Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.2502 Cavalli, Marcelo Arthur
FMVZ Avaliação morfoquantitativa dos efeitos da subnutrição e da renutrição protéica no processo condilar da mandíbula de ratos wistar: uma correlação com a expressão do receptor de insulina / Marcelo Arthur Cavalli. -- 2011.
109 f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, São Paulo, 2011.
Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres. Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Orientador: Prof. Dr. Edson Aparecido Liberti.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: CAVALLI, Marcelo Arthur
Título: Avaliação morfoquantitava dos efeitos da subnutrição protéica pré e pós-natal e da renutrição pós-natal no processo condilar da mandíbula de ratos wistar: uma correlação com a expressão do receptor de insulina
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências
Data:_____/_____/_____
Banca Examinadora
Prof.Dr._________________________ Instituição:______________________
Assinatura:______________________ Julgamento:_____________________
Prof.Dr._________________________ Instituição:______________________
Assinatura:______________________ Julgamento:_____________________
Prof.Dr._________________________ Instituição:______________________
DEDICATÓRIA
O início da minha trajetória acadêmica, se é que se posso dizer isso, com
conseqüente desenvolvimento do tema deste trabalho só aconteceu porque tive
como norte uma professora, uma anatomista, uma pesquisadora e odontóloga
exemplar. Já estaria muito bem amparado se as qualidades daquela que se tornaria
a minha orientadora se limitassem a estas, entretanto, para a minha sorte e a
daqueles que a circundavam, haveria qualidades ainda mais expressivas. A verdade
é que não consigo encontrar as palavras que se aproximam daquilo que tenho em
mente, em meu coração. Todavia, posso afirmar com convicção que fui acolhido por
esta pessoa, passando pouco a pouco a admirá-la de tal forma que pudesse
considerá-la como uma mãe! Não se trata de egoísmo, é o sentimento que paira.
Transformou-se em um dos meus alicerces, em uma referência, em um guia a ser
lembrado para o resto da minha vida! Então, o sentimento de saudade naturalmente
existente, é confortado por imaginar que uma pessoa como essa só pode estar em
um lugar à sua altura, entretanto, se este local não for tão bom, ela o transformará
no melhor ambiente que existe, com certeza.
Esta é uma singela menção àquela que, por onde passou, com quem
conviveu, será sempre lembrada pela sua bondade, competência e devoção. À Silvia
AGRADECIMENTOS
Àquelas pessoas que sou eternamente grato, as quais fazem parte da minha
vida e da minha história: a minha família.
Ao meu pai, José Carlos Cavalli, presente como figura de pai, por me ensinar
o caminho do trabalho, da perseverança, da hombridade e da lealdade. Por ser um
exímio colega de trabalho, um companheiro de conversas...por ser um amigo.
À minha querida mãe, Cleuza Arthur Cavalli, uma pessoa exemplar como mãe
e como ser humano. Muito zelosa, ensinou-me a trilhar uma história que estivesse
galgada no alicerce familiar, baseando-se no que é justo, sempre com amor.
Ao casal, símbolo de respeito e companheirismo, José Carlos Cavalli e
Cleuza Arthur Cavalli.
À minha admirável irmã, Carla Arthur Cavalli, por sempre zelar pelo meu bem
estar. Agradeço pela ajuda desprendida e pela nossa amizade.
À minha querida e amável sobrinha, Manuella Cavalli Muscat, por propiciar
momentos incríveis, os quais foram fundamentais nesta jornada.
Não poderia faltar uma menção ao amigo e exemplo profissional Edson
Aparecido Liberti. Um ser humano inigualável, que me orientou, ensinou Anatomia e
mostrou através do trabalho quais devem ser os valores de uma pessoa, de um homem.
Ao professor Renato Paulo Chopard, por me apresentar a Anatomia desde
quando aluno de graduação, até enquanto aluno da pós-graduação. Obrigado pela
Ao ilustre professorMatsuyoshi Mori, que durante a minha graduação foi uma
das pessoas que mostrou ter algo a mais do que as boas aulas ministradas. Sempre
esteve à disposição dos alunos, muito atencioso; mostrou, além de muito
conhecimento acadêmico, as vertentes da profissão e da vida.
À professora Maria Angélica Miglino, pela oportunidade e confiança aplicadas.
Ao professor Luís Ronaldo Picosse que desde a época de monitoria em
Anatomia, na graduação, muito me ensinou.
À professora Margareth Oda, por fazer parte diretamente do meu ensino e
trajeto na Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo e, indiretamente,
durante a pós-graduação.
Ao professor Pedro Primo Bombonato, que apesar de conhecê-lo pouco,
passava em suas aulas o gosto que tinha em lecionar.
À Flávia de Oliveira, que sempre demonstrou humildade e consideração pelas
pessoas que gosta. Obrigado por me ensinar os primeiros caminhos no
LAFACC/VQM.
À Sra. Marta Maria da Silva Righetti, técnica do Laboratório de Histologia do
Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, pela
amizade, disponibilidade e competência demonstradas durante o desenvolvimento
deste trabalho.
A Maicon Barbosa da Silva pela amizade e por me ajudar em todo o meu
percurso no Mestrado.
À Sra. Cleide Rosana Duarte Prisco, Estatística do Instituto de Ciências
Biomédicas, por ter a paciência de me introduzir à Estatística e por se dedicar com
tanto interesse ao meu trabalho. Agradeço, além disto, por propiciar momentos de
“Nada, absolutamente nada resiste ao trabalho”
RESUMO
CAVALLI, M. A. Avaliação morfoquantitava dos efeitos da subnutrição e da renutrição protéica no processo condilar da mandíbula de ratos wistar: uma
correlação com a expressão do receptor de insulina. [Morphoquantitative
evaluation of the effects of protein deprivation and refeeding in the mandibular condyle of wistar rats: an expression correlation of the insulin receptor. 109 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.
A cartilagem do processo condilar (PC) da mandíbula de ratos wistar é secundária e
atua como sítio do crescimento mandibular. O fenômeno depende da ingestão
adequada de proteínas e da ação de hormônios, entre eles a insulina. Objetivou-se
correlacionar as alterações morfológicas provenientes da subnutrição protéica pré e
pós-natal, da renutrição pós-natal com a detecção imunohistoquímica e a
quantificação do receptor de insulina (IR) na cartilagem do PC de ratos wistar. Os
grupos experimentais formaram-se animais heterogêneos (n=3) de acordo com a
ração oferecida, protéica ou hipoprotéica, e com as respectivas idades, nos grupos
N e S (nutridos e subnutridos com 60 dias de vida), R (renutridos do desmame até
60 dias), NN (nutridos até 100 dias) e RR (renutridos do desmame até 100 dias).
Após a eutanásia, os espécimes foram processados para análise sob microscopia
de luz. Cortes sagitais foram submetidos a colorações que permitiram observar o
padrão celular, a matriz cartilagínea e o componente colágeno das camadas da
cartilagem do PC. Cortes também foram submetidos à imunomarcação do receptor
de insulina. Para se observar alteração na arquitetura tecidual do PC, realizou-se a
microscopia eletrônica de varredura. Observou-se que o PC contém praticamente o
mesmo número de células em proliferação na fase púbere e no adulto maduro
(N=NN; p 0,05). A subnutrição determinou a diminuição significativa do número de
células da camada proliferativa do PC (N≠S; p<0,05) e o restabelecimento nutricional
mantido até a idade adulta não normaliza este parâmetro, de modo que o número de
células permanece menor (NN≠RR; p<0,05). A densidade celular aos 100 dias é
maior no grupo RR (NN≠RR; p<0,05). Quanto ao período púbere, a avaliação do
colágeno demonstrou que a renutrição é capaz de prover novas áreas de
desenvolvimento do componente fibroso do complexo osteocartilagíneo e aumento
apresentaram reatividade bastante heterogênea ao receptor de insulina, com
predomínio nas camadas condroblástica e hipertrófica. O número de células
imunorreativas foi menor e se equivalem estatisticamente nos grupos S e RR,
enquanto que os grupos N, NN e R exibiram maior número, sendo N=R e R=NN;
p<0,05. A densidade dessas células foi menor em S, N e R quando comparados ao
grupo NN e não houve diferença estatística entre S, N, R e RR. O número de células
do PC modifica-se pouco no período púbere, e o seu desenvolvimento normal é
sensível à depleção protéica, de modo que o tecido não é capaz de responder ao
restabelecimento protéico mesmo quando mantido até a idade adulta, apresentando
também drástica diminuição da produção de matriz extracelular. A insulina funciona
como hormônio de crescimento no PC, e o quadro apresentado em estados de
subnutrição, é muito semelhante àquela condição observada no diabetes do tipo II,
na qual as células se tornam resistentes à insulina.
LISTA DE ABREVIATURAS
a Camada articular da cartilagem do processo condilar
ANOVA Análise de variância
c Camada condroblástica da cartilagem do processo condilar
CF Células em fila
DAB Diaminobenzidine tetrahydrochloride
DNA Ácido desoxirribonucléico
DAPI Fluorocromo 4´,6-diamidino-2-fenilindol
DP Desvio padrão
ECPC Espessura das camadas do processo condilar
EPI Equipamento de Proteção Individual
g Grama
GAG Glicosaminoglicana
h Camada hipertrófica da cartilagem do processo condilar
IGF Insulin-like growth factor
IR Receptor de Insulina
IRβ Subunidade beta do receptor de insulina
M Gaiola metabólica
MC Matriz cartilagínea
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
mg Miligramas
ml Mililitros
N Grupo experimental nutrido de 60 dias
NN Grupo experimental nutrido de 100 dias
p Camada pré-condroblástica da cartilagem do processo condilar
PBS Solução salina Tamponada
pH Potencial hidrogeniônico
PC Processo condilar
R Grupo experimental renutrido de 60 dias
RNA Ácido ribonucléico
RR Grupo experimental renutrido de 100 dias
S Grupo experimental subnutrido
TGI Trato gastrointestinal
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura do receptor de insulina em humano 33
Figura 2 - Representação esquemática da formação dos grupos
experimentais 40
Figura 3 - Gaiolas metabólicas 43
Figura 4 - Etapas para a obtenção do processo condilar da mandíbula 47
Figura 5 - Corte sagital de PC. Área da cartilagem do PC
delimitada (Azo-Carmin). Objetiva de 5x 51
Figura 6 - Cortes sagitais evidenciando as camadas constituintes do PC. A: Espessura das camadas articular e pré-condroblás- tica; B: Espessura das camadas condroblástica e hipertró- fica (Azo-carmin)
52 Figura 7 - Corte sagital do PC. Demarcação dos componentes
celulares da camada condroblástica do PC (Azo-carmin).
