Swab bucal em anuros: uma proposta de substituição ao uso de métodos invasivos para obtenção de dna animal em pesquisa / Bucal swab in anuros: a substitution proposal for the use of invasive methods for obtaining animal dna in research

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 54064-54072 jul. 2020. ISSN 2525-8761

Swab bucal em anuros: uma proposta de substituição ao uso de métodos

invasivos para obtenção de dna animal em pesquisa

Bucal swab in anuros: a substitution proposal for the use of invasive methods for

obtaining animal dna in research

DOI:10.34117/bjdv6n7-887

Recebimento dos originais: 03/06/2020 Aceitação para publicação: 31/07/2020

Lara Micheletti de Almeida

Formação acadêmica mais alta: Graduanda em Ciências Biológicas licenciatura/ bacharel - UENP Instituição: Universidade Estadual do Norte do Paraná (UENP), campus Luiz Meneghel Rodovia BR-369 Km 54, Vila Maria, CP 261 -, Bandeirantes – Paraná, CEP 86360-000

E-mail: laramike_@hotmail.com Kevin Mailon Carrapeiro Pavan

Formação Acadêmica mais alta: Graduado em Ciências Biológicas (UENP) e Pós graduado em MBA em Gestão de Pessoas

Universidade Pitágoras Unopar

Rua Santa Bárbara n°86, São José II, Cambará-Paraná, CEP: 86390-000 E-mail: Kevinpavan@hotmail.com

Mayra Costa da Cruz Gallo de Carvalho Doutora em Agronomia - ESALQ

Instituição: Universidade Estadual do Norte do Paraná (UENP), campus Luiz Meneghel Rodovia BR-369 Km 54, Vila Maria, CP 261 -, Bandeirantes – Paraná, CEP 86360-000

E-mail: mayra@uenp.edu.br Sandremir de Carvalho Doutor em Agronomia - ESALQ

E-mail: sandremir@uenp.edu.br Laís Araújo

Graduada em Ciências Biológicas - UENP

E-mail: lais_araujo23@hotmail.com RESUMO

A extração do DNA animal, dependendo da metodologia aplicada pode ser invasiva, e causar injúrias ao mesmo, ou até levá-lo a óbito. Embora uma grande quantidade de estudos com DNA animal que objetivam conhecer a variabilidade genética utilizem tais metodologias atualmente metodologias baseadas na técnica de swab tem se mostrado alternativas eficazes. Nesse trabalho comparamos a metodologia de extração de DNA a partir de tecido do fígado a técnica de swab da mucosa oral em anfíbios. Duas espécies de anfíbios foram utilizadas Dendropsophus nanus e Scinax fuscovarius. O DNA extraído foi utilizado na técnica de AFLP visando observar se ocorreriam diferenças na

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reprodutibilidade da técnica ou no seu potencial de revelar o polimorfismo. A técnica de swab a partir da mucosa oral apresentou redução importante no rendimento de DNA porém não apresentou diferenças significativas na qualidade do DNA obtido bem como no seu potencial de uso posterior para estudo de polimorfismo genético por AFLP. Assim, sugere-se que a técnica de swab bucal seja uma alternativa importante para os estudos de variabilidade genética em anuros substituindo metodologias invasivas, principalmente as que requerem eutanásia do animal.

Palavras-chave: Bioética, extração de DNA, anfíbios, AFLP. ABSTRACT

The extraction of animal DNA, depending on the applied methodology, can be invasive, and cause injuries to it, or even lead to death. Although a large number of studies with animal DNA that aim to know the genetic variability currently use such methodologies, methodologies based on the swab technique have proven to be effective alternatives. In this work, we compared the methodology for extracting DNA from liver tissue with the swab technique of the oral mucosa in amphibians. Two species of amphibians were used: Dendropsophus nanus and Scinax fuscovarius. The extracted DNA was used in the AFLP technique in order to observe if there would be differences in the reproducibility of the technique or in its potential to reveal the polymorphism. The swab technique from the oral mucosa showed an important reduction in DNA yield, but did not present significant differences in the quality of the obtained DNA or in its potential for later use for the study of genetic polymorphism by AFLP. Thus, it is suggested that the oral swab technique is an important alternative for studies of genetic variability in anurans replacing invasive methodologies, especially those that require animal euthanasia.

Keywords: Bioethics, DNA extraction, amphibians, AFLP.

