CULTIVO MIXOTRÓFICO DE DIATOMÁCEAS UTILIZANDO GLICERINA COMO FONTE DE CARBONO
ENGENHEIRA DE ALIMENTOS DANIELA ALMEIDA NOGUEIRA
PROF. DR. CARLOS ANDRÉ VEIGA BURKERT Orientador
RIO GRANDE, RS 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS
CULTIVO MIXOTRÓFICO DE DIATOMÁCEAS UTILIZANDO GLICERINA COMO FONTE DE CARBONO
ENGENHEIRA DE ALIMENTOS DANIELA ALMEIDA NOGUEIRA
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciências de Alimentos
PROF. DR. CARLOS ANDRÉ VEIGA BURKERT Orientador
RIO GRANDE, RS 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelo auxílio espiritual através de paz e tranquilidade para enfrentar os obstáculos.
Aos meus pais, Nesio e Sonia, pela sólida formação que me foi dada e pelo contínuo apoio em todos estes anos, ensinando-me, principalmente, a importância da construção e coerência de
meus próprios valores.
Aos meus irmãos Cesar e Katiane, a minha cunhada Rejeane, meu sobrino Carlos Eduardo e ao meu amigo de jornada Sérgio pelo auxílio, força e apoio nos momentos difíceis desta
caminhada.
À Universidade Federal do Rio Grande – FURG, através do Núcleo de Desenvolvimento Social e Econômico /FURG, pela formação profissional e pessoal ao longo dos anos de convivência e aos queridos colegas e amigos que lá conquistei, Rodrigo, Vanessa, Eliane, Luciane, Dóris, Helen, Thaís, Fernanda, pelo incentivo e apoio a realização e conclusão deste
trabalho, em especial a Tatiane e a Lucia pelo companherismo nos momentos mais complicados.
À Universidade Federal do Rio Grande – FURG, através do Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos – pela oportunidade da realização do curso de Mestrado
em Engenharia Ciência de Alimentos.
Ao meu orientador, André, pela acolhida no Laboratório de Engenharia de Bioprocessos, pela disponibilidade, incentivo, paciência e pelos puxões de orelhas construtivos.
À professora Janaína também pela acolhida no Laboratório de Engenharia de Bioprocessos, pelo incentivo, pelo auxílio, carinho e preocupação.
Às professoras Eliana, Susana e Jaqueline pelas essenciais sugestões para o aperfeiçoamento da dissertação, pelo grande apoio, dedicação no auxílio de metodologias, colaborações estas
fundamentais no decorrer do trabalho.
Aos Laboratórios de Análise Sensorial e Controle de Qualidade, Engenharia Bioquímica, Operações Unitárias, Microbiologia e Biosseparação e Micotoxina desta Universidade, pela
parceria no empréstimo de equipamentos e materiais para a efetivação do trabalho, um agradecimento especial, aos Técnicos administrativos em Educação: Lutiane, Roque, Jaques,
Ana, Maria de Jesus, à todos, pelo carinho apoio, disponibilidade e pelo respeito que tem por sua profissão, que é o que faz desta Universidade ser respeitada.
À Estação Marinha de Aquacultura (EMA), pela doação da água marinha necessária para a execução dos cultivos microalgais, nas pessoas de Ricardo e Alessandro.
Aos amigos do Laboratório de Engenharia de Bioprocessos, pelos momentos de descontração e agradável companhia, Bruno, Franciela, Francisco, Ligia, Micheli, Nathalie, Renata,
Vanessa, Angelina, Charlon, Rafael Remedi e Thalles.
Aos colegas do Laboratório de Engenharia Microbiologia e Biosseparações, que de uma forma ou de outra contribuíram neste trabalho, Ailton, Daiane, Joana e Luisa. As colegas do Laboratório de Micotoxina e do Laboratório de Tecnologia de Alimentos Cristiana pelo auxílio na determinação do perfil de ácidos graxos e a Carolina pela disposição
em auxiliar no trabalho.
Aos seres iluminados que Deus colocou no meu caminho para facilitar minha passagem neste mundo, as amigas Elisane chamada carinhosamente de “Lisi” e minha amada bolsista Natália
vulgo “Kurica” não só pela amizade, por si só muito importante, mas pela fundamental participação na realização deste trabalho, em todos os sentidos, o qual sem elas não teria
conseguido.
À minha estimada filha peluda de quatro patas “Milu Maria” sempre disposta a “ganhar e doar” um carinho sem esperar nada em troca.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela concessão de bolsa e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo
LISTA DE TABELAS CAPÍTULO III
Artigo I - Crescimento das microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum em meio contendo GGA e GR em diferentes concentrações
Tabela 1. Média ± desvio padrão para biomassa máxima, produtividade, velocidade específica máxima das microalgas Chaetoceros calcitrans Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum e análise estatística dos dados, utilizando GGA e GR ... 35 Artigo II - Produção de lipídios em cultivo mixotrófico utilizando glicerina como fonte de carbono
Tabela 1. Conteúdo lipídico das microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum utilizando GGA e GR nas concentrações de 0,03 M, 0,05 M, 0,07 M ... 55 Tabela 2. Lipídios totais produzidos pelas microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum utilizando GGA e GR nas concentrações de 0,03 M, 0,05 M, 0,07 M ... 55 Tabela 3. Média ± desvio padrão pára biomassa ao término dos cultivos das microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum utilizando GGA e GR nas concentrações de 0,03 M, 0,05 M, 0,07 M ... 56 Tabela 4. Perfil de ácidos graxos das microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum ... 60
LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO II
Figura 1 - Compostos extraídos de microalgas ... 7
Figura 2 - Estrutura da frústula de diatomáceas ... 9
Figura 3 - Tipos morfológicos básicos de diatomáceas ... 10
Figura 4 - Foto ilustrativas da microalga Chaetoceros calcitrans ... 10
Figura 5 - Foto ilustrativa da microalga Phaeodactylum tricornutum ... 11
Figura 6 - Foto ilustrativa da microalga Skeletonema costatum ... 12
Figura 7 - Diferenças entre os metabolismos autotrófico, heterotrófico e mixotrófico ... 14
CAPÍTULO III Artigo I - Crescimento das microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonem costatum em meio contendo GGA e GR em diferentes concentrações Figura 1 - Estufa fotoperíodo e distribuição dos fotobiorreatores ... 31
Figura 2 - (a) Biomassa de Chaetoceros calcitrans em meio contendo glicerina de grau analítico, (b) pH em meio contendo glicerina de grau analítico, (c) Biomassa de Chaetoceros calcitrans em meio contendo glicerina residual, (d) pH em meio contendo glicerina residual 33 Figura 3 - (a) Biomassa de Phaeodactylum tricornutum em meio contendo glicerina de grau analítico, (b) pH em meio contendo glicerina de grau analítico, (c) Biomassa de Phaeodactylum tricornutum em meio contendo glicerina residual, (d) pH em meio contendo glicerina residual ... 37
Figura 4 - (a) Biomassa de Skeletonema costatum em meio contendo glicerina de grau analítico, (b) pH em meio contendo glicerina de grau analítico, (c) Biomassa de Skeletonema costatum em meio contendo glicerina residual, (d) pH em meio contendo glicerina residual . 39 Artigo II - Produção de lipídios em cultivo mixotrófico utilizando glicerina como fonte de carbono Figura 1 - Fluxograma de preparo da biomassa para a quantificação de lipídios e determinação de ácidos graxos ... 51
Figura 2 - Formação do sistema trifásico obtido na extração de lipídios totais pelo método de Bligh e Dyer ... 52 Figura 3 - Balão de fundo chato com lipídios extraídos da microalga Skeletonema costatum . 52
SUMÁRIO CAPÍTULO I ... 1 1. INTRODUÇÃO GERAL ... 1 2. OBJETIVOS ... 4 2.1. Objetivo geral ... 4 2.2. Objetivos específicos ... 4 CAPÍTULO II ... 5 3. REVISÃO DA LITERATURA ... 6 3.1.Microalgas ... 6 3.2. Diatomáceas... 7 3.2.1. Divisão ... 7 3.2.2. Classe Bacillariophyceae ... 7 3.2.3. Habitat ... 9 3.2.4. Morfologia ... 9 3.2.5. Chaetoceros calcitrans ... 10 3.2.6. Phaeodactylum tricornutum ... 11 3.2.7.Skeletonema costatum... 12
3.3. Tipos de cultivo microalgal ... 13
3.4. Nutrientes para o crescimento de microalgas ... 14
3.4.1. Carbono ... 14
3.4.2. Nitrogênio ... 15
3.4.3. Fósforo ... 16
3.4.4. Silício ... 16
3.4.5. Vitaminas ... 16
3.5. Fatores externos que influenciam o cultivo de microalgas ... 17
3.5.1. Efeito da temperatura ... 17
3.5.2. Efeito do pH ... 17