Objetiva de 20x. 53
Figura 8 - Sistema-teste sobre a imagem das camadas condroblás- tica e hipertrófica do PC, corada pelo método da Safrani-
na-O 54
Figura 9 - Área da cartilagem do PC. Número de células sensibiliza-
das aferido na região (imunohistoquímica - IR) 55
Figura 10 - Área do osso subcondral do PC. O número de células sensibilizadas foi aferido na região do (imunohistoquími-
ca - IR) 56
Figura 11 - Microscopia de luz. Coloração pelo método de Azo-carmim. A – Grupo N com a representação das camadas do PC: articular (a), pré-condroblástica (p), condroblástica (c) e hipertrófica (h); B – Grupo S; C – Grupo R; D – Grupo NN;
E – Grupo RR 78
Figura 12 - Microscopia de luz. Coloração do método do Picrosirius sob luz polarizada. Detecção de fibras colágenas do tipo I (ama- relo, laranja e vermelho) e III (verde). A - Camadas articular (a), pré-condroblástica (p), condroblástica (c) e hipertrófica (h) do PC. B a F – Distribuição das fibras colágenas tipos I e III na matriz da cartilagem fibrosa do PC nos grupos N, S,
R, NN e RR, respectivamente 80
Figura 13 - Microscopia de luz. Coloração pelo método de
Safranina – O. Representação da distribuição da matriz
Figura 14 - Microscopia eletrônica de varredura (MEV) do PC de ratos wistar dos grupos N, S, R e NN. Objetivas de 500X (A - D);
700X (E-H); 1200X (I-L) 84
Figura 15 - Imunohistoquímica do receptor de Insulina (IR).
D, E, F – Imunofluorescência do IR. As setas demonstram as células sensibilizadas ao IR (imunomarcadas) e as cabe-
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Parâmetros metabólicos dos grupos N, S e R. Média (±DP) dos valores da última semana de monitoramento na gaiola
metabólica 60
Tabela 2 - Média (±DP) do número de células da camada condroblástica,
área da cartilagem e densidade celular do PC 63
Tabela 3 - Camada articular (média ± DP). Número de células em fila (CF), espessura das camadas da cartilagem do PC (ECPC) e a relação número de células em fila/espessura
(CF/ECPC) 65
Tabela 4 - Camada Pré-condroblástica (média ± DP). Número de células em fila (CF), espessura das camadas da cartilagem do PC (ECPC) e a relação número de células em
fila/espessura (CF/ECPC) 66
Tabela 5 - Camada condroblástica (média ± DP). Número de células em fila (CF), espessura das camadas da cartilagem do PC (ECPC) e a relação número de células em
fila/espessura (CF/ECPC) 67
Tabela 6 - Camada Hipertrófica (média ± DP). Número de células em fila (CF), espessura das camadas da cartilagem do PC (ECPC) e a relação número de células em fila/espessura
(CF/ECPC) 68
Tabela 7 - Média (±DP) da porcentagem do conteúdo cartilagíneo das camadas do PC avaliadas em cortes submetidos à
coloração por Safranina – O 70
Tabela 8 - Média (±DP) do número de células imunorreativas ao receptor de insulina (IR); da área da cartilagem do PC e
da densidade celular nos diferentes grupos 71
Tabela 9 - Imunomarcação do receptor de insulina (IR) no osso
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - Relação entre ingestão alimentar e massa corpórea dos grupos N, S e R. Período metabólico, entre a 1ª e a 6ª senama... 61
Gráfico 2 - Média (±DP) do número de células da camada condroblástica
(A); área da cartilagem do PC (B) e densidade celular (C) ... 64
Gráfico 3 - A – Número de células em fila (CF) das camadas da cartilagem do PC; B – Espessura das camadas da cartilagem do PC
(ECPC); C – Relação CF/ECPC nas camadas da cartilagem
do PC (média±DP) ... 69
Gráfico 4 - A – Número de células imunorreativas da cartilagem do PC; B – Área da cartilagem do PC; C – Densidade de células
imunorreativas da cartilagem do PC (média±DP)... 72
Gráfico 5 - A – Número de células imunorreativas ao IR da região sub condral do PC; B – Área da região subcondral do PC; C – densidade de células da região subcondral do PC, imunor-
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 26
2 REVISÃO DE LITERATURA... 28
2.1 ANATOMIA DA ATM ... 28
2.1.1 No Homem... 28
2.1.2 Em Ratos... 30
2.2 A SUBNUTRIÇÃO E SEUS EFEITOS... 31
2.3 MECANISMOS DE CRESCIMENTO RELACIONADOS À
INSULINA... 32
3 PROPOSIÇÃO... 36
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 37
4.1 OBTENÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 37
4.2 ANÁLISE METABÓLICA ... 41
4.2.1 Protocolo de Análise Metabólica... 44
4.3 OBTENÇÃO DOS PROCESSOS CONDILARES DA MANDÍBULA (PC)... 44
4.4 MICROSCOPIA DE LUZ ... 48
4.4.1 Azo-carmim... 48
4.4.2 Picrosirius... 48
4.4.3 Safranina-O... 49
4.5 IMUNOHISTOQUÍMICA PARA O RECEPTOR DE INSULINA (IR)... 49
4.6 ESTUDO QUANTITATIVO ... 50
4.6.1 Área da Cartilagem do PC... 51
4.6.2 Espessura das Camadas Cartilagíneas do PC (ECPC)... 52
4.6.3 Número e Densidade de Células da Camada Condroblástica
4.6.4 Relação de Número de Células em Fila (CF) por Espessura das
Camadas do PC (CF/ECPC)... 53
4.6.5 Safranina-O... 54
4.6.6 Área da Cartilagem do PC (IR)... 55
4.6.7 Número e Densidade de Células IR na Cartilagem do PC... 55
4.6.8 Área do Osso Subcondral (IR)... 56
4.6.9 Número e Densidade de Células IR no Osso Subcondral... 57
4.7 IMUNOFLUORESCÊNCIA – IR ... 57
4.8 ESTUDO TRIDIMENSIONAL – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
VARREDURA (MEV)... 57
4.9 TRATAMENTO ESTATÍSTICO ... 58
5 RESULTADOS... 59
5.1 ANÁLISE METABÓLICA ... 59
5.2 ANÁLISE QUANTITATIVA ... 62
5.2.1 Área da camada Condroblástica... 62
5.2.2 Número de Células da Camada Condroblástica... 62
5.2.3 Densidade Celular... 63
5.2.4 Espessura das Camadas do PC (ECPC), Número de Células em
Fila (CF) e a Relação CF/ ECPC... 65
5.2.5 Quantidade de Matriz Cartilagínea (MC) – Safranina – O... 70
5.2.6 Número de Células Imunorreativas ao Receptor de Insulina
(IR) na Cartilagem do PC... 70
5.2.7 Área da Cartilagem do PC... 71
5.2.8 Densidade de Células Imunorreativas ao Receptor de Insulina
(IR) da Cartilagem do PC... 71
5.2.9 Número de Células Imunorreativas ao Receptor de Insulina
(IR) na Região Subcondral do PC... 73
5.2.10 Área da Região Subcondral... 73
5.2.11 Densidade de células imunorreativas ao receptor de insulina
5.3 ANÁLISE QUALITATIVA ... 76
5.3.1 Microscopia de Luz... 76
5.3.2 Estudo Tridimensional – Microscopia Eletrônica de Varredura
(MEV)... 82
5.3.3 Imunohistoquímica – Receptor de Insulina (IR)... 85
6 DISCUSSÃO... 86
6.1 ANÁLISE METABÓLICA ... 87
6.2 ANÁLISEMORFOQUANTITATIVA ... 90
7 CONCLUSÕES... 99
IN T R O D U Ç Ã O I2 6
1 INTRODUÇÃO
o c re s c im e n to e o d e s e n v o lv im e n to c ra n io fa c ia l d e c o rre m d e u m c o n s ta n te
p ro c e s s o d e re m o d e la ç ã o e a p o s iç ã o s u tu ra l (E N L O W , 1 9 6 8 ; E N L O W , 1 9 7 5 ;
S C H U M A C H E R , 1 9 9 9 ), re g id o s p o r fa to re s in trín s e c o s (g e n é tic o e h o rm o n a l) e
e x trín s e c o s (M O Y E R S , 1 9 9 1 ); e s te s , m e c â n ic o s , n u tric io n a is e fís ic o s (N E W M A N e t
a I., 1 9 8 2 ).
O p ro c e s s o c o n d ila r d a m a n d íb u la (P C ) re p re s e n ta o fe n ô m e n o d o
c re s c im e n to c ra n io fa c ia l, s e n d o o n to g e n e tic a m e n te p ro v e n ie n te d a ju s ta p o s iç ã o d e
u m a c a rtila g e m p rim á ria c e n tra l c o m u m a c a rtila g e m s e c u n d á ria p e rifé ric a , q u e
c o n fig u ra u m re v e s tim e n to d e te c id o c o n ju n tiv o fib ro s o (M IZ O G U C H I e t a I., 1 9 9 0 ).
