UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE SEMENTES
TESE
CARACTERIZAÇÃO DE GENÓTIPOS DE ARROZ SUBMETIDOS AOS ESTRESSES DE FRIO E PROFUNDIDADE DE SEMEADURA
CAROLINE BORGES BEVILACQUA
PELOTAS, 2013
CAROLINE BORGES BEVILACQUA
CARACTERIZAÇÃO DE GENÓTIPOS DE ARROZ SUBMETIDOS AOS ESTRESSES DE FRIO E PROFUNDIDADE DE SEMEADURA
Tese apresentada à Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel”, Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação do Prof. Dr. Paulo Dejalma Zimmer, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Ciência e Tecnología de Sementes, para obtenção do título de Doutora em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. PAULO DEJALMA ZIMMER
Co-orientadora: PhD. NILDA ROMA BURGOS – University of Arkansas (EUA)
PELOTAS, 2013
Dados de catalogação na fonte:
(Gabriela Machado Lopes – CRB: 10/1842) B571c Bevilacqua, Caroline Borges
Caracterização de genótipos de arroz submetidos aos estresses de frio e profundidade de semeadura. / Caroline Borges Bevilacqua; orientador Paulo Dejalma Zimmer – Pelotas, 2013.
93 f. :il
Tese (Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de sementes). Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas.
Pelotas, 2013.
1. Estádios iniciais; 2. qRT-PCR; 3. Arroz vermelho; 4. Esterase. I. Zimmer, Paulo Dejalma (orientador); II. Título.
CDD 633.18
CARACTERIZAÇÃO DE GENÓTIPOS DE ARROZ SUBMETIDOS AOS ESTRESSES DE FRIO E PROFUNDIDADE DE SEMEADURA
AUTORA: Caroline Borges Bevilacqua, M.Sc.
ORIENTADOR: Prof. Paulo Dejalma Zimmer, Ph.D.
BANCA EXAMINADORA
Prof. PAULO DEJALMA ZIMMER, Dr., UFPel (Orientador)
Profa LIA REJANE SILVEIRA REINIGER, Dra, UFSM
NACIELE MARINI, Dra, UFPel
Engo Agro GERI EDUARDO MENEGHELLO, Dr., UFPel
ANDREIA DA SILVA ALMEIDA, Dra, UFPel
Prof. LUCIANO CARLOS DA MAIA, Dr., UFPel
Aos meus amores: meus pais Paulo Cezar Bevilacqua (in memorian) e Marta Lúcia Bevilacqua eminhas irmãs Letícia e Amanda Borges Bevilacqua
Dedico...
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e ao meu pai por terem me guiado.
Aos meus pais, Paulo Cezar Bevilacqua e Marta Lúcia Bevilacqua, por tudo.
As minhas irmãs Letícia e Amanda Bevilacqua e ao meu “irmão”, meu cunhado Ormuz Neto, pelos conselhos, amor e apoio.
À Universidade Federal de Pelotas e ao meu orientador pela oportunidade de realização do doutorado.
Ao Dr. Luis Avila por se dispor a entrar em contato e me apresentar para a Dr. Burgos e assim permitir a realização do meu Doutorado Sanduíche. Além de sempre manter contato e se preocupar como eu estava nos Estados Unidos.
A Dr. Nilda Roma Burgos por grandiosamente me guiar, orientar, planejar e discutir os resultados dos experimentos realizados nos Estados Unidos. Além de todo o apoio, amizade e ensinamentos. Thank you very much Dear Dr. Burgos. I also want to thank all my coworkers in USA: Hussain, Vijay, Shelpa, Reio, Fernando, Ana Carolina and Jun.
Thanks my sweeties, hard workers and my great friends Dr. Coy Batoy and Dr. Paul Tseng, I miss you guys, a lot!!! Hope “cya” soon, “dudes”!!
A todos os amigos que fiz nos USA que de alguma forma me ajudaram e me fizeram bem…Igor mimoso, Bruna, Sergio, Montse, Alejandro, Dimitra, Bia, Fabio, Buri, Gra...enfim…muitos amigos queridos! E em especial queria agradecer a uma grande amiga que considero uma irmã de coração Cris Pilon, obrigada por todo apoio, carinho, amizade, puxões de orelha e gargalhadas...
Hey, Fernando, Lara, Ana, Bea e Cris...nunca vou esquecer aquela madrugada de
“32°F” que vocês me esperaram chegar de viagem só pra me darem “O” abraço que eu precisava.
Ao Dr. Luciano Maia pelo auxílio nas analises dos experimentos.
Aos Dr. Antonio Costa de Oliveira e Dr. Odir Dellagostin por concederem espaço e equipamentos indispensáveis à realização dos experimentos.
Aos Dr. Andy Pereira e Dr. Supratim Basu por contribuírem de forma grandiosa desde o planejamento até a análise dos resultados dos experimentos realizados nos Estados Unidos.
companheirismo, tantos pousos, choros, risadas...Cris, meus estudos para a qualificação sem tua presença, cafés e explicações seriam bem mais pesados!! Enfim, minha estada em Pelotas foi mais alegre com vocês!
Aos colegas Carol Terra Borges, Silvana e Eduardo Venske pelo auxílio nos experimentos.
Ao tio Marco, tio Luiz, tio Beto e tio Salla e às tias Tania, Gilda, Alexia e Bete pelo super apoio, vocês todos moram no meu coração!
Aos meus avós pela força e exemplo!
Às minhas grandes amigas Babi, Livia e Nati, por me apoiarem tanto e estar comigo sempre!
Ao pessoal do Laboratório de Sementes e Biotecnologia, por disponibilizar a realização efetiva dos experimentos.
À Maya Beatriz por ficar ao meu lado durante a escrita da tese.
Ao CNPq pelo auxílio financeiro que possibilitou a realização deste trabalho.
E a todos que, também, contribuíram para que eu concluísse mais essa grande etapa em minha vida.
RESUMO GERAL
BEVILACQUA, Caroline Borges. Caracterização de genótipos de arroz submetidos aos estresses de frio e profundidade de semeadura. 2013. 97f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Sementes) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Sementes, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS
O estresse causado pelo frio interfere negativamente na fisiologia, metabolismo, crescimento e desenvolvimento das plantas e, portanto, limita a produtividade em lavouras de arroz. As respostas em nível de crescimento em arroz (Oryza sativa L.) submetido a baixas temperaturas ainda são pouco compreendidas. Um melhor entendimento do mecanismo de tolerância ao estresse em plantas de arroz pode ajudar na identificação, no germoplasma de arroz, de plantas com tolerância submetidas à temperatura variável, além de ser útil para outros estresses abióticos, como diferentes profundidades de semeadura. Para caracterizar genótipos de arroz, com variação na sensibilidade ao frio, tiveram-se como objetivos:avaliar a aplicabilidade de diferentes índices de estresse utilizando-se como parâmetro o comprimento de plântula; classificar acessos de arroz cultivado e vermelho como Japonica ou Indica;
comparar a resposta ao frio de cultivares de arroz tolerante e sensível a esse estresse, com relação ao acúmulo de massa seca e possíveis alterações no teor de clorofila;categorizá-los com relação à sensibilidade ao frio e à profundidade de semeadura; e analisar a expressão de genes que respondem a frio, assim como genes responsivos a submersão, sob condições de frio e/ou tratamento constituídos por diferentes profundidades de semeadura. Para avaliar o acúmulo de massa seca e o teor de clorofila, as sementes, após sete dias a 25°C, foram expostas a 4°C durante 24 h e logo após, foi medida a fotossíntese e,posteriormente, as plantas ficaram 72 h a 25°C para sua recuperação. Já para os demais experimentos,as plântulas foram coletadas 7 e/ou 14 dias mantidas a 25°C ou 18/13°C dia/noite e diferentes profundidades de semeadura (1.5cm, 5cm, 10cm e 15cm); as avaliações da expressão gênica diferencial foram realizadas com essas amostras coletadas, para 4 diferentes genes induzidos pelo frio e também em amostras coletadas após exposição a 10°C durante 6, 24 e 96 h a 1.5 cm e 10 cm de profundidade de semeadura.Os resultados indicaram que é possível a identificação de genótipos superiores para a tolerância a esses estresses abióticos com base em seus índices de estresse, utilizando como parâmetro o comprimento da parte aérea, devido a habilidade das plantas tolerar estresses abióticos afetar a morfologia assim como a fisiologia da planta de arroz. Assim como é possível a utilização do Índice de Tolerância (STI) e da Média Geométrica (GM) para selecionar genótipos tolerantes ao frio ou profundidade de semeadura, baseado no comprimento de parte aérea de plântula. As subespécies Japonica e Indica respondem diferentemente aos estresses abióticos, no entanto, para alguns genes responsivos a esses estresses, essas subespécies apresentam o mesmo respondem semelhantemente. Além disso, as análises a nível molecular da tolerância ao frio e a profundidade de semeadura indicaram a importância das vias ABA-dependente e ABA- independente como vias de transdução do sinal em plantas sob estresse abiótico.