1 INTRODUÇÃO

Há cerca de 7000 espécies de anfíbios anuros conhecidos no mundo, número este que cresce todos os anos (AMPHIBIAWEB:2020). O Brasil representa o país com a maior riqueza de anuros do planeta, possuindo 1093 espécies registradas em seu território (SBH, 2019; SEGALLA et al., 2019). Os anfíbios enfrentam grande declínio, sendo um dos grupos de vertebrados mais ameaçados. Este declínio está ligado desde a mudanças climáticas e a doenças emergentes, introdução de espécies exóticas, ações antrópicas como fragmentação de hábitats até a poluição industrial e por agrotóxicos (KLINK & MACHADO, 2005; COSTA et al., 2012; GRÜNDLER et al., 2012).

Os anuros são fundamentais para o fluxo de energia e dinâmica trófica dos ecossistemas (STEBBINS; COHEN, 1995), sua perda pode implicar em prejuízos quantitativos e qualitativos na agricultura e poluição ambiental, na eutrofização de corpos d’água, no desequilíbrio de redes tróficas e até afetar a indústria farmacêutica (TOLEDO et al., 2010). No entanto, ainda há uma lacuna no conhecimento sobre sua ecologia, diversidade e status de conservação na região Neotropical (POMBAL-JR; GORDO 2004). A escassez de conhecimentos sobre as espécies de anfíbios é um fator limitante para o planejamento de estratégias de conservação tão necessárias a estes animais (GARCIA & VINCIPROVA 2003).

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Desde a década passada, as estratégias de conservação têm levado em consideração o conhecimento sobre a variabilidade genética das espécies, bem como sobre a estrutura genética das populações naturais. Tais conhecimentos são fundamentais para o estabelecimento de estratégias de longo prazo (HEDRICK, 2001; SUNNUCKS, 2000; GALETTI-JR, 2008).

Por outro lado, os estudos que objetivam conhecer a variabilidade genética nas populações naturais para subsidiar os programas de conservação partem de metodologias que em sua maioria ainda utilizam amostras de tecido de animais eutanasiados para obtenção de DNA (GONÇALVES, 2010; OUELLET et al., 2005; MOTA, 2010; NALI, 2016; KUHN, 2014).

Técnicas para obtenção de DNA avançam atualmente em busca de métodos que sejam mais práticos, rápidos e eticamente aceitáveis (ARAUJO et al., 2004; SILVA, 2018). Células da mucosa oral são utilizadas na medicina forense com resultado satisfatório para obtenção de material genético (LIJNEN; WILLEMS, 2001). Esta abordagem vem se mostrando promissora em comparação a outros meios de extração, além de ser rápida e de custo reduzido (LACORTE et al., 2004; ABRAÃO, 2005; MILLER, 2006; SCHULTE et al., 2011). Pesquisas utilizando o swab da partir da pele, membranas interdigitais ou ainda a mucosa bucal para extração de DNA de anfíbios têm demonstrado ser possível a extração de DNA em quantidade e qualidade suficientes para análises moleculares posteriores e vem sendo utilizadas em substituição ao uso de amostras teciduais (BROQUET et al., 2007; RODRIGUEZ et al., 2014; Byrne et al., 2017).

Nesse sentido, considerando a importância de desenvolvermos métodos eficientes e não invasivos para obtenção de DNA, e que, principalmente evitem a eutanásia de animais na pesquisa, utilizamos a técnica de swab bucal em substituição ao uso de amostras de tecido para obtenção de DNA. Os resultados obtidos mostraram não haver diferença na eficiência de obtenção de DNA das amostras coletadas por swab bucal em comparação as tradicionalmente obtidas a partir da maceração de tecido do fígado. Além disso, as amostras de DNA obtidas por swab apresentam qualidade e quantidade suficiente para uso posterior na técnica de AFLP. Conclui-se, portanto, não haver necessidade do uso de amostras de tecido obtidas a partir da eutanásia do animal quando objetiva-se investigar a variabilidade genética em populações naturais de anuros.

2 MATERIAIS E MÉTODOS

A metodologia adotada para o desenvolvimento do trabalho foi aprovada pelo comitê de ética no uso de animais em pesquisa da UENP-CLM (Comitê de ética no uso de animais- CEUA UENP, portaria 300/2018, certificado 14 /2019).

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Os animais foram coletados em uma fazenda situada no município de Cornélio Procópio, região norte do Estado do Paraná. Duas espécies de anuros foram amostradas: Dendropsophus nanus (Boulenger, 1889) e Scinax fuscovarius (A. Lutz, 1925).