A c a rtila g e m d o P C d e s e m p e n h a u m p a p e l im p o rta n te ta n to n a d e te rm in a ç ã o
d a m o rfo lo g ia fa c ia l, c o m o e m fu n ç õ e s o ro fa c ia is c o m p le x a s c o m o a m a s tig a ç ã o e a
fa la (B A E e t a l., 2 0 0 3 ). M a is e s p e c ific a m e n te , o P C é u m d o s p rin c ip a is s ítio s d e
c re s c im e n to m a n d ib u la r e m c o m p rim e n to e a ltu ra (F U E N T E S e t a I., 2 0 0 2 ). E s te tip o
d e c a rtila g e m p re s u m e c re s c im e n to d e a d a p ta ç ã o re g io n a l, o c re s c im e n to ó s s e o
e n d o c o n d ra L E s ta c a rtila g e m é re fe rid a c o m o s e c u n d á ria e a p a re c e m a is ta rd e n o
d e s e n v o lv im e n to e m b rio n á rio , d e m a n e ira in d e p e n d e n te d o c o n d ro e s q u e le to . S itu a
-s e n a -s m a rg e n -s d o -s o -s -s o -s m e m b ra n o -s o -s d u ra n te a fa -s e p ré -n a ta l e in íc io d o
d e s e n v o lv im e n to p ó s -n a ta l, e é g e ra lm e n te d e n a tu re z a tra n s itó ria . E m
c o n tra p a rtid a , a c a rtila g e m s e c u n d á ria d o P C s e d e s e n v o lv e n a c a rtila g e m a rtic u la r
p e rm a n e n te . H is to lo g ic a m e n te , a c a rtila g e m s e c u n d á ria c o n té m n ã o s ó o c o lá g e n o
tip o 11, q u e é c a ra c te rís tic a d e to d a s a s c a rtila g e n s , ta m b é m o c o lá g e n o tip o I, q u e e s tá a u s e n te e m c a rtila g e n s p rim á ria s (D E L A T T E , 2 0 0 4 ).
E x is te m v á ria s z o n a s h ls to ló q ic a s q u e d e fin e m a re g iã o d o P C . D e s ta fo rm a ,
s u b ja c e n te à s u p e rfíc ie a rtic u la r, q u e a p re s e n ta re s q u íc io in tra m e m b ra n o s o , lo c a liz a
-s e a z o n a p ré c o n d ro b lá s tic a (p ), q u e é in d ife re n c ia d a e c o n té m c é lu la s
p o te n c ia lm e n te c a rtila g ín e a s . A b a ix o , s itu a -s e a z o n a c o n d ro b lá s tic a (c ), o n d e h á
s e c re ç ã o d e m a triz e x tra c e lu la r. S e g u id a d e s ta , e n c o n tra -s e a c a m a d a c e lu la r
in te rn a , q u e c o n s titu i a z o n a m a is b a ix a , h ip e rtró fic a (h ), o n d e o o s s o s u b c o n d ra l é
fo rm a d o (C A R L S O N e t a l., 1 9 8 0 ; F U E N T E S e t a i., 2 0 0 2 ).
P a ra q u e e s te c o m p le x o p ro c e s s o d e c re s c im e n to d o P C o c o rra n o rm a lm e n te ,
IN T R O D U Ç Ã O I2 7
d e u m a v a rie d a d e d e fa to re s (D E O L IV E IR A e t a I., 2 0 1 0 ), s e n d o o m a is e v id e n te , a
re s triç ã o d o c o n s u m o d e a lim e n to s p ro té ic o s (S H R A D E R ; Z E M A N , 1 9 7 3 ).
D e n tre o s n u trie n te s o s te o tró fic o s , a s p ro te ín a s d e s e m p e n h a m im p o rta n te
p a p e l n o d e s e n v o lv im e n to d o te c id o ó s s e o , q u e é p a rtic u la rm e n te re s p o n s á v e l p e la
in g e s tã o p ro té ic a d u ra n te o s a n o s q u e p re c e d e m o in íc io d a p u b e rd a d e (B O N J O U R
e t a I., 2 0 0 1 ). C o n s e q ü e n te m e n te , a s u b n u triç ã o p ro té ic a , d u ra n te o d e s e n v o lv im e n to
d o s te c id o s e ó rg ã o s , p o d e a u m e n ta r o ris c o d e o s te o p o ro s e e d e fra tu ra s ta rd ia s a o
lo n g o d a v id a (R IZ Z O L l; B O N J O U R , 1 9 9 9 ; H A R V E Y ; C O O P E R , 2 0 0 4 ), a lé m d e
a lte ra r p e rm a n e n te m e n te a e s tru tu ra c o rp o ra l, a fis io lo g ia e o m e ta b o lis m o , s e n d o
c a p a z d e c o n d u z ir a d o e n ç a s c rô n ic a s e m p e río d o s ta rd io s d a v id a (E N G E L B R E G e t
a l.,2 0 0 4 ).
D e s ta fo rm a , a s u b n u triç ã o p ro té ic a (P U C C IA R E L L I; O Y H E N A R T , 1 9 8 7 )
re p re s e n ta u m d o s fa to re s e p ig e n é tic o s , o n u tric io n a l (M O Y E R S , 1 9 9 1 ), q u e a tu a
d e te rm in a n d o o c o m p ro m e tim e n to d o c re s c im e n to . D u ra n te o p e río d o g e s ta c io n a l
N a k a m o to , P o rte r e W in k le r (1 9 8 3 ) o b s e rv a ra m q u e a s u b n u triç ã o p ro té ic a a lte ra d e
m a n e ira d ife re n te a s o s s ific a ç õ e s e n d o c o n d ra l e in tra m e m b ra n o s a , e q u e a p a rtir d o
d e s m a m e , a s p ro p o rç õ e s m a n d ib u la re s s ã o s e v e ra m e n te a lte ra d a s , c h e g a n d o a
a p re s e n ta r c e rta d e fo rm a ç ã o (A L lP P I e t a I., 1 9 8 4 ).
E s tru tu ra s c a rtila g ín e a s , c o m o o s d is c o s e p ifis ia is e a c a rtila g e m d o P C ,
a tu a m d ire ta m e n te s o b re o c re s c im e n to ó s s e o e m fa s e s p re c o c e s d o
d e s e n v o lv im e n to . Q u a n d o s u b m e tid a s a o s e fe ito s d a s u b n u triç ã o , a s m e s m a s
m o s tra m -s e in c a p a z e s d e re to m a r u m p a d rã o n o rm a l d e c re s c im e n to , d e v id o à s
a lte ra ç õ e s p e rm a n e n te s q u e o c o rre m n a s u a e s tru tu ra (A L lP P I e t a i., 1 9 8 4 ). P o ré m ,
q u a n d o a in jú ria o c o rre n o p e río d o p ré v io a o d e s m a m e , a s re p e rc u s s õ e s n e s s e
te c id o m o s tra m -s e m a is s e v e ra s d o q u e a s q u e s e v e rific a a p ó s e s s e p e río d o .
D ife re n te s re g iõ e s d o e s q u e le to re s p o n d e m ta m b é m d e fo rm a d iv e rs a a o s p e río d o s
e m q u e s e a p lic a a s u b n u triç ã o (B R E T O N , 2 0 0 9 ; C O U P É , 2 0 0 9 ).
E n tre ta n to , s ã o in c e rta s a s in fo rm a ç õ e s s o b re a s c o n d iç õ e s q u e p o d e m
p ro m o v e r u m a re to m a d a e fic a z , p a ra q u e o te c id o c a rtila g ín e o d e u m a d e te rm in a d a
e s tru tu ra a tin ja o c o m p le to d e s e n v o lv im e n to , fa to r e s te q u e e s tá n a d e p e n d ê n c ia
ta n to d o m o m e n to e m q u e s e in s ta la a s u b n u triç ã o c o m o d o e s tá g io d e m u ltip lic a ç ã o
R E V 5 Ã O D E L . . T E R A T U R A I2 8
2 REVISÃO DE LITERATURA
N e s t a s e ç ã o , a t r a v é s d o le v a n t a m e n t o b ib lio g r á f ic o , o s it e n s a s e g u ir a b o r d a m
o s a s s u n t o s e n v o lv id o s n a p r e s e n t e p e s q u is a .
2 . 1 A N A T O M I A D A A T M
A s e g u ir , o s a s p e c t o s a n a t ô m ic o s d a A T M h u m a n a e d o r a t o .
2 . 1 . 1 No Homem
O e s t u d o d a a n a t o m ia e d a m ic r o a n a t o m ia d a a r t ic u la ç ã o t e m p o r o m a n d ib u la r
( A T M ) , m a is e s p e c if ic a m e n t e d o p r o c e s s o c o n d ila r d a m a n d í b u la d e h u m a n o s , t e m
s id o f o c o d e m u it o s e s t u d o s .
A A T M é u m a a r t ic u la ç ã o a lt a m e n t e e s p e c ia liz a d a , d is t in g u in d o - s e d a s
d e m a is p o r s e r r e v e s t id a p o r t e c id o f ib r o s o a v a s c u la r , d e n o m in a n d o - s e
f ib r o c a r t ila g e m . A lé m d is s o , é c a r a c t e r iz a d a p o r a p r e s e n t a r n o s d o is c o m p le x o s
ó s s e o s a r t ic u la r e s o s d e n t e s , c u ja f o r m a e p o s iç ã o t ê m in f lu ê n c ia d e c is iv a n o s
m o v im e n t o s a r t ic u la r e s . É u m a a r t ic u la ç ã o b ila t e r a l, d e m o d o q u e a m b a s s ã o
c o n ju g a d a s s e n d o p o r t a n t o , f u n c io n a lm e n t e , u m a ú n ic a a r t ic u la ç ã o . A lé m d is s o , h á
u m d is c o a r t ic u la r q u e s e in t e r p õ e e n t r e a m a n d í b u la e o o s s o t e m p o r a l, d iv id in d o o
e s p a ç o a r t ic u la r e m c o m p a r t im e n t o s s u p e r io r e in f e r io r .
