentaram bandas heteromórficas CMA+/DAPInas regiões terminais de
26
terminal DAPI+, os baixos conteúdos de DNA do subclado Crispae revela que esses caracteres evoluem de forma independente. As análises filogenéticas revelam que essa heterocromatina é uma característica plesiomórfica no gênero e que houve a desamplificação da mesma no subclado Cattleya. Esses dados sugerem que, apesar da estabilidade cromossômica numérica, o gênero Cattleya apresenta uma grande diversidade heterocromática, sem uma associação direta entre a amplificação de sequencias repetitivas CMA ou DAPI positivas e mudanças nos conteúdos de DNA.
27
INTRODUÇÃO
O gênero Cattleya Lindl. (Epidendroideae, Orchidaceae) constitui um grupo de plantas exclusivamente neotropical com aproximadamente 114 espécies (Pridgeon et al., 2005; van den Berg, 2008; van den Berg, 2014). Dessas aproximadamente 90 são reportadas para o Brasil (Barros et al., 2015; Govaerts et al., 2015), sendo predominantemente epífitas ou mais raramente rupícolas/terrestres (Pabst & Dungs 1975, Chase et al., 2003, van den Berg, 2008). O gênero é caracterizado por apresentar flores vistosas, labelo não fundido à coluna (ao contrário dos gêneros relacionados Epidendrum L. e Encyclia Hook.) e anteras com quatro a oito políneas (Withner, 1988).
O relacionamento de Cattleya com gêneros relacionados da subtribo Laeliinae foram bastante alterados com base em analises de filogenia molecular. van den Berg et al. (2000) observaram que o gênero Laelia Lindl., conforme tradicionalmente delimitado
(Dressler, 1993), é polifilético e as espécies brasileiras são filogeneticamente mais relacionadas aos gêneros Cattleya e Sophronitis Lindl. Com base nisso, as Laelia brasileiras foram transferidas para o gênero Sophronitis (van den Berg et al., 2000; van den Berg & Chase 2000). Contudo, Chiron & Castro (2002) optaram por subdividir as antigas espécies de Laelia brasileiras em gêneros menores (Hoffmannseggella H.G.Jones, Microlaelia (Schltr.) Chiron & V.P.Castro, Dungsia Chiron & V.P.Castro e Hadrolaelia
(Schltr.) Chiron & V.P.Castro e Sophronitis Lindl.), correspondendo a antigos subgêneros ou secções. Mais recentemente, as espécies de Sophronitis juntamente com as Laelia brasileiras foram inseridas em Cattleya (van den Berg, 2008; van den Berg et al., 2009; van den Berg, 2014). Dessa forma, o gênero Cattleya sensu lato é dividido em quarto subgêneros [Cattleya Lindl, Cattleyella (van den Berg & M.W.Chase) Van den Berg, Intermediae (Cogn.) Withner e Maximae (Withner) Van den Berg]. Com o subgênero
Cattleya subdividido em três secções [Cattleya Lindl, Crispae (Pfitzer) van den Berg e
Lawrenceanae van den Berg]. A secção Crispae apresenta cinco séries [Cattleyodes
(Schltr.) van den Berg, Hadrolaelia (Schltr.) van den Berg, Microlaelia (Schltr.) van den Berg, Parviflorae (Lindl.) van den Berg e Sophronitis (Lindl.) van den Berg] (van den Berg, 2014), resumidamente ilustrados na Fig. 1.
