Imunomodulação do extrato de Lippia sidoides na atividade funcional de fagocitos do sangue periferico humano / Immunomodulation of Lippia sidoides extract in the functional activity of phagocytes in human peripheral blood

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Brazilian Journal of Development

Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 10, p. 78615-78626, oct. 2020. ISSN 2525-8761

Imunomodulação do extrato de Lippia sidoides na atividade funcional de

fagocitos do sangue periferico humano

Immunomodulation of Lippia sidoides extract in the functional activity

of phagocytes in human peripheral blood

DOI:10.34117/bjdv6n10-335

Recebimento dos originais: 10/09/2020 Aceitação para publicação: 15/10/2020

Katleyn Polizeli Galvão Silva

Mestranda em Imunologia e Parasitologia Básicas e Aplicadas Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Araguaia

Endereço: Avenida Valdon Varjão, nº 6390, CEP: 78607-059,Barra do Garças – MT E-mail: [email protected]

Danielle Cristina Honorio França

Discente de Medicina

Universidade do Estado de Mato Grosso, Campus Cáceres

Endereço: Av. Santos Dumont, s/n, Cidade Universitária, CEP 78.200-000, Cáceres-MT E-mail: [email protected]

Mariana da Silva Honorio

Biomédica - Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Araguaia

Endereço: Avenida Valdon Varjão, nº 6390, CEP: 78607-059, Barra do Garças – MT E-mail: [email protected]

Fabiana Custodio Borges

Mestre em Imunologia e Parasitologia Básicas e Aplicadas Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Araguaia

Endereço: Avenida Valdon Varjão, nº 6390, CEP: 78607-059, Barra do Garças – MT E-mail: [email protected]

Claudia Cristina de Sousa

Mestre em Imunologia e Parasitologia Básicas e Aplicadas Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Araguaia

André Henrique Furtado Torres

Mestrando em Ciências de Materiais

Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Araguaia

Adenilda Cristina Honorio França

Doutora em Imunologia

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 10, p. 78615-78626, oct. 2020. ISSN 2525-8761 Endereço: Avenida Valdon Varjão, nº 6390, CEP: 78607-059, Barra do Garças - MT

E-mail: [email protected]

Eduardo Luzia França

Doutor em Imunologia

Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Araguaia

Endereço: Avenida Valdon Varjão, nº 6390, CEP: 78607-059, Barra do Garças - MT E-mail: [email protected]

RESUMO

O uso de plantas medicinais vem sido notada desde antes do início da civilização, para cura de doenças, como cicatrizantes entre outros. Um exemplo de planta com essa característica é a Líppia sidoides, pertencente à família verbanacea. É popularmente chamada de Alecrim pimenta, encontra-se em sua composição um óleo rico em Timol e Carvacrol que apresentam atividades microbicidas. A bactéria Escherichia coli, faz parte do grupo das bactérias Gram negativas, anaeróbicas facultativas que por muito tempo foram dadas como inofensivas. Mas essa visão mudou quando se descobriu que algumas cepas de Escherichia coli estavam causando diarreia em humanos e em alguns animais domésticos, então foi classificada como Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). A transmissão dessa bactéria se dá por ingestão de água e alimentos contaminados e devido essa fácil transmissão e as cepas da EPEC serem multirresistentes à drogas convencionais o aumento de busca por produtos naturais que contenham atividade microbicida tem se tornado um campo de estudo promissor. Visto isso, no presente estudo propomos avaliar o potencial imunomodulador do extrato etanólico de ¬ L. sidoides, em fagócitos do sangue periférico humano na presença da Escherichia coli enteropatogênica. Para obtenção de fagócitos coletou-se 12 amostras de sangue de indivíduos saudáveis na faixa etária de 18 a 40 anos. E posteriormente foram realizadas subculturas de E. coli enteropatogênica, em fase de crescimento exponencial. Na preparação do extrato foram coletadas as folhas de L. sidoides e foi dividida em duas etapas: alcoolatura e destilação. As outras partes do vegetal foram maceradas e colocadas em frascos de vidro. Os Fagócitos e a EPEC foram incubados na presença da L. sidoides durante 2 horas, e após este período foi avaliada a atividade dos fagócitos mononucleares através da análise da liberação de ânion superóxido. A fagocitose e a atividade microbicida foram avaliados pela técnica de acridina orange. A análise estatística foi obtida através da análise de variância (ANOVA, um critério) seguida do teste Tukey. Notou-se um aumento na produção de ânion pelos fagócitos na presença da L. sidoides entre o grupo controle e o tratado, tendo como média e desvio padrão respectivamente (10,13 ± 1,66), associado ao aumento da fagocitose e atividade microbicida dessas células. A partir destes dados concluímos que a L. Sidoides exerce atividade estimulante às células fagocitárias promovendo a morte da bactéria, demostrando ser um futuro produto alvo a ser usado na terapia antimicrobiana.