3.5.3. Efeito da agitação e aeração ... 17
3.5.4. Luminosidade ... 18
3.6. Biodiesel e glicerina ... 18
3.7. Produção de lipídios e ácidos graxos por microalgas ... 20
3.8. Considerações finais ... 22 CAPÍTULO III ... 23 DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO ... 23 Artigo I ... 24 RESUMO ... 25 ABSTRACT ... 26 1. INTRODUÇÃO ... 27 2. MATERIAL E MÉTODOS ... 29 2.1. Microalgas ... 29 2.2. Glicerina ... 29 2.3. Água marinha ... 29 2.4. Inóculo ... 29
2.5. Cultivo nos fotobiorreatores ... 30
2.5.1. Inóculo ... 30
2.5.2. Condições de cultivo ... 30
2.6. Determinações analíticas ... 32
2.6.1. pH ... 32
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 32 3.1.Crescimento celular... 32 3.1.1. Chaetoceros calcitrans ... 32 3.1.2. Phaeodactylum tricornutum ... 36 3.1.3. Skeletonema costatum ... 38 4. CONCLUSÃO ... 40 5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 42 Artigo II... 44 RESUMO ... 45 ABSTRACT ... 46 1. INTRODUÇÃO ... 47 2. MATERIAL E MÉTODOS ... 48 2.1. Microalgas ... 48 2.2. Glicerina ... 48 2.3. Água marinha ... 48 2.4. Inóculo ... 49
2.5. Cultivo nos fotobiorreatores... 49
2.5.1. Inóculo ... 49
2.5.2. Condições de cultivo ... 49
2.6. Quantificação de lipídios totais ... 50
2.7. Determinação do perfil de ácidos graxos ... 53
2.8. Análise estatística ... 54 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 54 3.1.Conteúdo lipídico ... 54 3.1.1. Chaetoceros calcitrans ... 57 3.1.2. Phaeodactylum tricornutum ... 57 3.1.3. Skeletonema costatum ... 58
3.2. Perfil de ácidos graxos ... 59
3.2.1. Chaetoceros calcitrans ... 61 3.2.2. Phaeodactylum tricornutum ... 61 3.2.3. Skeletonema costatum ... 62 4. CONCLUSÃO ... 63 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 65 CAPÍTULO IV ... 67 1. CONCLUSÃO GERAL ... 68
2. SUGESTÃO PAARA TRABALHOS FUTUROS ... 69
CAPÍTULO V ... 70
1. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 71
APÊNDICE A - Curvas padrão das microalgas utilizadas no estudo e curva padrão de glicerina. ... 79
CAPÍTULO I:
Cultivo mixotrófico de diatomáceas utilizando glicerina como fonte de carbono RESUMO GERAL
O objetivo deste trabalho foi avaliar os parâmetros de crescimento celular e o acúmulo de lipídios no cultivo mixotrófico de três espécies de microalgas marinhas do grupo das diatomáceas (Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum), utilizando como fonte de carbono glicerina de grau analítico (GGA) e glicerina residual (GR) obtida da produção de biodiesel. Todos os cultivos foram conduzidos em fotobiorreatores, do tipo Erlenmeyer de 1 L, contendo 900 mL do meio Conway, acrescido de GGA ou GR, em diferentes concentrações. Os experimentos foram realizados em triplicata e dispostos em estufa do tipo fotoperíodo integral, temperatura de 24 ± 1 °C, irradiância de 3000 Lx, salinidade de 28 u.p.s e agitação constante através da injeção de ar estéril. A cada 24 h alíquotas foram retiradas do cultivo para avaliação dos parâmetros de crescimento celular e ao término dos cultivos a biomassa foi quantificada quanto ao teor de lipídios pelo método de Bligh e Dyer e o perfil de ácidos graxos determinado através de cromatografia gasosa. Chaetoceros calcitrans teve seu crescimento celular favorecido quando cultivada em GGA nas concentrações 0,05 M e 0,07 M, atingindo biomassa máxima de 1,99 ± 0,09 g.L-1 e 1,99 ± 0,04 g.L-1. O maior acúmulo de lipídios foi na concentração de 0,05 M de GGA e GR, com 44,23 ± 0,29 % e 40,81 ± 0,74 %, respectivamente, havendo um aumento de 18,7 % para 30,4 % nos ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs) quando utilizada GR, com maior produção dos ácidos α – linolênico (11 %) e ɣ - linolênico (9,7 %). Phaeodatylum tricornutum obteve melhor desempenho quando cultivada em GGA na concentração de 0,03 M com valores para produtividade de 0,55 ± 0,01 g.L-1. dia-1 e de 0,66 ± 0,01 dia-1 para a velocidade específica máxima de crescimento. A biomassa máxima ficou em 2,84 ± 0,07 g.L-1, 3,09 ± 0,05 g.L-1, 2,96 ± 0,26 g.L-1, 2,93 ± 0,04 g.L-1, 2,87 ± 0,19 g.L-1 e 2,92 ± 0,08 g.L-1, não havendo diferenças significativas entre as concentrações de glicerina e os diferentes cultivos. Os melhores resultados de lipídios foram obtidos para a concentração de 0,03 M de GGA e GR, com 50,4 ± 2,0 % e 49,0 ± 1,4 %, respectivamente. Maior produção de ácidos graxos monoinsaturados (AGMs) foi observada quando utilizado GGA, com 45,1 %, com destaque a produção do ácido palmitoleico (31,5 %). Skeletonema costatum obteve melhor desempenho quando cultivada em GR, obtendo a biomassa máxima de 3,68 ± 0,08 g.L-1, produtividade de 0,83 ± 0,05 g.L-1. dia-1 e velocidade específica máxima de crescimento de 0,67 ± 0,14 dia-1. Esta microalga se destacou na produção lipídica em relação às outras microalgas, obtendo 67,78 ± 1,41 % e 66,40 ± 0,46 % de lipídios na concentração de 0,05 M de GGA e GR, respectivamente. O maior teor de ácidos graxos foi do ácido oleico, quando cultivada em GR, em que obteve 38 % do total de 47,8 % de AGM. As microalgas desse estudo mostraram se bastante versáteis podendo ser direcionada à produção de biodiesel ou alimentação.
Mixotrophic culture of diatoms using crude glycerin as source of carbon ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the parameters of cell growth and lipid accumulation in mixotrophic cultivation of three species of marine microalgae group of diatoms (Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum and Skeletonema costatum) using as a carbon source pure glicerol (PG) or raw glycerol (RG), obtained from biodiesel production. All cultures were performed in photobioreactors, the type 1 L Erlenmeyer flasks containing 900 mL of medium Conway, supplemented whith PG or RG, in different concentrations. The experiments were performed in triplicate and placed in the greenhouse type photoperiod, temperature of 24 ± 1 °C, irradiance of 3000 Lx, salinity of 28 u.p.s and constant agitation by the injection of sterile air. Every 24 h aliquots were withdrawn from the culture for assessment of parameters of cell growth and the end of cultivation the biomass was quantified as the lipid content by the method of Bligh and Dyer and the fatty acid profile determined by gas chromatography. The microalgae Chaetoceros calcitrans, had his favored cell growth when grown in PG at the concentration of 0.05 M and 0.07 M, reaching maximum biomass of the 1.99 ± 0,09 g.L-1 e 1.99 ± 0,04 g.L-1. The largest accumulation of lipids concentration was 0.05 M PG and RG with 44.23 ± 0.29 % and 40.81 ± 0.74 % , respectively, there was an increase of 18 7 % to 30.4 % polyunsaturated fatty acids ( PUFAs ) using RG, with greater production of α - linolenic acid (9.7 %) and ɣ - linolenic acid (11 %). Phaeodactylum tricornutum performed better when grown in medium containing PG at the concentration 0.03 M, with values for productivity of 0.55 ± 0.01 g.L-1. day-1 and 0.66 ± 0.01 day-1 for the maximum specific growth rate. The maximum biomasses were 2.84 ± 0.07 g.L-1, 3.09 ± 0.05 g.L-1, 2.96 ± 0.26 g.L-1, 2.93 ± 0.04 g.L-1, 2.87 ± 0.19 g.L-1 e 2.92 ± 0.08 g.L-1, with no significant differences between the concentrations of glycerin and different cultivations. The better results lipid concentration were obtained of 0.03 M of PG and RG, with 50.4 ± 2.0 % and 49.0 ± 1.4 %, respectively. Increased production of monounsaturated fatty acids (MUFAs) when used the PG, with 45.1 %, mainly the production of palmitoleic acid (31.5 %). Skeletonema costatum performed better when grown in RG, obtaining the maximum biomass of 3.68 ± 0.08 g.L-1, productivity of 0.83 ± 0.05 g.L-1. day-1 and maximum specific growth rate of 0.67 ± 0.14 day-1. This stood in microalgae lipid production in relation to others microalgae, obtaining 67.78 % ± 1.41 and 66.40 ± 0.46 % lipid at the concentration of 0.05 M PG and RG, respectively. The increased production of fatty acids was the oleic acid when grown in RG, which afforded 38 % of the total of 47.8 % of MUFA. The study showed that microalgae are very versatile and can be directed to the production of biodiesel or food.