Cattleya apresenta 26 espécies com registro de números cromossômicos (22,8%
28
estáveis. Nesses casos, é necessário o emprego de abordagens citogenéticas mais refinadas que possibilitem um melhor detalhamento do cariótipo. Entre essas abordagens, o bandeamento cromossômico com fluorocromos tem sido utilizado como ferramenta citotaxonômica em diferentes grupos de orquídeas (D’emerico et al., 2005; Kao et al., 2001; Cabral et al., 2006; Moraes et al., 2007; Moraes et al., 2012; Koehler et al., 2008; Oliveira, et al., 2015). Dentre esses, os mais usuais são a cromomicina A3 (CMA) e 4’, 6-diamidinino-2-fenilindol (DAPI) que coram regiões do genoma ricas em GC e AT, respectivamente. Outra abordagem frequentemente empregada é a quantificação do DNA nuclear por citometria de fluxo (Loureiro et al., 2007). Em orquídeas, apesar do pequeno número de espécies com tamanho do genoma estimado (327 espécies), diferentes subfamílias podem ser caracterizadas com base nos seus respectivos tamanhos dos genomas (Leitch et al., 2009; Jersáková et al., 2013).
A caracterização cariotípica mais detalhada de espécies do gênero Cattleya, assim
como de gêneros relacionados pode contribuir para uma melhor compreensão da
sistemática do grupo. O somatório dessas informações, como a disponibilidade de
filogenias moleculares recentes (van den Berg et al., 2000; van den Berg et al., 2009; van
den Berg, 2014) e de sequencias de DNA da maioria das espécies disponíveis em bancos
de dados (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) tornam Cattleya um excelente modelo
para estudar tendências de evolução da heterocromatina em Orchidaceae. No presente trabalho foram estudadas citologicamente dezenove espécies do gênero Cattleya (sensu van den Berg, 2014), através da análise de número e morfologia cromossômica, dupla-coloração com os fluorocromos CMA e DAPI. Além disso, foi estimado o conteúdo de DNA nuclear para doze dessas espécies por citometria de fluxo. Estes dados foram interpretados com base em filogenias moleculares e análises de reconstruções caráteres,
permitindo interpretar de forma mais clara a evolução cariotípica do grupo (Vaio et al.,
29
30
MATERIAL E MÉTODOS
Material Botânico
Todo o material analisado foi proveniente de coletas de campo (ver locais de coletas na Tabela 1), com plantas mantidas em cultivo no jardim experimental do Laboratório de Citogenética Vegetal, do Centro de Ciências Agrárias, da Universidade Federal da Paraíba, com exsicatas depositadas no Herbário Prof. Jayme Coelho de Moraes (EAN) do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba. Todos os binômios foram atualizados de acordo com World Orchid Checklist - www.kew.org/data/monocotsRedirect.html (Govaert et al., 2015).
Bandeamento cromossômico
31
Quantificação do DNA nuclear
Para a quantificação do DNA, uma suspensão de núcleos oriunda de folhas jovens foi preparada como descrito por Loureiro et al., (2007) com 1.500 µL de tampão WPB (Woody Plant Buffer), 1g de tecido foliar da amostra e do padrão macerados juntos. A suspensão obtida foi filtrada em uma malha de 30 µm e posteriormente corada com 25 µL de iodeto de propídeo. O tamanho do genoma foi estimado através de um citômetro de fluxo CyFlow® SL (Partec, Görlitz, Germany). O conteúdo de DNA final para cada acesso foi calculado com base em pelo menos três diferentes medições realizadas em três dias distintos para cada planta individualmente, com três repetições. Foram realizados testes preliminares para a escolha do controle interno, utilizando folhas jovens de Glycine max cv. ‘Polanka’ 2C = 2,5 pg DNA (Dolezel et al., 1992). Para o processamento dos dados utilizou-se o software FloMax®.
Relações filogenéticas e reconstrução de caracteres
As relações filogenéticas para o gênero Cattleya (Fig. 1 e 5) foram baseadas em uma filogenia molecular prévia (van den Berg, 2014). Para a reconstrução de estados ancestrais dos caracteres cariotípicos (bandas CMA/DAPI), foi utilizado o programa
32 Tabela 1. Lista de táxons analisados, números de coletor, locais de coleta, números cromossômicos, tamanho do genoma em 2C e tipos de bandas
fluorescentes mais evidentes. T= terminais, I= intersticiais, P= proximais, PG = pictogramas e ca.= cerda de. * Jones et al., 1998.