Palavras Chave: Verbanacea, EPEC, Fagócitos. ABSTRACT

The use of medicinal plants has been noted since before the beginning of civilization, to cure diseases such as healing among others. An example of a plant with this characteristic is the Lippia sidoides, belonging to the verbanacea family. It is popularly called Rosemary pepper, is found in its composition an oil rich in Timol and Carvacrol that present microbicide activities. The bacterium Escherichia coli, is part of the group of Gram-negative, facultative anaerobic bacteria that have long been reported harmless. But this view changed when it was discovered that some strains of Escherichia coli were causing diarrhea in humans and some domestic animals, so it was classified as enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). The transmission of this bacterium occurs due to ingestion of contaminated water and food and due to this easy transmission and the strains of EPEC being multidrug resistant to

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 10, p. 78615-78626, oct. 2020. ISSN 2525-8761 conventional drugs, the increased search for natural products containing microbicidal activity has become a promising field of study. In the present study, we propose to evaluate the immunomodulatory potential of the ethanol extract of ¬ L. sidoides in phagocytes of human peripheral blood in the presence of enteropathogenic Escherichia coli. To obtain phagocytes, 12 blood samples were collected from healthy individuals aged 18 to 40 years. And later, enteropathogenic E. coli subcultures were performed, in exponential growth phase. In the preparation of the extract, the leaves of L. sidoides were collected and it was divided into two stages: alcohol and distillation. The other parts of the vegetable were macerated and placed in glass jars. Phagocytes and EPEC were incubated in the presence of L. sidoides for 2 hours, and after this period the activity of mononuclear phagocytes was evaluated by analyzing the release of superoxide anion. Phagocytosis and microbicidal activity were evaluated by the acridine orange technique. The statistical analysis was obtained through the analysis of variance (ANOVA, a criterion) followed by the Tukey test. There was an increase in the production of anion by phagocytes in the presence of L. sidoides between the control group and the treated group, with the mean and standard deviation respectively (10.13 ± 1.66), associated with increased phagocytosis and microbicidal activity of these cells. Based on these data, we conclude that L. Sidoides exerts stimulating activity to phagocytic cells, promoting the death of the bacterium, proving to be a future target product to be used in antimicrobial therapy.

Keywords: Verbanacea, EPEC, Phagocytes.

1 INTRODUÇÃO

Por muito tempo, tem-se notado a utilização de plantas com propriedades medicinais por diversas

culturas e por várias partes do mundo. Uma ampla escala de medicamentos utilizados e comercializados são produzidos partindo de princípios ativos de plantas (FARNSWORTH et al., 1985). Terapias com plantas medicinais são vastamente utilizadas em diferentes países. No Brasil plantas com fins terapêuticos são utilizadas por uma grande parte da população. E isso se dá devido à carência na qualidade de assistência medica e farmacológica e a ausência do acesso aos medicamentos (MAZZARI; PRIETO, 2014).

O número de doenças negligenciadas aumentou muito nos últimos anos assim como o uso de tratamentos alternativos (RIBEIRO et al, 2018; POSSAMAI et al, 2020).Estudo de características biológicas, tal como, a busca de novos compostos moleculares com propriedades terapêuticas a partir de plantas medicinais teve avanço nas últimas décadas (CORTÊS et al, 2013, PESSOA et al, 2015, RIBEIRO et al, 2018).

Neste ponto, foi evidenciado que a Lippia Sidoides da família verbanacea possui potencial terapêutico. Essa planta que popularmente é chamada de Alecrim pimenta, possui em sua composição um óleo rico em Timol e Carvacrol, que apresenta propriedades microbicidas (CAVALCANTI et al.,2010; FERNADES et al, 2012).

Sobre este gênero não se encontra muitos trabalhos sobre composição química e farmacológica. Alguns trabalhos descrevem que estas células quando são colocadas junto à extratos de plantas amplificam sua atividade bactericida para Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC) (FRANÇA et al.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 10, p. 78615-78626, oct. 2020. ISSN 2525-8761 2010; SCHERER et al. 2011; REINAQUE et al. 2012; CORTES et al. 2013; PESSOA et al. 2015). Com o extrato da L. sidoides estes efeitos ainda não estão esclarecidos.