1. INTRODUÇÃO GERAL
O constante aumento da demanda por fontes de energia, as mudanças climáticas causadas pelo aquecimento da atmosfera e o esgotamento das reservas de petróleo de fácil extração, aliado a um desenvolvimento socioeconômico mais intenso, sobretudo nos países em desenvolvimento, têm incentivado a utilização de insumos renováveis, que possam substituir, ao menos parcialmente, os combustíveis de origem fóssil como petróleo, carvão e gás natural (MOTA, SILVA; GONÇALVES, 2009).
Biocombustíveis são derivados de biomassa renovável que podem substituir, parcial ou totalmente, combustíveis derivados de petróleo e gás natural em motores à combustão ou em outro tipo de geração de energia. Os dois principais biocombustíveis líquidos usados no Brasil são o etanol extraído de cana-de-açúcar e, em escala crescente, o biodiesel, que é produzido a partir de óleos vegetais ou de gorduras animais e adicionado ao diesel de petróleo em proporções variáveis (MINISTÉRIO DE MINAS E ENERGIA, 2011). Segundo Gonçalves, Perez; Ângelo (2009), o uso de biocombustíveis geralmente apresenta inúmeros benefícios, incluindo sustentabilidade, redução dos gases geradores do efeito estufa, desenvolvimento regional, social e agrícola. A produção estimada de biodiesel no Brasil, em novembro de 2012, foi de 247 mil m3. No acumulado do ano, acrescido da estimativa para novembro, a produção atingiu 2.673 mil m3, um acréscimo de 0,7 % em relação ao mesmo período de 2011 (2.456 mil m3) (FRANCO, LOBO; CRUZ, 2013).
Devido aos inúmeros incentivos governamentais que tem impulsionado a produção de biodiesel, tal combustível está sendo produzido largamente, e um fator preocupante frente a este crescimento é o destino da glicerina excedente, uma vez que para cada tonelada de biodiesel obtido são gerados cerca de 100 Kg deste coproduto, provocando efeitos adversos à viabilidade econômica do biodiesel (BOWKER, DAVIES; AL-MAZROAI, 2009).
A disposição da glicerina excedente constitui um sério problema para a produção do biodiesel, e é fundamental buscar alternativas para seu consumo, na forma bruta e/ou como derivado de alto valor agregado, viabilizando economicamente o aumento da produção de biodiesel (BEATRIZ, ARAÚJO; LIMA, 2011). A glicerina residual resultante da síntese do biodiesel usualmente apresenta 55 - 90 % de pureza. O restante consiste de triacilgliceróis não convertidos, metanol ou etanol não convertido, biodiesel, sabões e outros (AMARAL et al., 2009).
Neste contexto, a glicerina residual vem sendo investigada como fonte de carbono em processos microbianos para a obtenção de bioprodutos de alto valor agregado, uma vez que é considerada uma fonte de carbono altamente reduzida e assimilável por diversos micro-organismos sob condições aeróbicas e anaeróbicas para obtenção de energia metabólica (RIVALDI et al., 2008).
As microalgas realizam a fotossíntese como metabolismo principal para a obtenção de carbono orgânico através do carbono inorgânico contido no CO2, utilizando a
energia solar e liberando oxigênio na atmosfera (BROWN; ZEILER, 1993). Por outro lado, o cultivo mixotrófico utiliza compostos orgânicos, luz e CO2 simultaneamente. Este tipo de
cultivo proporciona um aumento da concentração de biomassa, da taxa de crescimento, da produção de clorofilas, carotenoides e ácidos graxos, fato aparentemente associado ao efeito sinérgico da luz e do substrato orgânico (GARCÍA et al., 2005; BRENNAN; OWENDE, 2010).
Na indústria alimentícia, as biomassas derivadas de microalgas são comercializadas como alimento natural ou suplemento alimentar, sendo encontradas formulações em pó, tabletes, cápsulas ou extratos. São também incorporadas em massas, petiscos, doces, bebidas, entre outros, tanto como suplemento nutricional quanto como corantes naturais (PULZ; GROSS, 2004). Além disso, a biomassa microalgal é rica em ácidos graxos poli-insaturados, como ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido docosaexaenoico (DHA), capazes de prevenir doenças cardiovasculares, câncer, diabetes, doenças inflamatórias, entre outras (DERNER et al., 2006).
Muitas pesquisas vem sendo realizadas dando enfoque nas fontes de carbono utilizadas nos cultivos mixotróficos de microalgas, tais como melaço (ANDRADE; COSTA, 2008), manipueira (BORGUETTI, 2009), vinhaça de cana de açúcar (OLIVEIRA, 1998), resíduos de suínocultura (RODRIGUES, 2000), acetato e glicose (LIU et al., 2009), glicose (DERNER, 2006), frutose, lactose e manose (GARCÍA et al.,2006) e glicerol (MORAIS et al., 2009, GARCÍA et al., 2000).
No entanto, o uso de glicerina residual ainda é pouco explorado na utilização de cultivos mixotróficos de microalgas, sendo importante, estudos para avaliar a capacidade de assimilação do glicerol por diferentes espécies de microalgas, bem como o impacto sobre o crescimento microalgal e a composição da biomassa.
Desde 2007, estudos vem sendo conduzidos no Laboratório de Engenharia de Bioprocessos da Universidade Federal do Rio Grande - FURG buscando o aproveitamento da
glicerina por via biotecnólogica para obtenção de bioprodutos de importância comercial, tais como biossurfactantes bacterianos (PRIETO, 2007; ROSA, 2008), biomassa de leveduras como fonte de nutrientes (SANTOS, 2009; MACHADO JR., 2010) e enzimas (LADEIRA, 2012). PALUDO (2012) utilizou como fonte de carbono glicerina de grau analítico no cultivo mixotrófico de dez diferentes microalgas marinhas e obteve resultados promissores quanto ao conteúdo lipídico das microalgas do grupo das diatomáceas. Neste contexto, este trabalho vem contribuir nestes estudos, avaliando o potencial de diatomáceas na bioconversão da glicerina residual em biomassa com alto teor de lipídios, comparando com a glicerina de grau analítico.
2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral
Avaliar o crescimento celular e o acúmulo de lipídios no cultivo mixotrófico de três espécies de microalgas marinhas do grupo das diatomáceas (Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum), utilizando como fonte de carbono glicerina de grau analítico e glicerina residual obtida da produção de biodiesel.
2.2. Objetivos específicos
Comparar o uso da glicerina de grau analítico (GGA) e da glicerina residual (GR) em diferentes concentrações (0,03 M, 0,05 M e 0,07 M) para as microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum, verificando os efeitos da substituição de GGA por GR e da concentração sobre os parâmetros de crescimento celular, como biomassa máxima, produtividade e velocidade específica máxima de crescimento;
Comparar o uso da glicerina de grau analítico e da glicerina residual em diferentes concentrações (0,03 M, 0,05 M e 0,07 M) para as três microalgas, verificando os efeitos da substituição de GGA por GR e da concentração no teor de lipídios ao término dos cultivos.
Em uma concentração estabelecida, determinar o efeito da substituição de GGA por GR no perfil de ácidos graxos das três microalgas.
CAPÍTULO II
3. REVISÃO DA LITERATURA 3.1. Microalgas
Os primeiros estudos envolvendo cultivo de microalgas no Brasil foram realizados no início da década de 70, quando foram criadas as primeiras coleções de microalgas marinhas. Na USP foi organizado um laboratório que abrigava algumas dezenas de cepas. A partir de 1980 os estudos começaram a se difundir pelo Brasil, com envolvimento de pesquisadores e universidades de vários estados, e atualmente têm ampla participação de pesquisadores, integrando profissionais das mais diversas áreas, como fisiologia, ecologia, bioquímica, ecotoxicologia e aquicultura (LOURENÇO, 2006).