Táxon Local de coleta Voucher 2n 2C DNA (pg) CMA+/DAPI– DAPI+/CMA– Fig.
Clado Cattleya
Cattleya Lindl. subg. Cattleya Withner
Cattleya sect. Cattleya Withner
C. labiata Lindl. Águas Belas, PE L.P.Felix, 14828 40 5,44 2T + 4P - 2B
C. trianae Linden & Rchb.f. Cultivada Não documentado 40 5,10 2T - 3F
C. warneri T.Moore ex R.Warner Cultivada Não documentado 40 2T + 6P - 3G
Subclado Crispae
Cattleya sect. Crispae (Pfitzer) Van den Berg
Cattleya ser. Cattleyodes (Schltr.) Van den Berg
C. grandis (Lindl.) A.A.Chadwick Itatim, BA L.P.Felix, 13201 40 3,60 2T + ca. 20P ca. 76P 3A
Cattleya ser. Hadrolaelia (Schltr.) Van den Berg
C. sincorana (Schltr.) Van den Berg Ibicoara, BA L.P.Felix, 14550 40 2T + 2P + 4I ca. 40T 3D
Cattleya ser. Parviflorae (Lindl.) Van den Berg
C. crispata (Thunb.) Van den Berg Diamantina, MG L.P.Felix, 15372 80 3T ca.152T 2C
C. pfisteri (Pabst & Senghas) Van den Berg Barra da Estiva, BA L.P.Felix, 14501 40 4,34 2T + 2P ca.12T 3B
C. rupestris (Lindl.) Van den Berg Diamantina, MG L.P.Felix, 15346 40 4,39 2T ca.12T 3C
Cattleya ser. Sophronitis (Lindl.) Van den Berg
C. cernua (Lindl.) Van den Berg Peruíbe, SP Não documentado 40 5,26 2T + 10I ca.76T 3E
Clado Intermediae
Cattleya subg. Intermediae (Cogn.) Withner
33
C. amethystoglossa Linden & Rchb.f. Morro do Chapéu, BA E.M.Almeida,
696
40 7,52 2T ca. 78T 4B
C. elongata Barb.Rodr. Ibicoara, BA L.P.Felix, 14559 80 7,09 4T + ca. 20P ca. 140T 4C
C. granulosa Lindl. Alcaçuz, RN L.P.Felix, 11963 40 7,77 2T + ca. 34P ca. 76T 4D
C. guttata Lindl. Itaibó, BA L.P.Felix, 14450 40 7,96 2T + ca. 36P ca. 76T 4E
C. intermedia Graham ex Lindl. Cultivada Não documentado 40 5,20 2T + ca. 36P ca. 76T 4F
C. loddigesii Lindl. Cultivada Não documentado 40 2T + ca. 38P ca. 72T 4G
C. nobilior Rchb.f. Brasília, DF Não documentado 42 6,22 2T + ca. 38P ca. 80T 4H
C. tenuis Campacci & Vedovello Bonina, BA L.P.Felix, 15454 40 2T + ca. 28P ca. 76T 2A
C. walkeriana Gardner Goiana, GO E.M.Almeida,
508
34
RESULTADOS
Citogenética
A lista das espécies analisadas, seus respectivos locais de coleta, números cromossômicos e conteúdo de DNA nuclear e bandas mais evidentes encontram-se sumarizados na Tabela 1. Todas as espécies analisadas apresentaram 2n = 40, exceto C. nobilior Rchb.f. (Fig. 4H) com 2n = 42 e os poliploides C. elongata Barb.Rodr. (Fig. 4C) e
C. crispata (Thunb.) van den Berg (Fig. 2A) com 2n = 80. Todas as espécies apresentaram
cromossomos pequenos (~ 2 m), cariótipos simétricos, cromossomos metacêntricos/submetacêntricos ou acrocêntricos, conforme ilustrado em C. labiata Lindl. (Fig. 2B). O padrão de bandas CMA e DAPI foi bastante variável entre as diferentes espécies do gênero. Pelo menos um par de bandas terminais CMA+/DAPI em todas as espécies
estudadas. Além disso, foram observadas um número variável de bandas CMA+/DAPI proximais também em todas as espécies analisadas, exceto em C. trianae, C. crispata, C. rupestris, C. aclandiae, C. amethystoglossa e C. elongata. Foram visualizados grandes
blocos CMA/DAPI+ terminais em ambos os braços cromossômicos de todas as espécies do clado Intermediae e do subclado Crispae (Fig. 3, 4 e 5).