Visto isso, o presente trabalho tem como objetivos avaliar a atividade fagocítica e microbicida das células mononucleares com o extrato da L. sidoides como estimulante, na presença da bactéria EPEC.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE PERIFÉRICO HUMANO

Foram coletadas amostras de sangue periférico de 24 doadores saudáveis, na faixa etária de 20 a 50 anos. Todos os doadores estavam cientes no momento da coleta que o sangue seria destinado a fins de pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Esclarecido.

2.2 OBTENÇÃO DOS FAGÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO

Foram coletados em média 5 ml de sangue periférico em tubos com EDTA de cada doador, para obtenção dos leucócitos. Foi realizada a separação das populações celulares por gradiente de densidade Ficoll-Paque (Pharmacia), durante 40 min a 160G em temperatura ambiente. O anel enriquecido de fagócitos mononucleares foi retirado e reservado.

As células foram então lavadas duas vezes em solução salina tamponada (PBS). A seguir foi realizada a contagem em câmera de Neubauer, e as concentrações celulares foram ajustadas para 2x106

células/mL.

2.3 PREPARAÇÃO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE LIPPIA SIDOIDES

A planta utilizada na preparação do extrato foi coletada e depositada no herbário do Centro de Biodiversidade Ambiental, Rezerva Ecocerrado Brasil localizada no município de Araxá, MG, Brasil (latitude 19° 36’47,1’’, longitude 47° 08’20,9’’ e altitude de 939m). Esse extrato é distribuído como fitoterápico e sua fabricação foi de responsabilidade do farmacêutico José Gonçalves de Paiva Teixeira, CRF/MG 1360-9.

As folhas de L. sidoides foram coletadas e o extrato foi preparado por duas etapas: pelo processo de alcoolatura e destilação. As partes vegetais foram maceradas e colocadas em frascos de vidro de boca larga, sendo 200g da planta para um litro de álcool 70%. Os frascos foram tampados e deixados por 30 dias em temperatura ambiente, durante os primeiros 10 dias os vidros foram agitados uma vez ao dia.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 10, p. 78615-78626, oct. 2020. ISSN 2525-8761 Após esse período o preparado foi filtrado com filtro de papel. As amostras foram então processadas em destilador e concentradas até à consistência xaroposa, em temperatura de 60°C. A concentração do extrato obtida foi de 0.2g/ml.

2.4 INCUBAÇÃO DOS FAGÓCITOS COM BACTÉRIA E EXTRATO DE LIPPIA SIDOIDES Os fagócitos foram incubados com bactéria na presença do extrato alcoólico de Lippia sidoides. A alcoolatura de L. sidoides à 2% sofreu diluições seriadas (1:100,000) com água destilada até a concentração de 2µg/ml, de modo que a quantidade de extrato adicionado às amostras foi de 100ng a cada 50µl. Essa concentração foi baseada em outros estudos com extratos e substancias obtidas de plantas que apresentaram efeitos imunomodulatórios em microconcentrações (CHIANG et al., 2003; KOKO et al., 2008). Foram incubados 150µl da solução de células com 150µl da solução de bactérias e 50µl da solução de Lippia sidoides, durante 30 min em banho-maria à 37°C. Para análise de fagocitose foram utilizados 250µl da solução de células e 250µl da solução de bactérias, para a mesma quantidade de estímulos. Como controle negativo os mesmos volumes de fagócitos mononucleares também foram incubados na ausência de estímulos, apenas com o extrato e apenas com a bactéria, pelo mesmo período e nas mesas condições.

2.5 AVALIAÇÃO DA FAGOCITOSE E ATIVIDADE BACTERICIDA DOS FAGÓCITOS A fagocitose e a atividade microbicida dos fagócitos foi avaliada pela técnica de acridina orange (França et al, 2011a). Após o período de incubação, as suspensões de células e bactérias foi submetida a centrifugação por 10 min à 160G. O pellet foi corado com 200µl de acridina orange na concentração de 14,4 mg/ml por 1 minuto, a seguir foi ressuspendido em PBS. As soluções foram centrifugadas e lavadas com PBS mais duas vezes, a partir daí foram montadas lâminas e realizada a contagem em microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse E 2000, Nikon Corporation, Tokyo, Japan). Os grupos controles descritos anteriormente foram utilizados para realização de análise da viabilidade dos fagócitos perante ao extrato e verificação da atividade fagocitária em relação a Streptococcus mutans na ausência de outros estímulos.