O termo microalga, sinônimo de fitoplâncton, engloba micro-organismos procarióticos (cianobactérias) e eucarióticos (algas de dimensões microscópicas) fotossintéticos (dotados de clorofila a) que podem crescer rapidamente e viver em condições rigorosas devido à sua estrutura unicelular (GRIS, 2011). São geralmente gram-negativas, coloridas devido à presença de pigmentos fotossintéticos, e vivem, em sua maioria, em ambientes aquáticos (TOMASELLI, GIOVANNETTI; TORZILLO; 1993).
Nutricionalmente, as microalgas são fontes de macronutrientes (proteínas, lipídios, carboidratos), vitaminas e outros elementos-traço. São ainda ricas em pigmentos, como astaxantina, zeaxantina, clorofila e ficocianina (COSTA, 2008). Muitas microalgas são utilizadas para produção de alimentos por produzirem diversas substâncias, como vitaminas, sais minerais, pigmentos, lipídios e ácidos graxos. As principais aplicações dos ácidos graxos de microalgas estão no enriquecimento de rações para peixes, possibilidade de uso para produção de biodiesel e fonte de ácidos graxos essenciais na dieta humana (MORAIS; COSTA, 2008). Também a partir da biomassa são extraídas substâncias de importância farmacêutica, bem como são utilizadas na produção de cosméticos e como indicadores ambientais, entre outras aplicações (LOURENÇO, 2006).
Desta forma, em função da alta produtividade, do rápido crescimento e do grande número de substâncias por elas produzidas, tem aumentado o interesse de pesquisadores por estes micro-organismos, e muitos estudos vêm sendo realizados nos mais diversos campos, tais como: no tratamento de águas residuais de inúmeros processos industriais, como bioindicadores, na detecção de nutrientes (para as microalgas) e substâncias tóxicas (detergentes, efluentes industriais, herbicidas etc.) (DERNER, 2006, SCHMITZ, MAGRO; COLLA, 2012). Na indústria alimentícia são comercializadas como alimento natural ou suplemento alimentar, sendo encontradas formulações em pó, tabletes, cápsulas ou extratos.
São também incorporadas em massas, petiscos, doces, bebidas, entre outros, tanto como suplemento nutricional quanto como corantes naturais (PULZ & GROSS, 2004). A Figura 1 mostra alguns compostos que podem ser extraídos a partir de microalgas.
Figura 1 - Compostos extraídos de microalgas
Fonte: OLIVEIRA (2009)
3.2. Diatomáceas 3.2.1. Divisão
As diatomáceas pertencem à divisão Ochrophyta (designada como “plantas de cor ocre”). Esta divisão inclui diferentes grupos de algas, como as diatomáceas, as eustigmatofíceas, as rafidofíceas, entre outras. Os membros da divisão Ochrophyta variam desde células microscópicas até algas gigantes de dezenas de metros de comprimento, com diferenciação de tecidos. A clorofila a está presente na maior parte das ocrófitas, mas há também algumas formas heterotróficas não pigmentadas. Nas espécies pigmentadas (maioria das espécies da divisão), os pigmentos acessórios e protetores dos fotossistemas incluem a clorofila c e os carotenóides, como a fucoxantina e a vaucheriaxantina. Os produtos de reserva consistem em gotículas de gordura no citoplasma e/ou um polissacarídeo solúvel e derivado de glicose formado por ligações glicosídicas do tipo β-1,3, a crisolaminarina ou laminarina (LOURENÇO, 2006).
3.2.2. Classe Bacillariophyceae
Biólogos têm agrupado as microalgas em uma variedade de classes, distinguidas principalmente pelos seus pigmentos, ciclo de vida e estrutura celular básica. Em termos de
abundância, as diatomáceas (Bacillariophyceae) são dominantes nos oceanos, sendo também encontradas em água salobra e doce. Aproximadamente 100.000 espécies são conhecidas. Possuem paredes celulares impregnadas com sílica polimerizada. Todas as células armazenam carbono, seja na forma de óleo natural ou de um polímero de carboidratos conhecido como crisolaminarina. Suas células são eucarióticas, sua forma de vida é unicelular cocóide, de colônias filamentosas e outras formas. Fazem parte de seu complexo coletor de luz clorofilas a, b e c, β-caroteno e xantofilas, conferindo-lhes uma coloração dourado - amarronzada (OSHE et al, 2007).
A principal característica morfológica distintiva das diatomáceas diz respeito às suas frústulas silicosas, as quais representam caráter importante para sua classificação devido a seus ricos detalhes de forma e ornamentação. A palavra diatomácea é também uma alusão às frústulas, pois vem do grego dia, “de um extremo a outro”, e tomos, “corte”. As frústulas são estruturas bivalves complexas, que se encaixam formando uma espécie de teca que protege a célula (LOURENÇO, 2006).
A parede celular das diatomáceas é a impregnada de sílica (SIO2.n H2O), envolvida por uma
fina camada de matéria orgânica, conhecida como frústula. É altamente diferenciada, ornamentada por diferentes tipos de estruturas, e sempre dividida em duas unidades chamadas tecas, as quais se encaixam como duas placas de Petri, como ilustrado na figura 2. A teca maior é conhecida como epiteca (sempre originada da célula mãe), enquanto a menor é chamada hipoteca. Cada uma das tecas é composta pela valva e pelo cíngulo. As valvas são localizadas nas extremidades da célula e se unem por várias unidades silíceas delicadas, as bandas do cíngulo. Cada valva é composta por superfície e manto. Uma variedade de estruturas e projeções ornamentam as frústulas, as quais são a base da taxonomia das diatomáceas (FREIRE, 2012).
Figura 2 - Estrutura da frústula de diatomáceas
Fonte: CAVALCANTE (2012)
3.2.3. Habitat
As diatomáceas são ubíquas, ou seja, ocorrem no mar, em água salobra, em água doce e em ambientes terrestres úmidos. Elas podem apresentar hábitos planctônicos ou bentônicos. As diatomáceas podem participar da formação de biofilmes microbianos coloridos (limo), fazendo parte dos chamados microfitobentos, e podem ser encontradas em associações simbióticas com esponjas (LOURENÇO, 2006).
3.2.4. Morfologia
As diatomáceas variam desde 2,0 µm até 2,0 mm de diâmetro. Com esta variação estas microalgas estão incluídas em duas categorias: o picoplâncton, que são microalgas com tamanho entre 0,2 e 2,0 µm (MARTINS; SANO, 2004); e o mesoplâncton, que são organismos com tamanho entre 0,2 e 20 mm (DUARTE; SILVA, 2008).
As diatomáceas apresentam núcleo mais ou menos centralizado. Os plastos apresentam clorofilas a e c, β-caroteno, fucoxantina, diatoxantina e diadinoxantina como seus principais pigmentos fotossintéticos. Os plastos geralmente são pequenos, discóides e numerosos em diatomáceas cêntricas, ao passo que as diatomáceas penadas tendem a apresentar apenas dois plastos, grandes e achatados (LOURENÇO, 2006). A figura 3 ilustra os tipos morfológicos básicos de diatomáceas.
Figura 3 - Tipos morfológicos básicos de diatomáceas: a esquerda diatomácea penada, com simetria bilateral; direita diatomácea cêntrica, com simetria radial
Fonte: CENTRALES (2012) 3.2.5. Chaetoceros calcitrans
A espécie Chaetoceros calcitrans é uma microalga marinha unicelular, pertencente à classe Bacillariophyceae, amplamente empregada na alimentação de larvas de crustáceos marinhos e moluscos bivalves (SHEI et al., 2008). Quando cultivada em meio líquido e com agitação, apresenta células individuais, não formando cadeias (DERNER, 2006). A figura 4 ilustra a C. calcitrans.
Figura 4 - Foto ilustrativa da microalga Chaetoceros calcitrans
Fonte: http://www.starcentral.mbl.edu (2012)
Alguns estudos em relação ao cultivo mixotrófico de Chaetoceros sp. são mencionados na literatura, destacando-se o trabalho realizado por Derner (2006), que estudou o efeito de diferentes fontes de carbono no crescimento e na composição bioquímica da microalga Chaetoceros muelleri, e obteve um maior crescimento no meio contendo dióxido de carbono, com 786,7 mg.L-1 de biomassa máxima.