Palavras-chave: estádios iniciais; qRT-PCR; esterase; arroz vermelho.
BEVILACQUA, Caroline Borges. Characterization of rice genotypes under cold and deep sowing stresses. 2013. 97f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Sementes) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Sementes, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS
Cold stress adversely modifies their physiology, metabolism plant growth and development, as well as, it limits crop productivity. The responses of rice (Oryza sativa L.) subjected to low temperatures are still poorly understood. A better understanding of stress tolerance mechanism in rice plants will help to develop rice germplasm with improved field level tolerance under variable temperature and sowing depth conditions. To characterize rice genotypes with variation in sensitivity to cold, these are the following objectives: to evaluate the applicability of different Stress Indices using seedling lengthas parameter; classify accessions cultivated rice and red rice as Indica or Japonica; compare response to rice cultivars cold-tolerant and cold-sensitive to cold stress according to the dry matter accumulation and possible changes in chlorophyll content; categorize different genotypes with regard to sensitivity to cold and to sowing depth stresses and, analyze the expression of cold-responsive genes, and also genes submergence-responsive. The seeds after seven days at 25°C were exposed at 4°C for 24h and after that, photosynthesis was measured later, the plants were 72h at 25°C (recovery period) to assess the dry mass and chlorophyll. For the other experiments, the seedlings were collected 7 and/or 14 days maintained at 25°C or 18/13°C day/night and different sowing depths (1.5cm, 5cm, 10cm and 15cm), differential gene expression were performed with those seedlings using different genes induced by cold.
To evaluated gene expression using different genes induced by cold and anoxia, samples were collected after exposure to 10 ° C for 6, 24 and 96 h at 1.5 cm and 10 cm deep sowing. The results showed that is possible to identify superior genotypes for tolerance to these abiotic stresses based on the Tolerance Index (STI) and Media Geometric (GM) to select genotypes tolerant to cold or sowing depth, using as a parameter the seedling shoot length measurement.
Japonica and Indica subspecies respond differently to abiotic stresses, however for some of these stress-responsive genes, these subspecies responded similarly. Furthermore, the analysis at the molecular level of cold tolerance and sowing depth indicated the importance of ABA- dependent and ABA-independent signal transduction pathways in plants under abiotic stress.
Key words: seedling stages, oRT-PCR, esterase, red rice.
LISTA DE FIGURAS
Página CAPÍTULO IV ... 52 Figure 1. Seeding depth tolerance screening of weedy red rice accessions by
measurements of seedling root and shoot lengths (mm), 14 d after sowing.UFPel/FAEM. 2013 ... 58 Figure 2. Esterase isoenzyme analysis of red rice ecotype 116 and the cultivars
Diamante and BRS 6 Chui under cold stress (18ºC -10 h/ 13ºC -14 h).UFPel/FAEM.
2013 ... 59 Figure 3. Differential gene expression analysis assessed through qRT-PCR in
Ecotype 116, BRS6 Chui and Diamante compared with that of control subjected to cold stress (Relative fold change, log2 ratio) for each plants. UFPel/FAEM. 2013 ... 61 Figure 4. Differential Expression analysis of genes: a. ASR1 b: Germin c: JRC 2606
and d: JRC 3709 assessed through qRT-PCR in Ecotype 116, BRS 6 Chui and Diamante compared with that of control subjected to sowing depth stress (Relative fold change, log2 ratio) for each plants.UFPel/FAEM. 2013 ... 61 CAPÍTULO V ... 65 Figure 1. Phenol test of cultivated and weedy red rice accessions for subspecies
determination.UFPel/FAEM. 2013 ... 67 Figure 2. Response of selected Oryza genotypes to cold treatment (18C-10 h/13C-
14h temperature). Shoot lengths were measured (14 days after sowing). Each bar is the average of 3 replicates, each one with 5 seeds and 2 runs.UFPel/FAEM. 2013 ... 68 Figure 3. Response of weedy and cultivated rice to seeding depth at 5, 10, and 15 cm (with depth of 1.5 cm as control. Each bar is the average of 3 data points. Including the rice genotypes selected (CHI 08-C, GRE08-D01, 1602, PRA08-D02 and Spring).
UFPel/FAEM. 2013 ... 70 Figure 4. Rice seedling growth at depths of 1.5 cm, 5 cm, 10 cm and 15 cm under cold stress (18C-10 h/13C-14 h). Cold sensitivity/tolerance shown is relative to the response of plants exposed to the same depth under cold and normal mean temperature (25C). Including the rice genotypes selected (CHI 08-C, GRE08-D01, 1602, PRA08-D02 and Spring).UFPel/FAEM. 2013 ... 71 Figure 5. Gene expression analysis of transcription factors NAM, Dreb2A, MYB and F-box in PRA 08-D02 and Spring genotypes. Coleoptiles were harvested from 10-d- old seedlings. Panel A: Effects of cold (10C) on NAM, Dreb2A, MYB and F-box gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.
Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on NAM, Dreb2A, MYB and F-box gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions.
Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 ... 73 Figure 6. Gene expression analysis ofNAM, Dreb2A, MYB and F-box genein CHI 08-C, 1602 and GRE 08-D01genotypes. Coleoptiles were harvested from 10-d-old
expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions.
Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction. Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on NAM, Dreb2A, MYB and F-box gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 ... 74 Figure 7. Gene expression analysis of transcription factors H+ pyrophosphatase, Rab 16, GERMIN and glutamate dehydrogenase in PRA 08-D02 and Springgenotypes.
Coleoptiles were harvested from 10-d-old seedlings. Panel A: Effects of cold (10C) on H+pyrophosphatase, Rab 16, GERMIN and glutamate dehydrogenase expression.
Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction. Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on H+pyrophosphatase, Rab 16, GERMIN and glutamate dehydrogenase gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 ... 76 Figure 8. Gene expression analysis of H+pyrophosphatase, Rab 16, GERMIN and glutamate de hydrogenase gene in CHI 08-C, 1602 and GRE 08- D01genotypes.Coleoptiles were harvested from 10-d-old seedlings. Panel A: Effects of cold (10C) on H+pyrophosphatase, Rab 16, GERMIN and glutamate dehydrogenase expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction. Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on H+pyrophosphatase, Rab 16, GERMIN and glutamate dehydrogenase gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions.
Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 ... 77 Figure 9. Gene expression analysis of transcription factors ADH1, Expansin 7 and 12, ERF 70 and 68 and alpha-amylase in PRA 08-D02 and Spring genotypes.
Coleoptiles were harvested from 10-d-old seedlings. Panel A: Effects of cold (10C) on ADH1, Expansin 7 and 12, ERF 70 and 68 and alpha-amylase expression.
Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction. Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on ADH1, Expansin 7 and 12, ERF 70 and 68 and alpha-amylase gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 ... 78 Figure 10. Gene expression analysis ofADH1, Expansin 7 and 12, ERF 70, ERF 68 and alpha-amylase gene in CHI 08-C, 1602 and GRE 08-D01genotypes. Coleoptiles were harvested from 10-d-old seedlings. Panel A: Effects of cold (10C) on ADH1, Expansin 7 and 12, ERF 70, ERF 68 and alpha-amylase expression. Coleoptiles were
harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction. Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on ADH1, Expansin 7 and 12, ERF 70, ERF 68 and alpha-amylase gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 ... 80 Figure 11. Gene expression analysis of Sub 1b and APX2 in PRA 08-D02 and Spring genotypes. Coleoptiles were harvested from 10-d-old seedlings. Panel A: Effects of cold (10C) on Sub 1b and APX2 expression. Coleoptiles were harvested from 10-d- old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction. Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on Sub 1b and APX2 gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (PRA 08-D02) and tolerant (Spring) Japonica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 ... 81 Figure 12. Gene expression analysis of Sub 1b and APX2in CHI 08-C, 1602 and GRE 08-D01genotypes. Coleoptiles were harvested from 10-d-old seedlings. Panel A: Effects of cold (10C) on Sub 1b and APX2 expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions. Seedlings were exposed to cold and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction. Panel B: Effects of cold (10C) and depth stress (10 cm) on Sub 1b and APX2 gene expression. Coleoptiles were harvested from 10-d-old germinated seedlings of sensitive (CHI 08-C) and tolerant (1602 and GRE 08-D01) Indica accessions. Seedlings were exposed to cold
and depth stress for 6, 24, and 96 hours before RNA extraction.UFPel/FAEM. 2013 .. 82
Página CAPÍTULO I ... 26 Table 1 (a): First count (%), Germination (%) and Cold test of different rice genotypes. UFPel/FAEM. 2013 ... 31 Table 1(b): Total seedling length (root + shoot) in the different rice genotypes after cold stress and seed sowing deep stress. UFPel/FAEM. 2013 ... 31 Table 2(a): Averages for seedling shoot length (cm) subjected to stress 14 days after sowing. UFPel/FAEM. 2013 ... 33 Table 2(b): Correlation between Indices of Tolerance and Susceptibility and Geometric Mean for seedling length of the four genotypes. (D: Deep, C: Cold, SI:
Susceptibility Index; TI: Tolerance Index, GM: Geometric Mean; Statistical Significance was estimated by t test (*) and (**) significant (> 0.05) and (> 0, 01) of likelihood, respectively).UFPel/FAEM. 2013 ... 33 CAPÍTULO II ... 37 Tabela 1. Resposta para massa seca de cultivares de arroz tolerante ou sensível ao frio submetidas sete dias a 25°C, em seguida, expostas a 4°C (24 h), seguida de 72 h de recuperação (a 25°C). UFPel/FAEM. 2013 ... 41 Tabela 2. Teores de clorofila “a” e “b” e totais (μg.g-1) em plântulas de arroz tolerantes ou sensíveis ao frio submetidas sete dias a 25C, em seguida, expostas a frio (4C durante 24 h). UFPel/FAEM. 2013 ... 42 CAPÍTULO III ... 46 Tabela I. Informações referentes aos genes e suas sequências de nucleotídeos a serem utilizados em análises de expressão dos genes em qRT-PCR (Capítulo IV).
UFPel/FAEM. 2013 ... 49 Tabela II. Informações referentes aos genes e suas sequências de nucleotídeos a serem utilizados em análises de expressão dos genes em qRT-PCR (Capítulo V).
UFPel/FAEM. 2013 ... 49 CAPÍTULO IV ... 52 Table 1. Expressed genes in rice (Oryza sativa L.) when subjected to abiotic stress .... 57 CAPÍTULO V ... 65 Table I. Evaluation of rice tolerance to cold stress.UFPel/FAEM. 2013 ... 67 Table II. Screening of rice tolerance to depth stress (5 cm, 10 cm, and 15 cm) ... 69 Table III. Rice seedling growth at various seeding depths (5 cm, 10 cm and 15 cm) under cold stress (18C-10h/13C-14h). UFPel/FAEM. 2013 ... 69 Table IV. Genes analyzed into qRT-PCR to sensitivity and tolerance when subjected
to abiotic stress in (Indica and Japonica) rice genotypes. UFPel/FAEM. 2013 ... 72 Table V. Genes analyzed into qRT-PCR to sensitivity and tolerance when subjected
to abiotic stress in (Indica and Japonica) rice genotypes. UFPel/FAEM. 2013 ... 86
SUMÁRIO
Página
BANCA EXAMINADORA ... 2
DEDICATÓRIA ... 3
AGRADECIMENTOS ... 4
RESUMO GERAL ... 6
GENERAL ABSTRACT ... 7
LISTA DE FIGURAS ... 8
LISTA DE TABELAS ... 11
INTRODUÇÃO GERAL ... 13
1. A CULTURA DO ARROZ (Oryza sativa) ... 13
2. DIFERENCIAÇÃO DAS SUBESPÉCIES Indica E Japônica ... 14
3.TOLERÂNCIA AO ESTRESSE OCASIONADO PELO FRIO ... 14
4. ANÁLISES DA TOLERÂNCIA A NÍVEL MOLECULAR ... 16
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 21
CAPÍTULO I Application of Stress Indices for Low Temperature and Deep Sowing Stress: Screening of Rice Genotypes ... 26
CAPÍTULO II Resposta ao frio em cultivares de arroz com relação ao acúmulo de fitomassa e possíveis alterações no teor de clorofila ... 37
CAPÍTULO III Eficiência de iniciadores relacionados aos genes de tolerância ao estresse em arroz por baixas temperaturas e anoxia... 46
CAPÍTULO IV Differential gene expression of cold responsive genes in rice and red rice genotypes .. 52
CAPÍTULO V Screening of different rice genotypes for cold and deep sowing stresses ... 65
CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 91
INTRODUÇÃO GERAL
1. A CULTURA DO ARROZ (Oryza sativa)
Os dois pools gênicos, do complexo grupo de espécies de arroz (pertencente à família Poaceae), são compostos pelas espécies cultivadas Oryza sativa L. (arroz asiático) e Oryza glaberrima Steud. (arroz africano). O processo de domesticação da espécie Oryza sativa, provavelmente, levou à diferenciação das subespéciesindica e japonicaem resposta as condições a que foram expostas (MORISHIMA, 2001; GOMES e MAGALHÃES-JÚNIOR, 2004).
O Brasil está entre os 10 países maiores produtores de arroz do mundo, assim como China, Índia, Indonésia, Bangladesh, Vietnã, Tailândia, Mianmar, Filipinas e Japão, sendo o maior produtor mundial de arroz, ao se excluírem os países asiáticos (SOSBAI, 2010). No Brasil, o estado do Rio Grande do Sul (RS) é o principal produtor de arroz irrigado, apresentando uma área de cultivo estimada em 1.066 milhão de hectares, correspondendo a 66,9% da produção nacional de arroz (CONAB, 2012).
No RS, o período ideal para a semeadura dessa cultura corresponde de 15 de outubro a 15 de novembro. Nesse período, as normais climatológicas de 30 anos (Tabela 1) registraram temperaturas em torno de 18,55°C (CONAB, 2011; EMBRAPA/UFPel/INMET, 2011). No entanto, é sabido que temperaturas inferiores a 20°C podem ser prejudiciais ao desenvolvimento e rendimento da cultura, já que a temperatura ótima para a fase de germinação do arroz é de 20 a 35°C (YOSHIDA, 1981). Temperaturas abaixo de 20°C podem ocasionar injúrias, sendo o frio considerado um dos estresses abióticos mais importantes para o arroz (YOSHIDA, 1981; CRUZ, 2001).
Tabela 1. Normais climatológicas obtidas em análises realizadas durante 30 anos, na região Sul do Rio Grande do Sul. UFPel/FAEM. 2013.