2.6 DOSAGEM DE ÂNION SUPERÓXIDO

Para verificar se as células foram ativadas, analisou-se a liberação de ânion superóxido, pelos fagócitos do colostro na presença das microesferas com o hormônio adsorvido. Foi determinada a liberação de ânion superóxido utilizando o cromógeno Ferricitocromo C (Honorio-França et al, 1997). Em presença do ânion superóxido o ferricitocromo C sofre oxidação passando a ferrocitocromo C, sendo esta mudança colorimétrica detectável em espectrofotômentro com filtro de 550 nm.

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3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da viabilidade celular estão apresentados na Tabela 1. Observou-se que os fagócitos na presença do extrato alcoólico de L. sidoides não apresentaram diferença significativa em relação ao grupo controle, com valores próximos de 90% de células viáveis.

Tabela 1. Índice de viabilidade celular (%) dos fagócitos mononucleares (MN) do sangue periférico incubados com o extrato alcoólico de L. sidoides.

Grupos Viabilidade celular (%)

Células MN 92.33 ± 2.33

Células MN + L. sidoides 91.33 ± 3.42

Os dados representam a média ± o desvio padrão (DP) de 12 experimentos feitos com amostras de diferentes indivíduos. Os dados representam a média ± o desvio padrão (DP) de 12 experimentos feitos com amostras de diferentes indivíduos

O extrato de L. sidoides não alterou a viabilidade dos fagócitos, confirmando que esta planta não tem efeito toxico sobre as células sanguíneas. Gusman et al. (2015) também obteveram resultados semelhantes usando o extrato de L. sidoides sobre as células Th-1. Analises de toxicidade crônica durante 30 dias com administração oral de óleo essencial de L. sidoides (OELS) também revelou que este extrato não alterou aspectos histopatológicos, hematológicos, parâmetros bioquímicos e o número de leucócitos (FONTENELLE et al. 2007).

Na Figura 1 estão apresentados os resultados da liberação de ânion superóxido. Observou-se que os fagócitos do sangue na presença do extrato da L. Sidoides, independente da presença de da bactéria, apresentaram maior liberação do ânion superóxido (p<0.01) quando comparados aos fagócitos não tratados.

Os radicais derivados do oxigênio estão envolvidos em diversas ações importantes como reações imunológicas, na peroxidação dos lipídeos celulares, proteínas, carboidratos e DNA. Os fagócitos produzem ânion superóxido gerando oxidantes altamente microbicidas os quais são produzidos com o intuito de combater microrganismos potencialmente patogênicos.

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Figura 2. Liberação de ânion superóxido (O2-) pelos fagócitos MN do sangue periférico tratados pelo extrato alcoólico de Lippia sidoide, na presença ou não da Escherichia coli enteropatogênica (EPEC). Os resultados representam na média ±

Desvio padrão de 12 experimentos realizados com amostras de diferentes doadores. *p<0.01; diferenças entre fagócitos com os fagócitos incubados com L. Sidoides e/ou EPEC.

Os metabolitos ativos que participam do processo de fagocitose e atividade microbicida são importantes mecanismos de defesa contra infecções bacterianas (Ferrari et al, 2011; FREIRE et al, 2015). No metabolismo mitocondrial e peroxissomal celular durante o estresse oxidativo libera ânion superóxido em grandes quantidades. (FRANÇA et al. 2009; HONORIO-FRANÇA et al. 2009; FRANÇA et al, 2011b; HONORIO-FRANÇA et al, 2013). Então durante os processos de infecção, o organismo produz radicais livres que são mecanismos importantes para proteção (FRANÇA et al. 2010; FERNANDES et al, 2019).

Neste estudo a liberação de ânion superóxido pelos fagócitos do sangue humano induzida pelo extrato de L. sidoides sugere que esta planta foi capaz de modular a atividade funcional destas células. Trabalhos na literatura tem relacionado o aumento da liberação do superóxido com a fagocitose e a morte do microorganismo (FRANÇA et al, 2011a; ARAUJO et al, 2019; SAVAZZI et al. 2019). Os resultados obtidos no presente estudo confirmam que o aumento do ânion superóxido pelos fagócitos tratados pelo extrato da planta refletiram na fagocitose e atividade microbicida. O índice de fagocitose foi maior em células MN do sangue tratadas pelo extrato de L. Sidoides (Figura 2).