Moreira (2007), que avaliou o crescimento e a composição química da microalga Chaetoceros muelleri em meios alternativos, observou uma maior produção de lipídeos no meio contendo extrato de esterco de minhoca (EEM), quando comparado ao meio convencional F/2 Guillard. A concentração alcançada correspondeu a 0,112 pg.cel-1.
Paludo (2012) utilizou glicerina de grau analítico como fonte de carbono, avaliando a concentração de biomassa máxima, a produtividade e a velocidade específica máxima de crescimento de C. calcitrans, conseguindo um incremento de 31 % na biomassa no cultivo mixotrófico em relação ao cultivo autotrófico, sendo que a biomassa máxima obtida foi de 0,63 g.L-1, enquanto que no cultivo autotrófico foi de 0,44 g.L-1. Quanto ao consumo do substrato, a microalga C. calcitrans assimilou 48,7 % do glicerol adicionado no meio de cultivo Conway, contribuindo positivamente no crescimento da microalga, além de reduzir o tempo de cultivo, levando a um incremento na produtividade de 0,047 para 0,076 g.L-1.dia-1. Com relação ao conteúdo lipídico, houve um aumento de 19,30 % para 44,30 %.
3.2.6. Phaeodactylum tricornutum
Na figura 5 é ilustrada a microalga P. tricornutum, que é conhecida pelo seu alto valor nutricional, em função da presença de ácidos graxos poli-insaturados, especialmente do ácido eicosapentaenoico, e por apresentar facilidade no cultivo (LOURENÇO, 2006). O seu cultivo é realizado, principalmente, sob condições fotoautotróficas, resultando em taxa de crescimento e concentração de biomassa relativamente baixas. Contudo, o cultivo em condições mixotróficas poderia potencialmente produzir uma maior concentração de biomassa (GARCÍA et al., 2005).
Figura 5 – Foto ilustrativa da microalga Phaeodactylum tricornutum
Fonte: PALUDO (2012)
Diferentemente das demais microalgas, P. tricornutum possui diversos estudos em relação ao seu crescimento em cultivo mixotrófico, inclusive em glicerol. As principais fontes de carbono utilizadas foram: glicerol (GARCÍA et al., 2005), acetato e glicose (LIU et al., 2009), frutose e manose (GARCÍA et al., 2006), entre outras.
No estudo realizado por Paludo (2012), foi comparado os cultivos autotrófico mixotrófico de P. tricornutum, utilizando a glicerina de grau analítico como fonte adicional de carbono, obtendo-se um incremento de cerca 66 % na biomassa produzida no cultivo
mixotrófico. Também observou um aumento significativo na produtividade e velocidade específica máxima de crescimento, sendo 5 e 3 vezes maiores que no cultivo autotrófico, respectivamente. Além disso, o cultivo mixotrófico contribuiu para o aumento do conteúdo lipídico de P. tricornutum, sendo alcançado o valor de 21,1 %.
3.2.7. Skeletonema costatum
A figura 6 mostra a microalga S. costatum, que é um importante constituinte do fitoplâncton marinho em função de sua ocorrência em grandes quantidades. Por apresentar rápido crescimento, é amplamente utilizada para alimentação de larvas de crustáceos e moluscos bivalves, e também em estudos de auto-ecologia (BERTOLLI; FERNADES, 2008). A microalga ainda é identificada como uma espécie com potencial de uso para a captura do CO2 e produção de biodiesel gerando um Mecanismo de Desenvolvimento Limpo (MDL)
(BORGES, 2005).
Figura 6 - Foto ilustrativa da microalga Skeletonema costatum
Fonte: http://www.paper.li (2012)
Meinerz (2007) avaliou a influência de fatores como temperatura, salinidade e relação N:P no cultivo de Skeletonema sp., obtendo uma densidade celular máxima de 336,23 cel.mL-1, a 20 ºC, salinidade de 20 u.p.s e relação N:P de 16:1, verificando queda nos valores de densidade celular máxima com o aumento da temperatura (30 ºC), com a diminuição da salinidade (10 u.p.s) e com o aumento da relação N:P (24:1).
Paludo (2012) verificou em seus estudos que o uso da glicerina de grau analítico como fonte de carbono adicional contribuiu para o crescimento da diatomácea, obtendo-se biomassa numa proporção cerca de 21,8 % maior no cultivo mixotrófico, quando comparado ao cultivo autotrófico. Além da biomassa, observou-se aumento na produtividade de 0,085 g.L-1.dia -1 para 0,109 g.L-1.dia -1, e na velocidade específica máxima de crescimento, de 0,49 dia-1 para 0,53 dia-1. Com relação ao conteúdo lipídico da S. costatum, houve um aumento de 4,53 % para 55,2 %.
3.3. Tipos de cultivo microalgal
As características de crescimento e a composição das microalgas dependem significativamente das condições de cultivo. O cultivo de microalgas pode ser: autotrófico (fotoautotrófico), heterotrófico e mixotrófico. A diferença entre cada um dos cultivos esta fundamentada na fonte de carbono empregada e na utilização ou não de energia luminosa (CHEN et al., 2011).
Nos cultivos autotróficos, há o emprego de luz como exclusiva fonte de energia, para a fixação do CO2 e liberação de O2. Neste tipo de cultivo, problemas com contaminação
são menores quando comparado com as demais condições de cultivo.
Nos cultivos heterotróficos, não há utilização de luz, mas há o emprego de compostos orgânicos como fonte de carbono para biossíntese e energia. As principais fontes de carbono orgânico assimiladas por algumas espécies de microalgas são: glicose, acetato, glicerol, frutose, lactose, galactose e manose. Desta forma, por este tipo de cultivo utilizar fontes de carbono provenientes de açúcares, frequentemente problemas de contaminação são observados (CHEN et al., 2011). Neste tipo de cultivo ainda ocorre um aumento da concentração de biomassa e da produtividade. Apesar disso, poucos processos industriais utilizam-no, o que provavelmente esteja associado ao número limitado de espécies de microalgas heterotróficas disponíveis; maior contaminação por bactérias; inibição do crescimento em substratos com baixas concentrações de compostos orgânicos; incapacidade de produzir alguns produtos induzidos pela presença de luz, como pigmentos (GARCÍA et al., 2000).
Em relação ao cultivo mixotrófico, o CO2 e o carbono orgânico são
simultaneamente assimilados. Este tipo de cultivo pode ser o processo mais eficiente para a produção de biomassa algal, visto que implica em uma economia na energia gasta para a síntese de todo o aparato fotossintético e para a fixação do carbono (LEE, 2004).
A figura 7 exemplifica de forma ilustrativa o metabolismo mixotrófico, como sendo a interação dos metabolismos heterotróficos e autotróficos, ou seja, enquanto o cultivo heterotrófico representado em cinza na figura é realizado pela introdução de compostos orgânicos ao meio de cultura, em branco é representado o cultivo autotrófico onde a única fonte de carbono é o CO2 inorgânico proveniente do ar. A intersecção dos dois metabolismos
representa o metabolismo mixotrófico, onde o carbono é disponibilizado tanto por meio de compostos orgânicos quanto pelo ar atmosférico.
Figura 7 - Diferenças entre os metabolismos autotrófico, heterotrófico e mixotrófico
Fonte: MARIANO et al (2010)
3.4. Nutrientes para o crescimento de microalgas
Nas microalgas, os macronutrientes são responsáveis por várias funções como fontes de constituintes estruturais das biomoléculas, da membrana e do meio intracelular, participação nos processos de troca de energia e regulação das atividades metabólicas. A sua ausência ou insuficiência pode comprometer algumas das funções vitais nesses micro-organismos (LOURENÇO, 2006). Desta forma, o meio preparado para o cultivo influencia diretamente no crescimento celular, bem como na composição química da alga que está em estudo (BORGHETTI, 2009).
3.4.1. Carbono
Nos cultivos, o carbono é considerado como o macronutriente mais importante, uma vez que constitui ao redor de 50 % da biomassa microalgal, sendo que, comumente, o crescimento das microalgas encontra-se limitado por este composto (DERNER, 2006).
O carbono inorgânico pode estar na forma de dióxido de carbono (CO2), ácido
carbônico (H2CO3), bicarbonato (HCO3-) ou carbonato (CO2-) e suas proporções dependem do
pH. Quanto mais ácido, maior a proporção de CO2-livre, enquanto que com a elevação do pH
as proporções de bicarbonato e carbonato aumentam no meio (DERNER, 2006).