No subclado Crispae foram analisados representantes dos subclados Cattleyodes, Hadrolaelia, Parviflorae e Sophronitis (van den Berg, 2014), correspondendo às espécies brasileiras de Laelia sensu Dresler (1993). No subclado Cattleyodes, a única espécie analisada, C. grandis (Lindl.) A.A.Chadwick, apresentou duas bandas terminais CMA+, além de pequenas bandas CMA+ proximais em um par cromossômico (Fig. 3A). Para o subclado Hadrolaelia foi analisada C. sincorana (Schltr.) van den Berg, que apresentou duas bandas terminais CMA+ e bandas CMA+ proximais em três pares cromossômicos (Fig. 3D).
35
dessas, pequenas bandas CMA+ proximais difíceis de visualizar em outros pares cromossômicos.
No clado Intermediae, foram estudados dez espécies correspondentes ao subgênero Intermediae (Cogn.) Withner (sensu van den Berg, 2014). Em todas as espécies foram verificadas duas bandas terminais CMA+ (Fig. 4, setas), exceto em C. aclandiae Lindl. que foi observado apenas uma banda CMA terminal e um intersticial (Fig. 4A). Em C. elongata Barb.Rodr., destaque por apresentar o maior número cromossômico para a presente amostra (2n = 80), apresentou bandas heteromórficas CMA+/DAPI nas regiões terminais de quatro cromossomos (Fig. 4C). A espécie C. lodigesii, além de apresentar dois cromossomos totalmente corados com CMA+/DAPI, também apresentou bandas CMA+/DAPI proximais puntiformes (Fig. 4G).
Tamanho do Genoma
O conteúdo de DNA das espécies de Cattleya variou de 2C = 3,6 pg em C. grandis até 2C = 7,96 pg em C. guttata Lindl. (Tabela 1). Os tecidos foliares apresentaram ciclos de endoreduplicação em todas as espécies analisadas. Esse fenômeno resultou na presença de picos 2C, 4C e 8C na maioria das medições (Fig. 6). No subclado Cattleya, o conteúdo de DNA foi de 2C = 5,44 pg em C. labiata e 2C = 5,11 pg em C. trianae (Tab. 1), com um valor médio de 2C = 5,27 pg. O conteúdo de DNA médio para o subclado Crispae foi de 2C = 4,39 pg, com valores variando de 3,60 pg em C. grandis até 5,26 pg em C. cernua. Já o clado Intermediae, apresentou valores que variaram de 4,30 pg em C. tenius até 7,96 pg em C. guttata, com valor médio de 2C = 6,82 pg DNA. A C. elongata apresentou 2C = 7,09 pg
DNA, bem como dois ciclos de endoreduplicação somática equivalentes a 4C e 8C. Todavia, essa espécie poliploide (2n = 80) manteve uma quantidade de DNA próximo das espécies diploides.
Filogenia
36
Crispae parecem ter se dado de forma homóloga. Dessa forma, essa heterocromatina foi conservada nessas linhagens e perdida exclusivamente no subclado Cattleya.
37 Fig. 2 - Principais padrões de distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul)
38
Fig. 3 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies gênero Cattleya dos subclados Cattleya e Crispae. Metáfases mitóticas de C. grandis (A), C. pfisterii
39 Fig. 4 - Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) em espécies do
40
41