Variáveis Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez Anual Temperatura Média (°C) 23,2 23,0 21,7 18,5 15,1 12,4 12,3 13,4 14,9 17,5 19,6 22,0 17,8 Temperatura Média das Mínimas (°C) 19,1 19,1 17,7 14,4 11,1 8,6 8,6 9,5 11,2 13,6 15,3 17,7 13,8 Temperatura Mínima Absoluta (°C) 10,0 9,8 5,0 2,7 1,2 -3,0 -2,7 -1,0 0,2 2,6 6,0 7,9 -3,0 Temperatura Média das Máximas (°C) 28,2 27,9 26,9 24,0 20,8 17,8 17,5 18,6 19,6 22,2 24,6 27,1 22,9 Temperatura Máxima Absoluta (°C) 39,0 36,5 37,4 35,1 31,6 29,4 31,8 33,0 35,6 34,4 39,2 39,6 39,6 Fonte: Embrapa/UFPel/INMET, 2011.
14
Apesar dos esforços efetuados, maiores avanços são necessários em programas de melhoramento de arroz do Rio Grande do Sul quanto à tolerância ao frio. Isso se deve a baixa disponibilidade de fontes de tolerância, assim como a alta esterilidade presente em híbridos resultantes do cruzamento indica x japonica e a necessidade de progredir no desenvolvimento de metodologias de avaliação e seleção de genótipos elite (ROSSO, 2006).
2. DIFERENCIAÇÃO DAS SUBESPÉCIES Indica E Japônica
Diferenças morfológicas podem, algumas vezes, ser utilizadas para distinguir indica de japonica, como é o caso do formato do grão, sendo que, em geral, as sementes pertencentes à subespécie japonica possuem grãos curtos, largos e seção transversal arredondada enquanto que indicase caracteriza por grãos longos, estreitos e levemente planos.
Porém, o método mais utilizado atualmente para distinguir essas subespécies é o Teste de Fenol em populações de arroz vermelho, o qual foi primariamente utilizado em arroz cultivado. Esse teste consiste na verificação da mudança da cor (marrom escuro ou preto) da casca e do grão de amostras de arroz pertencentes, exclusivamente, à subespécie indica como resultado da atividade da enzima Polifenol Oxidase (GROSS et al., 2009).
Além dessas características que distinguem indica e japonica, as subespécies segregam para muitos genes e caracteres em associação, de maneira não casualizada (MORISHIMA, 2001), o que sugere a possiblidade de introdução de novas características, como fonte de variabilidade, por meio da síntese de híbridos indica x japônica. No entanto, a esterilidade presente no híbrido resultante desse cruzamento é, ainda, um problema em programas de melhoramento (LOPES, 2002).
3. TOLERÂNCIA AO ESTRESSE OCASIONADO PELO FRIO
Muitas pesquisa têm sido realizadas com o intuito de identificar e avaliar a tolerância ao frio em diferentes genótipos, assim como avaliar essa tolerância durante o estádio de germinação a fim de detectar genótipos tolerantes na subespécie japonica. Essa tolerância foi demonstrada em trabalhos utilizando-se temperaturas de 13°C e 28°C, no qual foi observado que as cultivares japonica, “Quilla 64117” e “Diamante”, demonstraram ser mas tolerantes ao frio, e entre as indica, as cultivares “BR-IRGA 410” e “IRGA 416” (CRUZ e MILACH, 2004). Os caracteres genéticos que levam à tolerância ao frio, ou seja, a fonte de tolerância, são oriundos dessas cultivares pertencentes à subespécie japonica e que são provenientes de
países como Chile, Filipinas e Japão. No estudo referido à tolerância foi determinada mediante a avaliação do comprimento do coleóptilo e pelo recrescimento do mesmo a 28°C após exposição a 13°C. Em estudos realizados pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) foram utilizados, como parâmetro de verificação a tolerância ao frio, de diferentes genótipos, o índice de velocidade de emergência (IVE) (EMBRAPA, 2009).
Estudos de tolerância ao frio em arroz utilizaram temperaturas inferiores a 20°C nas fases germinativa, vegetativa e reprodutiva (YOSHIDA, 1981; CRUZ, 2000). A temperatura a ser designada a aplicação do estresse, em condições controladas, pode ser constante ou alternada (dia e noite). Li e Rutger (1980) utilizaram temperatura constante (18ºC durante 14 dias) para avaliar a estatura de plântulas de arroz. Foram utilizadas temperaturas alternadas, Martins et al. (2007) avaliaram famílias mutantes quanto à tolerância ao frio, no período vegetativo, as plântulas mantidas em casa de vegetação à temperatura de 13ºC por 10 dias, enquanto para avaliação no período reprodutivo utilizou-se estresse de 15ºC por sete dias.
Após a planta ser exposta ao estresse por frio, essa pode se recuperar, ao retornar à temperatura ideal de cultivo, o que leva a menores percentuais de redução na estatura.
A tolerância ao frio pode ser relativa a um estádio ou fase de desenvolvimento da planta de arroz (CRUZ e MILACH, 2000). Na fase vegetativa esses danos podem ser desuniformidade e diminuição na velocidade e porcentagem de germinação, além de redução na estatura, devido ao retardo no desenvolvimento da planta e amarelecimento das folhas (SOUZA, 1990; STHAPIT et al., 1995). A tolerância, nessa fase, está sendo buscada a fim de antecipar a semeadura e evitar que a etapa reprodutiva coincida com a época de início de temperaturas ainda mais baixas e danosas. Além disso, objetiva favorecer a produtividade, já que, ao antecipar a semeadura, a fase reprodutiva coincidirá com a época de maior intensidade de radiação solar (MERTZ et al., 2009). Já na fase reprodutiva, os danos causados pelo frio são exerção incompleta da panícula e aumento na esterilidade de espiguetas (TERRES, 1991).
Alguns dos fatores que determinam o tempo necessário para a germinação de sementes e emergência de plântulas são temperatura e profundidade de semeadura (YOSHIDA, 1981; FERNANDEZ et al., 1985). O desempenho frente à profundidade de semeadura é considerado outro estresse abiótico que afeta o estande da lavoura, o qual ainda é muito pouco estudado. Para algumas espécies, essa característica pode ser positiva, principalmente para o desenvolvimento de bancos de sementes de plantas daninhas no solo, como por exemplo, o arroz vermelho, o qual apresenta maior longevidade quando as sementes são depositadas em profundidade comparadas aquelas na superfície (NOLDIN, 1995). Para
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avaliar e selecionar plantas vigorosas seu desempenho pode ser testado em diferentes profundidades de semeadura, além de o arroz vermelho poder ser utilizado como uma fonte de variabilidade genética germinação em grandes profundidades (MALONE et al., 2007).
4. ANÁLISES DA TOLERÂNCIA A NÍVEL MOLECULAR
As perturbações morfológicas, bioquímicas e moleculares, decorrentes do estresse por resfriamento iniciam com a desestabilização das membranas, o que acarreta em sua disfunção e na alteração dos processos celulares, resultando em modificações (TAIZ &
ZEIGER, 2013). No entanto, as plântulas de arroz, expostas ao estresse pelo frio, podem apresentar um aumento na síntese de Álcool Desidrogenase, a qual participa do processo de fermentação alcoólica, e consequente aumento na produção de etanol, o qual pode ajudar na preservação da fluidez dos lipídeos da membrana (MERTZ et al., 2009). No entanto, o aumento na produção de etanol, juntamente com o aumento de espécies reativas de oxigênio ou diminuição na síntese de antioxidantes, pode acarretar no aumento da peroxidação desses lipídeos insaturados levando à ruptura da membrana plasmática. Essa e outras modificações dependem de um estímulo extracelular, o qual ativa respostas de defesa.
Esse processo de estimulação, ativação e, portanto, de cascata de sinalização e transdução de sinal são fundamentais. Os elementos cis-acting, os quais participam dessa sinalização, são regiões do promotor de um gene que atuam como interruptores moleculares envolvidos na regulação da transcrição de uma rede gênica dinâmica (STRÄHLE e RASTEGAR, 2008). Já a proteína denominada “dedo de zinco” (Zinc Finger Protein), ZFP245, apresenta uma atividade, na região trans, na regulação da tolerância ao frio, como demonstrado por Huang et al. (2009). Esse acúmulo dá-se pela ativação da síntese de ABA.