O p r o c e s s o c o n d ila r ( P C ) h u m a n o t e m d e 1 5 a 2 0 m m d e la r g u r a e 8 a 1 0 m m
d e d iâ m e t r o â n t e r o - p o s t e r io r e é f o r m a d o p e la c a b e ç a e o c o lo d a m a n d í b u la , o c o lo
d a m a n d í b u la . S e u lo n g o e ix o e s t á e m â n g u lo r e t o c o m o p la n o d o r a m o m a n d ib u la r .
A s u p e r f í c ie a r t ic u la r lis a d o P C e s t á v o lt a d a a n t e r io r e s u p e r io r m e n t e . O p ó lo la t e r a l
p r o je t a - s e a p e n a s u m p o u c o a lé m d a s u p e r f í c ie e x t e r n a d o r a m o , e é r u g o s o p o r q u e
R E V I S Ã O D E L I T E R A T U R A I3 0
e s tilo m a n d ib u la r, d e s c rito s c o m o a c e s s ó rio s d a A T M (S IC H E R , 1 9 7 7 ; W A R W IC H ,
1 9 7 9 ; F E H R E N B A C H , 1 9 9 8 ).
2 .1 .2 Em Ratos
S e g u n d o M a v ro p o u lo s , B re s in e K ilia rid is (2 0 0 4 ), a m a n d íb u la d e ra to s é u m
e x c e le n te m o d e lo p a ra o e s tu d o d o s e fe ito s d a c a rg a e d a d ie ta s o b re o c re s c im e n to
e re m o d e la ç ã o ó s s e a s . Is to s e d e v e a o fa to d e c a d a h e m i-m a n d íb u la d o ra to
c o n s is tir, c o n ju n ta m e n te c o m o s s e u s p ro c e s s o s c o ro n ó id e , c o n c ita r e a n g u la r, e m
d ife re n te s u n id a d e s fu n c io n a is q u e s e rv e m c o m a n c o ra g e m p a ra a lg u n s m ú s c u lo s
d a m a s tig a ç ã o e , e s te s p o r s u a v e z , fo rn e c e m e s tím u lo m e c â n ic o p a ra a fo rm a ç ã o
ó s s e a . E s te s m e s m o s a u to re s re la ta m a in d a , q u e o P C d e ra to s q u e re c e b e m d ie ta
s ó lid a a p re s e n to u -s e m a io r e m re la ç ã o à q u e le s q u e d is p u s e ra m d e a lim e n to m a is
m a c io .
E m e s tu d o d e s c ritiv o m o rfo ló g ic o e h is to ló g ic o q u e c o m p a ro u o s c o m p o n e n te s
d a A T M h u m a n a c o m a d e ra to s d a lin h a g e m w is ta r, P o rto e t a I. (2 0 1 0 ) e v id e n c ia ra m
q u e h á g ra n d e s im ila rid a d e e n tre a A T M d a s d u a s e s p é c ie s . T a l c o m o n o h o m e m , h á
u m a e s p e s s a c a m a d a d e c a rtila g e m re c o b rin d o o P C . A s s u p e rfíc ie s a rtic u la re s d o s
o s s o s te m p o ra is s ã o s e m e lh a n te s , e x c e to p e lo m e n o r n ú m e ro d e c a m a d a s d e
c o n d ró c ito s , e p e la m a io r e s p e s s u ra d a c a m a d a fib ro s a . O fo rm a to d o d is c o ta m b é m
és e m e lh a n te , já q u e o d is c o d o ra to é b ic ô n c a v o e é c o n s titu íd o p o r fib ra s d o te c id o
c o n ju n tiv o , c o m o n o h u m a n o . A in d a , a A T M d o ra to ta m b é m c o n té m u m a m e m b ra n a
s in o v ia l, c o m o v e rific a d o n o h u m a n o . A p rin c ip a l d ife re n ç a e n tre a s a rtic u la ç õ e s
b a s e ia -s e n o fa to d e n a A T M d o ra to h a v e r e m in ê n c ia a rtic u la r n o o s s o te m p o ra l, e
e s s e p o r s u a v e z , a p re s e n ta r a fo s s a m a n d ib u la r e m fo rm a d e c a lh a . Is to p ro m o v e
m a io r lib e rd a d e n o m o v im e n to d e p ro tru s ã o d o ra to . C o rro b o ra n d o , e s tu d o s
p re c o c e s (W E IJ S , 1 9 7 5 ) s o b re a m a s tig a ç ã o d e ra to s a lb in o s , e v id e n c ia ra m q u e ,
ta n to o la d o d e tra b a lh o q u a n to o d e b a la n c e io , s ã o s o b re c a rre g a d o s d u ra n te a
R E V I 5 Ã O D E L I T E R A T U R A I3 1
2 .2 A S U B N U T R IÇ A O E S E U S E F E IT O S
A s u b n u tr iç ã o é c a u s a d a p o r d ie ta in a p r o p r ia d a , h ip o c a ló r ic a ( m a r a s m o ) o u
h ip o p r o té ic a ( k w a s h io r k o r ) , ta m b é m p o d e n d o s e r d e te r m in a d a p o r m á - a b s o r ç ã o d e
n u tr ie n te s o u a n o r e x ia . A d o e n ç a te m s id o o fo c o d e m u ito s e s tu d o s , in c lu s iv e e m
r a to s ( A N T H O N Y ; E D O Z IE N , 1 9 7 5 ) , p o r s e tr a ta r d e u m d o s m a is im p o r ta n te s
p r o b le m a s d e s a ú d e p ú b lic a d a a tu a lid a d e ( W O R L D H E A L T H F O R U M , 1 9 9 3 ) .
O s e fe ito s d a s fo r m a s d e s u b n u tr iç ã o a q u e s ã o s u b m e tid a s v á r ia s e s p é c ie s
d e a n im a is s ã o v e r ific a d o s n o s d iv e r s o s te c id o s , ó r g ã o s e s is te m a s . A s s im , p o d e m
s e r c ita d o s c o m o e x e m p lo s o s o s s o s d e a n im a is m a n tid o s c o m u m a d ie ta
h ip o p r o té ic a ,o n d e s e o b s e r v o u u m r e ta r d o n o s u r g im e n to d o s c e n tr o s d e o s s ific a ç ã o
e u m a r e d u ç ã o n o c r e s c im e n to e m c o m p r im e n to e la r g u r a ( S H R A D E R ; Z E M A N ,
1 9 7 3 ) ; e a s a r tic u la ç õ e s d e a n im a is s u b m e tid o s a u m a r e s tr iç ã o a lim e n ta r p a r c ia l,
o n d e s e v e r ific o u u m a r e d u ç ã o d a s ín te s e d a m a tr iz d e c o lá g e n o d a c a r tila g e m
a r tic u la r ( S P A N H E IM E R e t a I., 1 9 9 1 ) .
E s p e c ific a m e n te n a s e s tr u tu r a s c e fá lic a s , M o s s e V ilm a n n ( 1 9 7 8 )
r e lç a c io n a r a m a s u b n u tr iç ã o c o m o u m fa to r a m b ie n ta l q u e p o d e s e r fa c ilm e n te
e s tu d a d o e m c r â n io s d e r a to s e m d e s e n v o lv im e n to , c o n c lu in d o q u e a o r to c e fa liz a ç ã o
d e s s e s a n im a is r e p r e s e n ta u m m o d e lo a p r o p r ia d o p a r a a a v a lia ç ã o d o s a ju s te s
r e la tiv o s a o s p r o c e s s o s d e c r e s c im e n to c r a n io fa c ia l.
D e s ta m a n e ir a , N a k a m o to e t a i. ( 1 9 8 3 ) a v a lia r a m o s e fe ito s d a s u b n u tr iç ã o
p r o té ic a n o c r e s c im e n to e n d o c o n d r a l ( o s s o s lo n g o s ) e in tr a m e m b r a n o s o ( m a n d íb u la )
d e r a to s , c o n c lu in d o q u e o s m e s m o s s ã o a fe ta d o s d e m a n e ir a d ife r e n te d u r a n te a
g e r s ta ç ã o .
A p illi e t a I. ( 1 9 8 4 ) o b s e r v a r a m e m m a n d íb u la s d e r a to s q u e s o fr e r a m d u r a n te
2 1 d ia s , s u b n u tr iç ã o p r o té ic a a p a r tir d a é p o c a d o d e s m a m e , a o c o r r ê n c ia d e
a lte r a ç õ e s n a s p r o p o r ç õ e s ó s s e a s m a n d ib u la r e s , q u e d e te r m in a m u m a c e r ta
d e fo r m a ç ã o ó s s e a .
E m s e u tr a b a lh o s o b r e c r e s c im e n to c r a n io fa c ia l d e r a to s , P u c c ia r e lli ( 1 9 7 8 )
d e s c r e v e u q u e a s v a r ia ç õ e s n a fo r m a , ta m a n h o e p o s iç ã o d a s e s tr u tu r a s
c r a n io fa c ia is p o d e m s e r d e te c ta d a s n e s s e s a n im a is d u r a n te o d e s e n v o lv im e n to p ó s
R E V I SÃO D E L I T E R A T U R A I32
região facial, um a progressiva tendência à ortocefalização e rotações da lâm ina cribiform e do osso etm óide e do com plexo occipital.
P ucciarelli e O yhenart (1987) avaliaram os efeitos da subnutrição sobre o
crescim ento craniofacial em ratos durante a am am entação e consideraram as
carências nutricionais com o fatores não-genéticos im portantes, um a vez que elas
determ inam devios nos padrões norm ais de crescim ento. S egundo esses autores, o
ortocefalização é devida principalm ente a dois sistem as de desenvolvim ento do
esqueleto dos m am íferos. O prim eiro é o sistem a do neurocrânio, que possui
crescim ento inicial e de curta duração, e o segundo é o sistem a do esplancnocrânio,
que tam bém apresenta crescim ento inicial, porém , sustentado e de longa duração.
D e fato, com relação aos efeitos nutricionais, M oyers (1991) já havia descrito
a nutrição com o um a variável que afeta o crescim ento craniofacial, e m ais
especificam ente a m á nutrição, que considerou um fator desorganizador
determ inante dentre aqueles que controlam o crescim ento craniofacial. Todavia,
ressaltou a carência de inform ações específicas disponíveis sobre o assunto.