0 5 10 15 20 Fagócitos Fagócitos + L. sidoides

Fagócitos + EPEC Fagócitos + L. sidoides + EPEC Â nion s up e róxido (Nm o l/ml) * *

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Figura 2. Índice de Fagocitose (%) das células MN do sangue periférico para Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) na presença da extrato de Lippia sidoide. Os resultados representam na média ± Desvio padrão de 12 experimentos realizados com amostras de diferentes doadores. *p<0.01; diferenças entre fagócitos com os fagócitos incubados com L.

Sidoides e/ou EPEC.

A fagocitose é caracterizada como um mecanismo importante de defesa do nosso corpo principalmente contra infecções bacterianas (FAGUNDES et al, 2013, FAGUNDES et al, 2018). Netes trabalho o extrato da L. Sidoides também aumentou a atividade microbicida dos fagócitos MN do sangue para EPEC (Figura 3)

Figura 3. Atividade microbicida (%) dos fagócitos MN do sangue periférico para Escherichia coli enteropatogênica (EPEC)

na presença da extrato de Lippia sidoide. Os resultados representam na média ± Desvio padrão de 12 experimentos realizados com amostras de diferentes doadores. *p<0.01; diferenças entre fagócitos com os fagócitos incubados com L.

Sidoides e/ou EPEC.

Os macrófagos são células importantes nos mecanismos de defesa do organismos para infecções. Atividade microbicida sendo de suma importância na eliminação de infeções sobre tudo nas

0 20 40 60 80 100 Fagócitos+EPEC Fagócitos+L.sidoides+EPEC Fag o ci to se (% ) * 0 20 40 60 80 100

Fagócitos + EPEC fagócitos + L. sidoides + EPEC

A tiv idad e M icr o b ici d a (% ) *

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 10, p. 78615-78626, oct. 2020. ISSN 2525-8761 bacterianas (HONORIO-FRANÇA et al., 1997; FRANÇA-BOTELHO et al., 2006; FRANÇA et al., 2010). Os macrófagos quando ativados apresentam aumento no consumo de oxigênio que dá origem a produção de superóxido e uma variedade de espécies reativas do oxigênio (EROs), (Araújo et al, 2019). A geração de EROS tem sido reportada como importante mecanismo de defesa do organismo durante os processos infecciosos principalmente em infecções intestinais (HONÓRIO-FRANÇA et al., 2011; FRANÇA-BOTELHO et al., 2011; FRANÇA et.al., 2011a, FRANÇA et.al., 2011b, HONORIO-FRANÇA et al, 2013, MORCELI et al, 2013).

No presente estudo o extrato de L. sidoides apresentou capacidade de modular a atividade dos fagócitos mononucleares do sangue. Estudos prévios do grupo tem reportado a ação imunomodulátoria de L. sidoides associada a sistema de liberação modificada sobre sobre fagócitos do sangue (CHAUD et al, 2014). Também trabalhos tem reportado que constituintes dos óleos essenciais presentes na L.

sidoides de composto fenólico timol, que apresenta efeito imunomodulátorio, e sugerem que este

composto pode ser um dos responsáveis pela proliferação e ativação dos linfócitos (AMIRGHOFRAN et al., 2011).

Quando incubado o extrato de L. sidoides com a bactéria EPEC, os fagócitos aumentam os índices de fagocitose. Existem relatos que mostram o potencial estimulatório do timol na fagocitose de macrófagos murinos da linhagem RAW 264-7, que foi notado através do aumento da fluidez da membrana celular que é de suma importância para a captação de partículas pelos fagócitos (CHAUHAN et al., 2014). No entanto, PÉREZ – ROSÉS et al. (2015) mostraram atividade inibitória em níveis variados sobre a fagocitose de neutrófilos humanos do óleo essencial de Thymus zygis L. e

Corydothymus capitatus L. plantas que tem o timol e o carvacrol como constituintes principais,

respectivamente, e também de soluções purificadas de timol e carvacrol em várias diluições. Outros trabalhos tem sugerido que óleos presentes em plantas são importantes moduladores de fagócitos a aumentam a atividade microbicida (PESSOA et al, 2015; CRUZ et al, 2020). Mais estudos devem ser feitos para esclarecer mais o potencial imunomodulátorio da L. Sidoide sobre a atividade funcional de fagócitos do sangue.

4 CONCLUSÃO

Estes dados sugerem que o extrato de L. sidoides não apresentou efeito toxico para a célula mononucleares do sangue humano. Na presença do extrato de L. Sidoides os fagócitos quando em aumentaram a liberação de ânion superóxido, a fagocitose e atividade microbicida para EPEC.

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REFERÊNCIAS

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