Além disso, a super expressão de ZFP245 pode inferir proteção na planta pelo aumento da atividade antioxidante. Nessas regiões do DNA, os fatores de transcrição (TF) se ligam fisicamente, influenciando a expressão gênica.
A família de fatores de transcrição CBF (C-repeat binding factor) ou DREB (dehydration responsive element binding factor) regula a expressão de genes que respondem a diversos estresses, dentre os quais se destacam o estresse pelo frio, contendo os cis-elementos denominados CRT/DRE (DUBOUZET et al., 2003). Os fatores de transcrição AREB (ABA - responsive elementbinding protein ou TF ABA-dependentes) ou ABFs (binding factors), são importantes para diversos estresses, inclusive frio, ativando os cis-elementos ABRE (ABA - responsive element) assim como a família NAC (petúnia, NAM and Arabidopsis ATAF1,
ATAF2, e CUC2) (YAMAGUCHI-SHINOZAKI e SHINOZAKI, 2005; HU et al., 2008).
Portanto, existem diversas vias de transdução de sinal, sendo algumas ABA-dependente como nos genes NAM (determinam a posição do meristema apical caulinar), ABA-independente (DREBs), ABA-dependentes e independentes como MYBs (Myeloblastosis, família de numerosos fatores de transcrição), outros pertencentes ao grupo F-box e ao grupo AP2/ERF.
Algumas vezes, essas vias podem não ser específicas, podendo ser combinadas por meio de uma rede de interações entre diferentes genes, e os quais respondem a diferentes estresses, seja esses bióticos ou abióticos, o que é definido como “crosstalk” (FUJITA et al., 2006).
Portanto, é de grande relevância o estudo dessa rede de genes responsivos a estresses mediante análise da sua expressão genica desses, frente a condições adversas.
Para tanto, a técnica de reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase, em tempo real (qRT-PCR) faz uso de populações de mRNA expresso, em determinado tecido e estádio de desenvolvimento da planta. Essa ferramenta permite a investigação do transcriptoma a partir de genes previamente identificados e com acessos disponíveis em bancos de dados (PEREIRA, 2011). Além de essa metodologia apresentar especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade na quantificação do produto final amplificado, essa técnica pode ser utilizada para confirmar informações obtidas através de análises por microarranjo. Sendo a vantagem do microarranjo é a possibilidade de analisar milhares de genes ao mesmo tempo e já a qRT-PCR é limitada a poucos genes por corrida (FREEMAN, 1999; PEREIRA, 2011).
Para que haja um grande número de processos celulares, os quais são necessários à tolerância ao estresse, é imprescindível um controle combinatório de diferentes fatores de transcrição que tem sua expressão elevada para efetivar a tolerância. Em trabalho realizado por Lindlof et al. (2009) foram identificados 1.450 genes relacionados ao estresse do frio em arroz, os quais foram identificados por meio de análise por microarranjo, o que correspondeu a um número menor de genes do que aqueles encontrados em Arabdopsis (1753 genes), sob as mesmas condições experimentais.
Os fatores de transcrição OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D e OsDREB2A, ou seja OsDREBs, apresentaram homologia com os fatores de transcrição (DREBs) em Arabdopsis thaliana, sendo que os dois primeiros (OsDREB1A, OsDREB1B), em estudos realizados por Dubouzet et al. (2003), tiveram sua expressão induzida sob estresse por baixa temperatura, mas não por ABA exógeno ou sob estresse por seca. Isso pode evidenciar maior especificidade de OsDREB1B em resposta a estresse, pois OsDREB1A também foi induzido por alta salinidade e por ferimentos, o que torna relevante seu potencial
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emprego na produção de transgenia em Liliopsida tolerantes a diferentes estresses abióticos, já que o arroz é uma espécie modelo (BENNETZEN, 2002). Esses resultados foram possíveis devido à utilização de Arabdopsis trangênico, ao ser adicionado o gene OsDREB1A, o qual foi induzido à super expressão a fim de se averiguar a expressão diferencial dos genes alvo de DREB1A. No entanto, existem algumas diferenças entre OsDREB1A e DREB1A na especificidade de ligação do TF ao gene alvo, além de diferenças na ação sobre alguns genes alvo. Essas diferenças foram verificadas por meio de análises de microarranjos, por hibridização de sondas de cDNA com 7 mil genes, e confirmadas pela utilização de análise de RNA-gel blot (Northern blot). No estudo mencionado, a exposição ao frio foi temporária (-6°C por 30h) e considerada congelamento, ocorrendo após 4 semanas de cultivo sob 22°C, sendo que, após a exposição ao frio, as plantas retornaram ao cultivo à 22°C por mais 5 dias, como fase de recuperação ao estresse (DUBOUZET et al., 2003). No entanto, em estudos mais recentes (MATSUKURA et al., 2010) OsDREB2B e OsDREB2A foram induzidos por estresses abióticos.
Em outro experimento, foi avaliada a expressão de outros três DREBs homólogos à Arabdopsis (OsDREB1-1, OsDREB4-1 e OsDREB4-2), sendo que após três semanas de semeadura foi verificado que as plântulas de arroz transferidas para câmara fria (4°C em intervalos de no máximo 24h). Obtiveram um padrão único de expressão do fator de transcrição OsDREB1-1 e de OsDREB4-2, porém com diferentes níveis dentre tecidos analisados (TIAN et al., 2005).
Há relatos de TFs que são expressos constitutivamente e, mesmo assim, apresentam papel na tolerância ao frio, isso sendo devido à regulação pós-transcricional e ou traducional (FIGUEIREDO et al., 2010). Em outros casos, a elevação na expressão ocorre tanto em genes como nos fatores de transcrição. Esse é o caso do gene OsLti6a, que teve sua expressão elevada em cultivares tolerantes ao frio, além de apresentarem um acréscimo na expressão dos fatores de transcrição CRT/DRE (MORSY et al., 2005).
As proteínas de ligação ricas em glicina (GRPs/glycine-rich RNA-binding proteins), também, são sintetizadas sob frio em Arabdopsis, tendo uma função de chaperona. O mesmo ocorre em arroz, em que esses genes são conhecidos como OsGRPs, mais precisamente OsGRP1, OsGRP4 e OsGRP6 (KIM et al., 2010).
Diversos outros genes envolvidos na resposta ao frio durante a germinação de arroz já foram descritos, tais como Cor (Cold-regulated), KIn (cold inducible), ErD (Early responsive to dehydration), LTI (Low-temperature Induced), RD (Responsive to Dehydration), Rab16, Expansin 7 e 12, assim como genes que necessitam da sinalização de
ABA e da presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). Igualmente, foram identificadas proteínas quinases dependentes de cálcio (CDPKs), já que esse elemento é um importante intermediário na cascata de sinalização, ligando-se, muitas vezes, a calmodulina modificando o comportamento de quinases (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000;
RABBANI et al., 2003; CHINNUSAMY et al., 2006; LASANTHI-KUDAHETTIGE et al., 2007; WAN et al., 2007; SAIJO et al., 2001; XIANG et al., 2007). Além de genes envolvidos na resposta ao frio, genes participantes de processos metabólicos da planta são afetados ao final dessa cascata de transdução de sinal, como por exemplo, os que codificam Glutamato desidrogenase e Alfa-amilase (RABBANI et al., 2003; LASANTHI-KUDAHETTIGE et al., 2007).