2.3 M E C A N IS M O S D E C R E S C IM E N TO R E LA C IO N A D O S A IN S U LIN A
A insulina é um a proteína pequena, sintetizada nas células beta pancreáticas
e liberada na corrente sanguínea (G U Y TO N , 2006), agindo nas células com o
horm ônio anabólico que prom ove o m etabolism o próprio, balanço energético e
m anutenção da m assa corpórea (B O U R A -H A LFO N ; ZIC K , 2009). H istoricam ente, a
insulina é associada ao "açúcar no sangue", m as, na verdade, ela apresenta efeitos
profundos no m etabolism o dos carboidratos, lipídeos e proteínas.
P ara com eçar a exercer seus efeitos sobre as células-alvo, a insulina em
prim eiro lugar se liga e ativa um receptor protéico de m em brana. É o receptor
ativado, e não a insulina, que causa os efeitos subseqüentes. O receptor de insulina
(IR ) é um a com binação de quatro subunidades que se m antêm unidas por ligações
de dissulfeto: duas subunidades alfa (a), que se situam inteiram ente do lado externo
da m em brana celular e duas subunidades beta (~) que penetram através da
m em brana, projetando-se no citoplasm a celular (D E M E Y TS , 2004; G U Y TO N ; H A LL,
R E V I S Ã O D E L I T E R A T U R A I 3 3
lig a d aà s u b u n id a d e ~ , p r o m o v e a a u to fo s fo r ila ç ã o d a s u b u n id a d s ~ d o r e c e p to r d e in s u lin a , a q u a l a tiv a u m a tir o s in a q u in a s e lo c a l q u e , p o r s u a v e z , c a u s a fo s fo r ila ç ã o
d e d iv e r s a s o u tr a s e n z im a s in tr a c e lu la r e s , in c lu in d o u m g r u p o c h a m a d o d e
s u b s tr a to s d o r e c e p to r d e in s u lin a ( I R S ) . E s te s ú ltim o s tê m o e fe ito g lo b a l d e
a tiv a ç ã o e d e s a tiv a ç ã o d e d ife r e n te s e n z im a s . P o d e - s e d e fin ir , d e s ta fo r m a , tr ê s v ia s
d e s in a liz a ç ã o q u e s e p r o p a g a m a p a r tir d a a tiv a ç ã o d a tir o s in a q u in a s e d o r e c e p to r
d e in s u lin a , s ã o e la s : 1 ) C a s c a ta MAP K in a s e , q u e , e m ú ltim a a n á lis e é r e s p o n s á v e l p e lo c r e s c im e n to c e lu la r ; 2 ) C a s c a ta C b l/C A P , a q u a l m e d ia o tr a n s p o r te d e g lic o s e
e 3 ) C a s c a ta P I3 K , a tiv a d a p e lo s s u b s tr a to s d o r e c e p to r d e in s u lin a ( I R S ) e
d e s e m p e n h a fu n ç õ e s m e ta b ó lic a s ( B O U R A - H A L F O N ; Z IC K , 2 0 0 9 ) .
D e s te m o d o , a in s u lin a d ir ig e a m a q u in a r ia m e ta b ó lic a in tr a c e lu la r , d e m o d o a
p r o d u z ir o s e fe ito s d e s e ja d o s s o b r e o m e ta b o lis m o d e c a r b o id r a to s , lip íd e o s e
p r o te ín a s .
F ig u r a 1 - E s tr u tu r a d o r e c e p to r d e in s u lin a e m h u m a n o . N o ta - s e q u e o r e c e p to r p o s s u i d u a s s u b u n id a d e s , u m a a , e x tr a c e lu la r , e o u tr a ~ , a q u a l a tr a v e s s a a m e m b r a n a p la s m á tic a c e lu la r . A p a r tir d a lig a ç ã o d a in s u lin a a o s e u r e c e p to r , h á o in íc io d a s in a liz a ç ã o in tr a c e lu la r ( G U Y T O N ; H A L L , 2 0 0 6 )
R e la tiv a m e n te a o s m e c a n is m o s e n v o lv id o s c o m o p r o c e s s o d e c r e s c im e n to ,
R E V I 5 Ã O D E L I T E R A T U R A I34
de ação pleiotrópica, que participa da captação de glicose pelas células. Esse
horm ônio tem ação com prom etida no diabetes, sendo o quadro apresentado em
estados de subnutrição, m uito sem elhante àquela condição observada no diabetes
do tipo 11, no qual as células se tornam resistentes à insulina (N IETO -VAZQ U EZ et aI., 2008). A sua ação depende da própria ligação com os respectivos receptores,
que se trata de um com plexo heterodim érico, com duas subunidades, a a,
extracelular ligada ao segm ento transm em brana e a ~, intracelular. Tendo sido este
horm ônio, considerado um "horm ônio de crescim ento" por Laron (2008), ele é capaz
de prom over o aum ento da síntese de D N A e R N A e proteínas nos tecidos alvo. N as
cartilagens, bem com o os fatores de crescim ento sem elhantes à insulina, ou insulin
like grow th factors (IG Fs) (D ELATTE et aI., 2004), atua conjuntam ente na cartilagem
do PC e rege, portanto, o crescim ento da m andíbula (LlVN E; LAU FER ;
BLU M EN FELD ,1997; M O LTEN I et al.,1999). Entretanto, a síntese de alguns fatores
de crescim ento (TAJIM A et aI., 1998; VISN APU U et aI., 2002) e a expressão de seus
receptores, são diferentes entre as cartilagens prim árias e secundárias (VISN APU U
et aI., 2001). A m andíbula tem um crescim ento pronunciado durante os períodos
pré-púbere e pré-púbere (BJO R K; SKILLER ; M C N AM AR A, 1976), que são sincronizados
com o crescim ento linear em am bos os sexos (BO JR K; H ELM , 1967), certificando
que a influência horm onal está presente. O s estudos tam bém sugerem que os
m ecanism os de proliferação da cartilagem constituinte do PC podem ter m uito em
com um com aqueles que regulam a proliferação nas suturas cranianas, com o
tam bém nos discos epifisiais (FU EN TES et ai., 2002), por tratarem -se de cartilagem
m ista.
C om relação aos receptores de IG F-I, som atom edina sem elhante à insulina,
foram verificados na cartilagem do PC de ratos, IG F-IR , tendo sido identificados por
im unorreatividade. N a cam ada articular, a falta de im unorreatividade dem onstrou
não haver receptores na região. Já na cam ada pré-condroblástica, os condrócitos da
parte m ais inferior foram predom inantes, juntam ente àqueles da parte m ais superior
da cam ada condroblástica. N a parte inferior da cam ada condroblástica, e superior da
hipertrófica, um a fraca im unorreatividade dem onstrou a presença de poucos
receptores. N o local estudado, foi observado tam bém um aum ento na expressão
gênica do IG F-I na transição entre os períodos pré-púbere (31dias) e púbere (42
dias), evidenciando que a proliferação da cartilagem do PC pode ser regulada em
R E V I 5 Ã O O E L I T E R A T U R A I3 5
p u b e rd a d e (F U E N T E S e t a I., 2 0 0 2 ). P o ré m , n o p e río d o c o m p re e n d id o e n tre o
n a s c im e n to e 2 1 d ia s , o s re c e p to re s d e IG F -I fo ra m d e te c ta d o s n a s u p e rfíc ie
a rtic u la r d o c õ n d ilo e n a s c a m a d a s p ré -c o n d ro b lá s tic a e p a rte s u p e rio r d a
h ip e rtró fic a d a c a rtila g e m d o P C . É im p o rta n te re s s a lta r q u e n e n h u m re c e p to r d e G H
fo i e n c o n tra d o n a c a rtila g e m d o P C d e ra to s d e 1 -2 1 d ia s d e id a d e (V IS N A P U U e t
a l.,2 0 0 1 ).
O m e c a n is m o d e re g u la ç ã o d o c re s c im e n to d a c a rtila g e m s e c u n d á ria d o P C
a in d a n ã o e s tá to ta lm e n te e lu c id a d o , d e m a n e ira q u e n ã o h á re fe rê n c ia d a p re s e n ç a
d e in s u lin a n e m d e s e u s re c e p to re s n e s s e te c id o , e m s itu a ç õ e s d e e s ta d o n u tric io n a l
m o d ific a d o , c o m o n a c a rê n c ia p ro té ic a , o u d ia n te d a s u a c o rre ç ã o . E n tre ta n to , s a b e
-s e q u e a c a rê n c ia p ro té ic a p ro m o v e d e c ré s c im o n a p ro d u ç ã o d e in s u lin a , e
c o m p ro m e te o s fa to re s d e c re s c im e n to s e m e lh a n te s à in s u lin a [in s u lin -lik e g ro w th
fa c to rs (IG F -I e 11)] (J O U S S E e t a I., 1 9 9 8 ), q u e s ã o p ro d u z id o s n a m a io ria d o s te c id o s d o c o rp o e a tu a m c o m o im p o rta n te s re g u la d o re s d a h o m e o s ta s e e d o
c re s c im e n to ó s s e o , re g u la n d o p a rá c rin a e a u to c rin a m e n te o m e ta b o lis m o c e lu la r d o s
te c id o s (G IU S T IN A ; M A Z Z IO T T I; C A N A L lS , 2 0 0 8 ).