O CO2 é a fonte de carbono preferida pelas microalgas, uma vez que se difunde
rapidamente (difusão passiva) da água para o interior das células e é usado diretamente nos processos de fixação. Já o bicarbonato é incorporado ativamente, gerando um gasto energético para suportar este processo (BORGHETTI, 2009).
No cultivo mixotrófico, são utilizados, simultaneamente, uma fonte luminosa e um substrato orgânico como fonte de carbono (DERNER, 2006). Este tipo de cultivo representa uma excelente alternativa para produção de biomassa, quando comparado ao cultivo autotrófico. As taxas de crescimento e o aumento da concentração de biomassa aparentemente estão associados ao efeito sinérgico da luz e do substrato orgânico. Também é importante ressaltar que os cultivos mixotróficos apresentam elevada produção de clorofilas, carotenoides e ácidos graxos, quando comparados aos cultivos autotróficos. Além disso, substratos como o glicerol são capazes de estimular a produção destes metabólitos (GARCÍA et al., 2005). Neste tipo de cultivo, ainda, ocorre uma menor perda de biomassa durante a fase escura, decorrência da adição do substrato orgânico ao meio de cultivo (BRENNAN; OWENDE, 2010).
Assim, o emprego de fontes de carbono alternativas, como o glicerol, utilizadas nos cultivos mixotróficos, surge como uma solução na redução dos custos dos meios de cultivo. Além do glicerol, outras fontes de carbono orgânico também estão sendo empregadas no cultivo de diferentes microalgas, destacando-se: melaço (ANDRADE, 2005), manipueira (BORGUETTI, 2009), glicose (MULITERNO et al., 2005; DERNER, 2006), frutose, lactose e manose (GARCÍA et al., 2006), vinhaça de cana de açúcar (OLIVEIRA, 1998), resíduos de suíno cultura (RODRIGUES, 2000), acetato e a glicose (LIU et al., 2009).
3.4.2. Nitrogênio
O nitrogênio é o componente básico na formação de proteínas, ácidos nucléicos e pigmentos fotossintetizantes, constituinte de diversas substâncias do metabolismo primário e pode ser encontrado em concentrações variáveis no interior das células algáceas na forma inorgânica (nitrito, nitrato e amônio). É assimilado, preferencialmente, sob forma amoniacal (NH3 e NH4+), mas também pode ser assimilado na forma de nitrogênio gasoso ou molecular
(algumas cianobactérias), de nitrato (NO3-), de nitrito (NO2-) (LOURENÇO, 2006).
As principais fontes são os sais de nitrato, sais de amônio e uréia. As concentrações de proteínas e clorofilas nas células são diretamente proporcionais ao suprimento de nitrogênio. Com isso, a diminuição da concentração de proteína, ocasiona aumento significativo no percentual de polissacarídeos e a diminuição da clorofila aumenta a concentração de carotenoides, gerando mudança de coloração no cultivo, que tendem ao aspecto amarelado (LOURENÇO, 2006).
3.4.3. Fósforo
O fósforo, assim como o nitrogênio, é considerado um dos principais elementos limitantes para as microalgas. Ele é importante na regulação do metabolismo celular (síntese de lipídios e carboidratos) e no fornecimento de fosfatos para a geração de energia e na constituição de moléculas estruturais (ATP, açúcares fosfatados, ácidos nucléicos e fosfoenzimas). O fósforo é assimilado na forma de ortofosfato (HPO43-). As microalgas são
capazes de absorver quantidades elevadas do fósforo (8 a 16 vezes a mais que a sua cota mínima), permitindo que a célula continue a se desenvolver mesmo que não haja disponibilidade de novas fontes deste elemento. Os fosfatos utilizados por microalgas geralmente são os sais de sódio e potássio (LOURENÇO, 2006).
3.4.4. Silício
As diatomáceas são um dos grupos de fitoplâncton oceânico que possuem um requerimento essencial de ácido silícico para a formação da sua carapaça, pois é componente estrutural das frústulas e esqueleto externo. São fontes de silício os sais de silicato de sódio hidratados (LOURENÇO, 2006).
Na água do mar, o ácido silícico está presente em três formas químicas (H4SiO4,
H3SiO4- e H2SiO4-2).O ácido silícico molecular realmente absorvido pelas diatomáceas é ainda
alvo de discussões. Células algais são circundadas por uma camada limite difusa (DBL), contendo uma espessura efetiva da ordem do raio celular. O transporte de nutrientes através dessas camadas ocorre somente por difusão e assim pode limitar o suprimento de ácido silícico para a célula. Conforme a forma de ácido silícico absorvido pela célula, o sistema químico DBL será desequilibrado (BECKER, 1988).
3.4.5. Vitaminas
Apenas três vitaminas são efetivamente importantes para as microalgas: tiamina (B1), biotina e cianocobalamina (B12). Algumas espécies podem sintetizá-las, as que não
sintetizam necessitam recebê-las de fontes exógenas. As demais vitaminas não atuam como fatores limitantes, pois: são sintetizadas pelas algas; são sintetizadas por micro-organismos associados a algas e disponibilizados; não apresentam funções biológicas para algas; ou são necessárias em concentrações tão baixas a ponto de serem irrelevantes (LOURENÇO, 2006).
3.5. Fatores externos que influenciam o cultivo de microalgas 3.5.1. Efeito da temperatura
Segundo Lourenço (2006), a temperatura é um dos fatores que mais afetam a taxa metabólica dos organismos, interferindo principalmente na velocidade das reações bioquímicas e na composição celular. De maneira geral, a maioria das microalgas apresenta crescimento em temperaturas que variam de 15 a 25 ºC (KARAM; SOCCOL, 2007).
A atividade fotossintética diminui com a queda na temperatura, sendo que acima de 35 °C a concentração de proteínas e especificamente de pigmentos fotossintéticos proteicos decresce e ocorre um aumento nas concentrações de carboidratos e lipídios (TOMASELLI, GIOVANNETTI; TORZILLO, 1993).
3.5.2. Efeito do pH
Dentre os fatores mais importantes no cultivo de algas, destaca-se o pH do meio de cultivo, que também determina a solubilidade do dióxido de carbono e minerais no meio, o que, direta ou indiretamente, influencia o metabolismo das algas.
O pH depende de vários fatores como composição e capacidade tamponante do meio, quantidade de dióxido de carbono dissolvido, temperatura (que determina a solubilidade do CO2) e atividade metabólica das células (BECKER et al., 1988). A variação do pH em
culturas de microalgas ocorre devido ao consumo de substratos, solubilização e consumo do dióxido de carbono e à degradação de metabólitos produzidos (GRIMA et al., 1999).
3.5.3. Efeito da agitação e aeração
A aeração é um fator muito importante para a homogeneização dos nutrientes e para evitar a sedimentação das microalgas. Em cultivos de grande escala é recomendada a injeção de CO2 para contribuir ao processo de fotossíntese (BORGHETTI, 2009). A injeção
de ar aos cultivos proporciona uma difusão efetiva dos nutrientes, um aporte parcial de CO2
inorgânico, uma estabilidade do pH, a manutenção das algas em suspensão e o cultivo uniformemente distribuído (COLLA, RUIZ; COSTA, 2002).
A aeração é um processo mecânico, por meio do qual se aumenta o nível de oxigênio dissolvido em um meio de cultivo. Alguns autores afirmam que a aeração mecânica se faz necessária, principalmente, nas seguintes condições: durante à noite, devido à alta taxa de respiração das microalgas; quando as microalgas não são sadias (enfermas ou muito velhas), o que origina uma menor produção de oxigênio e um alto risco de morte repentina de
toda a biomassa; durante a falta ou carência de luz, pois com pouca radiação (solar ou artificial), diminui substancialmente a produção de oxigênio (inibição da fotossíntese) (BORGHETTI, 2009).
3.5.4. Luminosidade
Em cultivos mixotróficos, o crescimento celular não é estritamente dependente da fotossíntese, devido à presença de um substrato orgânico para a manutenção dos processos metabólicos e de crescimento e a luz deixa de ser um fator indispensável ao crescimento como é em cultivos autotróficos (YANG, HUA; SHIMIZU, 2000).
Os cultivos microalgais podem ser iluminados artificialmente por lâmpadas fluorescentes, luz natural ou uma combinação de diferentes fontes de luz (CHEN et al., 2011). A intensidade e duração dos feixes luminosos são importantes fatores ambientais no crescimento microalgal. Níveis extremos de luminosidade no cultivo de microalgas podem conduzir a dois processos desfavoráveis, a fotoinibição e a fotolimitação.