Um importante Quantitative Locus Trait (QTL) qLTG3-1 foi estudado pela comparação entre duas cultivares de arroz, outra que não apresenta esse alelo e uma que apresenta, por meio de análise do nível de expressão sob estresse pelo frio (15°C) por microarranjo. Esse QTL, na cultivar tolerante ao frio, durante a germinação, teve seus níveis de expressão aumentados 1 dia antes da germinação e durante o processo germinativo. Outra diferença observada foi no número de genes com a expressão modificada na comparação das cultivares contrastantes 1 dia antes da germinação, sendo essa diferença estimada ocorreu em 4.586 genes, dos quais 100 tiveram a expressão diferencial duplicada (FUJINO
&MATSUDA, 2010). Além dos genes já identificados, utilizando microarranjos, foram descobertos 18 micro RNAs que respondem ao frio em arroz (Lv et al., 2010).
Análises da expressão diferencial dos genes ASR (ABA, Stress and Ripening) foram realizadas pela utilização de qRT-PCR em arroz sob condições de estresses abióticos pelo frio e pela posterior averiguação de plantas que sofreram silenciamento gênico. Como resposta ao frio, os genes ASR1 e ASR4, dos 6 genes da família ASR, apresentaram elevação no número de seus transcritos (ARENHART et al., 2009). Análises de RNA gel-blot foram utilizadas para investigar a expressão diferencial em diferentes tecidos de arroz do gene OsARS1, em que foram detectados altos níveis de expressão na parte aérea tanto na fase vegetativa quanto reprodutiva sob condições de baixas temperaturas. Já sob condições de temperatura ideal esse gene foi expresso em todos os tecidos, com exceção dos calos (KIM et al., 2009). Esses pesquisadores sugerem que esse gene seja regulado pelo FT CBF1, sendo que as amostras de arroz transformado foram expostas ao frio (4°C por 3, 4, 5, 6, 7, 10 ou 12 dias, precedidas de 10 dias sob 30°C) e após serem submetidas ao frio foram, novamente, submetidas a 30°C por 10 dias.
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Rabbani et al. (2003), após 14 dias da semeadura de Nipponbare (japonica), utilizando a técnica de microarranjo, verificaram a expressão diferencial de 36 genes induzidos pelo frio (4°C durante 5, 10 e 24 horas), assim como 43 genes em presença de ABA, 62 genes em condições de desidratação e 57 genes em estresse de salinidade. Esses autores ressaltaram a estreita relação que esses genes apresentam, já que 15 desses genes responderam aos quatro diferentes estresses, assim como alto crosstalk entre frio e salinidade e, também, entre frio e ABA.
A técnica de microarranjo também permitiu a identificação de 121 genes que respondem de forma rápida ao frio (10°C durante intervalos de, no máximo, 24 horas) em arroz subespécie japonica, que são consideradas mais tolerantes a baixas temperaturas comparativamente à subespécie indica, no período de germinação. Neste estudo, foi proposto um modelo de regulação no qual participam fatores de transcrição ROS-bZIP1 que independem de ABA e de CBF/DREB ao contrário do gene GERMIN, que é expresso na presença de ABA (CHENG et al., 2007). O último que pode servir como parâmetro para análises, em que se deseja investigar se há aumento na síntese de ABA, assim como a interferência do ABA na expressão de genes que respondem a condições de baixas temperaturas.
Em outro estudo também foi investigada a resposta precoce ao estresse causado pelo frio (10°C) e sua relação com a rota oxidativa, sendo identificada que há sobreposição dos genes super regulados tanto sob condições de baixa temperatura quanto sob indução do mecanismo oxidativo, o qual ocorre em quase 60% dos genes averiguados pela técnica de microarranjo em arroz. O arroz, no estádio V3, apresentou resposta da rota oxidativa mais rápida que a resposta por grupos mediados por ABA em Nipponbare (YUN et al., 2010).
Além de ser verificada a ação do mecanismo oxidativo mediado por fatores de transcrição bzip, ERF e R2R3-MYB atuando sobre os respectivos elementos as1/ocs/TGA, GCC- box/JAreeMYB2. Também foi verificado, conforme o proposto por Cheng et al. (2007), que a resposta do fator de transcrição DREB/CBF independe da resposta oxidativa.
No entanto, há controvérsias sobre a resposta enzimática antioxidante, sendo sugerido que essa resposta pode ou não estar envolvida à tolerância e/ou à sensitividade ao estresse pelo frio, assim como também pode estar envolvida na tolerância à semeadura em grandes profundidades. Porém, foi demonstrada redução da fotoinibição e o dano oxidativo em cultivares tolerantes quando comparadas às sensíveis ao frio. Além disso, o modo como as cultivares respondem ao estresse é variável, algumas cultivares expressam constitutivamente altos níveis de Superóxido Dismutase (SOD) favorecendo a tolerância nas horas iniciais à
exposição ao estresse (BONNECARRÈRE et al., 2011). Outra enzima que também pode favorecer a tolerância, por também estar relacionada à ação antioxidante seria a enzima Ascorbato Peroxidase. Adicionalmente, a tolerância a grandes profundidades de semeadura pode envolver genes que conferem tolerância a plantas submersas, como é o caso de Sub1b (LASANTHI-KUDAHETTIGE et al., 2007).
Em pesquisas sobre a expressão ectópica de TERF2 através da transgenia, foi relatado que esse apresenta uma importante função regulatória na resposta ao estresse por baixas temperaturas em arroz, aumentando a tolerância ao frio, e, como uma das consequências, reduz a presença de espécies reativas de oxigênio, estabilizando a membrana.
Além disso, alguns genes regulatórios, como, OsMYB, OsICE e OsCDPK7 tiveram sua expressão elevada sob o tratamento com frio (TIAN et al., 2011). A família de fatores de transcrição MYB pode estar relacionada à regulação do metabolismo secundário e à regulação da formação meristemática (JIN e MARTIN, 1999).
Também pertencente ao grupo MYB, o fator de transcrição MYB3S, além de atuar na via de sinalização de açúcares atua, de maneira fundamental, na adaptação do arroz ao frio (SU et al., 2010). Como em arroz transformado geneticamente na presença ou ausência da função gênica de MYB3S, foi sugerida a onipresença da expressão desse FT. No entanto, sob estresse pelo frio, houve uma superexpressão de, até, 5 vezes. Foi relevante, nesse estudo, a descoberta da repressão da transcrição de FT DREB1/CBF por FT MYB3S, evidenciando a complementaridade de ambos. Esses mesmos autores descrevem a resposta do fator de transcrição MYB3S como ocorrendo a longo prazo, ou seja, também é fundamental para quando a planta se mantém sob condições de estresse.
Diante do exposto, o objetivo geral deste trabalho foi identificar e selecionar genótipos, de arroz cultivado e de arroz vermelho, tolerantes e sensíveis aos estresses abióticos induzidos por baixas temperaturas e por diferentes profundidades de semeadura.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AIDA, M.; ISHIDA, T.; FUKAKI, H.; FUJISAWA, H.; TASAKA, M. 1997. Gene involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant. Plant Cell.9: 841–857.
ARENHART, R.A. et al. 2009. Silenciamento da família gênica ASR em plantas de arroz.
Anais do XII Congresso Brasileiro de Fisiologia Vegetal. Fortaleza, Brasil.
ARENHART, R.A. 2008. Análise funcional dos genes ASR – Abscisic acid, Stress and Ripening – de arroz (Oryza sativa L.) em resposta ao estresse por alumínio. Dissertação
22
(Mestrado). Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, UFGRS.
BENNETZEN, J. 2002. The rice genome: Opening the door to comparative plant biology.
Science, Washington. 296 (5565): 60-63.
BONNECARRÈRE, V. et al. 2011. Response to photoxidative stress induced by cold in japonica rice is genotype dependent. Plant Science. 180: 726-732.
CHENG, C. et al. 2007. An early response regulatory cluster induced by low temperature and hydrogen peroxide in seedlings of chilling-tolerant japonica rice.BMC Genomics, 8 pp.175.
CHINNUSAMY, V.; ZHU, J.K.; SUNKAR, R. et al., 2006 Review: Gene regulation during cold acclimation in plants. Physiologia Plantarum. 126: 52-61.
CONAB, 2012. Companhia Nacional de Abastecimento. Acesso em agosto de 2013.