D e s s e m o d o , c o m o a s a lte ra ç õ e s n o m e ta b o lis m o d a g lic o s e e d a in s u lin a
fre n te à s u b n u triç ã o s ã o b e m c o n h e c id a s , b e m c o m o a im p o rtâ n c ia e o s lim ite s d a
re c u p e ra ç ã o n u tric io n a l a d e q u a d a s o b re o c re s c im e n to (S A W A Y A , 2 0 0 6 ), n o P C ,
p e s q u is a s tê m s u a im p o rtâ n c ia c a lc a d a n o fa to d e s te e s ta r s u b m e tid o à s in flu ê n c ia s
h o rm o n a is e n u tric io n a is , e p e lo e fe ito d a in s u lin a n o te c id o d e e s p é c im e s
s u b n u trid o s n ã o s e r b e m c o n h e c id o . D e s s a fo rm a , a s u b n u triç ã o a p e n a s p ro té ic a ,
c u jo p ro to c o lo fo i d e s e n v o lv id o n o p re s e n te e s tu d o (R E E V E S ; N IE L S E N ; F A H E Y ,
1 9 9 3 ), fo i a p lic a d a p a ra o e s tu d o d o re c e p to r d e in s u lin a , s o b re o P C , p rin c ip a l s ítio
re s p o n s á v e l p e lo c re s c im e n to m a n d ib u la r. A u to re s c o m o P im s to n e e t a I. (1 9 6 8 )
d e m o n s tra ra m q u e , s o b c o n d iç õ e s g ra v e s d e s u b n u triç ã o p ro té ic a , a in g e s tã o d e
q u a n tid a d e s a d e q u a d a s d e c a lo ria s is o la d a m e n te n ã o fo i c a p a z d e c o rrig ir o e x c e s s o
d e p ro d u ç ã o d e G H , s e n d o n e c e s s á ria a re n u triç ã o p ro té ic a p a ra q u e e s te n ív e l
fo s s e re g u la riz a d o . D e s ta m a n e ira , a re n u triç ã o p ro té ic a ta m b é m fo i p ro v id e n c ia d a ,
c o m o o b je tiv o d e o b s e rv a r o p o s s ív e l re e q u ilíb rio ta m b é m d a a tiv id a d e d o re c e p to r
d e in s u lin a . T a is a lte ra ç õ e s m e ta b ó lic a s s o b re o c re s c im e n to d o P C n ã o s ã o b e m
e lu c id a d a s , n e m m e s m o c o rre la c io n a d a s , c o n s id e ra n d o q u e a e s tru tu ra a p re s e n ta
P R O P O S I ç Ã O I3 6
3 PROPOSiÇÃO
B u s c o u - s e n a p r e s e n te p e s q u is a , a v a lia r e m r a to s w is ta r , q u a lita tiv a e
q u a n tita tiv a m e n te , n a s fa s e s p ú b e r e ( 6 0 d ia s ) e a d u lta ( 1 0 0 d ia s ) , a s
r e p e r c u s s õ e s m o r fo ló g ic a s d a s u b n u tr iç ã o p r o té ic a p r é e p ó s - n a ta l e d a
r e n u tr iç ã o p ó s - n a ta l, s o b r e o c r e s c im e n to d o p r o c e s s o c o n d ila r ( P C ) . E , p o r
m e io d a c o r r e la ç ã o d a s a lte r a ç õ e s o b s e r v a d a s n o P C , a tr a v é s d e m a r c a ç ã o
im u n o h is to q u ím ic a d o r e c e p to r d e in s u lin a , in v e s tig o u - s e ta m b é m :
• A p r e s e n ç a d o r e c e p to r d e in s u lin a n a c a r tila g e m d o P C ;
• A o c o r r ê n c ia d e v a r ia ç õ e s n a e x p r e s s ã o d o s r e c e p to r e s d e in s u lin a n o s
M A T E R I A I S E M É T O O O S I 3 7
4 MATERIAIS E MÉTODOS
E s ta s e ç ã o c o m p re e n d e a d e s c riç ã o d e ta lh a d a , e m o rd e m c ro n o ló g ic a , d a
m e to d o lo g ia a p lic a d a n a p re s e n te p e s q u is a .
4 .1 O B T E N Ç A O D O S G R U P O S E X P E R IM E N T A IS
P a ra a fo rm a ç ã o d o s g ru p o s e x p e rim e n ta is , fo ra m a c a s a la d o s , p e lo p e río d o
d e 7 a 1 0 d ia s , ra to s w is ta r (Ratfus norvegicus) jo v e n s c o m a p ro x im a d a m e n te 6 0
d ia s d e v id a e c o m p e s o v a ria n d o e n tre 2 8 0 e 3 2 0 g ra m a s p a ra o s m a c h o s e e n tre
2 0 0 e 2 5 0 g p a ra a s fê m e a s . A o lo n g o d e to d o o e x p e rim e n to o s a n im a is fo ra m
m a n tid o s , s e m re s triç ã o , c o m ra ç ã o p a ra ro e d o re s A IN -9 3 G , d e a c o rd o c o m a
"A m e ric a n In s titu te o f N u tritio n " (R E E V E S ; N IE L S E N ; N IE L S E N , 1 9 9 3 ), p re p a ra d a
e m la b o ra tó rio e s p e c ia liz a d o (R h o s te r® ). T a m b é m fo ra m o b s e rv a d o s o s c ic lo s c la ro
e e s c u ro d e 1 2 h o ra s , e a te m p e ra tu ra a m b ie n te c o n tro la d a a 2 3 °C . P a ra a
v ia b iliz a ç ã o d o a c a s a la m e n to , p re v ia m e n te à a c o m o d a ç ã o d o s a n im a is e m c a ix a s in d iv id u a is c o n te n d o u m m a c h o p a ra d u a s fê m e a s , e s te s p a s s a ra m p o r u m p e río d o
a d a p ta ç ã o , c o m o in tu ito d e q u e n ã o h o u v e s s e a re je iç ã o d o m a c h o p e la s fê m e a s .
A s s im , d u ra n te s e te d ia s , a n te s d o in íc io d o p ro c e s s o , a s fê m e a s e o s m a c h o s e ra m
a lte rn a d o s e n tre a s p ró p ria s c a ix a s . A p ó s e s te p e río d o , a s fê m e a s e o m a c h o e ra m
c o lo c a d o s n u m a s ó c a ix a , in ic ia n d o -s e , a s s im , o p e río d o d o a c a s a la m e n to . A s
ra ç õ e s o fe re c id a s c o n tin h a m d o is d ife re n te s te o re s p ro té ic o s , d e a c o rd o c o m o s
q u a is o s g ru p o s fo ra m d e fin id o s : a ra ç ã o n o rm o p ro té ic a , c o m 2 0 % d e c a s e ín a e a
h ip o p ro té ic a , c o m a p e n a s 5 % . F in d o e s te p e río d o , a s fê m e a s fo ra m s e p a ra d a s e m
g a io la s in d iv id u a is e c o n tin u a ra m re c e b e n d o a s re s p e c tiv a s ra ç õ e s , a té o
n a s c im e n to d a p ro le . L o g o a p ó s o n a s c im e n to , a s n in h a d a s fo ra m re d u z id a s a s e is
a n im a is , p ro c u ra n d o -s e m a n te r o m a io r n ú m e ro d e m a c h o s , g ê n e ro e le ito c o m o
o b je tiv o d e s e e v ita r a v a riá v e l s e x u a l d im ó rfic a . A o a tin g ire m 2 1 d ia s d e v id a , é p o c a
d o d e s m a m e , o s e s p é c im e s p a s s a ra m a s e r m o n ito ra d o s e m g a io la s m e ta b ó lic a s
in d iv id u a is , a té a tin g ire m a id a d e d e 6 0 d ia s d e v id a , c o n s titu in d o -s e , a s s im , o s
M A T E R I A I 5 E M É T O D O S I 3 8
a q u e le s q u e r e c e b e r a m a r a ç ã o h ip o p r o t é ic a . P a r a a f o r m a ç ã o d o g r u p o d e a n im a is
r e n u t r id o s ( R ) , a n im a is m a n t id o s c o m a r a ç ã o h ip o p r o t é ic a a t é o 2 1 ° d ia , p a s s a r a m a
r e c e b e r , a p a r t ir d o 2 2 ° d ia , a r a ç ã o n o r m o p r o t é ic a a t é q u e a t in g is s e m 6 0 d ia s d e
v id a . T a l p e r í o d o f o i e s t a b e le c id o p o r c o r r e s p o n d e r a o f in a l d a f a s e p ú b e r e d o r a t o ,
s e g u n d o V ia u e t a I . ( 2 0 0 5 ) . C o n f o r m e já d e s c r it o , o m o n it o r a m e n t o d o s g r u p o s N , S
e R f o i r e a liz a d o e m g a io la s m e t a b ó lic a s 1 c o m o in t u it o d e s e m e n s u r a r p a r â m e t r o s
c o m o a in g e s t ã o e a e x c r e ç ã o , lí q u id a s e s ó lid a s ( F ig u r a 2 ) . P a r a o b s e r v a r s e a s
c a r a c t e r í s t ic a s m o r f o ló g ic a s t e c id u a is d e c o r r e n t e s d o s p r o c e s s o s d e s u b n u t r iç ã o e
r e n u t r iç ã o s e in s t a la m d e f o r m a p e r m a n e n t e , a n im a is d o s g r u p o s R e N f o r a m
m a n t id o s c o m a s r e s p e c t iv a s d ie t a s a t é 1 0 0 d ia s d e v id a , c o n s t it u in d o - s e a s s im , o s
g r u p o s R R e N N .
M A T E R I A I 5 E M ÉT O D O S I3 9
M A T E R I A I 5 E M É T O D O S I4 1
4 .2 A N Á L IS E M E T A B Ó L IC A
O s e s p é c im e s fo r a m o b tid o s d e u m " p o o l" d e a n im a is u tiliz a d o s e m d ife r e n te s
p e s q u is a s n o L a b o r a tó r io d e A n a to m ia F u n c io n a l A p lic a d a à C lín ic a e à C ir u r g ia
( L A F A C C ) . V in te e q u a tr o g a io la s m e ta b ó lic a s fo r a m u tiliz a d a s p a r a o
d e s e n v o lv im e n to d e s s a a n á lis e d o s a n im a is d o s g r u p o s N , S e R ( F ig u r a 3 ) . A tr a v é s
d o p r o to c o lo e s ta b e le c id o n o ite m a s e g u ir ( 4 .2 .1 ) , o s a n im a is d o s g r u p o s ( N , S e R ) ,
a p a r tir d o 2 2 ° d ia , tiv e r a m m o n ito r a d o s o s s e g u in te s p a r â m e tr o s : m a s s a c o r p o r a l,
in g e s tõ e s s ó lid a e líq u id a , e x c r e ç õ e s s ó lid a e líq u id a .