A fim de verificar a eficácia do método swap comparado ao de obtenção de DNA a partir de amostras do tecido do fígado, as duas metodologias foram aplicadas aos indivíduos.

Para realização da coleta de swab, foi passada 4-6 vezes uma haste flexível de plástico com algodões em suas pontas (cotonete) na boca do animal para recolher as células da mucosa bucal. A haste foi colocada em um microtubo de 2mL e adicionou-se 2 L de RNAse (100 µg/ml). O material foi então incubado em banho-maria à 37°C por 1 hora, após esse tempo foi adicionado 6 L de Proteinase K(10 mg/ml), e incubado em banho à 56°C overnight. Posteriormente, 500 L de acetato de potássio 5 M foi adicionado a amostra e a mesma foi centrifugada a 3.000 rpm por 15’. 700 L de sobrenadante foi transferido para um microtubo novo ao qual foi adicionado 1,4 mL de etanol absoluto gelado para precipitar o DNA. Após, o material foi centrifugado por 15’ a 13.000 rpm. Em seguida os microtubos foram esvaziados, o pellet deixado para secar a temperatura ambiente, e após ressuspendido em 40 L de água ultrapura. O DNA foi aplicado (5L) em gel de agarose 1% para verificar sua integridade e o restante do DNA armazenado em freezer à -20 ºC.

Para a extração do DNA do fígado, os mesmos animais foram manipulados. A eutanásia destes ocorreu por meio da aplicação de xilocaína, anestesiando-os e sessando sua atividade cardíaca. O protocolo utilizado para a extração de DNA das amostras de fígado foi o mesmo desenvolvido para extração a partir de músculo de peixe proposto por Bardakci et al. (1994). A integridade do DNA foi verificada de forma semelhante ao anteriormente descrito.

. Após a quantificação das amostras obtidas foi aplicada a técnica molecular Amplified Fragmente Length Polymorphism (AFLP) seguindo o protocolo proposto por Vos et al. (1995) e modificado por Reck et al. (2011). O DNA foi digerido pelas enzimas EcoRI e MseI. Após a digestão, foi efetuada a ligação de adaptadores aos fragmentos resultantes que foram então pré-amplificados

utilizando os iniciadores Eco (5'GACTGCGTACCAATTCA-3') e Mse

(5'-GATGAGTCCTGAGTAAC-3'). Após a pré-amplificação, foi realizada a PCR seletiva com combinações específicas de dois ou três nucleotídeos na região terminal 3'. Foi realizado um teste com dezesseis combinações de iniciadores e selecionados quatro primers, sendo eles: GACG, CAGG, GAGC e GACT. Todas as PCRs seletivas de AFLP foram realizadas em triplicata com o objetivo de checar a reprodutibilidade da técnica em cada metodologia de extração utilizada. Os fragmentos amplificados foram analisados em gel de poliacrilamida a 8% (29:1), corados com nitrato de prata e traduzidos em dados binários indicando presença (1), ausência (0) do marcador.

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3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A quantidade de DNA total obtida das duas espécies foi aproximadamente 10 vezes menor com a metodologia de swab quando comprada a extração de amostra tecidual. Por outro lado, a razão Abs 260nm:280nm obtida em média para as duas metodologias testadas foi muito próxima (Tabela 1). Muitos autores relatam que o rendimento de DNA total a partir de protocolos de extração que envolvem a técnica de swab a partir de boca, cloaca, pele ou membranas interdigitais apresenta-se inferior ao rendimento obtidos por técnicas que utilizam amostras teciduais, normalmente de músculo. No entanto, as análises moleculares realizadas com essas amostras de DNA revelam grande potencial na geração de resultados sobre o polimorfismo genético (SCHULTE et al., 2011, GALLARDO et al., 2012; PRUNIER et al., 2012; BYRNE et al., 2017 )

Tabela 1: Resumo dos dados de extração de DNA e perfis eletroforéticos de AFLP obtidos para Dendropsophus nanus e Scinax fuscovarius a partir de amostras de DNA extraídas do tecido do fígado e de swap bucal.

Dendropsophus nanus Scinax fuscovarius

Fígado Swab Fígado Swab

Rendimento de DNA total (ng: µl) 1150 120 1620 180

Pureza (260nm:280nm) 1,2 1,1 1,3 1,2

Marcadores AFLP

Número de marcadores amplificados 235 231 175 177

*% coincidência 94,2% 95%

*%coincidência: Porcentagem de marcas moleculares de AFLP coincidentes para a espécie nas duas metodologias utilizadas, o swab bucal e DNA de fígado.