CRUZ, R.P.; MILACH, S.C.K. 2004. Cold tolerance at the germination stage of rice:
methods of evaluation and characterization of genotypes. Scientia Agricola. 61(1): 1-8.
CRUZ, R.P; MILACH, S.C.K. 2000. Melhoramento Genético para Tolerância ao Frio em Arroz Irrigado. Ciência Rural, Santa Maria, RS. 30 (5): 909-917.
DUBOUZET, J.G.; SAKUMA, Y; ITO, Y; KASUGA, M.; DUBOUZET, E.G.; MIURA, S.;
SEKI, M.; SHINOZAKI, K; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K. 2003. OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold- responsive gene expression. ThePlant Journal. 33 (4): 751-763.
EMBRAPA. 2009. Arroz irrigado: resultados de pesquisa do melhoramento genético para tolerância à estresse abióticos.Embrapa Clima Temperado, 2007/2008. Documentos, 257. Pelotas.
EMBRAPA/UFPel/INMET, 2011. Agrometeorologia UFPel. Acesso em março de 2011.
<http://www.ufpel.edu.br/faem/agrometeorologia/>
FERNANDEZ, F.; VERGARA, B.S.; YAPIT, N.; GARCIA, O. Crecimiento y etapas de desarrollo de la planta de arroz. In: TASCÓN, J.E.; GARCIA, D.E. (eds.). Arroz:
investigación y producción. Cali: CIAT, 1985. p.83-101.
FIGUEIREDO, D. et al. 2010. New insights into the abiotic stress signaling networkin rice. 8th International Symposium on Rice Functional Genomics, October 18th to 20th, Bento Gonçalves, Brazil.
FUJINO, K.; MATSUDA, Y. 2010.Genome-wide analysis of genes targeted by qLTG3-1 controlling low-temperature germinability in rice.Plant molecular biology.72 p. 137-152.
FUJITA, M.; FUJITA, Y.; NOUTOSHI, Y.; TAKAHASHI, F.; NARUAKA, Y.;
YAMAGUCHISHINOZAKI, K.; SHINOZAKI, K. 2006.Crosstalk between abiotic and biotic stress responses: acurrent view from the points of convergence in the stress signaling networks. Current Opinion in Plant Biology.9 (4): 436-442.
FREEMAN, W. M.; WALKER, S. J.; VRANA, K. E. 1999. Quantitative RT-PCR: Pitfalls and Potential. BioTechniques. 26 (1):112-125.
GOMES, A. da S.; MAGALHAES JUNIOR, A.M.de. Arroz irrigado no Sul do Brasil.Brasilia, DF: Embrapa Informação Tecnológica, 2004. p. 899.
GROSS, B.L.; SKARE, K.J.; OLSEN, K.M. 2009. Novel Phr1 mutations and the evolution of phenol reaction variation in US weedy rice (Oryza sativa). New phytologist, 184: 842-850.
HUANG, J. et al. 2009. Increased tolerance of rice to cold, drought and oxidative stresses mediated by the overexpression of a gene that encodes the zinc finger protein ZFP245.
Biochemical and biophysical research communications. 389: 556-561.
JIN, H.; MARTIN, C. 1999.Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family.Plant Mol Biol. 41: 577-585.
KIM, S.J. 2009. Ectopic expression of a cold-responsive OsASR1 cDNA gives enhanced cold tolerance in transgenic rice plants. Molecules and Cells. 27: 449-458.
KIM, J.Y. et al. 2010. Glycine-rich RNA-binding proteins are functionally conserved in Arabdopsis thaliana and Oryza sativa during cold adaptation process. Journal of Experimental Botany. 61 (9): 2317-2325.
LASANTHI-KUDAHETTIGE, R.; MAGNESCHI, L.; LORETI.E.; GONZALI, S.;
LICAUSI, F.; NOVI, G.; BERETTA O, VITULLI F, ALPI A, PERATA P. 2007. Transcript profiling of the anoxic rice coleoptile. Plant Physiology. 144:218–231.
LI, C.C.; RUTGER, J.N. 1980.Inheritance of cool-temperature seedling vigor in rice and its relationship with other agronomic characters. Crop Science. 20 (3): 295-298.
LINDLOF, A. et al. 2009. In silico analysis of promoter regions from cold-induced genes in rice (Oryza sativa L.) and Arabdopsis thaliana reveals the importance of combinatorial control. Bioinformatics, discovery note. 25 (11): 1345-1348.
LOPES, M.C.B. 2002. Caracterização fenotípica e molecular de genótipos de arroz irrigado. 2002. 80f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-graduação em Fitotecnia, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
LV, D.K.et al. 2010.Profiling of cold-stress-responsive miRNAs in rice by microarrays. Gene 459: 39-47.
MALONE, G.; ZIMMER, P.D.; MENEGHELLO, G.E.; CASTRO, M.A.S.; PESKE, S.T.
2007.Expressão diferencial de isoenzimas durante o processo de germinação de sementes de arroz em grandes profundidades de semeadura. Revista Brasileira de Sementes. 29 (1):61- 67.
MARTINS, A.F. 2007. Caracterização de famílias mutantes de arroz para tolerância ao frio nos períodos vegetativo e reprodutivo. Bragantia, Campinas. 66 (2): 227-233.
MATSUKURA, S.; MIZOI, J., YOSHIDA, T.; TODAKA, D.; ITO, Y.; MARUYAMA, K.;
SHINOZAKI, K; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K. 2010. Comprehensive analysis of rice
24
DREB2-type genes that encode transcription factors involved in the expression of abiotic stress-responsive genes. Molecular Genetics Genomics.283 (2): 185-196.
MORISHIMA, H. Evolution and domestication of rice.2001.In: KHUSH, G.S.; BRAR, D.S.;
HARDY, B. Rice Genetics IV. International rice genetics symposium, Los Baños.
International Rice Research Institute. p. 63-77.
MORSY, M.R., ALMUTAIN, A.M.; GIBBONS, J.; YUN, S.J.; de los REYES, B.G. 2005.
The OsLti6 genes encoding low-molecular-weight membrane proteins are differentially expressed in rice cultivars with contrasting sensitivity to low temperature. Gene. Jan 3;344:
171-80.
NOLDIN, J. A.1995. Characterization, seed longevity, and herbicide sensitivity of red rice (Oryza sativa L.) ecotypes, and red rice control in soybeans [Glycine max (L.) Merr.].
1995. 218 f. Thesis (Ph.D. Dissertation) – Texas A&M University, Texas.
PEREIRA, A. 2011. Plants reverse genetics: methods ad protocols. Methods in Molecular Biology.Springer protocols, Humana Press.
RABBANI, M.A. et al. 2003. Monitoring Expression Profiles of Rice Genes under Cold, Drought, and High-Salinity Stresses and Abscisic Acid Application Using cDNA Microarray and RNA Gel-Blot Analyses. Plant Physiology.133: 1755–1767.
ROSSO, A.F. de. 2002. Caracterização genética e fenotípica para tolerância ao frio e características agronômicas em arroz irrigado. 2006. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-graduação em Fitotecnia, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
SAIJO, Y.; KINOSHITA, N.; ISHIYAMA, K; HATA, S; KYOZUKA, J; HAYAKAWA, T;
NAKAMURA, T; SHIMAMOTO, K.; YAMAYA, T.; IZUI, K. 2001. A Ca2+-dependent protein kinase that endows rice plants with cold- and salt-stress tolerance functions in vascular bundles. Plant Cell Physiology.42:1228-1233.
SHINOZAKI, K.; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K. 2000. Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and crosstalk between two stress signaling pathways. Current Opinion in Plant Biology. 3:217-223.
SOUZA, P.R. 1990. Alguns aspectos da influência do clima temperado sobre a cultura do arroz irrigado, no sul do Brasil. Lavoura Arrozeira. 43:9-11.
SOSBAI (Sociedade Sul - Brasileira de Arroz Irrigado) 2010. Arroz irrigado: recomendações técnicas da pesquisa para o Sul do Brasil. 28. Reunião Técnica da Cultura do Arroz Irrigado. 188 p.