A s s im , n in h a d a s s u b s e q u e n te s fo r a m a n a lis a d a s d e ta l fo r m a q u e , n e s s a
p r im e ir a fa s e , fo r a m m o n ito r a d o s u m to ta l d e 3 a n im a is d o g r u p o N , 3 d o g r u p o S e 3
M A T E R I A I S E M É T O O O S I4 2
F ig u r a 3 - G a io la s m e t a b ó lic a s .A: P a r a m e n t o c o r r e t o p a r a o t r a b a lh o n o B io t é r io ( D e p . D e A n a t o m ia - I C B / U S P ) ; 8 : E s t a n t e c o m 1 2 g a io la s m e t a b ó lic a s , c o n t e n d o t u b o c o le t o r d e f e z e s e u r in a s e p a r a d a m e n t e , b e m c o m o b e b e d o u r o e c o m e d o u r o . C : E s p a ç o d e s t in a d o a o a n im a l d e a c o r d o c o m o s p r in c í p io s d a C o m is s ã o d e É t ic a d o I C B ; O : G a io la c o m a m a r c a ç ã o ( M 7 ) . O b s e r v a r o c o m e d o u r o e ju n t o a o b e b e d o u r o o c o le t o r d e d e s p e r d í c io , b e m c o m o o s c o le t o r e s in d iv id u a is d e f e z e s e u r in a ; E : B a la n ç a e m a ju s t e c o m o r e c ip ie n t e q u e ir á s e r u t iliz a d o n a p e s a g e m d o a n im a l, p a r a e n t ã o d e s c o n s id e r á - I o . F : P e s a g e m d o a n im a l. G : P e s a g e m d o c o m e d o u r o a s s im q u e é p r e e n c h id o c o m a r a ç ã o a p r o p r ia d a . O b s e r v e q u e h á u m a s u b d iv is ã o n o r e c ip ie n t e d e s t in a d a a c a p t a ç ã o d o d e s p e r d í c io e n q u a n t o o a n im a l s e a lim e n t a . H : C o m e d o u r o e m p o s iç ã o n a g a io la m e t a b ó lic a . O b s e r v e o d e s p e r d í c io q u e f o i a r m a z e n a d o n o r e c ip ie n t e a n t e r io r . I : P e s a g e m d o c o m e d o u r o d e p o is d e 1 d ia . A d if e r e n ç a e n t r e o s v a lo r e s o b t id o s a n t e s d a a lim e n t a ç ã o e d e p o is d e u m d ia d e a lim e n t a ç ã o , d á a in f o r m a ç ã o d e q u a n t o o a n im a l in g e r iu d e r a ç ã o ( e m g r a m a s ) . J : B e b e d o u r o g r a d u a d o e m m ililit r o s . K : B e b e d o u r o e m p o s iç ã o e c o le t o r d o d e s p e r d í c io d a in g e s t ã o d e á g u a c o le t a d o . A s o m a d á a in f o r m a ç ã o d e q u a n t a á g u a o a n im a l in g e r iu d u r a n t e o d ia d e e x p e r im e n t o . L : P a r t e in f e r io r d a g a io la c o n t e n d o o s r e c ip ie n t e s s e p a r a d o s p a r a a coleta d a e x c r e ç ã o , t a n t o s ó lid a c o m o lí q u id a , d u r a n t e o d ia d e e x p e r im e n t o .
M A T E R I A I S E M É T O D O S I 4 3
) O S 142
:O e p . D e Id o tu b o lo u r o . C : d e É tic a ju n to a o d e fe z e s p e s a g e m 3 g e m d o q u e h á iu a n t o o o s e r v e o J e m d o m te s d a ~ u a n to o litr o s . K : e ta d o . A d ia d e
M A T E R IA IS E M É T O D O S I4 4
4 .2 .1 Protocolo de Análise Metabólica
A s r a ç õ e s u tiliz a d a s e r a m a r m a z e n a d a s e m fr e e z e r ( - S O C ) , d e m o d o q u e d o is
q u ilo s d e c a d a tip o ( n o r m o o u h ip o p r o té ic a ) p e r m a n e c e s s e m e m g e la d e ir a ( 6 ° C ) , e m
fr a s c o s in d iv id u a is , p a r a o c o n s u m o d iá r io .
A s g a io la s m e ta b ó lic a s p e r m a n e c e r a m e m s a la e x c lu s iv a , s e n d o a e n tr a d a
d iá r ia r e s tr ita a d o is tr a ta d o r e s , d e v id a m e n te p a r a m e n ta d o s c o m E q u ip a m e n to d e
P r o te ç ã o In d iv id u a l ( E P I - g o r r o , m á s c a r a , lu v a s , a v e n ta l e ó c u lo s d e p r o te ç ã o ) , n o
p e r ío d o c o m p r e e n d id o e n tr e 1 2 :0 0 h e 1 4 :0 0 h . O b s e r v o u - s e o d e v id o c u id a d o p a r a a
m a n u te n ç ã o d e u m a m b ie n te tr a n q ü ilo c o m o m ín im o d e r u íd o s fo i to m a d o .
P a r a o in íc io d a to m a d a d iá r ia d e p a r â m e tr o s , a in te r r u p ç ã o d a in g e s tã o
a tr a v é s d a c o lo c a ç ã o d a d iv is ó r ia m e tá lic a n a e n tr a d a d o tú n e l d e a c e s s o à r a ç ã o e à á g u a , e r a r e a liz a d a . O s p a r â m e tr o s m e n s u r a d o s fo r a m o s s e g u in te s :
- In g e s tã o s ó lid a ( r a ç ã o ) e m m ilig r a m a s ( m g ) , q u a n d o a p e s a g e m d o
r e c ip ie n te fo i fe ita n o s m o m e n to s a n te r io r e p o s te r io r a o a c r é s c im o d a r a ç ã o ;
- E x c r e ç ã o s ó lid a ( fe z e s ) e m m ilig r a m a s ( m g ) ;
- M a s s a c o r p o r a l. A p ó s a r e tir a d a c u id a d o s a d o s a n im a is d a s r e s p e c tiv a s
g a io la s m e ta b ó lic a s , fo r a m p e s a d o s c o m o a u x ílio d e u m fr a s c o p lá s tic o , o q u a l tin h a
o s e u p e s o s u b tr a íd o ;
- E x c r e ç ã o líq u id a ( u r in a ) e m m ililitr o s ( m l) , d e a c o r d o c o m a g r a d u a ç ã o
p r e s e n te n o fr a s c o n o q u a l e r a a r m a z e n a d a ;
- In g e s tã o líq u id a ( á g u a ) e m m ililitr o s ( m l) a p a r tir d a o b s e r v a ç ã o d o " m e n is c o "
c o m r e la ç ã o à g r a d u a ç ã o d o r e s e r v a tó r io ( b e b e d o u r o ) .
A d a ta e a h o r a d e in íc io d o s p r o c e d im e n to s p a r a a to m a d a d e p a r â m e tr o s
fo r a m d e v id a m e n te r e g is tr a d a s e m fic h a e s p e c ífic a c o m o in tu ito d e s e d e te c ta r
p o s s ív e is a lte r a ç õ e s o u m u d a n ç a s c o m p o r ta m e n ta is . T o d o s o s p e s o s d e m a s s a
fo r a m o b tid o s p o r m e io d e b a la n ç a d e p r e c is ã o " .
D e s ta fo r m a , to d o s o s a n im a is d o e s tu d o , p o s s u ía m fic h a in d iv id u a l c o n te n d o
u m h is tó r ic o d iá r io , o r g a n iz a d a s c o m b a s e e m u m c ó d ig o d e r e g is tr o q u e in d ic a v a a
n in h a d a à q u a l p e r te n c e u e a g a io la m e ta b ó lic a in d iv id u a l n a q u a l r e s id iu a té a
M A T E R I A I S E M É T O D O S I4 5
e u t a n á s ia . E s t e c ó d ig o d e r e g is t r o f o i e s t a b e le c id o a o n a s c im e n t o e o b s e r v a d o a t é o
f in a l d e e s t u d o , c o m o ilu s t r a o e s q u e m a a b a ix o .
A3M24(58)
1
N ú r e r o r e f e r e n t e a o r e g is t r o g e r a l d o a n im a l.
S e g u e a o r d e m
c r o n o ló g ic a d e e u t a n á s ia d e t o d o s o s a n im a is . L e t r a r e f e r e n t e à n in h a d a .
P a r a a c o n s t it u iç ã o d e c a d a g r u p o f o r a m o b t id a s 5 n in h a d a s ( A , B , C , D e E ) . O n ú m e r o a o la d o ( 3 ) c o r r e s p o n d e a o a n im a l d e n t r o d a n in h a d a in d ic a d a .
L e t r a e n ú m e r o in d ic a n d o a g a io la m e t a b ó lic a e m q u e
o a n im a l
p e r m a n e c e u ( M 2 4 ) .
O s a n im a is u t iliz a d o s n o p r e s e n t e e s t u d o f o r a m e m g e r a l p r o v e n ie n t e s d a s
n in h a d a s A , B e C , e q u a n d o n e c e s s á r io e r a m t o m a d o s d a s n in h a d a s O e E , c o m o
n o c a s o d e s u p r im e n t o d a s p e r d a s .