A fotoinibição ocorre quando o fluxo de fótons absorvido pelos cloroplastos é tão alto que a concentração de elétrons de alta energia na célula é excessiva para ser consumida pelo Ciclo de Clavin. Esses elétrons de alta energia reagem com a água, formando peróxido de hidrogênio, tóxico às células. Já a fotolimitação ou sombreamento ocorre devido ao aumento da concentração de biomassa, diminuindo a profundidade de penetração da luz no cultivo. Desta forma, os micro-organismos localizados na superfície são altamente iluminados, e os localizados em profundidades maiores não recebem energia luminosa suficiente para garantir uma boa condição fotossintética (BEZERRA, 2006).
3.6. Biodiesel e glicerina
O biodiesel é obtido através da transesterificação (uma reação orgânica na qual um éster é transformado em outro através da troca dos grupos alcoóxidos) dos triacilgliceróis de óleos e gorduras de origem vegetal ou animal com um monoálcool de cadeia curta, tipicamente metanol ou etanol, na presença de um catalisador, produzindo uma mistura de ésteres alquílicos de ácidos graxos e glicerol. O glicerol formado é praticamente imiscível no biodiesel (RIVALDI et al., 2008).
De um modo geral, o biodiesel foi definido pela “National Biodiesel Board” dos Estados Unidos como o derivado monoalquil éster de ácidos graxos de cadeia longa, proveniente de fontes renováveis como óleos vegetais ou gordura animal, cuja utilização está
associada à substituição de combustíveis fósseis. Enquanto produto pode-se dizer que o biodiesel tem as seguintes características: é livre de enxofre e aromáticos; tem alto número de cetano, possui teor médio de oxigênio em torno de 11%; possui maior viscosidade que o diesel convencional; possui nicho de mercado específico, diretamente associado a atividades agrícolas; tem preço de mercado relativamente superior ao diesel comercial (NETO et al., 2000).
O glicerol (1,2,3 propanotriol ou glicerina) foi descoberto por Scheele em 1779 durante o processo de saponificação de azeite de oliva. Pasteur (1858) também observou sua formação como um subproduto da fermentação alcoólica, em concentrações de 2,5 - 3,6 % do conteúdo de etanol (ARRUDA, RODRIGUES; FELIPE, 2007). O termo glicerol aplica-se somente ao componente químico puro 1,2,3 propanotriol. O termo glicerina aplica-se aos produtos comerciais purificados, normalmente, contendo pelo menos 95 % de glicerol. Vários níveis e designações de glicerina estão disponíveis comercialmente. Eles diferem um pouco em seu conteúdo de glicerol e em outras características, tais como cor, odor e impurezas (MOTA, SILVA; GONÇALVES, 2009).
Na natureza, o glicerol existe em vegetais (soja, mamona, babaçu, girassol, palma, algodão, coco, dendê, pinhão manso, entre outros) e animais em formas combinadas com ácidos graxos. O glicerol é também um composto considerado fundamental dentro do sistema metabólico de micro-organismos, onde atua como precursor de numerosos compostos e como regulador de vários mecanismos bioquímicos intracelulares (RIVALDI et al., 2008).
O glicerol na sua forma pura apresenta-se como um líquido viscoso, incolor, inodoro e higroscópico, com sabor doce, solúvel em água e álcool, insolúvel em éter e em clorofórmio. Devido às suas características físicas e químicas e ao fato de ser inócuo, o glicerol puro apresenta diferentes aplicações na indústria de cosméticos, farmacêutica, detergentes, na fabricação de resinas e aditivos e na indústria de alimentos. Apesar de o glicerol apresentar estas aplicações na forma pura, poucos estudos estão sendo direcionados para a utilização de glicerina bruta na forma direta (RIVALDI et al, 2008).
Devido aos inúmeros incentivos governamentais para a produção de biodiesel, tal combustível está sendo produzido largamente, e um fator preocupante frente a este exacerbado crescimento é o destino da glicerina excedente, uma vez que para cada tonelada de biodiesel obtido são gerados 100 Kg de glicerina, provocando efeitos adversos à economia do biodiesel (BOWKER, DAVIES; AL-MAZROAI, 2009). O valor da glicerina bruta obtida desta produção encontra-se entre 0,2 a 0,4 R$/ kg. Este baixo valor é atribuído ao conteúdo de
aproximadamente 30 % (p/p) de impurezas e ao grande volume deste coproduto gerado pelas indústrias (RIVALDI et al., 2008).
A disposição da glicerina constitui um sério problema para a produção do biodiesel em grandes quantidades, e é fundamental buscar alternativas para o consumo desse volume extra deste coproduto, na forma bruta e/ou como derivado de alto valor agregado, viabilizando economicamente o aumento da produção de biodiesel (BEATRIZ, ARAÚJO; LIMA, 2011). A glicerina residual resultante da síntese do biodiesel usualmente apresenta 55 – 90 % de pureza. O restante consiste de triacilgliceróis não convertidos, metanol ou etanol não convertido, biodiesel, sabões e outros (AMARAL et al., 2009). Essas impurezas dependem da natureza da oleaginosa e do tipo de catálise empregada na preparação do biodiesel (FERREIRA, 2009).
A presença de tais compostos acaba limitando o emprego da glicerina bruta para fins farmacêutico, químico e na indústria de cosméticos, em função dos altos custos para a sua purificação (AMARAL et al., 2009). Para obter glicerina de alta pureza podem-se empregar processos adsortivos com carvão ativado ou argilas e as clássicas destilações a vácuo (FERREIRA, 2009). É válido ressaltar que a glicerina bruta contém cerca de 24 - 37,7 % de carbono, podendo estes valores variar em função da fonte utilizada na obtenção do biodiesel (KOLESÁROVÁ et al., 2011).
Desta forma, a conversão microbiana de glicerina bruta por processos biotecnológicos em produtos de maior valor agregado, como biomassa e moléculas bioativas, é uma alternativa relevante para a maior valorização da produção de biodiesel (RIVALDI et al., 2008).
3.7. Produção de lipídios e ácidos graxos por microalgas
Através da fotossíntese, as microalgas podem sintetizar ácidos graxos a partir de fontes de carbono, como o CO2, e também a partir de fontes de carbono orgânico (glicose,
acetato, etc.). A composição e a quantidade de lipídios dependem da distribuição destes nas células, da espécie de microalga, assim como das condições de cultivo autotrófico ou heterotrófico (PEREIRA et al., 2012).
Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos com cadeias de hidrocarbonetos contendo de 4 a 36 carbonos, sendo encontrados principalmente esterificados a triacilgliceróis, colesterol e fosfolipídios constituintes das membranas celulares. Eles podem ser classificados em saturados (contendo apenas ligações simples), monoinsaturados (uma
ligação dupla) ou insaturados (duas ou mais ligações duplas). Os ácidos graxos poli-insaturados podem ser representados usando-se a abreviação estrutural que os identifica única e exclusivamente através do número de carbonos e de duplas ligações. Também podem ser denominados a partir da posição das ligações duplas, em relação ao grupamento metila terminal, utilizando-se para tanto a denominação ω ou n,5. (IUPAC, 1978).
As microalgas sintetizam duas classes principais de lipídios: (a) lipídios neutros, que compreendem os mono, di e triacilgliceróis; e (b) lipídios polares que incluem os fosfolipídios e galactolipídios. Esses lipídios são produzidos a partir das fontes de carbono fornecidas à microalga, sejam elas orgânicas, como a glicose, acetato ou glicerol, ou inorgânicas como o dióxido de carbono (HUANG; CHEN, 2010).
O perfil lipídico, ou seja, as proporções relativas de lipídios neutros e polares, altera-se com a fase do ciclo de crescimento em que o cultivo se encontra: exponencial ou estacionária. Lipídios neutros são mais abundantes em células na fase estacionária. Lipídios polares e os lipídios poli-insaturados são mais abundantes na fase exponencial do cultivo (ALONSO et al., 2000). A biomassa microalgal é rica em ácidos graxos poli-insaturados, como ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido docosaexaenoico (DHA), capazes de prevenir doenças cardiovasculares, câncer, diabetes, doenças inflamatórias, entre outras (DERNER et al., 2006).
Sob condições mixotróficas, algumas microalgas aumentam sua taxa de crescimento e sua biomassa e produzem uma maior concentração de ácidos graxos (GARCÍA et al., 2000). Isso pode ser explicado pelo fato de que o uso de fontes suplementares de carbono minimiza as consequências do auto sombreamento causado pela elevada densidade celular. Com a baixa disponibilidade de luz em cultivos densos, a assimilação do carbono inorgânico pelas microalgas fica prejudicada. Se a alga consegue assimilar mais carbono, aumenta sua produção de carboidratos, proteínas e lipídios (DERNER, 2006).