STRÄHLE U, RASTEGAR S. 2008. Conserved non-coding sequences and transcriptional regulation.Brain Research Bulletin. 75:225–230.
SU, C.F., et al. 2010. A novel MYBS3-dependent pathway confers cold tolerance in rice.
Plant physiology. 153: 145-158.
TERRES, A. L. 1991. Melhoramento de arroz irrigado para tolerância ao frio no Rio Grande do Sul – Brasil. In: REUNIÓN SOBRE MEJORAMIENTO DE ARROZ EN EL CONO SUR, Goiânia, 1991. Trabajos.Montevideo: IICA – PROCISUR. p.91-103. (Diálogo, 33).
TIAN, X. H. et al. 2005. OsDREB4 genes in rice encode AP2-containing proteins that bind specifically to the dehydration-responsive element. Journal of Integrative Plant biology.47 (4): 467-476.
TIAN, Y. et al. 2011. Overexpression of ethylene response factor TERF2 confers cold tolerance in rice seedlings. Transgenic Research. 20: 857-866.
WAN, B; LIN, Y; MOU, T. 2007. Expression of rice Ca2-dependent protein kinases (CDPKs) genes under different environmental stresses. Federation of European Biochemical Societies. 581: 1179-1189.
XIANG, Y; HUANG, Y.; XIONG, L.2007. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement. Plant physiology. 144: 1416-1428.
YOSHIDA, S. 1981. Fundamentals of rice crop science. Los Baños: International Rice Research Institute.
YUN, K.Y.; PARK, M.R.; MOHANTY, B.; HERATH, V.; XU, F.; MAULEON, R.;
WIJAYA, E.; BAJIC, V.B.; BRUSKIEWICH, R.; REYES, B.G. de los.et al. 2010.
Transcriptional regulatory network triggered by oxidative signals configures the early response mechanisms of japonica rice to chilling stress. BMC Plant Biology. 10:16.
CAPÍTULO I
Application of Stress Indices for Low Temperature and Deep Sowing Stress screening of rice genotypes
Caroline Borges Bevilacqua1 (CBB); Daisy Ramirez Monzon2 (DRM); Eduardo Venske3 (EV); Supratim Basu4 (SB), Paulo Dejalma Zimmer5 (PDZ)
Abstract
Low temperature or cold stress and deep sowing plays a pivotal role in limiting rice (Oryza sativa L.) productivity in the temperate rice growing regions as well as in tropical high lands worldwide. A better understanding of stress tolerance mechanism in rice plants will help to develop rice germplasm with improved field level tolerance under variable temperature and sowing deep conditions. Using previously developed stress indices, this study presents results from low temperature and deep sowing screening of four rice genotypes. A group of 25 seeds per replicate (total of 3 replicates) was subjected to stress by deep sowing (15 cm) while another group was subjected to cold stress (13°C-10 h/18°C-14 h), and the control group remained under optimum conditions (25°C and sowing deep of 1.5 cm). The Geometric Mean (GM), Stress Tolerance Index (STI) and Stress Susceptibility Index (SSI) were used to evaluate the genotypic performance under control and stress conditions. The results indicate that it was possible to identify superior genotypes for tolerance based on their stress indices.
The indices although correlated, were found to be effective for the selection of genotypes with good yield potential under control and stress treatments and can now be used for genotypic screening under field conditions.
Keywords: Oryza sativa, temperature response, shoot length.
Running Title: Stress Indices for rice genotypes
INTRODUCTION
Low temperatures have a strong impact on the survival, growth, reproduction and distribution of plants. The plants are characterized by an inherent level of resistance to low temperatures, which reduces the metabolic activity. This level of resistance can vary among individual plants and species. The cold stress is characterized by physiological perturbations, generally called low-temperature damages (HUDAK &
SALAJ, 1999; YAN et al., 2010; ZHANG et al., 2010). The germination process followed by fast and uniform seedling emergence is essential for the successful crop development.
However if the seeds remain under the soil for long time this would impair germination which will be accompanied by abiotic stresses like low temperature or biotic stresses like pathogens. Consequently it will decrease the crop yield and increase the productivity cost.
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The abiotic stresses caused owing to deep sowing are also an important factor that plays a major role in impairing plant development. Hence the long term goal for breeding is the development of germplasm with improved field tolerance under different stress conditions owing to low temperature (CRUZ e MILACH, 2000) and seed sowing depths.
Rice is a temperature-sensitive crop; low temperatures and deep sowing dramatically reduce its production. Good tolerance at the seedling stage is an important character for stable rice production. Brazil is one of the largest rice producing countries in the world. However the conditions are not always favorable which makes early seedlings rotten thereby causing massive seed loss and delayed growth (CRUZ e MILACH, 2000). Hence it becomes important to develop rice plants that can circumvent the atrocities of nature. Previous reports have shown the genetics and physiological responses of plants to temperature stress but yield based on indices are needed for the evaluation of low temperature and deep sowing stress tolerance for applied plant breeding programs.
Several yield based stress indices have been developed that may be applicable for low temperature and deep sowing tolerance. The Geometric Mean (GM) and the Stress Tolerance Index (STI) (FERNANDEZ, 1993) have been used for comparing genotypic performance across years or environments. STI was developed to identify genotypes that perform well under both stress and control conditions. The Stress Susceptibility Index (SSI) (FISHER e MAURER, 1978) is a ratio of genotypic performance under stress and non-stress conditions, adjusted for the intensity of each trial, and have been found to be correlated with yield and canopy temperature in wheat (RASHID et al., 1999).
These different indices may be applicable to other abiotic stress traits, such as low temperature or deep sowing stress tolerance. This study presents the low temperature and deep sowing stress screening of rice plants in Brazil for selection of cold and depth stress (deep sowing) tolerant rice genotypes with good yield potential and applicability of several stress indices for genotypic stress under the aforesaid stress treatments.
MATERIAL AND METHODS
Plant Materials
Four rice genotypes were used in this study: “Brilhante” (cold tolerant, Fagundes et al., 2010), “IRGA 422 CL” (as model rice), “BRS 6 Chuí” (cold sensitive, Mertz et al., 2009) and one red rice ecotype 116.
Germination test
The experiment was carried out with 100 seeds in each four replicates. The seeds were set on paper roll previously dampened with sterile double distilled water using 2.5 times the paper dry mass. After sowing, these rolls were kept inside plastic bags in growth chamber at 25ºC for 14 days. The evaluations were made on 5 days and 14 days respectively after sowing, according to Brazilian standards (BRASIL, 2009).
Germination Percent (GP) was calculated as described in Scott et al. (1984). The germination count was calculated as described in Brazilian standards (BRASIL, 2009).
Cold test
The cold test was conducted as described by Vieira e Carvalho (1994) with some modifications in 4 replicates each with 100 seeds. The seeds were distributed uniformly on previously dampened filter paper and then these rolls were kept inside plastic bags in growth chamber for 7 days at 10ºC and these treated seeds were then kept inside the growth chamber (25ºC) for 7 days. The evaluation was made in a similar way like Germination test count.
Seed Treatment
The soil was previously autoclaved and then dried in a hot air oven (70ºC). The experiment was carried out in four replicates, with 25 seeds per genotype under three different conditions: for cold stress treatment the seeds were sowed at 1.5 cm depth in cups (200 mL) and kept in growth chamber under alternate temperatures (13°C-10 h/18°C-14 h) while for deep sowing stress, seeds were sowed at 15 cm deep in PVC tubes and kept in growth chamber at 25 ºC. Seeds sowed at a depth of 1.5 cm in cups served as control were kept in growth chamber at 25ºC. The measurements of shoot length and root length were made after 7 days and 14 days respectively. The Stress Susceptibility Index (SSI): ((1- (Ys/Yp))/(1-(Xs/Xp)), Geometric Mean (GM): ((Ys x Yp)1/2), Stress Tolerance Index (STI): ((Yp x Ys)/Xp2), were determined using the