A m a n u t e n ç ã o e lim p e z a d a s g a io la s m e t a b ó lic a s e r a m r e a liz a d a s
s e m a n a lm e n t e o u q u in z e n a lm e n t e d e a c o r d o c o m a n e c e s s id a d e . O s f u n is d e
e s c o a m e n t o d e u r in a e d e d ir e c io n a m e n t o d a s f e z e s a o s r e c ip ie n t e s e s p e c í f ic o s
e r a m d e s a c o p la d o s , e s f r e g a d o s c o m e s p o n ja m a c ia , e n x a g u a d o s e e n x u g a d o s c o m
p a n o s lim p o s s e c o s p a r a im e d ia t a r e p o s iç ã o , d u a s v e z e s p o r s e m a n a . O b e b e d o u r o
e o c o le t o r d e á g u a t a m b é m e r a m la v a d o s c o m a m e s m a f r e q u e n c ia . A g r a d e e o s
t ú n e is m e t á lic o s b e m c o m o o m a t e r ia l p lá s t ic o d a s p a r e d e s d a g a io la , e r a m lim p o s
c o m u m a g a z e e m b e b id a e m á lc o o l 70° d u a s v e z e s p o r s e m a n a e a lim p e z a g e r a l d a s a la , e r a r e a liz a d a q u in z e n a lm e n t e .
4 . 3 O B T E N Ç Ã O D O S P R O C E S S O S C O N O I L A R E S D A M A N D í B U L A ( P C )
S e is a n im a is d e c a d a u m d o s g r u p o s m o n it o r a d o s e m g a io la s m e t a b ó lic a s ( N ,
S e R ) e s e is d o s g r u p o s NN e R R , f o r a m s u b m e t id o s à e u t a n á s ia e m c â m a r a d e
d ió x id o d e c a r b o n o ( C 02) e t iv e r a m r e m o v id o s o s P C s , c o m o s e g u e . A d is s e c ç ã o
M A T r R I A I S E M É T o o o S I4 6
d o a r c o z ig o m á t ic o , q u e f o i r e b a t id o t r a z e n d o c o n s ig o o s f e ix e s d o m ú s c u lo
m a s s é t e r . A p ó s a d iv u ls ã o d o s f e ix e s d o m ú s c u lo t e m p o r a l, a c á p s u la a r t ic u la r d a
a r t ic u la ç ã o t e m p o r o m a n d ib u la r ( A T M ) f o i t o t a lm e n t e e v id e n c ia d a , r e m o v e n d o - s e ,
e n t ã o , u m b lo c o c o n t e n d o o P C d a m a n d í b u la e o m ú s c u lo p t e r ig ó id e o la t e r a l ( F ig u r a
4 ) .
A p ó s c u id a d o s a d is s e c ç ã o d o m . p t e r ig o id e o la t e r a l, o s P C s f o r a m f ix a d o s e m
B o u in p o r 8 h o r a s , e d e s c a lc if ic a d o s e m s o lu ç ã o d e M o r s e c o n t e n d o á c id o f ó r m ic o
( 5 0 % ) e c it r a t o d e s ó d io ( 2 0 % ) , t r o c a d a e m in t e r v a lo s d e 4 8 h o r a s , d u r a n t e 3 0 d ia s .
O t e s t e d e d e s c a lc if ic a ç ã o p a r a a v a lia r o c o n t e ú d o m in e r a l d o e s p é c im e f o i
r e a liz a d o , a d ic io n a n d o - s e à s o lu ç ã o d e s c a lc if ic a d o r a , u m a s o lu ç ã o d e o x a la t o d e a m ô n io a 5 % , n a p r o p o r ç ã o d e 5 : 1 . A p ó s la v a g e m e m á g u a d e s t ila d a , o s e s p é c im e s
f o r a m d e s id r a t a d o s e m s é r ie c r e s c e n t e d e a lc o ó is ( 7 0 ° a o a b s o lu t o ) , d ia f a n iz a d o s e m
x ilo l e in c lu í d o s r o t in e ir a m e n t e e m p a r a f in a . C o r t e s s e m i- s e r ia d o s d e 5 I J m , n o p la n o
s a g it a l, f o r a m o b t id o s e m m ic r ó t o m o ( L e ic a S M 2 0 0 R ) , m o n t a d o s e m lâ m in a s
h is t o ló g ic a s e m a n t id o s e m e s t u f a a 3 7 ° C , p a r a d e s p a r a f in a ç ã o .
O s c o r t e s a s s im o b t id o s f o r a m u t iliz a d o s a s t é c n ic a s d e s c r it a s a s e g u ir .
M A T E R I A I S E M É T O D O S I 4 7
M A T E R I A I S E M É T O D O S I 4 8
4 . 4 M I C R O S C O P I A D E L U Z
E m c o r t e s d o P C d e t r ê s a n im a is d e c a d a g r u p o , f o r a m r e a liz a d a s a s
s e g u in t e s c o lo r a ç õ e s : a z o - c a r m im , p ic r o s í r iu s e s a f r a n in a - O .
4.4.1 Azo-carmim
P a r a e s s a c o lo r a ç ã o , d e c a d a a n im a l d e t o d o s o s g r u p o s ( N , S , R, NN e R R ) ,
f o r a m u t iliz a d a s 4 lâ m in a s c o n t e n d o 5 c o r t e s c a d a , n u m t o t a l d e 6 0 c o r t e s p o r g r u p o .
C o m e s t e m é t o d o ( R O M E I S , 1 9 6 8 ) o b je t iv o u - s e e v id e n c ia r o s c o m p o n e n t e s
c e lu la r e s d a s c a m a d a s d a c a r t ila g e m d o P C . A s s im , o s e s p é c im e s p e r m a n e c e r a m
2 0 m in u t o s e m c o r a n t e " e e m á g u a d e s t ila d a , p o r 1 0 m in u t o s . A p ó s la v a d o s , e m
s e g u ir , o s c o r t e s f o r a m im e r s o s e m s o lu ç ã o d e á c id o f o s f o t u n g u í s t ic o a 5 % , im e r s o s
p o r 1 0 m in u t o s e m a z u l d e a n ilin a a 1 % e d e s id r a t a d o s e m s é r ie c r e s c e n t e d e
á lc o o is ( 7 00 a o a b s o lu t o ) , d ia f a n iz a d o s e m x ilo l e m o n t a d o s e n t r e lâ m in a e la m í n u la
c o m m e io a p r o p r ia d o " ,
4.4.2 Picrosirius
E s s a m e t o d o lo g ia , d e s e n v o lv id a p o r J u n q u e ir a e t a I . ( 1 9 7 9 ) , f o i e m p r e g a d a
p a r a a t ip if ic a ç ã o , s o b lu z p o la r iz a d a , d a s f ib r a s c o lá g e n a s d o P C . P a r a t a n t o , f o r a m
u t iliz a d a s 3 lâ m in a s c o n t e n d o 5 c o r t e s d e c a d a a n im a l d o s g r u p o s N , S , R , NN e R R ,
o u s e ja , 1 5 c o r t e s p o r g r u p o .
M A T E R i A I 5 E M É T O D O S I4 9
R e s u m id a m e n t e , o s c o r t e s p e r m a n e c e r a m 2 5 m in u t o s e m c o r a n t e '' e , a p ó s
la v a d o s e m á g u a d e s t ila d a , f o r a m d e s id r a t a d o s , d ia f a n iz a d o s e m o n t a d o s d e a c o r d o
c o m o d e s c r it o n o it e m a n t e r io r ( 4 . 4 . 1 ) .
4 . 4 . 3 S a f r a n in a - O
P a r a q u e s e p r o c e d e s s e à a n á lis e q u a lit a t iv a d a m a t r iz c a r t ila g í n e a d o P C , e m p r e g o u - s e o m é t o d o d a S a f r a n in a - O , d e s c r it o p o r L u n a ( 1 9 6 8 ) , e m 3 lâ m in a s
c o n t e n d o 5 c o r t e s c a d a d e c a d a a n im a l, d e t o d o s o s g r u p o s ( N , S , R , N N e R R ) ,
p e r f a z e n d o u m t o t a l d e 1 5 c o r t e s p o r g r u p o .
A t é c n ic a c o n s t it u iu d a r e h id r a t a ç ã o d o s c o r t e s e m d u a s p a s s a g e n s p o r 7
m in u t o s e m x ilo l e , e m s e g u id a , e m d u a s p a s s a g e n s d e 2 m in u t o s e m e t a n o l a 1 0 0 %
e a 9 5 % . A p ó s la v a g e m e m á g u a d e s t ila d a , o s c o r t e s f o r a m im e r s o s , d u r a n t e 1 0
m in u t o s , n a s e g u in t e s o lu ç ã o d e s a f r a n in - O ( S ig m a ) : 0 , 1 % d e s a f r a n in e m t a m p ã o
a c e t a t o d e s ó d io ( 0 , 1 M ; p H 4 , 6 ) .
A d e s id r a t a ç ã o f o i r e a liz a d a p o r d u a s p a s s a g e n s d e 2 m in u t o s c a d a e m e t a n o l
a 9 5 % e a 1 0 0 % , s e g u id a s p e la im e r s ã o p o r d u a s v e z e s , e m x ilo l ( 7 m in u t o s c a d a ) .
A m o n t a g e m f o i r e a liz a d a c o n f o r m e d e s c r it o n o it e m 4 . 4 . 1 .
4 . 5 I M U N O H I S T O Q u í M I C A P A R A O R E C E P T O R D E I N S U L I N A ( I R )
P a r a e s s a m e t o d o lo g ia , f o r a m o b t id a s 4 lâ m in a s ( c o n t e n d o 5 c o r t e s c a d a ) d o
P C d e t r ê s a n im a is d e c a d a g r u p o ( N , S , R , N N e R R ) , n u m t o t a l d e 6 0 c o r t e s p o r
g r u p o .
D e s t a f o r m a , o s c o r t e s f o r a m s u b m e t id o s à p a s s a g e m e m s é r ie d e c r e s c e n t e d e a lc o ó is ( a b s o lu t o a t é 5 0 ° - 2 m in u t o s c a d a ) e , e m s e g u id a , la v a d o s e m á g u a
d e s t ila d a ( 5 m in u t o s ) . O s c o r t e s f o r a m e x p o s t o s p o r 5 m in u t o s e m s o lu ç ã o d e
p e r ó x id o d e h id r o g ê n io a 3 % d ilu í d o e m m e t a n o l a 1 0 0 % , la v a d o s c o m e m s o lu ç ã o