Alguns autores reportam um aumento da biomassa seca e aumento da produção de lipídios pela microalga P. tricornutum utilizando fontes de carbono como extrato de centeio, trigo ou batata (FÁBREGAS et al., 1997), glicose e glicerol (GARCÍA et al., 2000).
Paludo (2012) utilizou como fonte de carbono glicerina de grau analítico na concentração de 0,05 M para o cultivo mixotrófico de microalgas e obteve resultados interessantes com relação à produção de lipídios para as microalgas Dunaliella tertiolecta e Tetraselmis suecica, conseguindo um bom incremento no acúmulo de lipídios (1,54 e 2,39 vezes, respectivamente) em relação ao cultivo autotrófico. Para as microalgas C. calcitrans, P.
tricornutum e S. costatum, além de apresentarem elevado conteúdo lipídico (44,3 %, 21,1 % e 55,2 %, respectivamente), representando incrementos de 2,30, 1,61 e 12,19 vezes em relação ao cultivo autotrófico, verificou ainda que com a adição da glicerina de grau analítico houve uma acréscimo na produção de biomassa de 1,44, 2,98 e 1,28 vezes, respectivamente.
García et al. (2006) utilizaram diferentes fontes de carbono (frutose, glicose e glicerol) para verificar o aumento da produtividade do ácido ecosapentanoico (EPA) a partir da microalga P. tricornutum. Os valores máximos de produtividade de biomassa nos cultivos mixotróficos para o glicerol, frutose e glicose foram de 21,30 mg.L.h-1, 15,80 mg.L.h-1 e 10,20 mg.L.h-1, respectivamente. Estes valores foram, respectivamente, 10, 8 e 5 vezes maiores que os obtidos em cultivo fotoautotrófico. Foram observadas diferenças nos perfis de ácidos graxos de biomassa obtida com glicerol e frutose. Os percentuais dos principais ácidos graxos de P. tricornutum em cultivo mixotrófico utilizando o glicerol foram: ácido mirístico 1,5 %, ácido palmítico 2 %, ácido palmitoleico 4,78 % e ácido eicosapentanoico 2,4 %. Para os mesmos ácidos, porém em cultivo autotrófico, os percentuais foram: 0,47 %, 0,88 %, 1,32 % e 1,6 %, respectivamente.
3.8. Considerações Finais
Com base no exposto na revisão bibliográfica, é importante frisar a carência de estudos que reportem o uso de glicerol em cultivos mixotróficos microalgais. Além disso, há a falta de maiores informações a respeito dos efeitos das condições de cultivo para diferentes espécies de microalgas, assim como estudos relacionados ao conteúdo lipídico, entre outros bioprodutos. Até o momento, a maior parte dos estudos com glicerol refere-se à diatomácea Phaeodactylum tricornutum, mostrando assim a importância deste trabalho ao propor o estudo das microalgas Chaetoceros calcitrans e Skeletonema costatum.
CAPÍTULO III:
Artigo I
Crescimento das microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum em meio contendo GGA e GR em diferentes concentrações
Crescimento das microalgas Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum em meio contendo GGA e GR em diferentes concentrações
RESUMO
As microalgas vem ganhando destaque na área de biotecnologia uma vez que estas tem se mostrado bastante versáteis com relação às condições de cultivo e aos tipos substratos que podem ser assimilados como fonte de carbono em cultivos mixotróficos. Além disso, são conhecidas por possuírem alta produtividade, pelo rápido crescimento e pelo grande número de substâncias por elas produzidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento celular no cultivo mixotrófico de três espécies de microalgas marinhas do grupo das diatomáceas (Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum e Skeletonema costatum), utilizando como fonte de carbono glicerina de grau analítico (GGA) e glicerina residual (GR) obtida da produção de biodiesel. Os cultivos foram conduzidos em fotobiorreatores, do tipo Erlenmeyer de 1 L, contendo 900 mL do meio Conway, acrescido de GGA ou GR, nas concentrações de 0,03 M, 0,05 M e 0,07 M, e ajuste de salinidade em 28 u.p.s. Os experimentos foram realizados em triplicata e dispostos em estufa do tipo fotoperíodo integral, temperatura de 24 ± 1°C, irradiância de 3000 Lx e agitação constante através da injeção de ar estéril. A cada 24 h alíquotas foram retiradas do cultivo para avaliação dos parâmetros de crescimento celular. A microalga Chaetoceros calcitrans teve seu crescimento celular favorecido quando cultivada em GGA nas concentrações de 0,05 M e 0,07 M, atingindo biomassa máxima de 1,99 ± 0,09 g.L-1 e 1,99 ± 0,04 g.L-1, respectivamente, e produtividade de 0,28 ± 0,01 g.L-1. dia-1. Phaeodactylum tricornutum obteve melhor desempenho quando cultivada em meio contendo GGA na concentração de 0,03 M, com os valores para a produtividade de 0,55 ± 0,01 g.L-1. dia-1 e de 0,66 ± 0,01 dia-1 para a velocidade específica máxima de crescimento, a biomassa máxima ficou em 2,84 ± 0,07 g.L-1, não havendo diferenças significativas entre as concentrações de glicerina e os diferentes cultivos. Skeletonema costatum obteve melhor desempenho quando cultivada em GR, obtendo a biomassa máxima de 3,68 ± 0,08 g.L-1, produtividade de 0,83 ± 0,05 g.L-1. dia-1 e velocidade específica máxima de crescimento de 0,67 ± 0,14 dia-1. As três microalgas estudadas neste trabalho se mostraram bastantes promissoras para a produção de biomassa, assim como demonstraram a capacidade de se desenvolver em meio contendo GGA e em meio contendo glicerina oriunda da produção de biodiesel como fonte de carbono no cultivo mixotrófico, havendo impactos positivos tanto na produtividade quanto na velocidade específica máxima de crescimento, porém são necessários maiores estudos sobre as condições de cultivo para que se possa otimizar a produção de biomassa e direcionar o metabolismo das microalgas para a obtenção do produto de interesse.
Growth of microalgae Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum and
Skeletonema costatum in medium containing PG and RG in different concentrations ABSTRACT
Microalgae is gaining prominence in biotechnology as these has shown very versatile regarding growing conditions and types substrates that can be assimilated as a carbon source in mixotrophics cultivations. In addition, are known to have high productivity , by rapid growth and the large number of substances produced by them. The aim of this study was to evaluate cell growth in mixotrophic cultivation of three species of marine microalgae group of diatoms (Chaetoceros calcitrans, Phaeodactylum tricornutum and Skeletonema costatum) using as a carbon source pure glycerol (PG) or raw glycerol (RG) obtained from biodiesel production. All cultures were conducted in photobioreactors, the type 1 L Erlenmeyer flasks containing 900 mL of medium Conway, supplemented whith PG or RG, at concentrations of 0.03 M, 0.05 M and 0.07 M, and adjust salinity 28 u.p.s. The experiments were performed in triplicate and placed in the greenhouse full type photoperiod, temperature of 24 ± 1 °C, irradiance of 3000 Lx and constant agitation by the injection of sterile air. Every 24 h aliquots were withdrawn from the culture for assessment of parameters of cell growth. The microalgae
Chaetoceros calcitrans, has favored its cell growth when grown on PG at concentrations of
0.05 M and 0.07 M, reaching maximum biomass around 1.99 ± 0.09 g.L-1 e 1.99 ± 0.04 g.L-1 productivity of 0,28 ± 0.01 g.L-1. day-1. Phaeodatylum tricornutum performed better when grown in medium containing PG at a concentration of 0.03 M, with the values for the productivity of 0.55 ± 0.01 g L-1. day-1 and 0.66 ± 0.01 day-1 for the maximum specific growth rate, maximum biomass was 2.84 ± 0.07 g.L-1, with no significant differences between the concentrations of glycerin and differents cultivations. Skeletonema costatum performed better when grown in RG, getting the maximum biomass of 3.68 ± 0.08 g.L-1, productivity 0.83 ± 0.05 g.L-1. day-1 and maximum specific growth rate of 0.67 ± 0.14 day-1. The three microalgae studied in this work have shown quite promising for biomass production as well as demonstrate the ability to grow in medium containing in medium containing PG and glycerol deriving from the production of biodiesel, as carbon source in the culture mixotrophic with positive effects of productivity and the maximum specific growth rate, but larger studies on the growing conditions are needed so that we can optimize biomass production and direct the metabolism of microalgae for obtaining the product of interest.