A espécie Dendropsophus nanus (Boulenger, 1889) revelou um total de 469 fragmentos amplificados com os quatro primers, dos quais 442 tiveram o perfil de amplificação (presença/ausência) similar entre as amostras de DNA extraídas do fígado e a partir do método swap, o que equivale a uma porcentagem de coincidência de 94,2% entre as duas metodologias utilizadas. Para a espécie Scinax fuscovarius (A. Lutz, 1925) o total de fragmentos foi de 352 com os mesmo quatro primers e, deste total, 335 apresentaram perfil similar entre as amostras de DNA extraídas a partir do fígado e do método swap, resultando em 95,1% de coincidência.

Com o desenvolvimento da biotecnologia, e a invenção da PCR, foi possível o desenvolvimento de diversas técnicas moleculares para análise de DNA (MOLINA; TOBO, 2004). Essas técnicas avançaram muito no quesito de praticidade e aplicabilidade para o uso do genoma em diversos tipos organismos, possibilitando a discriminação e reconhecimento de varrições no DNA de forma ágil e eficaz (ARAUJO et al., 2004).

O material genético proveniente de células da mucosa oral vem sendo amplamente utilizado na medicina forense, mostrando eficácia na obtenção de DNA e na amplificação via PCR (LIJNEN; WILLEMS, 2001; Abraão et al., 2005).

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Lacorte et al., (2004), extraiu DNA de sangue (invasivo), pelos e células da mucosa oral (não-invasivos) de Equus caballus, onde o swab oral se destacou como a melhor extração entre os métodos não-invasivos, pois apresentou maiores quantidades de DNA.

Miller et al. (2006) a fim de averiguar se a técnica de swab seria eficiente para extração do material genético da tuatara, um réptil da Nova Zelândia, coletou material de sua cloaca, boca e sangue para comparação. Tanto as amostras de swab da mucosa bucal quanto da cloaca forneceram fonte de DNA segura para a pesquisa, concluindo assim, que o swab é um método válido, além de mais simples de se realizar em campo. Abordando a eficiência da técnica também em répteis, porém com lagartos, Schulte et al., (2011) identificou o swap bucal como um método não invasivo e confiável, corroborando com Miller (2006). Semelhantemente, Broquet et al. (2007) utilizaram o swab bucal para análise genética de anfíbios e obtiveram rendimentos surpreendentemente altos.

Em estudos sobre a fauna de anfíbios há os pesquisadores que optam por não capturar o animal, como Strehl e Boelter (2015), Caldas et al., (2009) e Capeletti et al., (2019). Eles se restringem a fotos e bioacústica como fonte de informações para realização do estudo, atuando com uma abordagem menos danosa aos espécimes, porém sem a obtenção de material genético para futuras análises genéticas, as quais podem ser muito úteis a conservação. Com o avanço da pesquisa sobre o método de swab, a coleta de DNA para complemento dos trabalhos em campo pode ser facilitada e eticamente mais aceitável, possibilitando a ampliação do conhecimento sobre o grupo. A técnica se swab pode ser utilizada de forma a evitar o manuseamento excessivo do animal, o que é principalmente importante em espécies muito pequenas ou frágeis, por meio do uso do swab da pele (Prunier et al., 2012).

Deve-se sempre haver uma avaliação em relação ao custo versus benefício ao se utilizar animais em pesquisa, principalmente no caso de levá-los a óbito. Uma alternativa que imponha o menor sofrimento possível aos indivíduos, causando assim menos danos, e que gere resultados robustos será a melhor escolha (RUSSELL & BURCH, 1959).

4 CONCLUSÕES

As duas metodologias de extração de DNA resultaram em alta eficiência na revelação do polimorfismo dos indivíduos analisados. Sugere-se então, que ao menos aos estudos que se pautem na análise de polimorfismos, ou quando um rendimento elevado de DNA não seja um pré-requisito para a metodologia, que a técnica analisada nesta pesquisa possa ser empregada alternativamente a metodologias que necessitem eutanasiar os espécimes. Desta forma, a vida animal será preservada garantindo maior coerência entre os estudos de diversidade genética e o seu objetivo final, o de conservação.

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AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Educação Tutorial (PET) e Fundo Nacional de Desenvolvimento da Educação (FNDE).

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